BR112015014258B1 - Microrganismo transformado, seu processo de produção e uso para produzir carotenoides - Google Patents

Abstract

acetiltransferases e seu uso para produzir carotenoides a presente invenção refere-se a acetiltransferases, codificação de sequências de ácidos nucleicos a partir disso, construtos de expressão e vetores que compreendem essas sequências, microrganismos transformados com os mesmos e uso dos mesmos.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a acetiltransferases inovadoras, codificação de sequências de ácido nucleico, portanto, a construtos e vetores de expressão que compreendem essas sequências, microorganismos transformados com os mesmos e processos para a produção microbiológica de carotenoides, por exemplo, para zeaxantina, astaxantina, luteína ou β-criptoxantina.

[002] Os carotenoides são pigmentos orgânicos que variam de cor, do amarelo para o vermelho, os quais são produzidos naturalmente por determinados organismos, incluindo organismos fotossintéticos (por exemplo, plantas, algas, cianobactérias), e alguns fungos.

[003] Os carotenoides, tais como, as luteínas, zeaxantina ou astaxantina são aditivos importantes na dieta humana e de gado, como substâncias de pigmentação e precursores de derivados de vitamina A. Além disso, os carotenoides têm uma ação que promove a saúde, por exemplo, intensifica a resposta imune e, devido às suas propriedades antioxidantes, uma ação de prevenção ao câncer, o que torna interessante o uso dos mesmos como produtos nutracêuticos. Um processo econômico para preparar carotenoides e gêneros alimentícios com um teor de carotenoide aumentado é, portanto, de grande importância. Os processos particularmente econômicos para preparar carotenoides são processos biotecnológicos que utilizam proteínas e genes biossintéticos de biossíntese de carotenoide a partir de organismos que produzem carotenoide.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] A presente invenção refere-se a proteínas ou a polipeptídeos que compreendem a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 14, respectivamente, ou uma sequência derivada dessas sequências por substituição, inserção ou deleção de aminoácidos que tem uma homologia de pelo menos 50% no nível de aminoácido com a sequência SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 14.

[005] Os inventores constataram, surpreendentemente, que a incorporação de um gene que codifica uma acetiltransferase de acordo com invenção em uma célula hospedeira que pode produzir um carotenoide específico que contém pelo menos uma grupo hidroxila, como por exemplo, zeaxantina ou astaxantina, altera perfis de carotenoide nas células hospedeiras, tais como formas acetiladas do carotenoide são produzidos, o que permite um acúmulo aumentado/intensificado de compostos de carotenoide (formas acetiladas mais formas não-acetiladas) na célula em comparação a cepas não transformadas com o gene que codifica a proteína ou o polipeptídeo de acordo com a invenção.

[006] A presente invenção também se refere a polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos da presente invenção, a construtos de ácido nucleico, a vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos, e a métodos para produzir os polipeptídeos.

[007] A presente invenção também fornece sistemas aprimorados, em particular, micro-organismos transformados para a produção biológica de carotenoides em que pelo menos um polipeptídeo heterólogo que tem atividade de acetiltransferase é expresso.

[008] Em um exemplo preferencial, a invenção fornece fungo oleaginoso (incluindo, por exemplo, levedura) que produz um ou mais carotenoides. A presente invenção também fornece métodos para tal levedura e fungo, métodos para usar tal levedura e fungo a fim de produzir carotenoides, e métodos para preparar composições que contêm carotenoide, tais como, alimento ou aditivos de alimentação, ou suplementos nutricionais, que usam carotenoides produzidos em tal levedura oleaginosa ou fungo. Em particular, a presente invenção fornece sistemas e métodos para gerar levedura e fungo que contém polinucleotídeos que codificam o polipeptídeos da presente invenção.

VISÃO GERAL DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[009] SEQ ID NO: 1 é a sequência de DNA não otimizada que codifica acetiltransferase ATF1 a partir de S. cerevisiae.

[010] SEQ ID NO: 2 é a sequência de DNA não otimizada que codifica acetiltransferase ATF1 a partir de S. bayanus.

[011] SEQ ID NO: 3 é a sequência de DNA não otimizada que codifica acetiltransferase ATF1 a partir de S. mikatae.

[012] SEQ ID NO: 4 é a sequência de DNA não otimizada de acetiltransferase ATF1 a partir de S. kudriavzevii.

[013] SEQ ID NO: 5 é a sequência de aminoácido, conforme deduzido a partir de SEQ ID NO: 1.

[014] SEQ ID NO: 6 é a sequência de aminoácido, conforme deduzida a partir de SEQ ID NO: 2.

[015] SEQ ID NO: 7 é a sequência de aminoácido, conforme deduzido a partir de SEQ ID NO: 3.

[016] SEQ ID NO: 8 é a sequência de aminoácido, conforme deduzido a partir de SEQ ID NO: 4.

[017] SEQ ID NO: 9 é a sequência de DNA que codifica a acetiltransferase ATF1 a partir de S. cerevisiae, conforme otimizada para a expressão em Yarrowia lipolytica.

[018] SEQ ID NO: 10 é a sequência de DNA que codifica acetiltransferase ATF1 a partir de S. bayanus, conforme otimizado para a expressão em Yarrowia lipolytica.

[019] SEQ ID NO: 11 é a sequência de DNA que codifica acetiltransferase ATF1 a partir de S. mikatae, conforme otimizado para a expressão em Yarrowia lipolytica.

[020] SEQ ID NO: 12 é a sequência de DNA que codifica acetiltransferase ATF1 a partir de S. kudriavzevii, conforme otimizado para a expressão em Yarrowia lipolytica.

[021] SEQ ID NO: 13 é a sequência de DNA não otimizada que codifica acetiltransferase ATF1 a partir de S. arboricolus.

[022] SEQ ID NO: 14 é a sequência de aminoácido, conforme deduzida a partir de SEQ ID NO: 13.

[023] SEQ ID NO: 15 é a sequência de DNA que codifica acetiltransferase ATF1 a partir de S. arboricolus, conforme otimizada para a expressão em Yarrowia lipolytica.

[024] SEQ ID NO: 16 é a sequência de DNA que codifica acetiltransferase ATF1 a partir de S. bayanus, conforme otimizado para a expressão em Paracoccus zeaxantinaifaciens que usa a tabela de uso de códon de P. denitrificans PD1222.

[025] SEQ ID NO: 17 é a sequência de DNA que codifica acetiltransferase ATF1 a partir de S. cerevisiae, conforme otimizado para a expressão em Paracoccus zeaxantinaifaciens com o uso tabela de uso de códon de P. denitrificans PD1222.

[026] SEQ ID NO: 18: é a sequência de DNA não otimizada de acetiltransferase ATF1 a partir de S. cerevisiae com um sítio Ndel interno removido

DEFINIÇÕES

[027] Polipeptídeo isolado: O termo "polipeptídeo isolado" significa um polipeptídeo que é modificado pela mão do homem em relação àquele polipeptídio conforme encontrado na natureza. Em um aspecto, o polipeptídeo é pelo menos 1% puro, por exemplo, pelo menos 5% puro, pelo menos 10% puro, pelo menos 20% puro, pelo menos 40% puro, pelo menos 60% puro, pelo menos 80% puro E pelo menos 90% puro, conforme determinado por SDS-PAGE.

[028] Polipeptídeo substancialmente puro: O termo "polipeptídeo substancialmente puro" significa uma preparação que contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1% e no máximo 0,5% em peso de outro material de polipeptídeo com o qual o mesmo é associado de maneira original ou recombinante. Preferencialmente, o polipeptídeo é pelo menos 92% puro, por exemplo, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro, pelo menos 99,5% puro e 100% puro em peso a partir do total de material de polipeptídeo presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão, preferencialmente, em uma forma substancialmente pura. Isso pode ser alcançado, por exemplo, preparando-se o polipeptídeo através de métodos recombinantes conhecidos ou de métodos de purificação clássicos.

[029] Identidade de Sequência: A relação entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência".

[030] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácido é determinado com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) conforme implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), preferencialmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade aberta para lacunas de 10, penalidade de extensão para lacunas de 0,5, e a matriz de substituição de EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). A emissão de "maior identidade" rotulada por Needle (obtida com o uso da opção não breve) é usada como a identidade de porcentagem e é calculada conforme o seguinte:

[031] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de dioxirribonucleotídeo é determinado com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra), conforme implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente a versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade aberta para lacuna de 10, penalidade de extensão para lacuna de 0,5, e a matriz de substituição de EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUC4.4). A emissão de "maior identidade" rotulada por Needle (obtida com o uso da opção não breve) é usada como a identidade de porcentagem e é calculada conforme o seguinte:

[032] Fragmento: o termo "fragmento" significa um polipeptídeo que tem um ou mais (diversos) aminoácidos apagados do amino-terminal e/ou carboxila-terminal de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de acetiltransferase.

[033] Variante alélica: o termo "variante alélica" significa qualquer uma dentre duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de gene podem ser silenciosas (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou pode codificar os polipeptídeos que têm sequências de aminoácido alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[034] Polinucleotídeo isolado: o termo "polinucleotídeo isolado" significa uma polinucleotídeo que é modificado pela mão de um homem em relação àquele polinucleotídeo, conforme encontrado na natureza. Em um aspecto, o polinucleotídeo isolado é pelo menos 1% puro, por exemplo, pelo menos 5% puro, pelo menos 10% puro, pelo menos 20% puro, pelo menos 40% puro, pelo menos 60% puro, pelo menos 80% puro, pelo menos 90% puro e pelo menos 95% puro, conforme determinado por eletroforese de agarose. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, de cDNA, de RNA, semissintética, sintética, ou quaisquer combinações das mesmas.

[035] Polinucleotídeo substancialmente puro: o termo "polinucleotídeo substancialmente puro" significa uma preparação de polinucleotídeo livre de outros nucleotídeos não pertencentes ou não desejados e em uma forma adequada para uso dentro de sistemas de produção de polipeptídeo geneticamente elaborado. Desse modo, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, no máximo 8%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3%, no máximo 2%, no máximo 1% e no máximo 0,5% em peso de outro material de polinucleotídeo ao qual o mesmo é associado de maneira original ou recombinante. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões 5' e 3' não transladadas que ocorrem naturalmente, tais como promotores ou terminadores. Preferencialmente, o polinucleotídeo é pelo menos 90% puro, por exemplo, pelo menos 92% puro, pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puros pelo menos 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão, preferencialmente, em uma forma substancialmente pura.

[036] Sequência de Codificação: o termo "sequência de codificação" significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácido de um polipeptídeo. Os limites da sequência de codificação são determinados, geralmente, por um quadro de leitura aberta, que inicia, geralmente, com o códon de início ATG ou códons de início alternativos, tais como, GTG e TTG e termina com um códon de interrupção, tal como, TAA, TAG e TGA. A sequência de codificação pode ser um polinucleotídeo de DNA, cDNA, sintético ou recombinante.

[037] cDNA: o termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição inversa de uma molécula de mRNA submetida a splicing obtida a partir de uma célula eucariótica. O cDNA carece de sequências íntron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. A transcrição de RNA primária inicial é um precursor para o mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo emendas (splicing), antes do aparecimento como mRNA submetido a emenda madura.

[038] Construto de ácido nucleico: o termo "construto de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de filamento ou simples ou duplo, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de maneira que não existiriam naturalmente, de outro modo, ou que é sintética. O termo construto de ácido nucleico é sinônimo do termo "cassete de expressão" quando o construto de ácido nucleico contém as sequências de controle exigida para expressão de uma sequência de codificação da presente invenção.

[039] Sequências de controle: o termo "sequências de controle" significa todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, porém sem limitação, uma sequência de poliadenilação líder, uma sequência de propeptídeo promotora, uma sequência de peptídeo de sinalização e um terminador de transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor e sinais de interrupção transcricional e traducional. As sequências de controle podem ser dotadas de conectores com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle com a região de codificação do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[040] Ligado de maneira operacional: o termo "ligado de maneira operacional" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência de codificação de um polinucleotídeo de modo que a sequência de controle direciona a expressão da sequência de codificação.

[041] Expressão: o termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, porém sem limitação, transcrição, modificação após transcrição, tradução, modificação pós-traducional e secreção.

[042] Vetor de expressão: o termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e é ligada de maneira operacional a nucleotídeos adicionais que fornecem sua expressão.

[043] Célula hospedeira: o termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação, transfecção, transdução, conjugação e semelhantes com um construto de ácido nucleico ou com um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" abrange qualquer progênie de uma célula progenitora que não é idêntica à célula progenitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[044] Variante: o termo "variante" significa um polipeptídeo que tem atividade de acetiltransferase que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção de um ou mais (diversos) resíduos de aminoácido sem uma ou mais (diversas) posições. Uma substituição significa uma reposição de um aminoácido que ocupa uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção de um aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicionar 1 a 3 aminoácidos adjacentes a um aminoácido que ocupa uma posição.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[045] Acetiltransferases doravante significam proteínas ou enzimas de acordo com a invenção que transferem um grupo acetila a um carotenoide ou a um derivado de carotenoide que contém pelo menos um grupo hidroxila, por exemplo, a zeaxantina ou a astaxantina, que compreende as sequências de aminoácido SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 14 ou uma sequência derivada dessas sequências por substituição, inserção ou deleção de aminoácidos e tem uma homologia de pelo menos 50% no nível de aminoácido com a sequência SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 14.

[046] A sequência de aminoácido retratada na SEQ ID NO: 5 é derivada de translação da sequência de DNA retratada na SEQ ID NO: 1, a sequência de aminoácido retratada na SEQ ID NO: 6 é derivada de translação da sequência de DNA retratada na SEQ ID NO: 2, a sequência de aminoácido retratada na SEQ ID N0: 7 é derivada de translação da sequência de DNA retratada na SEQ ID NO: 3, a sequência de aminoácido retratada na SEQ ID NO: 8 é derivada de translação da sequência de DNA retratada na SEQ ID NO: 4, e a sequência de aminoácido retratada na SEQ ID NO: 14 é derivada de translação da sequência de DNA retratada na SEQ ID NO: 13.

[047] Substituição significa a reposição de um ou mais aminoácidos por um ou mais aminoácidos. As reposições são, preferencialmente, as reposições chamadas conservadoras, nas quais o aminoácido reposto tem uma propriedade semelhante ao aminoácido original, por exemplo, reposição de Glu por Asp, Gin por meio de Asn, Val por Ile, Leu por Ile, Ser por Thr.

[048] A deleção é a reposição de um aminoácido através de um acoplamento direto. As posições preferenciais para deleções são as terminações do polipeptídeo e os acoplamentos entre os domínios de proteína individuais.

[049] As inserções são introduções de aminoácidos na corrente de polipeptídeo, sendo que, formalmente, há uma reposição de um acoplamento direto por um ou mais aminoácidos.

[050] A homologia entre duas proteínas significa a identidade dos aminoácidos sobre todo o comprimento de cada proteína, que é calculado por comparação ao auxílio do programa de computador GAP (UWGCG, University of Wisconsin, Genetic Computer Group, algoritmo de programa de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 1970, 48: 443 a 453)), que define os seguintes parâmetros: peso de lacuna: 12; peso de comprimento: 4; compatibilidade média: 2,912; não compatibilidade média: -2,003.

[051] Uma proteína que tem uma homologia de pelo menos 50% no nível de aminoácido com a sequência SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 14 significa uma proteína que, em comparação à sua sequência com a sequência SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 14 que usa o algoritmo de programa acima com o conjunto de parâmetros acima, tem uma identidade de pelo menos 50%, preferencialmente 60%, em particular, preferencialmente 70%.

[052] As acetiltransferases podem ser preparadas, conforme descrito doravante, pela expressão de gene dos ácidos nucleicos apropriados que codificam essas proteínas de organismos naturais ou geneticamente manipulados.

[053] A invenção se refere, adicionalmente, a um processo para transferir um grupo acetila a um carotenoide ou a um derivado de carotenoide que contém pelo menos um grupo hidroxila, tal como, por exemplo, zeaxantina, [beta]- criptoxantina, 3'-hidroxiequinenona, 3-hidroxiequinenona, adonixantina (4-cetozeaxantina), astaxantina, foenicoxantina (adonirubinaa), [alfa]-criptoxantina ou luteína ou derivados dos mesmos que têm até átomos de 40 C. Preferencialmente, tais carotenoides ou derivados de carotenoide contêm pelo menos um elemento estrutural de 3- hidroxi-[beta]-ionona ou pelo menos de 3-hidroxi-4-ceto- [beta]-ionona ou pelo menos de 3-hidroxi-[epsilon]-ionona ou pelo menos de 3-hidroxi-4-ceto-[epsilon]-ionona na molécula, tal como, por exemplo, 3-hidroxi-6-vinil-[beta]- ionona, 3-hidroxi-4-ceto-6-vinil-[beta]-ionona, 3- hidroxiretinol, 3-hidroxi-4-cetoretinol, 3-hidroxiretinal, 3-hidroxi-4-cetoretinal, ácido 3-hidroxiretinoico, ácido 3- hidroxi-4-cetoretinoico ou luteína.

[054] A invenção também se refere a codificação de sequências de ácido nucleico para uma das acetiltransferases de acordo com a invenção. Um ácido nucleico preferencial tem a sequência SEQ ID NO: 1, SQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 13.

[055] A invenção se refere, ademais, a análogos funcionais dos ácidos nucleicos de acordo com a sequência SEQ ID NO: 1, SQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 13, obtidos mediante adição, substituição, inserção e/ou deleção de nucleotídeos individuais ou múltiplos, que codificam, adicionalmente, uma acetiltransferase que tem a especificidade desejada.

[056] A invenção também abrange aquelas sequências de ácido nucleico que compreendem as então chamadas mutações silenciosas ou que são modificadas em comparação a uma sequência mencionada especificamente em conformidade com o uso de códon de uma origem específica ou um organismo hospedeiro e variantes de ocorrência natural de tais sequências de ácido nucleico.

[057] A invenção também abrange modificações das sequências de ácido nucleico obtidas por degeneração do código genético (isto é sem quaisquer mudanças na sequência de aminoácido correspondente) ou por substituição de nucleotídeo conservadora (isto é, o aminoácido correspondente é reposto por outro aminoácido de mesma carga, tamanho, polaridade e/ou solubilidade), e sequências modificadas por adição, inserção, inversão ou deleção de nucleotídeo, em que as sequências codificam uma acetiltransferase, de acordo com a invenção, que tem um "perfil de substrato modificado", e as sequências complementares correspondentes.

[058] A invenção se refere, adicionalmente, a construtos de expressão que compreendem uma sequência de ácido nucleico, de acordo com a invenção, sob o controle genético de sequências de ácido nucleico regulatórias; e vetores que compreendem pelo menos um desses construtos de expressão.

[059] A invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico recombinante. "Molécula de ácido nucleico recombinante" se refere, principalmente, a uma molécula de ácido nucleico, ou uma sequência de ácido nucleico compreende moléculas de ácido nucleico de duas ou mais fontes genéticas diferentes. De acordo com a presente invenção, a molécula de ácido nucleico recombinante pode ser um construto de expressão, isto é, uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo que tem acetiltransferase de acordo com a invenção, conectado de maneira operacional a uma sequência de controle de expressão, ou a mesma sequência de ácido nucleico que é integrada ao cromossomo hospedeiro integrado.

[060] Preferencialmente, os construtos de acordo com a invenção abrangem um promotor 5'- a montante da sequência de codificação em questão e uma sequência de terminador 3'- a jusante, e, opcionalmente, elementos regulatórios costumeiros adicionais, e, em cada caso acoplados de maneira operacional à sequência de codificação. A conexão operacional deve ser entendida como significando a disposição sequencial do promotor, da sequência de codificação, do terminador e, caso apropriado, outros elementos regulatórios de tal maneira que cada um dos elementos regulatórios possa realizar sua função pretendida na expressão da sequência de codificação. Os exemplos de sequências acopláveis de maneira operacional são sequências de direcionamento, ou intensificadores de translação, intensificadores, sinais de poliadenilação e semelhantes. Os elementos regulatórios adicionais abrangem marcadores selecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e semelhantes.

[061] Além das sequências artificiais regulatórias, a sequência regulatória natural ainda pode estar presente a montante do gene real estrutural. Caso desejado, essa regulagem natural pode ser desligada por modificação genética, e a expressão dos genes pode ser intensificada ou rebaixada. No entanto, o construto de gene também pode ser mais simples em construção, isto é, os sinais regulatórios adicionais não são inseridos a montante do gene estrutural e o promotor natural com sua regulagem não é removido. De preferência, a sequência regulatória natural sofre uma mutação tal que a regulagem não ocorra mais e a expressão de gene seja aumentada ou reduzida. Uma ou mais cópias das sequências de ácido nucleico pode estar presente no construto de gene.

[062] Os exemplos de promotores adequados são: o promotor cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, l-PR ou l-PL, que são empregados vantajosamente em bactérias gram-negativas; e os promotores gram-positivos amy e SP02, os promotores de levedura ADC1, MFa, Ac, P-60, CYC1, GAPDH, TEF1 ou os promotores de planta CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, nos ou o promotor de ubiquitina ou faseolina. Uma preferência em particular é dada ao uso de promotores induzíveis, por exemplo, promotores induzíveis leves e em temperatura particular, tais como o promotor PrP1r.

[063] Em princípio, todos os naturais de promotor com suas sequências regulatórias podem ser usados. Além disso, promotores sintéticos também podem ser usados de maneira vantajosa.

[064] As sequências regulatórias mencionadas acima se destinam a permitir a expressão alvejada das sequências de ácido nucleico e de proteína expressão. Dependendo do organismo hospedeiro, isso pode significar, por exemplo, que o gene é expresso ou sobre-expresso apenas após a ocorrência da indução, ou que o mesmo é expresso e/ou sobre-expresso de maneira imediata e/ou constitutiva.

[065] As sequências ou fatores regulatórios podem ter, preferencialmente, um efeito positivo em expressão e, dessa maneira, aumentar ou reduzir o último. Desse modo, uma intensificação dos elementos regulatórios pode ocorrer, vantajosamente, no nível de transcrição com o uso de fortes sinais de transcrição, tais como, promotores e/ou "intensificadores". Além disso, a translação também pode ser intensificada aprimorando-se, por exemplo, a estabilidade de mRNA.

[066] Um cassete de expressão é gerado fundindo-se um promotor estável com uma sequência de nucleotídeo de acetiltransferase adequada e um sinal de terminador ou um sinal de poliadenilação. Para esta finalidade, recombinação costumeira e técnicas de clonagem são usadas conforme são descritas, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e em T. J. Silhavy, M. L. Berman and L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984) e em Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).

[067] Para expressão em um organismo hospedeiro adequado, o construto de ácido nucleico recombinante ou o construto de gene é inserido vantajosamente em um vetor hospedeiro específico que permite uma ideal expressão de gene no hospedeiro. Os vetores são bem conhecidos pelo trabalho versado e pode ser encontrado, por exemplo, em "Cloning vectors" (Pouwels P. H. et al., Ed., Elsevier, Amsterdam-Nova Iorque-Oxford, 1985). Os vetores devem ser entendidos como significando não apenas plasmídeos, porém todos os outros vetores conhecidos pelo trabalhador versado, tais como, por exemplo, fagos, vírus, tais como SV40, CMV, baculovírus e adenovírus, transpósons, elementos de IS, plasmídeos, cosmídeos e DNA linear ou circular. Esses vetores podem ser replicados de maneira autônoma no organismo hospedeiro ou de maneira cromossômica.

[068] Os vetores, de acordo com a invenção, permitem a geração de micro-organismos recombinantes que são transformados, por exemplo, com pelo menos um vetor, de acordo com a invenção, e que podem ser empregados para produzir os mutantes. Os construtos recombinantes descritos acima, de acordo com a invenção, são introduzidos vantajosamente em um organismo hospedeiro adequado e são expressos. É preferencial usar usual métodos de clonagem e de transfecção conhecidos pelo trabalhador versado a fim de ocasionar a expressão dos ácidos nucleicos mencionados acima no sistema de expressão em questão. Os sistemas adequados são descritos, por exemplo, em protocolos atuais em biologia molecular, F. Ausubel et al., Ed., Wiley Interscience, Nova Iorque 1997.

[069] Os organismos hospedeiros adequados são, em princípio, todos os organismos que permitem a expressão dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção, as variantes alélicas, e os equivalentes e derivados funcionais dos mesmos. Os organismos iniciais preferenciais são aqueles que podem sintetizar naturalmente os carotenoides. No entanto, os organismos iniciais podem sintetizar os carotenoides devido ao fato de que a introdução de genes de biossíntese de carotenoide também é adequada. Os organismos iniciais significam organismos procarióticos e eucarióticos, tais como, por exemplo, micro-organismos ou plantas. Os micro-organismos preferenciais são bactérias, leveduras, algas ou fungo.

[070] Portanto, a invenção se refere, adicionalmente, a um processo para preparar os organismos geneticamente modificados descritos abaixo, em que os genes de acetiltransferase, de acordo com a invenção, são introduzidos no genoma do organismo inicial. Organismos iniciais significam os organismos antes da modificação genética, de acordo com a invenção.

[071] Os genes de acetiltransferase de acordo com a invenção, podem ser, em princípio, introduzidos através de todos os métodos conhecidos pelo trabalhador versado nos organismos iniciais descritos abaixo, que são geneticamente modificados através dos mesmos.

[072] Esses genes são introduzidos vantajosamente nos organismos iniciais ou nas células dos mesmos através de transformações, transfecção, conjugação, eletroporação, com o uso da então chamada pistola de partícula, ou por microinjeção.

[073] O trabalhador versado pode constatar métodos apropriados para micro-organismos nos compêndios de Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, by F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, by D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), by Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press.

[074] Os exemplos de métodos vantajosos que podem ser mencionados são aqueles, tais como, a introdução do DNA por recombinação homóloga ou heteróloga, por exemplo, com o uso do gene URA3, especificamente, o gene URA3 de Ashbya, conforme descrito no Pedido no D.E. 19801120.2, e/ou pelo método de REMI (="integração mediada por enzima de restrição ") que é descrito abaixo.

[075] A técnica de REMI se baseia na co-transformação de um construto de DNA linear que foi cortado em ambas as extremidades com a mesma endonuclease de restrição, juntamente com a endonuclease de restrição que foi usada para essa restrição do construto de DNA, em um organismo. A endonuclease de restrição, em seguida, corta o DNA genômico do organismo no qual o construto de DNA foi introduzido com a enzima de restrição. Isso leva a uma ativação dos próprios mecanismos de reparo da célula. Esses mecanismos de reparo reparam as rupturas de filamento no DNA genômico que foram causadas por endonuclease e, durante isso, também incorporam, com uma determinada frequência, o construto de DNA co-transformado ao genoma. Comumente, os sítios de clivagem de restrição são retidos em ambas as extremidades do DNA durante isso.

[076] Essa técnica foi descrita por Bolker et al. {Mol. Gen. Genet. 1995, 248: 547 a 552) para o mutagenesis de inserção de fungo. O método foi usado por Von Schiestl and Petes (Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A., 1991, 88: 7585 a 7589) a fim de constatar que não há recombinação heteróloga em Saccharomyces. O método foi descrito por Brown et al. (Mol. Gen. Genet. 1996, 251: 75 a 80) para a transformação estável e expressão regulada de um gene-repórter passível de indução.

[077] É possível usar o método de REMI para posicionar os fragmentos de ácido nucleico de acordo com a invenção ou os genes de acetiltransferase mencionados acima de acordo com a invenção em sítios ativos por transcrição no genoma.

[078] É possível e vantajoso clonar os ácidos nucleicos junto de pelo menos uma gene-repórter em um construto de DNA, que é introduzido no genoma. Esse gene-repórter deve facilitar a capacidade de detecção através de um ensaio de cultura, fluorescência, quimiluminescência ou bioluminescência ou por uma medição fotométrica. Os exemplos que podem ser mencionados de genes-repórteres são genes com resistência a antibióticos, genes de hidrolase, genes de proteína fluorescente, genes de bioluminescência, genes de glicosidase, o gene de luciferase, gene de [beta]- galactosidase. Esses genes possibilitam medir e quantificar, facilmente, a atividade de transcrição e, assim, a expressão dos genes. Isso significa que é possível identificar sítios no genoma que tem uma produtividade que difere em um fator de até 2.

[079] Caso se pretenda introduzir uma pluralidade de genes, tais como, por exemplo, genes adicionais de biossíntese de carotenoide, no organismo, os mesmos podem ser todos introduzidos juntos com um gene-repórter em um único vetor, ou cada gene individual com um gene-repórter pode ser introduzido em um vetor em cada caso, no organismo, sendo que é possível introduzir os vários vetores ao mesmo tempo, ou sucessivamente. É também possível inserir fragmentos de gene que codificam para as respectivas atividades com o uso das técnicas de REMI.

[080] As enzimas de restrição adequadas, em princípio, para integrar os genes de acetiltransferase ou os construtos de ácido nucleico de acordo com a invenção no genoma de organismos iniciais são bem conhecidas por uma pessoa versada na técnica. As enzimas de restrição que reconhecem apenas pares de 4 bases como sítio de clivagem de restrição são menos preferenciais devido ao fato de que as mesmas cortam muito frequentemente no genoma ou no vetor a ser integrado, e as enzimas preferenciais reconhecem 6, 7, 8 ou mais pares de base como um sítio de clivagem, tais como, BamHI, EcoRI, Bg//II, SphI, SpeI, XbaI, XhoI, NcoI, Sa/I, C/aI, KpnI, HindIII, SacI, PstI, BpnI, NotI, SrfI ou SfiI, como apenas alguns exemplos das possíveis enzimas. Torna-se vantajoso, caso as enzimas usadas não mais têm sítios de clivagem no DNA a ser introduzido; isso aumenta a eficiência de integração. Comumente, 5 a 500 U, preferencialmente 10 a 250, em particular, preferencialmente 10 a 100 U das enzimas são usados na mistura de REMI. As enzimas são empregadas, vantajosamente, em uma solução aquosa que contém substâncias para estabilização osmótica, tal como açucares tais como sacarose, trealose ou glicose, polióis, tais como, glicerol ou polietileno glicol, um tampão com uma tamponamento vantajosa situada na faixa de pH 5 a 9, preferencialmente 6 a 8, em particular preferencialmente 7 a 8, tais como tris, MOPS, HEPES, MES ou PIPES e/ou substâncias para estabilizar os ácidos nucleicos, tais como, sais inorgânicos ou orgânicos de Mg, Cu, Co, Fe, Mn ou Mo. É também possível, quando apropriado, que outras substâncias estejam presentes, tais como EDTA, EDDA, DTT, [beta]-mercapto etanol ou inibidores de nuclease. No entanto, é também possível realizar a técnica de REMI sem essas adições.

[081] O processo é realizado em uma temperatura situada na faixa de 5 a 80°C, preferencialmente a partir de 10 a 60°C, em particular, preferencialmente a partir de 20 a 40°C. Outros métodos conhecidos para desestabilizar membranas de células são adequados para o processo, tal como, por exemplo, eletroporação, fusão com vesículas carregadas ou desestabilização com vários metais alcalinos ou sais de metais alcalino-terrosos, tais como lítio, rubídio ou sais de cálcio, em que os sais de lítio são preferenciais.

[082] A invenção se refere, adicionalmente, a um organismo geneticamente modificado correspondente, sendo que a expressão dos genes de acetiltransferase de acordo com a invenção é aumentada por comparação com um organismo do tipo selvagem no caso em que o organismo inicial contém um gene de acetiltransferase, ou é causada no caso em que o organismo inicial não contém um gene de acetiltransferase, pela modificação genética.

[083] Um organismo modificado geneticamente significa um organismo no qual o (s) gene (s) de acetiltransferase (s) ou o (s) construto (s) de ácido nucleico de acordo com a invenção foram inseridos, preferencialmente através de um dos métodos descritos acima.

[084] O organismo modificado geneticamente contém pelo menos um gene de acetiltransferase de acordo com a invenção ou pelo menos um construto de ácido nucleico de acordo com a invenção. Dependendo do organismo inicial, o ácido nucleico pode estar presente no interior ou no exterior do cromossomo.

[085] O metabolismo de carotenoide no organismo modificado geneticamente é preferencialmente alterado por comparação ao tipo selvagem.

[086] Os organismos preferenciais são bactérias recombinantes, plantas, fungos ou levedura. Em uma modalidade particular, o fungo recombinante é oleaginoso de modo que possa acumular lipídeos a pelo menos cerca de 20% de seu peso em célula seca; e produz pelo menos um carotenoide selecionado do grupo que consiste em anteraxantina, adonirubina, adonixantina, astaxantina, cantaxantina, capsorubrina, β-criptoxantina, a-caroteno, δ- caroteno, ε-caroteno, equinenona, 3-hidroxiequinenona, 3'- hidroxiequinenona, Y-caroteno, ^-carotene, 4-ceto- Y— caroteno, Z—caroteno, ocriptoxantina, β-criptoxantina, deoxiflexixantina, diatoxantina, 7,8-dideidroastaxantina, dideidrolicopeno, fucoxantina, fucoxantinol, isorenierateno, β-isorenierateno, lactucaxantina, luteína, licopeno, mixobactona, neoxantina, neurosporeno, hidroxineurosporeno, peridinina, fitoeno, rodopina, glicosídeo de rodopina, 4-ceto-rubixantina, sifonaxantina, esferoideno, esferoidenona, espiriloxantina, toruleno, 4- ceto-toruleno, 3-hidroxi-4-ceto-toruleno, uriolida, acetato de uriolida, violaxantina, zeaxantina-3-diglicosídeo, zeaxantina, uma carotenoide de C30, e combinações dos mesmos, e pode acumular o carotenoide produzido em pelo menos cerca de 1% de seu peso em célula seca. Ainda mais preferencialmente, o fungo recombinante é um membro de um gênero selecionado a partir do grupo que consiste em: Aspergillus, Blakeslea, Botrytis, Candida, Cercospora, Cryptococcus, Cunninghamella, Fusarium (Gibberella), Kluyveromyces, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Neurospora, Penicillium, Phycomyces, Pichia (Hansenula), Puccinia, Pythium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces, Sclerotium, Trichoderma, Trichosporon, Xanthophyllomyces (Phaffia) e Yarrowia, ou é de uma espécie selecionada a partir do grupo que consiste em: Aspergillus terreus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Blakeslea trispora, Botrytis cinerea, Candida japonica, Candida pulcherrima, Candida revkaufi, Candida tropicalis, Candida utilis, Cercospora nicotianae, Cryptococcus curvatus, Cunninghamella echinulata, Cunninghamella elegans, Fusarium fujikuroi (Gibberella zeae), Kluyveromyces lactis, Lipomyces starkeyi, Lipomyces lipoferus, Mortierella alpina, Mortierella ramanniana, Mortierella isabellina, Mortierella vinacea, Mucor circinelloides, Neurospora crassa, Phycomyces blakesleanus, Pichia pastoris, Puccinia distincta, Pythium irregulare, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula pinicola, Rhodotorula gracilis, Saccharomyces cerevisiae, Sclerotium rolfsii, Trichoderma reesei, Trichosporon cutaneum, Trichosporon pullulans, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) e Yarrowia lipolytica.

[087] Dentre essas cepas oleaginosas, algumas produzem naturalmente carotenoides e algumas não produzem; essas cepas podem ser utilizadas adicionalmente como uma célula hospedeira por introdução de genes de biossíntese de carotenoide, conforme revelado na Patente no U.S. 7 851 199.

[088] Em uma modalidade particular, a bactéria recombinante é gram-negativa ou positiva. Os hospedeiros bacterianos gram-positivos incluem, porém sem limitação, Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Paenibacillus e Streptomyces. As bactérias gram-negativas incluem, porém sem limitação E. coli, Pseudomonas e Paracoccus. O hospedeiro bacteriano recombinante pode ser quaisquer Bacillales incluindo, porém sem limitação, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis. O hospedeiro bacteriano recombinante também pode ser quaisquer Streptomyces incluindo, porém sem limitação, Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus e Streptomyces lividans. O hospedeiro bacteriano recombinante também pode ser quaisquer Paracoccus incluindo, porém sem limitação Paracoccus denitrificans, Paracoccus versutus, Paracoccus carotinifaciens, Paracoccus marcusii e Paracoccus zeaxantinaifaciens.T e a bactéria recombinante produz pelo menos um carotenoide selecionado a partir do grupo que consiste em anteraxantina, adonirubina, adonixantina, astaxantina, cantaxantina, capsorubrina, β-criptoxantina, ocaroteno, δ-caroteno, ε-caroteno, equinenona, 3- hidroxiequinenona, 3'-hidroxiequinenona, Y—caroteno, ^— caroteno, 4—ceto—Y—caroteno, Z—caroteno, ocriptoxantina, deoxiflexixantina, diatoxantina, 7,8-dideidroastaxantina, dideidrolicopeno, fucoxantina, fucoxantinol, isorenierateno, β—isorenierateno, lactucaxantina, luteína, licopeno, mixobactona, neoxantina, neurosporeno, hidroxineurosporeno, peridinina, fitoeno, rodopina, rodopina glicosídio, 4—ceto—rubixantina, sifonaxantina, esferoideno, esferoidenona, espiriloxantina, toruleno, 4— ceto—toruleno, 3—hidroxi—4—ceto—toruleno, uriolida, acetato de uriolida, violaxantina, zeaxantina-3-diglicosídeo, zeaxantina, um carotenoide C30, e combinações dos mesmos.

[089] Em outras modalidades, a presente invenção fornece um método para produzir um carotenoide, sendo que o método compreende as etapas de cultivar um fungo ou uma bactéria sob condições que permitem a produção do carotenoide; e isolar o carotenoide produzido.

[090] A cultivação do organismo modificado geneticamente de acordo com a invenção ocorre de maneira conhecida por si só, tal como a cultivação do tipo selvagem apropriado, por exemplo, no caso de micro-organismos em um meio adequado, tal como, por exemplo, em placas de ágar em uma cultura de suspensão, ou no caso de plantas no solo ou meios com nutrientes apropriadamente adequados. A Colheita significa, no caso de micro-organismos, o isolamento dos micro-organismos e, no caso de plantas, no corte da planta ou, quando apropriado, partes de planta apropriadas que contém os carotenoides. Os carotenoides são isolados de maneira conhecida por si só, por exemplo, através da ruptura das células do organismo, extração dos carotenoides e purificação subsequente dos carotenoides por métodos de separação química ou física, tais como extração ou cromatografia.

[091] Os exemplos a seguir ilustram a invenção.

EXEMPLOS

[092] A tabela 1 abaixo descreve certas cepas de Yarrowia lipolytica usadas na exemplificação a seguir: TABELA 1: FILAMENTOS DE YARROWIA LIPOLYTICA.

[093] As cepas de Yarrowia ML9863 e ML9335 foram construídas pela introdução de genes heterólogos sob o controle de promotores constituintes, acoplados a várias gerações de híbridos, a começar por ML350 e ATCC201249, conforme descrito na Patente no US 7.851.199. O gene GGS e o gene HMG truncado ("HMG-ter") foram derivados de sequências de Yarrowia correspondentes à sintase nativa de pirofosfato de geranilgeranila e a genes de redutase de hidroximetilglutarila-CoA, respectivamente. Os genes carp. e carB foram derivados de Mucor circinelloides e os mesmos codificam uma ciclase de sintase/licopeno de fitoeno bifuncional e uma desidrogenase de fitoeno, respectivamente. O gene crt W foi sintetizado para codificar uma cetolase de caroteno de Parvularcula bermudensis. O gene crtZ foi ampliado a partir de Xanthobacter autotrophicus (Xa) ou sintetizado para codificar a hidroxilase de caroteno de Cronobacter pulveris (conhecida anteriormente como Enterobacter pulveris) (Ep) ou bactéria Enterobacteriaceae DC404 (Dc). Esses genes são, às vezes, mas nem sempre, associados a marcadores auxotróficos (URA3, LEU2, URA2, LYS1, ADE1) ou a uma área loxP, remanescente de um marcador HygR ou NatR. TABELA 2: PLASMÍDEOS.

[094] Toda biologia molecular básica e procedimentos de manipulação de DNA descritos no presente documento são geralmente realizados de acordo com Sambrook et al. ou Ausubel et al. (J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (eds). 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl (eds.). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York).

Exemplo 1a: produção de pmb6532, que codifica s. Cerevisiae acetiltransferase atf1.

[095] O gene ATF1 de Saccharomyces cerevisiae teve o códon otimizado de acordo com o viés de códon Yarrowia, e o fragmento de DNA especificado em SEQ ID No: 9 foi sintetizado de novo. Durante a nova síntese, a sequência 5'-TGCTAGCCACAAAA, que contém uma área de restrição de NheI e uma sequência de Kozak típica para permitir a translação eficiente, foi adicionada imediatamente a montante do ATG. A sequência ACGCGT-3', que compreende uma área de restrição MluI, foi adicionada imediatamente a jusante do códon de parada. Essa sequência foi clivada com o uso de NheI e MluI e ligada pMB6157 cortado com NheI e MluI para produzir pMB6532. A proteína resultante codificada pelo gene Sc-ATF1 de pMB6532 é especificada em SEQ ID No: 5. Esse plasmídeo foi clivado subsequentemente com EcoRV, e o cassete que contém Sc-ATF1 duplicado pela inserção de um fragmento de 2,35 kb de fragmento de Sspl-Pvull do mesmo plasmídeo para criar pMB6563, que codifica transcritos convergentes de Sc- ATF1 flanqueando um marcador HygR. O marcador NatR, que confere resistência à nourseotricina, foi usado para substituir o HygR nesse plasmídeo pela clivagem de pMB6563 com Sspl e BamYW e ligação do mesmo ao fragmento de 1,3 kb de Sspl-BamYll proveniente de pMB6200, para criar pMB6608.

Exemplo 1b: introdução de acetiltransferase atf1 de s. Cerevisiae em uma cepa de yarrowia capaz de produzir zeaxantina

[096] A cepa ML11218 foi transformada com um fragmento PvuW de MB6563 que compreende duas cópias de Sc-ATFI sob o controle de promotores constituintes e um marcador selecionável para resistência a higromicina, HygR. Dez transformantes resistentes a higromicina foram escolhidos a partir da chapa de transformação (YPD + 100 mg/l higromicina) após um período de 3 a 4 dias de crescimento a 30°C. A maioria dos transformadores produzidos entre 14 e 17% de zeaxantina monoacetilada e entre 42 e 57% de zeaxantina diacetilada (como uma porcentagem de zeaxantina total) quando cultivada em YPD por 4 dias a 30°C. A produção livre de zeaxantina estava na faixa de entre 27 e 42% de zeaxantina total. Uma cepa, ML12641, foi escolhida para engenharia adicional.

[097] A cepa ML12641 foi transformada com MB6608 tratado com Xbal, que compreende duas cópias de Sc-ATF1 sob o controle de promotores constituintes e um marcador selecionável para nourseotricina, NatR. Dez transformadores resistentes a nourseotricina foram escolhidos a partir da chapa de transformação (YPD + 100 mg/l de nourseotricina) após ser cultivado por um período de 3 a 4 dias a 30°C. Vários transformadores produzidos entre 9 e 16% de zeaxantina monoacetilada e entre 56 e 80% de zeaxantina diacetilada (como uma porcentagem de zeaxantina total) quando cultivados em YPD por 4 dias a 30°C. A produção livre de zeaxantina está na faixa entre 11 e 28% de zeaxantina total. Uma cepa, ML12735, foi escolhida para análise adicional e para cultura em um fermentador de lote alimentado.

[098] A cepa ML12735 foi cultivada em um fermentador com o uso de um processo alimentado por lote. A produção de zeaxantina total (livre mais esterificada) aumentou em duas vezes em comparação à cepa ML11218, que não carrega nenhuma cópia do gene Sc-ATF1. Adicionalmente, a Figura 1 ilustra que a produção de zeaxantina na cepa ML11218 aumenta nitidamente no começo da fermentação, então, platôs como a produção de zeaxantina cessam. Em contraste, embora a cepa ML12735 tenha um perfil de produção similar no começo do processo de fermentação, a produção de zeaxantina continua a aumentar para além do limite alcançado pelo ML11218 e a fermentação mantém sua produtividade por um período estendido, ao contrário da cepa ML11218.

Exemplo 1c: introdução de acetiltransferase atf1 s. Cerevisiae em um filamento de yarrowia capaz de produzir astaxantina

[099] A cepa ML12526 foi transformada com MB6563 (que contém transcritos convergentes de ATF1 que flanqueia um marcador HygR) que foi tratado com Xba. Cinco transformadores resistentes a higromicina foram escolhidos a partir da chapa de transformação (YPD + 100 mg/l de higromicina) após ser cultivado por um período de 3 a 4 dias de cultura a 30°C. Após o crescimento subsequente por 3 a 4 dias em Frascos de agitação de YPD a 30°C, transformadores produzidos entre 22 e 29% de astaxantina monoacetilada e entre 16 e 56% de astaxantina diacetilada (como uma porcentagem de astaxantina total). A produção livre de astaxantina estava na faixa entre 19 e 59% de astaxantina total. Um filamento, ML12707, foi escolhido para análise posterior e para cultivo em um fermentador de lote alimentado.

[100] A cepa ML12707 foi cultivada em um fermentador com o uso de um processo de lote alimentado. A Figura 2 ilustra que a taxa de produção de astaxantina na cepa ML12707 é mais alta logo no começo da fermentação e alcança uma concentração mais alta no final da execução em comparação à cepa ML12562, que não carrega cópia alguma do gene Sc-ATF1.

Exemplo 2a: produção de pmb6732, pmb6733 e pmb6812, que codifica acetiltransferase atf1 de s. Bayanus e s. Arboricolus, respectivamente

[101] Os plasmídeos foram gerados pela expressão de genes ATF1 provenientes de diferentes espécies Saccharomyces conforme descrito na Tabela 2. Os genes ATF1 de Saccharomyces bayanus (Sb), Saccharomyces kudriavzevii (Sk) e Saccharomyces arboricolus (Sk) tiveram o códon otimizado de acordo com o viés de códon Yarrowia e os fragmentos de DNA especificados em SEQ ID No: 10, 12 e 15, respectivamente, foram sintetizados de novo. Durante a nova síntese dos genes ATF1 diferentes, a sequência 5'- TGCTAGCCACAAAA, que contém uma área de restrição de NheI e uma sequência típica de Kozak para permitir a translação eficiente, foi adicionada imediatamente a montante do ATG. A sequência ACGCGT-3', que compreende uma área de restrição MluI, foi adicionada imediatamente a jusante do códon de parada. As sequências foram clivadas com o uso de NheI e MM e ligadas a pMB6157 cortado com MreI e MM para produzir pMB6732, pMB6733 e pMB6812, respectivamente. As proteínas resultantes codificadas pelos genes ATF1 de pMB6732, pMB6733 e pMB6812 são especificadas nas SEQ ID No: 6, 8 e 14, respectivamente.

Exemplo 2b: produção de pmb6832, que abriga duas cópias de acetiltransferase atf1 de s. Bayanus

[102] O ATF1 de S. bayanus também foi inserido conforme descrito acima em dois outros vetores que sustentam promotores constituintes (pMB6655 e pMB6674), para criar pMB6769 e pMB6771, e os dois cassetes distintos foram combinados, por meio da transferência de um fragmento de PvuII-Ssp proveniente de pMB6769 que suporta um cassete em pMB6771 clivado por EcoRV, que suporta o outro cassete e um marcador resistente a higromicina, para produzir pMB6832.

Exemplo 2c: introdução de genes de acetiltransferase atf1 provenientes de s. Bayanus, s. Kudriavzevii e s. Arboricolus em um filamento de yarrowia com a capacidade de produzir zeaxantina

[103] A cepa ML11218 foi transformada de modo independente com MB6732 (Sb-ATF1), MB6733 (Sk-ATF1) e MB6812 (Sa-ATF1) que foram tratados com XbaI. Dez transformadores resistentes à higromicina de cada plasmídeo foram escolhidos a partir da chapa de transformação (YPD + 100 mg/l de higromicina) após um período de 3 a 4 dias de crescimento a 30°C. Após ser subsequentemente cultivado por um período de 3 a 4 dias em frascos de agitação de YPD a 30°C, os transformadores foram analisados para produção de zeaxantina e comparados à cepa de controle, ML11218. Os transformadores que abrigam o ATF1 de S. bayanus (pMB6732) produziram entre 4 e 16% de zeaxantina monoacetilada e entre 46 e 85% de zeaxantina diacetilada (como uma porcentagem de zeaxantina total). A produção livre de zeaxantina estava na faixa entre 8 e 38% de zeaxantina total. Um transformante que abriga ATF1 de S. kudriavzevii (pMB6733) produziu cerca de 3% de zeaxantina monoacetilada e nenhuma zeaxantina diacetilada (como uma porcentagem de zeaxantina total). Os transformadores que abrigam o ATF1 de S. arboricolus (pMB6812) produzidos entre 20 e 22% de zeaxantina monoacetilada e entre 30 e 45% de zeaxantina diacetilada (como uma porcentagem de zeaxantina total). A produção livre de zeaxantina está na faixa entre 34 e 49% de zeaxantina total.

[104] O ATF1 de S. bayanus foi escolhido para estudos adicionais e para investigar sua capacidade de acetilação em fermentadores. A cepa ML11218 foi transformada com um fragmento PvuW de pMB6832, que abriga duas cópias de ATF1 de S. bayanus. Seis transformadores resistentes à higromicina foram escolhidos a partir da chapa de transformação (YPD + 100 mg/l de higromicina) após um período de 3 a 4 dias de crescimento a 30°C. Após serem subsequentemente cultivados por um período de 3 a 4 dias em frascos de agitação de YPD a 30°C, os transformadores produziram entre 5 e 6% de zeaxantina monoacetilada e entre 83 e 90% de zeaxantina diacetilada (como uma porcentagem de zeaxantina). A produção livre de zeaxantina estava na faixa entre 4 e 14% de zeaxantina total. Um filamento, ML13129, foi escolhido para análise adicional e para cultivo em um fermentador de lote alimentado.

[105] A cepa ML13129 foi cultivada em um fermentador com o uso de um processo alimentado por lote. A produção total (livre mais esterificada) de zeaxantina aumentou 1,8 vezes quando comparada à cepa ML11218, que não carrega cópia alguma do gene Sb-ATF1. Adicionalmente, a Figura 3 ilustra que a produção de zeaxantina em ambos os filamentos tem um perfil de produção similar no começo da fermentação, mas a produção em platôs ML11218 e a produção de zeaxantina cessam. Em contraste, a produção de zeaxantina continua a aumentar na cepa ML13129 após o limite alcançado por ML11218 que se aproxima quase ao dobro de seus níveis.

Exemplo 2d: introdução de genes de acetiltransferase atf1 provenientes de s. Bayanus e s. Kudriavzevii em um filamento de yarrowia com a capaidade de produzir astaxantina

[106] A cepa ML12526 foi transformada de modo independente com MB6732 (Sb-ATF1) e MB6733 (Sk-ATF1) que foi tratado com XbaI. Dez transformadores resistentes à higromicina de cada plasmídeo foram escolhidos a partir da chapa de transformação (YPD + 100 mg/l de higromicina) após serem cultivados por um período de 3 a 4 dias de a 30°C. Após serem cultivados, subsequentemente, por um período de 3 a 4 dias em frascos de agitação de YPD a 30°C, os transformadores foram analisados para a produção de astaxantina e comparados à cepa de controle, ML12526. Os transformadores que abrigam o plasmídeo pMB6732 de Sb-ATF1 produziram entre 16 e 30% de astaxantina monoacetilada e entre 57 e 76% de astaxantina diacetilada (como uma porcentagem de astaxantina total). A produção de astaxantina livre está na faixa entre 8 e 37% de astaxantina total. Os transformadores que abrigam o plasmídeo pMB6733 de Sk-ATF1 produziram entre 9 e 24% de astaxantina monoacetilada e entre 1 e 6% de astaxantina diacetilada (como uma porcentagem de astaxantina total). A produção de astaxantina livre está na faixa entre 70 e 90% de astaxantina total. Um filamento, ML12819, que abriga p plasmídeo pMB6732 de Sb-ATF1, foi escolhido para análise adicional e para cultivo em um fermentador de lote alimentado. A cepa ML12819 foi cultivada em um fermentador com o uso de um processo alimentado por lote. A Figura 4 ilustra que a taxa de produção astaxantina na cepa ML12819 é similar em comparação à cepa ML12562, que não carrega o gene Sb-ATF1, mas alcança uma concentração mais alta no final da execução.

Exemplo 3a: produção de pmb6976, pmb6977, pmb6978 e pmb6979 que codifica atf1 de s. Bayanus e s. Cerevisiae nativos e de códon otimizado

[107] Os genes ATF1 de S. bayanus e S. cerevisiae tiveram o códon otimizado para expressão na cepa de Paracoccus sp. R114/pBBR-K-mev-op-R1 4-P crtE-crtERUA (Patente US 20070202579 A1, US 7232679 B2) com o uso da tabela de uso do códon Paracoccous denitrificans PD1222, e os fragmentos de DNA especificados em SEQ ID No: 16 e SEQ ID No: 17, respectivamente, foram sintetizados de novo. Nenhum gene ATF1 de códon otimizado S. bayanus e S. cerevisiae especificado no SEQ ID No: 2 e SEQ ID No: 18 foi também sintetizado de novo. O gene ATF1 em estado natural de S. cerevisiae contém uma área NdeI que foi removida durante a nova síntese. Durante a nova síntese, a sequência 5'-CAT foi adicionada imediatamente a montante do ATG para criar uma área de restrição de NdeI. A sequência AAGCTT-3', que compreende uma área de restrição de HindIII, foi adicionada imediatamente a jusante do códon de parada. Tanto as versões do ATF1 de S. bayanus e S. cerevisiae com códon otimizado quanto as versões com o códon não otimizado otimizado foram clonadas sob o controle do promotor crtE de Paracoccus com o uso do plasmídeo pRK-P crtE-crtE (derivado do pRK415, Keen, et al., Gene. 1988, 70: 191-197) que foram clivados com NdeI e HindIII para produzir pMB6976 (Sb-ATF1 estado natural), pMB6977 (Sc-ATF1 estado natural), pMB6978 (Sb-ATF1 códon otimizado) e pMB6979 (Sc-ATF1 com códon otimizado).

[108] A proteína resultante codificada pelos genes Sb- ATF1 em pMB6976 e pMB6978 é especificada em SEQ ID No: 6. A proteína resultante codificada pelos genes Sc-ATF1 em pMB6977 e pMB6979 é especificada em SEQ ID No: 5.

[109] A Tabela 3 abaixo descreve os filamentos de E. coli usados na exemplificação a seguir: TABELA 3: FILAMENTOS DE E. COLI.

[110] A Tabela 4 abaixo descreve os filamentos de Paracoccus usados na exemplificação a seguir: TABELA 4: FILAMENTOS DE PARACOCCUS ZEAXANTHINIFACIENS.

Exemplo 3b: introdução de atf1 de s. Bayanus e cerevisiae em um filamento de paracoccus com a capacidade de produzir zeaxantina por meio de conjugação

[111] O plasmídeo pMB6975 (plasmídeo de controle pRK415) e os plasmídeos pMB6976, pMB6977, pMB6978 e pMB6979 que hospedam os diferentes genes ATF1 foram transformados em filamento E. coli S17-1 para produzir filamentos MB7706, MB7007, MB7708, MB7709 e MB7710. A cepa E. coli S17-1 é um hospedeiro de mobilização que contém genes de transferência em seu cromossomo. O vetor pRK415 é usado como a expressão do plasmídeo e hospeda os genes de transferência necessários para mover o mesmo para Paracoccus. Os plasmídeos pMB6975 a pMB6979 foram introduzidos individualmente na cepa Paracoccus sp. R114/pBBR-K-mev-op- R114-PcrfE-cI-fERn4 (RifR) por meio de uma conjugação com filamentos de E. coli MB7706 a MB7710 e seleção em 100 mg/l de rifampicina e 2,5 mg/l de tetraciclina. Os exconjugantes de Paracoccus criados foram chamados R114/pBBR-K-mev-op- R114-PcrfE-crfER114 + pMB7006, R114/pBBR-K-mev-op-R114- PcrtE-crtER 4 + pMB7007, R114/pBBR-K-mev-op-R114- PcrtE-crtER 4 + pMB7008, R114/pBBR-K-mev-op-R114- PcrtE-crtER 4 + pMB7009 e R114/pBBR-K-mev-op-R114- PcrtE-crtER A + pMB7010.

[112] Seis exconjugantes de Paracoccus que alojam os diferentes genes ATF1 e seis exconjugantes que alojam o plasmídeo de controle foram selecionados e cultivados em F- meio (10 g/l de triptona, 10 g/l de extrato de levedura, 30 g/l de NaCl, 10 g/l de D-glucose, 5 g/l de MgSO4-7H2O, pH 7,0) a 28°C a 200 rpm por 24 horas e analisados para a produção de carotenoide. Um milímetro de caldo foi colhido, centrifugado e o pélete celular foi extraído para carotenoides conforme descrito para amostras de Yarrowia lipolytica. Todos os filamentos de Paracoccus que hospedam genes ATF1 S. bayanus e S. cerevisiae otimizados e não otimizados produziram zeaxantina acetilada e criptoxantina β além de zeaxantina livre, criptoxantina β e carotenos. A cepa de controle, R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrfE-crfE R114 + pMB7006, sem ATF1, não produz zeaxantina acetilada ou criptoxantina β acetilada.

[113] Dois exconjugantes típicos de Paracoccus, R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrfE-crfERn4 + pMB7008-11 e R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtERn4 + pMB7010-9, que hospedam o gene ATF1 estado natural e o códon otimizado proveniente de S. cerevisiae, respectivamente, foram escolhidos para análise mais detalhada e comparação à cepa de controle, R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-crtER114 + pMB7006-10. Os filamentos foram cultivados em meio F conforme descrito acima. Quinhentos microlitros de todo caldo foram colhidos e liofilizados por 48 horas. Os carotenoides foram extraídos e analisados conforme descrito para amostras de Yarrowia lipolytics. A Figura 5 mostra que filamentos que hospedam ATF1 produziram cerca de 10% de zeaxantina monoacetilada e cerca de 4% de zeaxantina diacetilada (como uma porcentagem de zeaxantina total). Os filamentos que hospedam ATF1 também produziram 74% e 65% a mais de produto hidroxilado (zeaxantina acetilada e livre, e criptoxantina β) em comparação com a cepa de controle (55% e 43% a mais de zeaxantina total).

Exemplo 4: extração e quantificação de produção de carotenóide por hplc a partir de células de yarrowia lipolvtica e paracoccus

[114] O teste de frasco de centrífuga e a análise carotenoide de filamentos gerados foram realizados de acordo com os métodos descritos anteriormente na patente no US 7.851.199 B2.

[115] Para a quantificação de carotenoides acetilados a partir de Yarrowia e Paracoccus por HPLC e HPLC DAD MS, os seguintes métodos foram usados:

MÉTODO CAROTENÓIDE DE FASE NORMAL

[116] Uma bomba binária Waters 1525 fixada a um amostrador automático Waters 717 foi usado para injetar as amostras. Uma coluna Phenomenex Luna 3μ de sílica (2), de 150 x 4,6 mm com kit de segurança de coluna de guarda de sílica foi usada para refundir os carotenoides. Amostras carotenoides sintéticas, obtidas a partir de CaroteNature (GmbH, Im Budler 8, CH-4419 Lupsingen, Switzerland) ou recebidas a partir de DSM Nutritional Products Ltd., foram usadas como padrões de referência. Compostos acetilados de astaxantina e zeaxantina foram sintetizados com base em experimentos revisados em Kaewkoola e Krisnangkura, Chem Phys Lipids. 2010, 163: 685-688 e Kaewkool, et al., Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2009, 11 1: 474-480. Aproximadamente, 100 mg/l de carotenoide foi dissolvido em acetato de etila e excesso de base tanto de hidróxido de sódio quanto de hidróxido de potássio foi adicionado. Foi permitido que as amostras ficassem ocultas à temperatura ambiente e analisadas periodicamente de 1 a 5 dias. Foram usados, então, componentes acetilados sintetizados como marcadores de tempo de retenção, mas a quantificação é baseada em um composto não acetilado. Todos os outros compostos acetilados, exceto os provenientes de zeaxantina e astaxantina, foram identificados por recursos espectrais de UV apenas. A fase móvel consistiu em 1000 ml de hexano, 30 ml de isopropanol e 0,1 ml de ácido acético para compostos relacionados a astaxantina ou 1000 ml de hexano, 60 ml de isopropanol e 0,1 ml de ácido acético para compostos relacionados a zeaxantina. A taxa de fluxo para cada execução foi de 0,6 ml por minuto. A coluna estava à temperatura ambiente. O volume de injeção foi de 20 μL. O detector foi um detector em matriz de fotodiodo que coleta de 210 a 600 nm.

[117] Um cromatograma típico para compostos relacionados a zeaxantina com o uso desse método é mostrado na Figura 6: 1: carotenos 2: criptoxantina β acetilada 3: zeaxantina diacetilada 4: criptoxantina β 5: zeaxantina monoacetilada 6: zeaxantina

[118] Um cromatograma típico para compostos relacionados a astaxantina com o uso do método acima é mostrado na Figura 7: 1: carotenos 2: adonixantina diacetilada 3: adonixantina monoacetilada 4: astaxantina diacetilada 5: adonirubina 6: astaxantina monoacetilada 7: astaxantina

MÉTODO HPLC DAD MS

[119] Para a determinação de zeaxantina acetilada por HPLC DAD MS, as amostras foram suspensas novamente em solvente de extração a frio extremo (mistura 50/50 v/v de hexano e acetato de etila contendo 0,01 % de butil-hidroxi- tolueno (BHT). Um sistema Alliance 2795 HPLC (Waters) equipado com uma coluna Waters X-Bridge C18 (3,5μl, 2,1 x50 mm) e uma coluna de guarda Thermo Basic 8 (2,1x10 mm) foi usada para refundir os carotenoides a 25°C. Amostras autênticas de cartenóide foram usadas como padrão. A fase móvel e as taxas de fluxo são mostradas abaixo (Solvente A=Acetato de Etila; Solvente B=Água; Solvente C= Metanol; Solvente D= Acetonitrila). O volume de injeção foi de 10 μl. O detector foi um detector em matriz de fotodiodo Waters 996 em conjunto com um espectrômetro de massa Micro Mass Quattro Micro. O espectrômetro de massa foi executado em configurações padrão para monitoramento de íon único em modo de íon positivo. A tensão de cone usada foi de 35V. O tempo de retenção para zeaxantina foi de 1,09 minutos, a absorvência máxima a 450 nm com massa monoisotópica foi de 569,4 em modo de íon positivo. O tempo de retenção da zeaxantina monoacetilada foi de 2,68 minutos, a absorvência máxima a 450 nm com massa monoisotópica de 611,4 em modo de íon positivo. O tempo de retenção da zeaxantina diacetilada foi de 3,08 minutos, a absorvência máxima a 450 nm com massa monoisotópica de 653,4 em modo de íon positivo. O tempo de retenção para outros carotenoides foi de: criptoxantina β, 3,2 minutos, licopeno, 3,6 minutos, y- caroteno, 3,8 minutos e β-caroteno, 3,95 minutos.

Claims (9)

1. Microrganismo transformado, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir de uma cepa de fungo oleaginoso ou bactérias produtoras de zeaxantina, o referido microrganismo tendo a capacidade de produzir carotenoides, em que pelo menos um polipeptídio heterólogo que tem atividade de acetiltransferase é expresso, em que a referida atividade de acetiltransferase é converter uma molécula carotenoide que tem (a) pelo menos um anel de β- ionona e/ou pelo menos um anel de ε-ionona, e (b) pelo menos um grupo hidroxila associado ao anel, para a molécula carotenoide correspondente, parcialmente ou totalmente acetilada, em que o referido polipeptídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em um polipeptídio de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 14.

2. Microrganismo transformado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem uma atividade enzimática para converter zeaxantina, astaxantina, luteína e β-criptoxantina em monoou diacetato de zeaxantina, mono- ou diacetato de astaxantina, mono- ou diacetato de luteína e acetato de β- criptoxantina, respectivamente.

3. Microrganismo transformado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ser para a produção de carotenoides, em que o metabolismo carotenoide é diferente daquele de um estado selvagem.

4. Microrganismo transformado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito microrganismo é uma cepa oleaginosa.

5. Microrganismo transformado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dita cepa oleaginosa é uma cepa de Yarrowia lipolytica.

6. Microrganismo transformado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito microrganismo é uma bactéria.

7. Microrganismo transformado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita cepa bacteriana é uma cepa de Paracoccus zeaxanthinifaciens.

8. Processo para produzir o microrganismo transformado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende introduzir um ácido nucleico ou construto de ácido nucleico que consiste na sequência retratada em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 13 que é ligada de modo funcional a um ou mais sinais de regulação.

9. Uso de um microrganismo transformado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a produção de carotenoides acetilados.

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