BR112020005744A2 - produção de ésteres retinílicos - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere à produção de ésteres retinílicos, como, em particular, acetato de retinila, um importante componente para produção de vitamina A. Os ésteres retinílicos podem ser gerados através de conversão enzimática de retinol cujo processo inclui o uso de enzimas com atividade de acetiltransferase (ATF), acetilando, assim, o retinol em retinol/acetato de retinila. O dito processo é particularmente útil para produção biotecnológica da vitamina A.

Description

“PRODUÇÃO DE ÉSTERES RETINÍLICOS”

[0001] A presente invenção se refere à produção de ésteres retinílicos, como, em particular, acetato de retinila, um importante componente para produção de vitamina A. Os ésteres retinílicos podem ser gerados através de conversão enzimática de retinol cujo processo inclui o uso de enzimas com atividade de acetiltransferase (ATF), acetilando, assim, o retinol em retinol/acetato de retinila. O dito processo é particularmente útil para produção biotecnológica da vitamina A.

[0002] Os ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, são importantes intermediários ou precursores para produção de retinoides, particularmente, como vitamina A. Os retinoides, incluindo vitamina A, são um dos fatores nutricionais muito importantes e indispensáveis para oS seres humanos que devem ser supridos através de dieta. Os retinoides promovem o bem-estar dos seres humanos, entre outros, em relação à visão, ao sistema imunológico e ao crescimento.

[0003] Os métodos de produção química atuais para retinoides, particularmente, vitamina A e precursores da mesma, têm algumas características indesejáveis, como, por exemplo, consumo de alta energia, etapas de purificação complicadas e/ou subprodutos indesejáveis. Portanto, nas últimas décadas, outras abordagens para fabricar retinoides, particularmente vitamina A e precursores da mesma, foram investigados, incluindo etapas de conversão microbiana, que seriam mais econômicas assim como ecológicas.

[0004] Em geral, os sistemas biológicos que produzem retinoides são intratáveis e/ou produzem os compostos em níveis muito baixos que seu isolamento em escala industrial não é praticável em relação ao interesse econômico. Há várias razões para isso, incluindo instabilidade dos retinoides em tais sistemas biológicos ou na produção relativamente alta de subprodutos.

[0005] A acetilação de carotenoides, como, por exemplo, astaxantina, pela ação de Atfl a partir de Saccharomyces bayanus foi relatada previamente (documento WO2014096992) Entretanto, essas enzimas têm usualmente especificidade de substrato muito estreita, na medida em que o grupo hidróxi acetilado em astaxantina está localizado na estrutura de anel beta-ionona, enquanto o grupo hidróxi acetilado em retinol está na extremidade alifática da molécula e não no anel de beta-ionona. Portanto, essas funções hidróxi acetiladas estão, cada uma, em um contexto estrutural local muito diferente, e, assim, as enzimas de ATF diferentes com alterações estruturais leves no seu local ativo pode ter afinidades muito diferentes para esses grupos hidróxi em retinoides versus carotenoides. Assim, a partir da atividade de SbLbATFl em carotenoides como revelado previamente, O elemento versado não pode prever como a ação seria em retinoides.

[0006] Assim, é uma tarefa em andamento buscar por rotas alternativas (biotecnológicas) incluindo o uso de enzimas que têm especificidade de produto aprimorada e/ou produtividade para a conversão de betacaroteno em componentes de retinoide para produção de vitamina A. Particularmente, é desejável otimizar a produtividade de enzimas envolvidas na conversão de retinol para ésteres retinílicos, como, por exemplo, acetato de retinila.

[0007] Surpreendentemente, pode-se identificar atualmente as acetil transferases (ATFs) específicas que têm capacidade de converter retinol, de preferência, trans- retinol, em éster retinílico, particularmente, acetato de retinila, com uma conversão total de pelo menos cerca de 10 % para geração de ésteres retinílicos, por exemplo, acetato de retinila.

[0008] Em particular, a presente invenção é direcionada às enzimas acetiladoras [EC 2.3.1.84], particularmente, Atfl, que são expressas em uma célula hospedeira adequada, como uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, com a atividade de acetilar retinol em ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, com uma conversão total para produção de acetato de retinila de pelo menos cerca de 10 %, de preferência, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 90 ou mesmo 100 % com base na quantidade total de retinoides com a mistura de retinol produzida pela dita célula hospedeira, isto é, uma quantidade de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, de pelo menos 10% em comparação à uma quantidade de retinol presente na dita mistura de retinol produzida pela célula hospedeira. As enzimas Atfl como definido no presente documento são particularmente úteis para acetilação de trans-retinol ou de uma mistura de retinol compreendendo retinol cis e trans com uma porcentagem de pelo menos 65 % de trans-retinol, resultando na formação de trans-ésteres retinílicos.

[0009] os termos “acetil transferase”, “enzima acetiladora de retinol”, “atividade de acetilação de retinol que tem enzima” ou “ATF” são usados de modo intercambiável no presente documento se referem às enzimas [EC 2.3.1.84] que têm capacidade de catalisar a conversão de retinol em acetato de retinila com uma quantidade de pelo menos 80 %, cerca de 87, 90, 92, 95, 97, 99 ou até 100 % de acetato de retinila produzido na trans-isoforma. As ditas ATFs têm capacidade de converter retinol, de preferência, trans- retinol, em éster retinílico, particularmente, acetato de retinila, com uma conversão total de pelo menos cerca de %, de preferência, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 90 ou mesmo 100 % (com base na quantidade total de retinoides contida na mistura de retinol produzida pela dita célula hospedeira) para geração de ésteres retinílicos, por exemplo, acetato de retinila. Uma isoforma preferencial é ATF1l.

[0010] Os termos “conversão”, "conversão enzimática", "acetilação" ou “acetilação enzimática” em conjunto com a catálise enzimática de retinol são usados de modo intercambiável no presente documento se referem à ação de ATF, em particular, enzima de Atfl como definido no presente documento.

[0011] Como usado no presente documento, o termo "célula hospedeira fúngica" inclui particularmente levedura como célula hospedeira, como, por exemplo, Yarrowia ou Saccharomyces.

[0012] A enzima de ATF pode ser usada em uma forma isolada (por exemplo, em um sistema livre de célula) ou pode ser expressa em uma célula hospedeira adequada, como, por exemplo, uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica. As enzimas podem ser expressas como enzimas endógenas Ou como enzimas heterólogas. De preferência, as enzimas como descrito no presente documento são introduzidas e expressas como enzimas heterólogas em uma célula hospedeira adequada, como, por exemplo, uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica.

[0013] As ATFsS adequadas, particularmente, enzimas de Atfl, de acordo com a presente invenção podem ser obtidas a partir de qualquer fonte, como, por exemplo, plantas, animais, incluindo seres humanos, algas, fungos, incluindo levedura, ou bactérias. As ATFSs particularmente úteis, de preferência, enzimas de ATFl, são obtidas a partir de levedura, em particular, Saccharomyces ou Lachancea, de preferência, obtidas a partir de Saccharomyces bayanus, como, por exemplo, SbATF1 (sequência de polipeptídeos derivada de AHX23958.1), Lachancea mirantina (LMATF1; SEQ ID NO:33), ou Lachancea fermentati, como LIATF1 (sequência de polipeptídeos derivada de SCW02964.1) ou LIFfATF1 (sequência de polipeptídeos derivada de LT598487). Adicionalmente, as enzimas de ATF1l particularmente úteis são obtidas a partir de plantas, incluindo, mas não se limita às plantas selecionadas a partir de Petunia, Euonymus, Malus ou Fragaria, de preferência, obtidas a partir de P. hybrida, como, PhATF (sequência de polipeptídeos derivada de ABG75942.1), E. alatus, como EaCAcT (sequência de polipeptídeos derivada de ADF57327.1), M. domestica (sequência de polipeptídeos derivada de AY517491) ou FPF. ananassa (sequência de polipeptídeos derivada de AEM43830.1). Adicionalmente, as enzimas de ATF1 particularmente úteis são obtidas a partir de Escherichia, de preferência, E. coli, como, por exemplo, ECCAT (sequência de polipeptídeos derivada de

EDSO5563.1).

[0014] Em uma modalidade, os polipeptídeos que têm atividade de ATF, particularmente, atividade enzimática de Atfl, como definido no presente documento, isto é, atividade aumentada para a formação de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, através de acetilação de retinol, são obteníveis a partir de plantas, como, Petunia hybrida (PhATF), em particular, selecionados a partir de polipeptídeos com pelo menos cerca de 60 %, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade com a sequência de polipeptídeos derivada de ABG75942.1, por exemplo, polipeptídeos com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 70, 75, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99% ou até 100 % de identidade com um polipeptídeo de acordo com SEQ ID NO:11.

[0015] Em uma modalidade, os polipeptídeos que têm atividade de ATF, particularmente, atividade enzimática de Atfl, como definido no presente documento, isto é, atividade aumentada para a formação de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, através de acetilação de retinol, são obteníveis a partir de plantas, como, Euonymus alatus (EaCAcT), em particular, selecionados a partir de polipeptídeos com pelo menos cerca de 60 %, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99% ou até 100 % de identidade com uma sequência de polipeptídeos derivada de ADF57327.1, as ditas sequências sendo expressas em uma célula hospedeira produtora de carotenoide adequada e sob condições adequadas como descrito no presente documento, por exemplo, polipeptídeos com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99% ou até 100 % de identidade com um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:7.

[0016] Em uma modalidade adicional, os polipeptídeos que têm atividade de ATF, particularmente, atividade enzimática de Atfl, como definido no presente documento, isto é, atividade aumentada para a formação de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, através de acetilação de retinol, são obteníveis a partir de bactérias, como E. coli (ECCAT), em particular, selecionados a partir de polipeptídeos com pelo menos cerca de 60 %, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade com a sequência de polipeptídeos derivada de EDSO5563.1, por exemplo, polipeptídeos com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade com um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:5.

[0017] Em uma modalidade, os polipeptídeos que têm atividade de ATF, particularmente, atividade enzimática de Atfl, como definido no presente documento, isto é, atividade aumentada para a formação de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, através de acetilação de retinol, são obteníveis a partir de levedura, como, Saccharomyces bayanus (SLATF1l1), em particular, selecionados a partir de polipeptídeos com pelo menos cerca de 60 %, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:1.

[0018] Em uma outra modalidade, os polipeptídeos que têm atividade de ATF, particularmente, atividade enzimática de Atfl, como definido no presente documento, isto é, atividade aumentada para a formação de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, através de acetilação de retinol, são obteníveis a partir de levedura, como Lachancea mirantina (LMATF1), em particular, selecionados a partir de polipeptídeos com pelo menos cerca de 60 %, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:13.

[0019] Ainda em uma outra modalidade, os polipeptídeos que têm atividade de ATF, particularmente, atividade enzimática de Atfl, como definido no presente documento, isto é, atividade aumentada para a formação de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, através de acetilação de retinol, são obteníveis a partir de levedura, como Lachancea fermentati, em particular, selecionados a partir de polipeptídeos com pelo menos cerca de 60 %, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade com a sequência de polipeptídeos derivada de LT598487 ou SCW02964.1, por exemplo, polipeptídeos com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 %& ou até 100% de identidade com um polipeptídeo codificado pela SEQ ID NO:16 ou 18.

[0020] A célula hospedeira como descrito no presente documento tem capacidade de conversão de retinol em ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, com uma porcentagem de pelo menos cerca de 10 %, de preferência, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 90 ou mesmo 100 % para produção de ésteres retinílicos. De preferência, tal conversão total é obtida a partir de uma mistura de retinol compreendendo retinol cis e trans, com uma porcentagem de pelo menos cerca de 65 % como trans-retinol, como, por exemplo, pelo menos cerca de 68, 70, 75, 80, 85, 87, 90, 92, 95, 98, 99 ou até 100 % de retinol na trans-isoforma, como, por exemplo, cerca de 65 a 90 % na trans-isoforma, que é produzida na célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, uma célula hospedeira fúngica.

[0021] De preferência, a célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que produz quantidade muito alta de trans-retinol como descrito no presente documento é a mesma que a célula hospedeira que converte o retinol resultante em ésteres retinílicos, por exemplo, acetato de retinila, com uma conversão total de pelo menos cerca de 10% para ésteres retinílicos. De preferência, a mistura de retinol a ser convertida em ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, pela ação da ATF, particularmente, Atfl, como definido no presente documento compreende pelo menos 65 % de trans-retinol, como, por exemplo, cerce de 65 a 90 % na trans-isoforma, resultando em uma porcentagem de pelo menos 65 % de ésteres retinílicos trans na mistura de éster retinílico.

[0022] Assim, em uma modalidade, a invenção é direcionada para uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende uma mistura de retinol cis e trans com uma porcentagem de pelo menos 65 % de trans-retinol na mistura de retinol, a dita mistura de retinol sendo convertida por ATFs específicas, particularmente, Atfl, como definido no presente documento catalisando a conversão de retinol, de preferência, trans- retinol, em ésteres retinílicos, por exemplo, acetato de retinila, com uma taxa de conversão de pelo menos 10 % para ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, que terão uma porcentagem de pelo menos 65 % de ésteres retinílicos trans, por exemplo, acetato de trans-retinila.

[0023] As modificações a fim de ter a célula hospedeira como definido no presente documento produzem mais cópias de genes e/ou proteínas, como, por exemplo, ATFs com seletividade para formação de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, de preferência, com pelo menos 65 % dos ésteres estando na trans-isoforma, podem incluir o uso de promotores fortes, melhoradores de transcrição e/ou tradução, ou a introdução de uma ou mais cópias de gene na célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente. célula hospedeira fúngica, levando ao acúmulo aumentado das respectivas enzimas em um determinado tempo. O elemento versado sabe quais técnicas usar dependendo da célula hospedeira. O aumento ou redução de expressão de gene pode ser medido por vários métodos, como, por exemplo, tecnologia Northern, Southern ou Western blot como conhecido na técnica.

[0024] A geração de uma mutação em ácidos nucleicos ou aminoácidos, isto é, mutagênese, pode ser realizada de formas diferentes, como, por exemplo, por mutagênese aleatória ou lateral, danos físicos provocados por agentes, como, por exemplo, radiação, tratamento químico ou inserção de elemento genético. O elemento versado sabe como introduzir mutações.

[0025] Assim, a presente invenção é direcionada a uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como descrito no presente documento compreendendo um vetor de expressão de ou um polinucleotídeo que codifica ATFs, particularmente enzimas de Atfl, como descrito no presente documento que foi integrado no DNA cromossomal do hospedeiro. Tal célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende um polinucleotídeo heterólogo em um vetor de expressão ou integrado no DNA cromossômico que codifica ATFs, particularmente, enzimas de Atfl, como descrito no presente documento é denominada de célula hospedeira recombinante. A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, pode conter uma ou mais cópias de um gene que codifica as ATFs, particularmente, enzimas de Atfl, como definido no presente documento, como, por exemplo, polinucleotídeos que codifica polipeptídeos com pelo menos cerca de 60 % de identidade com a SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18, levando à superexpressão de tais genes que codificam as ATFs, particularmente, enzimas de Atfl, como definido no presente documento. O aumento de expressão de gene pode ser medido por vários métodos, como, por exemplo, tecnologia Northern, Southern ou Western blot como conhecido na técnica.

[0026] Com base nas sequências como revelado no presente documento e na preferência por acetilação de retinol (de preferência na trans-isoforma) em ésteres retinílicos (de preferência na trans-isoforma), particularmente, acetato de retinila, com uma conversão total de pelo menos cerca de 10 % obtida como ésteres retinílicos, por exemplo, acetato de retinila, pode-se deduzir ainda facilmente genes que codificam polipeptídeos que têm atividade de acetilação de retinol como definido no presente documento que poderiam ser usados para a conversão de retinol em ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila. Assim, a presente invenção é direcionada a um método para identificação de enzimas acetiladoras inovadoras, em que um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90,

92, 95, 97, 98, 99% ou até 100 % de identidade com as sequências conhecidas, como SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18, é usado como uma sonda em um processo de triagem para novas enzimas de AFT, particularmente, enzimas de eAtfl, com preferência por produção de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, a partir da conversão de retinol, em que o retinol compreende, de preferência, pelo menos cerca de 65 % de retinol como trans-retinol. Qualquer polipeptídeo que tem atividade de ATF, como, particularmente, Atfl, e revelado no presente documento pode ser usado para produção de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinilas a partir de retinol como descrito no presente documento, desde que a ação de acetilação resulte em pelo menos cerca de 10 % de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, com base na quantidade total de retinoides produzida.

[0027] A presente invenção é direcionada particularmente para o uso de tais ATFs inovadoras, particularmente, enzimas de Atfl, em um processo para produção de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, em que a produção de retinol LC-acila é reduzida. O processo pode ser realizado com uma célula hospedeira produtora de carotenoide adequada, particularmente, célula hospedeira fúngica, que expressa a dita ATF, particularmente, enzima de Atfl, de preferência, em que os genes que codificam as ditas enzimas são heterólogas expressadas, isto é, introduzidas nas ditas células hospedeiras. Os ésteres retinílicos, em particular, acetato de retinila, podem ser convertidos adicionalmente em vitamina A pela ação de mecanismos químicos e biotecnológicos adequados (conhecidos).

[0028] Assim, a presente invenção é direcionada para um processo para produção de uma mistura de éster retinílico compreendendo acetato de retinila, de preferência, com uma porcentagem de pelo menos 65 % de um acetato de trans- retinila, através de atividade enzimática de uma das enzimas de Atfl como definido no presente documento, compreendendo contato de retinol, de preferência, trans-retinol ou uma mistura de retinol com pelo menos 65-90 % na trans-isoforma, com a dita enzima de Atfl. Particularmente, a invenção é direcionada para um processo para produção de vitamina A, O dito processo compreendendo (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica uma das enzimas de Atfl como definido no presente documento em uma célula hospedeira produtora de carotenoide adequada, particularmente, célula hospedeira fúngica, como definido no presente documento, (b) converter enzimaticamente, isto é, acetilação, de retinol, de preferência, com uma porcentagem de pelo menos 65-90 % de trans-retinol, através da ação da dita Atfl expressada em uma mistura de acetato de trans- e cis-retinila, e (3) converter o dito acetato de retinila em vitamina A sob condições adequadas conhecidas pelo elemento versado.

[0029] Os termos “identidade de sequência", "% de identidade" são usados de modo intercambiável no presente documento. Para o propósito dessa invenção, é definido aqui que, a fim de determinar a porcentagem de identidade de sequência de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácido nucleico, as sequências são alinhadas com propósitos de comparação ideal. De modo a otimizar o alinhamento entre as duas sequências, podem ser introduzidas lacunas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Esse alinhamento pode ser realizado ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser executado em um comprimento mais curto, por exemplo, em cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/bases Ou aminoácidos. A identidade de sequência é o percentual de correspondências idênticas entre as duas sequências sobre a região alinhada relatada. A identidade de sequência em porcentagem entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada com o uso do algoritmo Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) JJ. Mol. Biol. 48, 443-453). Ambas as sequências de aminoácidos e sequências nucleotídicas podem ser alinhadas pelo algoritmo. O algoritmo de Needleman-Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para o propósito da presente invenção, foi usado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, Longden and Bleasby, Trends in Genetics 16, (6) pp 276277, http://emboss.bioinformatics.nl/). É usado EBLOSUM62 para as sequências de proteínas para a matriz de substituição. Para a sequência de nucleotídeos, é usado EDNAFULL. Os parâmetros opcionais usados são uma penalidade de abertura de lacunas de 10 e penalidade de extensão de lacuna de 0,5. A pessoa versada observará que todos esses parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a identidade de porcentagem geral de duas sequências não é significativamente alterada ao usar diferentes algoritmos.

[0030] Após o alinhamento pelo programa NEEDLE como descrito acima, a porcentagem de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência da invenção é calculada como a seguir: número de posições correspondentes no alinhamento que mostra um aminoácido idêntico ou um nucleotídeo idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após a subtração do número total de vãos no alinhamento. A identidade como definido no presente documento pode ser obtida a partir de NEEDLE através do uso da opção NOBRIEF e é etiquetada na saída do programa como "identidade mais longa". Se ambas as sequências de aminoácidos que são comparadas não diferirem em que qualquer um dos seus aminoácidos, as mesmas são idênticas ou têm 100 % de identidade. Em relação às enzimas originadas a partir de plantas como definido no presente documento, o elemento versado está ciente do fato de que as enzimas derivadas de planta podem conter um sinal de direcionamento de cloroplasto deve ser clivado através de enzimas específicas, como, por exemplo, enzimas de processamento de cloroplasto (CPEs).

[0031] As ATFs, particularmente, enzimas de Atfl, como definido no presente documento abrangem também enzimas que carregam substituição (ou substituições) de aminoácido que não altera a atividade enzimática, isto é, que mostra as mesmas propriedades em relação à enzima do tipo selvagem e catalisa a conversão de retinol em ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, em que pelo menos cerca de 10 % de retinol, como, por exemplo, uma mistura de retinol compreendendo pelo menos 65 % de trans-retinol, é convertido em ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila. Tais mutações são denominadas também “mutações silenciosas”, que não alteram a atividade (enzimática) das enzimas como descrito no presente documento.

[0032] Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção pode compreender apenas uma porção ou um fragmento da sequência de ácido nucleico que codifica polipeptídeos como definido no presente documento, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento que codifica uma porção de ATF, particularmente, ATF1, como definido no presente documento. A sequência de nucleotídeos determinada a partir da clonagem do gene de ATF, particularmente, gene de ATFl, permite a geração de sondas e iniciadores projetados para uso na identificação e/ou clonagem de outros homólogos a partir de outras espécies. A sonda/iniciador compreende tipicamente oligonucleotídeos substancialmente purificados que compreendem tipicamente uma região de sequência de nucleotídeos que hibridiza, de preferência, sob condições altamente rigorosas para pelo menos cerca de 12 ou 15, de preferência, cerca de 18 ou 20, com mais preferência, cerca de 22 ou 25, ainda com mais preferência, cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 75 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência de nucleotídeos como revelado no presente documento, ou fragmentos ou derivados dos mesmos.

[0033] Um exemplo não limitante preferencial de tais condições de hibridização em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 ºC, seguida por uma ou mais lavagens em lx SSC, 0,1 % de SDS a 50 ºC, de preferência, a 55 ºC, com mais preferência, a 60 ºC em ainda com mais preferência, a 65 “ºC.

[0034] As condições altamente rigorosas incluem, por exemplo, incubação de 2 h a 4 dias a 42 ºC com o uso de uma sonda de DNA etiquetada com digoxigenina (DIG) (preparada através do uso de um sistema de etiquetagem de DIG; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemanha) em uma solução, como solução DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) com ou sem 100 ug/ml de DNA de esperma de salmão, ou uma solução que compreende 50 % de formamida, 5x SSC (NaCl a 150 mM, citrato de trissódio a 15 mM), 0,02 % de dodecil sulfato de sódio, 0,1 % de N-lauroilsarcosina, e 2 % de reagente de bloqueio (Roche Diagnostics GmbH), seguido por lavagem dos filtros duas vezes por 5 a 15 minutos em 2x SSC e 0,1 % de SDS à temperatura ambiente e, então, lavagem de duas vezes por 15- minutos em 0,5x SSC e 0,1 % de SDS ou 0,1x de SSC e 0,1 % de SDS a 65-68 “ºC.

[0035] A expressão das enzimas/polinucleotídeos que codificam uma das ATFs específicas, particularmente, enzimas de Atfl, como definido no presente documento pode ser alcançada em qualquer sistema hospedeiro, incluindo (micro) organismos, que é adequado para produção de carotenoide/retinoides e que permite a expressão dos ácidos nucleicos que codificam uma das enzimas como revelado no presente documento, incluindo equivalentes funcionais Ou derivados como descrito no presente documento. Exemplos de (micro) organismos hospedeiros produtores de carotenoide/retinoide são bactérias, algas, fungos, incluindo leveduras, células vegetais ou animais. As bactérias preferenciais são essas dos gêneros Escherichia como, por exemplo, Escherichia coli, Streptomyces, Pantoea (Erwinia), Bacillus, Flavobacterium, Synechococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Mixococcus, Brevibacterium, Bradyrhizobium, Gordonia, Dietzia, Muricauda,

Sphingomonas, Synochocystis, Paracoccus, como, por exemplo, Paracoccus zeaxanthinifaciens. os microrganismos eucarióticos, em particular, fungos que incluem levedura, são selecionados a partir de Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, como Aspergillus niger, Pichia, como Pichia pastoris, Hansenula, como Hansenula polymorpha, Phycomyces, como Phycomyces blakesleanus, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia, Blakeslea, como, por exemplo, Blakeslea trispora ou Yarrowia, como Yarrowia lipolytica. É particularmente preferencial a expressão em uma célula hospedeira fúngica, como, por exemplo, Yarrowia OU Saccharomyces, ou a expressão em Escherichia, com mais preferência, a expressão em Yarrowia lipolytica ou Saccharomyces cerevisiae.

[0036] Dependendo da célula hospedeira, o polinucleotídeos como definido no presente documento para acetilação de retinol pode ser otimizado para expressão na respectiva célula hospedeira. O elemento versado sabe como gerar tais polinucleotídeos modificados. Entende-se que os polinucleotídeos como definido no presente documento abrange também tais moléculas de ácido nucleico otimizadas por hospedeiro desde que os mesmos expressem o polipeptídeo com as respectivas atividades como definido no presente documento.

[0037] Assim, em uma modalidade, a presente invenção é direcionada para uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende polinucleotídeos que codificam ATFs, em particular, enzimas de Atfl, como definido no presente documento que são otimizados para expressão na dita célula hospedeira, sem nenhum impacto no crescimento de padrão de expressão da célula hospedeira ou das enzimas. Particularmente, uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, é selecionada a partir de levedura, por exemplo, Yarrowia ou Saccharomyces, como, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae ou Yarrowia lipolytica, em que os polinucleotídeos que codificam as ATFs, particularmente, enzimas de Atfl, como definido no presente documento são selecionados a partir de polinucleotídeos com pelo menos 60 %, como por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade com a SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 17 ou 19.

[0038] Em relação à presente invenção, entende-se que os organismos, como, por exemplo, microrganismos, fungos, algas ou plantas, incluem também sinônimos ou basônimos de tais espécies que têm as mesmas propriedades fisiológicas, como definido pelo Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas ou pelo Código Internacional de Nomenclatura para algas, fungos e plantas (Código de Melbourne). Assim, por exemplo, a cepa Lachancea mirantina é um sinônimo de cepa Zygosaccharomyces sp. IFO 11066, originada no Japão.

[0039] A presente invenção é direcionada para um processo para produção de ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, a serem usados como, por exemplo, componentes na produção de vitamina A, em que os ésteres retinílicos são gerados através de acetilação de retinol (compreendendo particularmente pelo menos 65 % de ésteres retinílicos na trans-isoforma obtido a partir de conversão de retinol compreendendo pelo menos 65 % como trans-retinol)

como revelado no presente documento pela ação de ATF, particularmente, enzimas de Atfl, como descrito no presente documento, em que as enzimas acetiladoras, de preferência, heterólogas em uma célula hospedeira adequada sob condições adequadas como descrito no presente documento. Os ésteres retinílicos produzidos, particularmente, acetato de retinila, podem ser isolados e, purificados ainda opcionalmente a partir do meio e/ou célula hospedeira. Os ditos ésteres acetilados definidos no presente documento podem ser usados como componentes em um processo de múltiplas etapas que levam à vitamina A. A vitamina A pode ser isolada e purificada ainda opcionalmente a partir do meio e/ou célula hospedeira como conhecido na técnica.

[0040] De preferência, a acetilação de retinol através do uso de ATFs, particularmente, enzimas de Atfl, como descrito no presente documento, leva a um aumento de pelo menos cerca de 10 %, como, por exemplo, 12, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 90 ou mesmo 100 % de retinoides acetilados, isto é, ésteres retinílicos, presentes na mistura de retinol produzida pela célula hospedeira. É preferencial a acetilação de trans- retinol em ésteres retinílicos trans pela ação das enzimas de Atfl como definido no presente documento.

[0041] A célula hospedeira, isto é, microrganismo, algas, fungos, célula animal ou vegetal, que tem capacidade de expressar os genes produtores de betacaroteno, os genes de ATF, particularmente, genes de ATFl, como definido no presente documento, opcionalmente, os genes que codificam enzimas de oxigenação de betacaroteno, opcionalmente, os genes que codificam enzimas redutoras de retinal e/ou genes adicionais para biossíntese de vitamina A, pode ser cultivada em um meio aquoso suplementado com nutrientes apropriados sob condições aeróbicas ou anaeróbicas e como conhecido pelo elemento versado para a respectiva célula hospedeira produtora de carotenoide. Opcionalmente, tal cultivo ocorre na presença de proteínas e/ou cofatores envolvidos na transferência de elétrons como conhecido na técnica. O cultivo/crescimento da célula hospedeira pode ser conduzido na batelada, batelada alimentada, modo semicontínuo ou contínuo. Dependendo da célula hospedeira, de preferência, a produção de retinoides como, por exemplo, vitamina A e precursores da mesma como retinal, retinol, ésteres retinílicos, pode variar, como é conhecido pelo elemento versado. O cultivo e o isolamento de betacaroteno e célula hospedeira produtora de retinoides selecionada a partir de Yarrowia e Saccharomyces são descritos, por exemplo, no documento WO2008042338. Em relação à produção de betacaroteno e retinoides nas células hospedeiras selecionadas a partir de E. coli, os métodos são descritos, por exemplo, no documento US20070166782.

[0042] Como usado no presente documento, o termo "atividade específica" ou "atividade" em relação às enzimas significa sua atividade catalítica, isto é, sua habilidade de catalisar a formação de um produto a partir de um determinado substrato. A atividade específica define a quantidade de substrato consumida e/ou produto produzido em um determinado período de tempo e por quantidade definida de proteina em uma temperatura definida. Tipicamente, a atividade específica é expressa em umol de substrato consumido ou em produto formado por min por mg de proteína. Tipicamente, umol/min é abreviado por U (= unidade) . Portanto,

as definições de unidade para atividade específica de umol/min/(mg de proteína) ou U/(mg de proteína) são usadas de modo intercambiável ao longo desse documento. Uma enzima é ativa, se realizar sua atividade catalítica in vivo, isto é, na célula hospedeira como definido no presente documento ou em um sistema adequado (livre de célula) na presença de um substrato adequado. O elemento versado sabe como medir atividade enzimática, os métodos analíticos para avaliar a capacidade de uma ATF adequada, particularmente, Atfl, como definido no presente documento para produção de éster retinílico, particularmente, produção de acetato de retinila, a partir de conversão de retinol são conhecidos na técnica, como, por exemplo, descrito no Exemplo 4 do documento WO2014096992. Em suma, as titulações de produtos como ésteres retinílicos, particularmente, acetato de retinila, retinol, trans-retinal, cis-retinal, betacaroteno e similares podem ser medidas por HPLC.

[0043] Como usado no presente documento, uma "célula hospedeira produtora de carotenoide" é uma célula hospedeira, em que os respectivos polipeptídeos são expressos e ativos in vivo que levam à produção de carotenoides, por exemplo, betacaroteno. Os genes e métodos para gerar célula hospedeira produtora de carotenoide são conhecidos na técnica, consulte, por exemplo, o documento WO2006102342. Dependendo do carotenoide a ser produzido, genes diferentes podem ser envolvidos.

[0044] Como usado no presente documento, uma "célula hospedeira produtora de retinoide" é uma célula hospedeira, em que os respectivos polipeptídeos são expressos e ativos in vivo, levando à produção de retinoides, por exemplo,

vitamina A e seus precursores, através de conversão enzimática de betacaroteno através de retinal, retinol e ésteres retinílicos. Esses polipeptídeos incluem as ATFs como definido no presente documento. Os genes da trajetória de vitamina A e métodos para gerar célula hospedeira produtora de retinoides são conhecidos na técnica.

[0045] Os retinoides como usado no presente documento incluem produtos de clivagem de betacaroteno conhecidos também como apocarotenoides, incluindo, mas não se limita ao retinal, ácido retinólico, retinol, metóxido retinoico, acetato de retinila, ésteres de retinila, 4-ceto-retinoides, 3 hidroxi-retinoides ou combinações dos mesmos. Os ésteres retinílicos de cadeia longa como usado no presente documento definem ésteres de hidrocarboneto que consiste em pelo menos cerca de 8, como, por exemplo, 9, 10, 12, 13, 15 ou 20 átomos de carbono e ou até cerca de 26, como, por exemplo, 25, 22, 21 ou menos átomos de carbono, de preferência, com até cerca de 6 ligações insaturadas, como, por exemplo, 0, 1, 2, 4, 5, 6 ligações insaturadas. Os ésteres retinílicos de cadeia longa incluem, mas não se limitam ao ácido linoleico, ácido oleico ou ácido palmítico. A biossíntese de retinoides é descrita, por exemplo, no documento WO2008042338.

[0046] "Retinal" como usado no presente documento é conhecido sob o nome de IUPAC (2E,4E,6E,8E)-3,7-Dimetil-9- (2,6, 6-trimetilciclo-hexen-1-il)nona-2,4,6,8-tetraenal. É chamado de modo intercambiável no presente documento de retinaldeído ou aldeído de vitamina A inclui tanto isoformas cis- quanto trans-isoformas, como, por exemplo, 1l1l-cis retinal, 1l13-cis retinal, trans-retinal e todos os trans retinal.

[0047] O termo "carotenoides" como usado no presente documento é bem conhecido na técnica. Inclui 40 polienos de isoprenoide conjugado com e longos que são formados na natureza pela ligação de duas moléculas de pirofosfato de geranilgeranila de 20 carbonos. Esses incluem, mas não se limitam a fitoeno, licopeno e caroteno, como, por exemplo, betacaroteno, que pode ser oxidado na posição 4-ceto ou na posição 3-hidróxi para render cantaxantina, zeaxantina Ou astaxantina. A biossíntese de carotenoides é descrita, por exemplo, no documento WO2006102342.

[0048] "Vitamina A" como usado no presente documento pode ser qualquer forma química de vitamina A encontrada em soluções aquosas, como, por exemplo, não dissociada, na sua forma ácida livre ou dissociada como um ânion. O termo como usado no presente documento inclui todos os precursores ou intermediários na trajetória de vitamina A biotecnológica. Isso inclui também o acetato de vitamina A.

[0049] Os ésteres retinílicos como descrito no presente documento estão presentes na forma de uma "mistura de retinila e éster" compreendendo, de preferência, formas acetiladas, incluindo acetato de retinila e/ou outros ésteres, como ésteres retinílicos de cadeia longa. De preferência, a mistura de éster retinílico compreende pelo menos cerca de 65 %, como, por exemplo, 70, 75, 80, 90, 92, 95, 97, 99 ou até 100 % de ésteres retinílicos sendo acetatos, isto é, acetato de retinilas.

[0050] O termo “éster retinílico de cadeia longa” define ésteres de hidrocarboneto que consiste em pelo menos cerca de 8, como, por exemplo, 9, 10, 12, 13, 15 ou 20 átomos de carbono e até cerca de 26, como, por exemplo, 25, 22, 21 ou menos átomos de carbono, de preferência, com até 6 ligações insaturadas, como, por exemplo, 0, 1, 2, 4, 5, 6 ligações insaturadas. Os ésteres retinílicos de cadeia longa incluem, mas não se limitam ao linolato de retinila, oleato de retinila ou palmitato de retinila.

[0051] A presente invenção apresenta particularmente as modalidades a seguir (1) a (17): (1) Uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende uma enzima com atividade de acetilação, como atividade de acetilação de retinol, de preferência, acetil transferase (ATF) [EC 2.3.1.84], com mais preferência, uma enzima com atividade de acetil transferase 1 (Atfl), a dita enzima que catalisa a conversão de retinol, de preferência, trans- retinol, em uma mistura de acetato de retinila, com uma porcentagem de pelo menos 10 % de retinol acetilado, isto é, acetato de retinila, com base na quantidade total de retinoides produzida pela dita célula hospedeira. (2) Uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende uma enzima com atividade de acetilação de retinol, de preferência, atividade de acetil transferase [EC 2.3.1.84], com mais preferência, atividade de acetil transferase 1, a dita célula hospedeira que produz uma mistura de éster retinílico compreendendo acetato de retinila, em que a mistura compreende pelo menos cerca de 65 %, de preferência, 80, 87, 90, 92, 95, 97, 99 ou até 100 % de ésteres retinílicos na trans-isoforma. (3) A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, da modalidade (1 ou (2), em que o éster retinílico é selecionado a partir de acetato de retinila. (4) A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, da modalidade (1), (2) ou (3) que compreende uma acetil transferase heteróloga, de preferência, acetil transferase heteróloga 1. (5) A célula hospedeira produtora de carotenoide das modalidades (1), (2), (3) ou (4), em que a acetil transferase, de preferência, acetil transferase 1, é selecionada a partir de plantas, animais, incluindo seres humanos, algas, fungos, incluindo levedura ou bactérias, de preferência, selecionada a partir de Saccharomyces, Fragaria, Escherichia, Euonymus, Malus, Petunia ou Lachancea. (6) A célula hospedeira produtora de carotenoide da modalidade (5), em que o acetil transferase é acetil transferase 1 selecionada a partir de Saccharomyces bayanus, Fragaria ananassa, Escherichia coli, Euonymus alatus, Malus domestica, Petunia hybrida, Lachancea mirantina ou Lachancea fermentati. (7) A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, da modalidade (6), em que a acetil transferase 1 é selecionada a partir de um polipeptídeo com pelo menos 60 % de identidade com um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18. (8) A célula hospedeira produtora de carotenoide das modalidades (1), (2), (3), (4), (5), (6) ou (7), em que a célula hospedeira é selecionada a partir de plantas, fungos, algas ou microrganismos, de preferência, selecionada a partir de fungos incluindo levedura, com mais preferência,

a partir de Saccharomyces, Aspergillus, Pichia, Hansenula Phycomyces, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia, Blakeslea ou Yarrowia, ainda com mais preferência, a partir de Yarrowia lipolytica Ou Saccharomyces cerevisiae. (9) A célula hospedeira produtora de carotenoide das modalidades (1), (2), (3), (4), (5), (6) ou (7), em que a célula hospedeira é selecionada a partir de plantas, fungos, algas ou microrganismos, de preferência, selecionada a partir de Escherichia, Streptomyces, Pantoea, Bacillus, Flavobacterium, Synechococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Mixococcus, Brevibacterium, Bradyrhizobium, Gordonia, Dietzia, Muricauda, Sphingomonas, Synochocystis ou Paracoccus. (10) À célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, da modalidade (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8) Ou (9), em que o éster retinílico compreendendo acetato de retinila é convertido adicionalmente em vitamina A. (11) Um processo para produção de uma mistura de éster retinílico compreendendo acetato de retinila através de atividade enzimática de acetil transferase [EC 2.3.1.84], de preferência, atividade de acetil transferase 1, compreendendo contato de retinol coma dita acetil transferase, de preferência, acetil transferase 1, em que pelo menos cerca de 65 a 90 % de retinol está na trans- isoforma. (12) Um processo da modalidade (11) que usa a célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, das modalidades (1), (2), (3), (4), (5),

(6), (7), (8), (9) ou (10). (13) Um processo para produção de vitamina A compreendendo as etapas de: (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica acetil transferase [EC 2.3.1.84] como definido no presente documento em uma célula hospedeira produtora de carotenoide adequada, de preferência, célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, da modalidade (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8) ou (9); (b) converter enzimaticamente retinol que compreende trans- e cis-retinol com pelo menos cerca de 65 a 90 % como trans- retinol em uma mistura de acetato de retinila compreendendo acetato de cis- e trans-retinila, (c) converter acetato de retinila em vitamina A sob condições de cultivo adequadas. (14) Uso de acetil transferase [EC 2.3.1.84] como acima e definido presente documento para produção de uma mistura de acetato de retinila compreendendo acetato de trans- e cis- retinila, em que pelo menos cerca de 65 a 90 % de acetatos estão na trans-isoforma, em que a acetil transferase é heteróloga expressa na célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, das modalidades (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9) ou (10), a dita mistura de acetato de retinila sendo obtida através de conversão de uma mistura de retinol compreendendo trans- e cis-retinol, em que pelo menos cerca de 65 a 90 % de retinóis está na trans-isoforma. (15) Um processo para produção de uma mistura de éster retinílico compreendendo acetato de retinila através de atividade enzimática de acetil transferase [EC 2.3.1.84], de preferência, atividade de acetil transferase 1, compreendendo "contato de retinol com a dita acetil transferase, de preferência, acetil transferase 1, em que a razão de trans-isoformas a cis na mistura é de pelo menos cerca de 4. (16) Um processo para produção de vitamina A compreendendo as etapas de: (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica acetil transferase [EC 2.3.1.84] em uma célula hospedeira produtora de caroteno adequada, (b) converter enzimaticamente retinol em uma mistura de acetato de retinila compreendendo acetato de trans- e cis- retinila em uma razão de pelo menos cerca de 4:1, (c) converter retinol em vitamina A sob condições de cultivo adequadas. (17) Uso de acetil transferase [EC 2.3.1.84] para produção de uma mistura de acetato de retinila compreendendo acetato de trans- e cis-retinila em uma razão de pelo menos cerca de 4:1, em que a acetil transferase é heteróloga expressa em uma célula hospedeira produtora de carotenoide adequada.

[0052] Os exemplos a seguir são apenas ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da invenção de forma alguma. Os conteúdos de todas as referências, pedidos de patente, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo desse pedido são incorporados a título de referência pelo presente documento, em particular, o documento WO2008042338, WO2014096992, WO2016172282, WO2009126890, US20070166782 ou US20160130628. Exemplos Exemplo 1: Métodos gerais, cepas e plasmídeos

[0053] Todos os procedimentos de biologia molecular básica e manipulação de DNA descritos no presente documento são, em geral, realizados de acordo com Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nova Iorque (1989) ou Ausubel et al. (eds). Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: Nova Iorque (1998).

[0054] Ensaio de placa de agitação. Tipicamente, 800 ul de Extrato de levedura a 0,25 %, peptona a 0,5 % (0,25X YP) são inoculados com 10 pl de Yarrowia crescido recentemente e sobreposto com 800 ul de fonte de carbono de óleo mineral (Drakeol 5, Penreco Personal Care Products, Karns City, PA, EUA) a 58% de óleo de milho em óleo mineral e/ou 5 % em glicose em fase aquosa. Os transformantes foram crescidos em placas de 24 poços (Microplate Devices 24 Deep Well Plates Whatman 7701-5102), cobertos com vedação de manta (Analytical Sales and Services Inc. Plate Mats 24010CM) vedados de estéril com Folhas de Fita Qiagen Airpore (19571) e agitados em um agitador de múltiplas placas Infors (Multitron), 30 ºC, 800 RPM no meio YPD por 4 dias. A fração de óleo mineral foi removida dos poços de placa de agitação e analisada por HPLC em uma coluna de fase normal, com um detector de matriz de fotodiodo. Esse método é usado nos Exemplos 2, 3, 4.

[0055] Transformação de DNA. As cepas são transformadas durante a noite no meio de placa YPD. 50 pl de células são raspados a partir de uma placa e transformados através de incubação em 500 pul com l1 u1pug de DNA de transformação, tipicamente, DNA linear para transformação integrativa, PEG 3550MW a 40 %, acetato de lítio a 100 mM, Ditiotreitol a

50 mM, Tris-Cl a 5mM com pH 8,0, EDTA a 0,5mM por 60 minutos a 40 ºC e semeadas diretamente para o meio seletivo ou no caso de seleção de marcador antibiótico dominante, as células são crescidas em meio líquido de YPD por 4 horas a ºC antes de semear no meio seletivo.

[0056] Biologia molecular de DNA. Os genes foram sintetizados com as extremidades Nhel e MluIl no vetor pUC57 (GenScript, Piscataway, NJ). Tipicamente, os genes foram subclonados nos vetores MB5082 'URA3', MB6157 HygR e MB8327 NatR para seleção de marcador em transformações de Yarrowia lipolytica, como no documento WO2016172282. Para a inserção de gene limpa através da junção de extremidade não homóloga aleatório do gene e do marcador HindIII/XbaIl (MB5082) ou PvuII (MB6157 e MB8327), purificados respectivamente através de eletroforese em gel e coluna de purificação em gel Qiagen. O marcador MB5082 'URA3” poderia ser reusado devido às sequências de flanqueamento repetidas gratuitas que possibilitam seleção de excisantes circulares do cassete URA3 em FOA. Os marcadores NatR e HygR podem ser removidos por expressão transiente de Cre recombinase que resulta em excisantes devido ao flanqueamento de locais Lox.

[0057] Lista de plasmídeos. As sequências de plasmídeo, cepas, nucleotídeo e aminoácido a serem usadas são listadas na Tabela 1, 2 e a listagem de sequências. As sequências de nucleotídeos ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 17 e 19 são otimizadas por códon para expressão em Yarrowia.

[0058] Tabela 1: lista de plasmídeos usados para construção das cepas que carregam os genes de ATF1l heterólogos. As sequências ID NOs se referem aos insertos. Para mais detalhes, consulte texto.

plasmídeo MB Principal Inserto SEQ ID NO:

[0059] Tabela 2: lista de cepas Yarrowia usadas para produção de retinoides que carregam os genes de ATF1 heterólogos. Para mais detalhes, consulte texto. Cepa de Descrição Primeiramente = 7788 Cepa de caroteno documento 15710 ML7788 transformado com MB7311 - | documento FEEL. 17544 ML15710 curado de URA3 por FOA e |aqui HygR por Cre/lox [e 17767 ML17544 transformado com MB6072 aqui DMBCO-URA3 e MB6732 SLbATF1-HygR e curado de marcadores 17978 ML17968 transformado com MB8200 aqui FL£RDH-URA3 e curado de marcadores

[0060] Método de retinol de fase normal. Uma bomba binária Waters 1525 fixa a um amostrador automático 717 foi usada para injetar amostras. Foi usado um Phenomenex Luna de Sílica 3 pp (2), 150 x 4,6 mm com um kit de coluna de proteção de sílica de segurança para resolver retinoides. A fase móvel consiste em 1000 ml de hexano, 30 ml de isopropanol e 0,1 ml de ácido acético para compostos relacionados à astaxantina, ou 1000 ml de hexano, 60 ml de isopropanol e 0,1 ml de ácido acético para compostos relacionados à zeaxantina. A taxa de fluxo para cada um é 0,6 ml por minuto. A temperatura de coluna é ambiente. O volume de injeção é 20 pl. O detector é um detector de matriz de fotodiodo que coleta de 210 a 600 nm. Os analitos foram detectados de acordo com a Tabela

3.

[0061] Tabela 3: lista de analitos que usam o método de retinol de fase normal. A adição de todos os intermediários adicionados gera a quantidade de retinoides totais. Para mais detalhes, consulte texto.

Intermediários Tempo de Lambda máx.

| retenção [min] [em l1-cis-retinal 4,0 364 | 1º-cis-retinal 4,1 | 364 acetato de retinila 3,5 326 éster retinílico 3 325

[0062] Preparação de amostra. As amostras foram preparadas “através de vários métodos dependendo das condições. Para amostras de caldo inteiro ou caldo lavado, o caldo foi colocado em um tubo de PrecellysO pesado e a fase móvel foi adicionada, as amostras foram processadas em um homogeneizador PrecellysO (Bertin Corp, Rockville, MD, EUA) na configuração mais alta 3X de acordo com as direções de fabricação. No caldo lavado, as amostras foram centrifugadas em um tubo de 1,7 ml em uma microcentrífuga a 10000 rpm por 1 minuto, o caldo decantado, 1 ml de água adicionado peletizado e decantado e levado ao volume original. A mistura foi peletizada novamente e levada a uma quantidade apropriada de fase móvel e processada por batida com esferas PrecellysO. Para a análise de fração de óleo mineral, a amostra foi centrifugada a 4000 RPM por 10 minutos e o óleo foi decantado do topo através de pipeta de deslocamento positiva (Eppendorf, Hauppauge, NY, EUA) e diluída na fase móvel através de vórtice e medida para concentração de retinoide por análise de HPLC.

[0063] Condições de fermentação. As fermentações foram idênticas às condições previamente descritas com o uso, de preferência, de sobreposição de óleo de silicone ou óleo mineral e tanque agitado que foi, de preferência, alimentado com glicose ou óleo de milho em um reator de bancada com 0,5 la51 de volume total (consulte o documento WO2016172282).

Em geral, os mesmos resultados foram observados com um tanque agitado com batelada alimentada com uma produtividade aumentada que demonstra a utilidade do sistema para a produção de retinoides. De preferência, as fermentações foram produzidas em bateladas com 5 % de glicose e 20 % de óleo de silicone forma adicionados após o oxigênio dissolvido despencar e a alimentação foi retomada para alcançar 20 % de oxigênio dissolvido ao longo do programa de alimentação. Alternativamente, o óleo de milho foi usado como uma alimentação e óleo mineral foi usado como uma segunda fase para coletar os retinoides alifáticos.

Exemplo 2: Produção de retinoides em Yarrowia lipolytica

[0064] Para expressão de ATFl heteróloga, a cepa produtora de trans-retinol ML17968 foi transformada com fragmentos de gene PvuIlI purificados contendo fragmentos de gene de acetiltransferase ligados a um marcador resistente à higromicina (HygR) para seleção em meio rico (YPD) contendo 100 ug/ml de higromicina. Antes do plaqueamento, os cultivos foram crescidos em YPD por quatro horas para sintetizar os genes “resistentes ao antibiótico. Os isolados foram examinados para acilação em ensaios de placa de agitação, especificamente, com o uso de 10 % de glicose como uma fonte de carbono em 0,25X YP com óleo de silicone como uma sobreposição e isolados bem-sucedidos foram examinados adicionalmente no reator de tanque agitado em batelada com alimentação de glicose e sobreposição de óleo de silicone, que mostraram uma ordem de produtividade de magnitude aumentada indicando a utilidade na produção de retinoides. Os dados da análise são mostrados na Tabela 4).

[0065] Tabela 4: produção de trans-retinoides em Yarrowia como melhorada pela ação de enzimas de Atfl heterólogas. A análise foi feita em uma fermentação de placa de agitação “Strans” significa que a porcentagem de acetato de trans- retinila na mistura de retinoides, e a análise foi feita em placas de agitação (SP) e tanques agitados em batelada (ST).

"n.a." significa não disponível. Para mais detalhes consulte texto. Organismo gene de % de Cepa de plasmídeo | rem rm em L. LffATF1 11,7 18523 8806 Ea [FAT L. LmATF1 40,4 18523 8849 amas [ATO Exemplo 3: Produção de retinoides em Saccharomyces cerevisiae

[0066] Tipicamente, uma cepa de betacaroteno é transformada com genes heterólogos que codificam enzimas, como geranilgeranil sintase, fitoeno sintase, licopeno sintase, licopeno ciclase, construída que está produzindo betacaroteno de acordo com métodos padrão como conhecidos na técnica (como, por exemplo, como descrito no documento US20160130628 ou WO2009126890). A introdução e/ou superexpressão das enzimas de ATF como definido no presente documento, resultados similares relativos à produção de acetato de retinila, em particular, com pelo menos 60 % na trans-isoforma, são obtidas. Adicionalmente, quando transformado com betacaroteno, o retinal de genes de oxidase pode ser produzido. Adicionalmente, quando transformado com retinol desidrogenase, então, o retinol pode ser produzido.

Opcionalmente, os genes aciladores de retinol endógeno podem ser deletados.

Com essa abordagem, são obtidos resultados similares relativos à especificidade para trans-isoforma ou produtividade para acetato de retinila.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES

1. Célula hospedeira produtora de carotenoide caracterizada por compreender uma enzima com atividade de acetilação, como atividade de acetilação de retinol, de preferência, atividade de acetil transferase [EC 2.3.1.84], com mais preferência, atividade de acetil transferase 1, a dita célula hospedeira que produz uma mistura de éster retinílico com uma taxa de conversão de retinol em ésteres retinílicos de pelo menos 10 %.

2. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma enzima com atividade de acetilação de retinol com preferência por acetilação de trans-retinol.

3. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o éster retinílico é selecionado a partir de acetato de retinila.

4, Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender uma acetil transferase heteróloga, de preferência, acetil transferase heteróloga 1.

5. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a acetil transferase, de preferência, acetil transferase 1, é selecionada a partir de plantas, animais, incluindo seres humanos, algas, fungos, incluindo levedura, ou bactérias, de preferência, selecionada a partir do grupo que consiste em Petunia, Euonymus, Escherichia, Saccharomyces e Lachancea.

6. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a acetil transferase é acetil transferase 1 selecionada a partir de Petunia hybrida, Euonymus alatus, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces arbirocola, Lachancea mirantina ou Lachancea fermentati.

7. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a acetil transferase 1 é selecionada a partir de um polipeptídeo com pelo menos 60 % de identidade com a acetil transferase 1 de acordo com as SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 16 ou 18.

8. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir de plantas, fungos, algas ou microrganismos, de preferência, selecionada a partir do grupo que consiste em Escherichia, Streptomyces, Pantoea, Bacillus, Flavobacterium, Synechococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Mixococcus, Brevibacterium, Bradyrhizobium, Gordonia, Dietzia, Muricauda, Sphingomonas, Synochocystis, Paracoccus, Saccharomyces, Aspergillus, Pichia, Hansenula, Phycomyces, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia, Blakeslea e Yarrowia, com mais preferência, a partir de Yarrowia lipolytica ou Saccharomyces cerevisiae.

9. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o éster retinílico que compreende acetato de retinila é convertido adicionalmente em vitamina A.

10. Processo para produção de uma mistura de éster retinílico caracterizado por compreender acetato de retinila através de atividade enzimática de acetil transferase [EC

2.3.1.84], de preferência, atividade de acetil transferase 1, compreendendo contato de retinol com a dita acetil transferase, de preferência, acetil transferase 1, em que pelo menos cerca de 65 a 90 % de retinol está na trans- isoforma.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por usar a célula hospedeira produtora de carotenoide conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

12. Processo para produção de vitamina A caracterizado por compreender as etapas de: (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica acetil transferase [EC 2.3.1.84] como definido no presente documento em uma célula hospedeira produtora de carotenoide adequada, de preferência, célula hospedeira produtora de carotenoide conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 9, (b) converter enzimaticamente retinol que compreende trans- e cis-retinol com pelo menos cerca de 65 a 90 % como trans- retinol em uma mistura de acetato de retinila compreendendo acetato de cis- e trans-retinila, (c) converter acetato de retinila em vitamina A sob condições de cultivo adequadas.

13. Uso caracterizado por ser de acetil transferase [EC

2.3.1.84] para produção de uma mistura de acetato de retinila compreendendo acetato de trans- e cis-retinila, em que pelo menos cerca de 65 a 90 % de acetatos estão na trans-isoforma, em que a acetil transferase é heteróloga expressa na célula hospedeira produtora de carotenoide conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores l1 a 9, a dita mistura de acetato de retinila sendo obtida através de conversão de uma mistura de retinol compreendendo trans- e cis-retinol, em que pelo menos cerca de 65 a 90 % de retinóis estão na trans-isoforma.