BRPI0609040A2 - produção de carotenóides em levedo e fungos oleaginosos - Google Patents

Abstract

PRODUçãO DE CAROTENóIDES EM LEVEDO E FUNGOS OLEAGINOSOS. A presente invenção refere-se sistemas para produção de levedos ou fungos oleaginosos manipulados que expressam carotenõides.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção Para "PRODUÇÃO DE CAROTENOIDES EM LEVEDO E FUNGOS OLEAGINOSOS"

Pedidos Relacionados

O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório 5 U.S. No. 60/663,621, depositado em 18 de Março de 2005, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Antecedentes da Invenção

Carotenoides são pigmentos orgânicos oscilando, quanto à cor, de amarelo a vermelho, que são naturalmente produzidos por determinados 10 organismos, incluindo organismos fotossintéticos (por exemplo, plantas, algas, cianobactérias) e alguns fungos. Carotenoides são responsáveis pela cor laranja de cenouras, bem como rosa em flamingos e salmões e o vermelho em lagostas e camarão. Os animais, contudo, não podem produzir carotenoides e devem receber os mesmos através de sua dieta.Pigmentos de carotenóide (por exemplo, p-caroteno e astaxanti-

na) são usados industrialmente como ingredientes para alimentos e estoques de ração, servindo a uma função nutricional e intensificação da aceitabilidade do consumidor. Por exemplo, astaxantina é amplamente usada em aquicultura de salmão para proporcionar uma coloração laranja característi-20 ca de suas contra-partes. Alguns carotenoides são também precursores de vitamina A. Também, carotenoides têm propriedades antioxidantes e podem ter vários benefícios para a saúde (veja, por exemplo, Jyonouchi e colaboradores, Nutr. Câncer 16: 93, 1991; Giovannucci e colaboradores, J. A/aí/. Câncer Inst. 87: 1767, 1995; Miki, Pure Appl. Chem 63: 141, 1991; Chew e 25 colaboradores, Anticancer Res. 19: 1849, 1999; Wang e colaboradores, An-timicrob. Agents Chemother. 44: 2452, 2000). Alguns carotenoides, tais como p-caroteno, licopeno e luteína, são atualmente vendidos como suplementos nutricionais.

Em geral, os sistemas biológicos que produzem carotenoides 30 são industrialmente intratáveis e/ou produzem os compostos em níveis tais que isolamento em escala comercial não é praticavel. Assim, a maioria dos carotenoides usados na indústria são produzidos através de síntese química.Existe uma necessidade por sistemas biológicos aperfeiçoados que produzem carotenóides. Alguns esforços foram feitos anteriormente para manipular geneticamente determinadas bactérias ou fungos para produzir níveis maiores de carotenóides (veja, por exemplo, Misawa e colaboradores, J. Bio-5 technol. 59: 169, 1998; Visser e colaboradores, FEMS Yeast Research 4: 221, 2003). Contudo, sistemas aperfeiçoados que permitem níveis maiores de produção e maior facilidade de isolamento são necessários. Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona sistemas aperfeiçoados para aprodução biológica de carotenóides. Em um aspecto, a invenção abrange a descoberta de que é desejável produzir carotenóides em organismos oleaginosos. Sem desejar estar preso a qualquer teoria em particular, os presentes inventores propõem que sistemas biológicos sejam capazes de acumular níveis maiores de carotenóides se os compostos são capturados em corpos15 lipídicos. A despeito de se os níveis absolutos são maiores, contudo, carotenóides que são acumulados dentro de corpos lipídicos em organismos oleaginosos são prontamente isoláveis através de isolamento dos corpos lipídicos.

A presente invenção, portanto, proporciona fungos oleaginosos 20 (incluindo, por exemplo, levedo e outros fungos unicelulares) que produzem um ou mais carotenóides. A presente invenção também proporciona métodos de construção de tais levedos e fungos, métodos de uso de tais levedos e fungos para produzir carotenóides e métodos de preparo de composições contendo carotenóide, tais como aditivos para alimentos ou rações ou su-25 plementos nutricionais, usando os carotenóides produzidos em tais levedos ou fungos oleaginosos. Em particular, a presente invenção proporciona sistemas e métodos para geração de levedos e fungos contendo uma ou mais modificações oleagínicas e/ou carotenogênicas que aumentam a oleaginici-dade e/ou alteram suas capacidades de produção de carotenóide quando 30 comparado com outros organismos idênticos que carecem da(s) modifica-ção(ões).

A presente invenção ainda abrange o reconhecimento geral deque sistemas que acumulam lipídios são úteis para a produção e/ou isolamento de agentes lipofílicos (tais como, mas não limitado a, isoprenóides ou compostos derivados de isoprenóide). Assim, de acordo com a presente invenção, é desejável manipular organismos para produzir tais agentes lipofílicos e/ou acumular lipídios. Vários outros aspectos da presente invenção serão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir da presente descrição, incluindo as reivindicações em anexo. Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1A-1D representam determinados carotenóides comuns.

A Figura 2 representa como níveis suficientes de acetil-CoA e NADPH podem ser acumulados no citosol de organismos oleaginosos para permitir a produção de níveis significativos de lipídios citosólicos. Enzimas: 1, decarboxilase de piruvato; 2, dehidrogenase de malato; 3, enzima málica; 4, dehidrogenase de piruvato; 5, sintase de citrato; 6, liase de ATP-citrato; 7, translocase de citrato/malato.

As Figuras 3A e 3B representam a via de biossíntesé de isoprenóide de mevalonato a qual opera, tipicamente, em eucariotas, incluindo fungos.

A Figura 4 representa a via de biossíntesé de isoprenóide meva-lonato-independente, também conhecida como via de DXP a qual, tipicamente, opera em bactérias e nos plastídeos de plantas.

A Figura 5 representa intermediários na via de biossíntesé de isoprenóide e como eles alimentam as vias biossintéticas de outras biomolé-culas, incluindo carotenóides, bem como compostos de não-carotenóides, tais como esteróis, esteróides e vitaminas, tais como vitamina E ou vitamina K.

As Figuras 6A-6D ilustram várias vias biossintéticas de carote-nóide. A Figura 6A destaca ramificações que levam a várias xantofilas cíclicas e acíclicas; a Figura 6B mostra determinadas vias de X. dendrorhous que geram carotenóides dicíclicos e monocíclicos, incluindo astaxantina; aFigura 6C mostra vias interconectadas para conversão de p-caroteno em qualquer um de uma variedade de outros carotenóides, incluindo astaxanti-na; a Figura 6D representa possíveis vias de síntese de carotenóides cíclicos e xantofilas comuns de plantas e algas a partir de neurosporeno. 5 As Figuras 7A-7C mostram um alinhamento de determinados

polipeptídeos de reductase de HMG-CoA fúngica representativos. Conforme pode ser observado, esses polipeptídeos mostram identidade muito alta a-través da região çatalítica e também têm domínios que abrangem a membrana complexa. Em algumas modalidades da invenção, esses domínios 10 que abrangem membrana são rompidos ou são removidos de modo que, por exemplo, uma versão hiperativa do polipeptídeo pode ser produzida.

As Figuras 8A-8D representam representações esquemáticas de plasmídeos gerados e descritos em detalhes na exemplificação. Definições Modificação carotenogênica: O termo "modificação carotenogê-

nica", conforme usado aqui, se refere a uma modificação de um organismo hospedeiro que se ajusta à produção de um ou mais carotenóides, conforme descrito aqui. Por exemplo, uma modificação carotenogênica pode aumentar o nível de produção de um ou mais carotenóides e/ou pode alterar níveis de produção relativos de diferentes carotenóides. Em princípio, uma modificação carotenogênica da invenção pode ser qualquer modificação química, fisiológica, genética ou outra que altera, apropriadamente, a produção de um ou mais carotenóides em um organismo hospedeiro produzido por esse organismo quando comparado com o nível produzido em um organismo de outro modo idêntico não submetido à mesma modificação. Na maioria das modalidades, contudo, a modificação carotenogênica compreenderá uma modificação genética, tipicamente, resultando na produção aumentada de um ou mais carotenóides selecionados. Em algumas modalidades, o carotenoide selecionado é um ou mais de astaxantina, p-caroteno, cantaxantina,luteína, licopeno, fitoeno, zeaxantina e/ou modificações de zeaxantina ou astaxantina (por exemplo, glicosídeo, zeaxantina esterificada ou astaxantina). Em algumas modalidades, o carotenoide selecionado é uma ou maisxantofilas e/ou uma modificação das mesmas (por exemplo, glicosídeo, xan-tofilas esterifiçadas). Em determinadas modalidades, a xantofila é selecionada do grupo consistindo de astaxantina, luteína, zeaxantina, licopeno e modificações dos mesmos. Em algumas modalidades, o carotenóide selecionado 5 é um ou mais de astaxantina, (3-caroteno, cantaxantina, luteína, licopeno e zeaxantina e/ou modificações de zeaxantina ou astaxantina. Em algumas modalidades, o carotenóide é (3-caroteno. Em algumas modalidades, o carotenóide selecionado é astaxantina. Em algumas modalidades, o carotenóide selecionado é outro que não (3-caroteno. 10 Polipeptídeo carotenogênico: O termo "polipeptídeo carotenogê-

nico", conforme usado aqui, se refere a qualquer polipeptídeo que está envolvido no processo de produção de carotenóides em uma célula e pode incluir polipeptídeos que estão envolvidos em outros processos que não produção de carotenóide, mas cujas atividades afetam a extensão ou nível de 15 produção de um ou mais carotenóides, por exemplo, através de remoção de um substrato ou reagente utilizado por um polipeptídeo de carotenóide que está diretamente envolvido na produção de carotenóide. Polipeptídeos caro-tenogênicos incluem polipeptídeos da biossíntese de isoprenóide, polipeptídeos da biossíntese de carotenóide e polipeptídeos competidores da bios-20 síntese de isoprenóide, conforme esses termos são definidos aqui. O termo também abrange polipeptídeos que podem afetar a extensão até a qual carotenóides são acumulados em corpos lipídicos.

Carotenóide: O termo "carotenóide" é compreendido na técnica como se referindo a uma classe estruturalmente diversa de pigmentos deri-25 vados de intermediários da via de isoprenóide. A etapa obrigatória na biossíntese de carotenóide é a formação de fitoeno a partir de pirofosfato de ge-ranilgeranila. Carotenóides podem ser acíclicos ou cíclicos e podem ou não conter oxigênio, de modo que o termo carotenóides inclui carotenos e xantofilas. Em geral, carotenóides são compostos de hidrocarboneto tendo um 30 esqueleto de carbono polieno-conjugado formalmente derivado do composto com cinco carbonos IPP, incluindo triterpenos (C3o diapocarotenóides) e te-traterpenos (C4o carotenóides), bem como seus derivados oxigenados e ou-tros compostos que têm, por exemplo, C35, C5o> C6o, C7o. C8o de comprimento ou outros comprimentos. Muitos carotenóides têm fortes propriedades de absorção de luz e podem oscilar, quanto ao comprimento, em mais de C2oo-C3o diapocarotenóides consistem, tipicamente, de seis unidades de isopre-nóide unidas de uma maneira tal que a disposição das unidades de isopre-nóide é revertida no centro da molécula, de modo que os dois grupos metila centrais estão em uma relação posicionai 1,6 e os grupos metila não-terminais restantes estão em uma relação posicionai 1,5. Tais C3o carotenóides podem ser formalmente derivados da estrutura acíclica C30H42, tendo uma cadeia central longa de ligações duplas conjugadas através de: (i) hi-drogenação, (ii) desidrogenação, (iii) ciclização, (iv) oxidação, (v) esterifica-ção/glicosilação ou qualquer combinação desses processos. C4o carotenóides consistem, tipicamente, de oito unidades de isoprenóide unidas de uma maneira tal que a disposição de unidades de isoprenóide é revertida no cen- tro da molécula, de modo que os dois grupos metila centrais estão em uma relação posicionai 1,6 e os grupos metila não-terminais restantes estão em uma relação posicionai 1,5. Tais C40 carotenóides podem ser formalmente derivados da estrutura acíclica C4oH56, tendo uma cadeia central longa de ligações duplas conjugadas através de (i) hidrogenação, (ii) desidrogenação, (iii) ciclização, (iv) oxidação, (v) esterificação/glicosilação ou qualquer combinação desses processos. A classe de C4o carotenóides também inclui determinados compostos que surgem de redisposições do esqueleto de carbono ou através da remoção (formal) de parte dessa estrutura. Mais de 600 carotenóides diferentes foram identificados na natureza; determinados caro-tenóides comuns são representados na Figura 1. Carotenóides incluem, mas não estão limitados a: anteraxantina, adonirubina, adonixantina, astaxantina, cantaxantina, capsorubrina, p-criptoxantina, oc-caroteno, p-caroteno, p,ip-caroteno, õ-caroteno, £-caroteno, echinenona, 3-hidróxiechinenona, 3'-hidróxiechinenona, v-caroteno, ijj-caroteno, 4-ceto-v-caroteno, Ç-caroteno, cc-criptoxantina, deoxiflexixantina, diatoxantina, 7,8-didehidroastaxantina, dide-hidrolicopeno, fucoxantina, fucoxantinol, isorenierateno, p-isorenierateno, lactucaxantina, luteína, licopeno, mixobactona, neoxantina, neurosporeno,hidróxineurosporeno, peridinina, fitoeno, rodopina, glicosídeo de rodopina, 4-ceto-rubixantina, sifonaxantina, esferoideno, esferoidenona, espiriloxantina, toruleno, 4-ceto-toruleno, 3-hidróxi-4-ceto-toruleno, uriolida, acetato de urio-lida, violaxantina, zeaxantina-p-diglicosídeo, zeaxantina e C3o carotenóides. 5 Adicionalmente, compostos de carotenóide incluem derivados dessas moléculas os quais podem incluir grupos funcionais hidróxi-, metóxi-, oxo-, epóxi-, carbóxi- ou aldeídicos. Ainda, compostos de carotenóide incluídos incluem éster (por exemplo, éster de glicosídeo, éster de ácido graxo) e derivados de sulfato (por exemplo, xantofilas esterificadas). 10 Polipeptídeo de biossíntese de carotenóide: O termo "polipeptí-

deo da biossíntese de carotenóide" se refere a qualquer polipeptídeo que está envolvido na síntese de um ou mais carotenóides. Para mencionar uns poucos, esses polipeptídeos da biossíntese de carotenóide incluem, por e-xemplo, polipeptídeos de sintase de fitoeno, dehidrogenase de fitoeno (ou 15 desaturase), ciclase de licopeno, cetolase de carotenóide, hidroxilase de carotenóide, sintase de astaxantina, epsilon hidroxilase de carotenóide, ciclase de licopeno (subunidades beta e epsilon), glicosiltransferase de carotenóide e aciltransferase de acil CoA.diacilglicerol. Exemplos representativos de seqüências de polipeptídeo da biossíntese de carotenóide são apresentados 20 nas Tabelas 17-25.

Gene: O termo "gene", conforme usado aqui, geralmente se refere a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, opcionalmente incluindo determinados elementos regulatórios que podem afetar a expressão de um ou mais produtos genéticos (isto é, RNA ou proteína). 25 Heterólogo: O termo "heterólogo", conforme usado aqui, se refe-

re a genes ou polipeptídeos que não ocorrem naturalmente no organismo no qual ele está sendo expresso. Deve ser compreendido que, em geral, quando um gene ou polipeptídeo heterólogo é selecionado para introdução em e/ou expressão por uma célula hospedeira, o organismo fonte particular do 30 qual o gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser selecionado não é essencial para a prática da presente invenção, considerações relevantes podem incluir, por exemplo, quão intimamente relacionados a fonte potencial e or-ganismos hospedeiros estão em evolução ou quão relacionado o organismo fonte está com outros organismos fonte dos quais seqüências de outros po-lipeptídeos relevantes foram selecionados.

Célula hospedeira: Conforme usado aqui, a "célula hospedeira" 5 é uma célula de levedo ou fúngica que é manipulada de acordo com a presente invenção para acumular lipídio e/ou expressar um ou mais carotenói-des conforme descrito aqui. Uma "célula hospedeira modificada", conforme esse termo é usado aqui, é uma célula hospedeira que contém pelo menos uma modificação oleagínica e/ou pelo menos uma modificação carotenogê-nica de acordo com a presente invenção.

Isolado: O termo "isolado", conforme usado aqui, significa que a entidade isolada foi separada de pelo menos um componente com o qual ela estava previamente associada. Quando a maioria dos outros componentes foi removida, a entidade isolada é "purificada", isolamento e/ou purificação pode ser realizada usando quaisquer métodos conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, fracionamento, extração, precipitação ou outra separação.

Polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide: O termo "polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide", conforme usado aqui, se refere a um polipeptídeo cuja expressão em uma célula reduz o nível de difosfato de geranilgeranila (GGPP) disponível para entrar na via da biossíntese de carotenóide. Por exemplo, polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide incluem enzimas que atuam sobre intermediários de isoprenóide antes de GGPP, de modo que menos GGPP é gerado (veja,por exemplo, Figura 5). Sintase de esqualeno é mais um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide de acordo com a presente invenção; seqüências da sintase de esqualeno representativos são apresentadas na Tabela 16. Enzimas sintase de prenildifosfato e poliprenil transferase de pa-ra-hidróxibenzoato (PHB) são ainda polipeptídeos competidores da biossín-tese de isoprenóide adicionais de acordo com a presente invenção; enzimas sintase de prenildifosfato e polipeptídeos de poliprenil transferase de PHB representativos são apresentados nas Tabelas 29 e 30, respectivamente.Polipeptfdeo da biossíntese de isoprenóide: O termo "polipeptí-deo da biossíntese de isoprenóide" se refere a qualquer polipeptfdeo que está envolvido na síntese de isoprenóides. Por exemplo, conforme discutido aqui, tiolase de acetoacetil-CoA, sintase de HMG-CoA, reductase de HMG-5 CoA, quínase de mevalonato, quínase de fosfomevalonato, decarboxilase de pirofosfato de mevalonato, isomerase de IPP, sintase de FPP e sintase de GGPP estão todos envolvidos na via de mevalonato para biossíntese de isoprenóide. Cada uma dessas proteínas também é um polipeptfdeo da biossíntese de isoprenóide para fins da presente invenção e seqüências de exem-10 pios representativos dessas enzimas são proporcionados nas Tabelas 7-15.

Via de isoprenóide: A "via de isoprenóide" é compreendida na técnica como se referindo a uma via metabólica que produz ou utiliza o me-tabólito com cinco carbonos pirofosfato de isopentila (IPP). Conforme discutido aqui, duas vias diferentes podem produzir o precursor de isoprenóide 15 comum IPP - a "via de mevalonato" e a "via de não-mevalonato". O termo "via de isoprenóide" é suficientemente geral para abranger ambos esses tipos de via. A biossíntese de isoprenóides a partir de IPP ocorre através de polimerização de várias subunidades de isopreno de cinco carbonos. Meta-bólitos de isoprenóide derivados de IPP são de tamanho e estrutura química 20 variados, incluindo moléculas cíclicas e acíclicas. Metabólitos de isoprenóide incluem, mas não estão limitados a, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpe-nos, esteróis e poliprenóis, tais como carotenóides.

Modificação oleagínica: O termo "modificação oleagínica", conforme usado aqui, se refere a uma modificação de um organismo hospedeiro 25 que se ajusta à oleaginidade desejada desse organismo hospedeiro, conforme descrito aqui. Em alguns casos, o organismo hospedeiro já será oleaginoso pelo fato de ter a capacidade de acumular lipídio em pelo menos cerca de 20% de seu peso celular seco. Todavia, pode ser desejável aplicar uma modificação oleagínica em tal organismo, de acordo com a presente 30 invenção, por exemplo, para aumentar (ou, em alguns casos, possivelmente diminuir) seu acúmulo total de lipídio ou ajustar os tipos ou quantidades de um ou mais lipidios em particular que se acumulam (por exemplo, aumentaro acúmulo relativo de triacilglicerol). Em outros casos, o organismo hospedeiro pode ser não-oleaginoso (embora possa conter alguns componentes enzimáticos e regulatórios usados em outros organismos para acumular lipí-dio) e pode requerer modificação oleagínica de forma a se tornar oleaginoso de acordo com a presente invenção. A presente invenção também considera aplicação de modificação oleagínica de gêneros hospedeiros não-oleaginosos, de modo que sua oleaginicidade seja aumentada adicionalmente, ainda que mesmo após serem modificadas, elas possam não ser oleaginosas, conforme definido aqui. Em princípio, a modificação oleagínica pode ser qualquer modificação química, fisiológica, genética ou outra que altera, apropriadamente, a oleaginidade de um organismo hospedeiro quando comparado com um organismo de outro modo idêntico não submetido à modificação oleagínica. Na maioria das modalidades, contudo, a modificação oleagínica compreenderá uma modificação genética que resulta, tipicamente, em produção e/ou atividade aumentada de um ou mais polipeptídeos oleagí-nicos. Em algumas modalidades, a modificação oleagínica compreende pelo menos uma modificação química, fisiológica, genética ou outra; em outras modalidades, a modificação oleagínica compreende mais de uma modificação química, fisiológica, genética ou outra. Em determinados aspectos onde mais de uma modificação é utilizada, tais modificações podem compreender qualquer combinação de modificação química, fisiológica, genética ou outra (por exemplo, uma ou mais modificações genéticas e modificações químicas ou fisiológicas).

Polipeptídeos oleagínicos: O termo "polipeptídeo oleagínico", conforme usado aqui, se refere a qualquer polipeptídeo que está envolvido no processo de acúmulo de lipídio em uma célula e pode incluir polipeptídeos que estão envolvidos em outros processos que não a biossíntese de lipídio, mas cujas atividades afetam a extensão ou nível de acúmulo de um ou mais lipídios, por exemplo, através de remoção de um substrato ou rea-gente utilizado por um polipeptídeo oleagínico que está diretamente envolvido no acúmulo de lipídio. Por exemplo, conforme discutido aqui, carboxilase de acetil-CoA, decarboxilase de piruvato, dehidrogenase de isocitrato, liasede ATP-citrato, enzima málica e deaminase de AMP, dentre outras proteínas, estão todos envolvidos no acúmulo de lipídios em células. Em geral, espera-se que redução da atividade de decarboxilase de piruvato ou dehi-drogenase de isocitrato e/ou aumento da atividade de carboxilase de acetil CoA, liase de ATP-citrato, enzima málica e/ou deaminase de AMP promovam a oleaginidade. Cada uma dessas proteínas é um polipeptídeo oleagíni-co para fins da presente invenção e seqüências de exemplos representativos dessas enzimas são proporcionadas nas Tabelas 1 -6.

Oleaginoso: O termo "oleaginoso" se refere à capacidade de um organismo de acumular lipidio em pelo menos cerca de 20% de seu peso celular seco. Em determinadas modalidades da invenção, levedos ou fungos oleaginosos acumulam lipídios em pelo menos cerca de 25% de seu peso celular seco. Em outras modalidades, levedos ou fungos oleaginosos da invenção acumulam lipidio dentro da faixa de cerca de 20-45% de seu peso celular seco. Em algumas modalidades, organismos oleaginosos podem a-cumular lipidio em tanto quanto cerca de 70% de seu peso celular seco. Em algumas modalidades da invenção, organismos oleaginosos podem acumular uma grande fração do acúmulo total de lipidio na forma de triacilgliceroL Em determinadas modalidades, a maioria do lipidio acumulado está na forma de triacilglicerol. Alternativa ou adicionalmente, o lipidio pode se acumular na forma de corpos lipídicos intracelulares ou corpos oleosos. Em determinadas modalidades, a presente invenção utiliza levedos ou fungos que são naturalmente oleaginosos. Em alguns aspectos, organismos naturalmente oleaginosos são manipulados (por exemplo, genética, quimicamente ou de outro modo) de modo a aumentar adicionalmente o nível de lipidio acumulado no organismo. Em outras modalidades, levedos ou fungos que não são naturalmente oleaginosos são manipulados (por exemplo, genética, quimicamente ou de outro modo) para acumular lipidio, conforme descrito aqui. Para fins da presente invenção, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) e Cândida utilis são fungos não naturalmente oleaginosos.

Polipeptídeo: O termo "polipeptídeo", conforme usado aqui, ge-ralmente tem seu significado reconhecido na técnica de um polímero de pelo menos três aminoácidos. Contudo, o termo também é usado para se referir à classes funcionais específicas de polipeptídeos tais como, por exemplo, po-lipeptídeos oleagínicos, polipeptídeos carotenogênicos, polipeptídeos da bi-ossíntese de isoprenóide, polipeptídeos da biossíntese de carotenóide e polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide. Para cada uma de tais classes, a presente especificação proporciona vários exemplos de seqüências conhecidas de tais polipeptídeos. Aqueles habilitados na técnica apreciarão, contudo, que o termo "polipeptídeo" se destina a ser suficientemente geral para abranger não apenas polipeptídeos tendo a seqüência completa mencionada aqui (ou em uma referência ou banco de dados especificamente mencionado aqui), mas também abranger outros polipeptídeos que representam fragmentos funcionais (isto é, fragmentos retendo pelo menos uma atividade) de tais polipeptídeos completos. Além disso, aqueles habilitados na técnica compreenderão que seqüências de proteína geralmente toleram alguma substituição sem destruir a atividade. Assim, qualquer polipeptídeo que retém atividade e compartilha pelo menos cerca de 30-40% de identidade de seqüência global, freqüentemente maior do que cerca de 50%, 60%, 70% ou 80% e ainda usualmente incluindo pelo menos uma região de identidade muito maior, freqüentemente maior do que 90% ou mesmo 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em uma ou mais regiões altamente conservadas (por exemplo, polipeptídeos de dehidrogenase de isocitrato freqüentemente compartilham um motivo de AMP-ligação conservado; polipeptídeos de reductase de HMG-CoA incluem, tipicamente, um domínio catalítico altamente conservado (veja, por exemplo, Figura 7); carboxilase de acetil CoA tem, tipicamente, um domínio de transferase de carboxila; veja, por exemplo, Downing e colaboradores, Chem. Abs. 93: 484, 1980; Gil e colaboradores, Cell 41: 249, 1985; Jitrapakdee e colaboradores, Curr Protein Pept Sei. 4: 217, 2003; Patente U.S. Número 5.349.126, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade), usualmente abrangendo pelo menos 3-4 e freqüentemente até 20 ou mais aminoácidos, com outro polipeptídeo da mesma classe, é abrangido dentro do termo relevante "polipeptídeo"conforme usado aqui.

Organismo Fonte: O termo "organismo fonte", conforme usado aqui, se refere ao organismo no qual uma seqüência de polipeptídeo particular pode ser encontrada na natureza. Assim, por exemplo, se um ou mais polipeptídeos heterólogos estão sendo expressos em um organismo hospedeiro, o organismo no qual os polipeptídeos são expressos na natureza (e/ou do a partir dos genes dos quais eles foram originalmente clonados) é referido como organismo fonte. Onde mais de um polipeptídeo heterólogo está sendo expresso no organismo hospedeiro, um ou mais organismos fonte podem ser utilizados para seleção independente de cada um dos polipeptídeo(s) heteró-logo(s). será apreciado que qualquer e todos os organismos que contêm seqüências de polipeptídeo naturalmente relevantes podem ser usados como organismos fonte de acordo com a presente invenção. Organismos fonte representativos incluem, por exemplo, organismos fontes de animal, mamífero, inseto, planta, fungo, levedo, alga, bactéria, cianobactéria, archaebactéria e protozoário.

Descrição Detalhada de Determinadas Modalidades Preferidas da Invenção

Conforme mencionado acima, a presente invenção abrange a descoberta de que carotenóides podem, desejavelmente, ser produzidos em levedos e fungos oleaginosos. De acordo com a presente invenção, gêneros que (i) acumulam lipídio, freqüentemente na forma de corpos oleosos cito-plásmicos em, tipicamente, pelo menos cerca de 20% de seu peso celular seco; e (ii) produzem carotenóide(s) em um nível de pelo menos cerca de 1% e, em algumas modalidades, pelo menos cerca de 3-20% de seu peso celular seco, são gerados através de manipulação de células hospedeiras (isto é, gêneros incluindo, por exemplo, gêneros que ocorrem naturalmente, gêneros os quais foram previamente modificados, etc). Essas células hospedeiras manipuladas são, então, usadas para produzir carotenóides, de modo que carotenóides que participam dos corpos lipídicos possam ser prontamente isolados.

Em geral, será desejável equilibrar a oleaginidade e produção de carotenóide em células da invenção, de modo que, tão logo um nível deseja-vel mínimo de oleaginidade seja obtido, substancialmente todo carbono adicional o qual é capaz de ser utilizado e dirigido para a biossíntese de produtos seja dirigido a uma via de produção de carotenóide. Em algumas modalidades da invenção, essa estratégia envolve manipulação de células para serem oleaginosas; em outras modalidades, ela envolve manipulação de células para acumular um nível maior de lipídio, particularmente lipídio cito-plásmico, do que elas acumulariam na ausência de tal manipulação, mesmo embora as células manipuladas possam não se tornar "oleaginosas", conforme definido aqui. Em outras modalidades, a extensão até a qual uma célula hospedeira oleaginosa acumula lipídio é realmente reduzida, de modo que o carbono restante possa ser utilizado na produção de carotenóide. Células Hospedeiras

Aqueles habilitados na técnica apreciarão prontamente que existe uma variedade de gêneros de levedo e fungo que são naturalmente oleaginosos ou que produzem naturalmente carotenóides. Qualquer um de tais gêneros pode ser utilizado como gêneros hospedeiros de acordo com a presente invenção e pode ser projetadas ou de outro modo manipuladas para gerar os gêneros oleaginosos que produzem carotenóide da invenção. Alternativamente, gêneros que não são naturalmente oleaginosos nem produzem carotenóides podem ser empregados. Além disso, mesmo quando um gênero em particular tem uma capacidade natural para oleaginidade ou para produção de carotenóide, suas capacidades naturais podem ser ajustadas conforme descrito aqui, de modo a alterar o nível de produção de lipídio e/ou carotenóide. Em determinadas modalidades, projeção ou manipulação de um gênero resulta em modificação de um tipo de lipídio e/ou carotenóide o qual é produzido. Por exemplo, um gênero pode ser naturalmente oleaginoso e/ou carotenogênico, contudo, manipulação ou modificação do gênero pode ser empregada de modo a alterar o tipo de lipídio o qual é acumulado e/ou alterar o tipo de carotenóide o qual é produzido.

Quando de seleção de um gênero de levedo ou fúngico em particular para uso de acordo com a presente invenção, geralmente será desejável selecionar um cujas características de cultura sejam passíveis de pro-dução em escala comercial. Por exemplo, geralmente (embora nem sempre necessariamente) será desejável evitar organismos filamentosos ou organismos com requisitos particularmente incomuns ou estringentes para condições de crescimento. Contudo, onde condições para escala produção em escala comercial podem ser aplicadas as quais permitem utilização de organismos filamentosos, esses podem ser selecionados como células hospedeiras. Em algumas modalidades da invenção, seria desejável utilizar organismos comestíveis como células hospedeiras, uma vez que eles podem, opcionalmente, ser formulados diretamente em aditivos para alimentos ou rações ou em suplementos nutricionais, conforme desejado. Para facilidade de produção, algumas modalidades da invenção utilizam células hospedeiras que são geneticamente tratáveis, passíveis de genética molecular (por e-xemplo, podem ser eficazmente transformadas, especialmente com vetores estabelecidos ou disponíveis; opcionalmente podem incorporar e/ou integrar genes múltiplos, por exemplo, seqüencialmente; e/ou têm seqüência genética conhecida; etc), desprovidos de requisitos complexos de crescimento (por exemplo, uma necessidade pela luz), mesofílicos (por exemplo, preferem temperaturas de crescimento na faixa de cerca de 25-32 eC), capazes de assimilar uma variedade de fontes de carbono e nitrogênio e/ou capazes de crescimento em alta densidade celular. Alternativa ou adicionalmente, várias modalidades da invenção utilizam células hospedeiras que crescem como células únicas ao invés de organismos multicelulares (por exemplo, como micélios).

Em geral, quando é desejável utilizar um organismo naturalmente oleaginoso de acordo com a presente invenção, qualquer organismo oleaginoso modificável e cultivável pode ser empregado. Em determinadas modalidades da invenção, levedos ou fungos de gêneros incluindo, mas não limitado a, Blakeslea, Cândida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon e Yarrowia são empregados. Em determinadas modalidades particulares, organismos de espécies que incluem, mas não estão limitados a, Blakeslea frispora, Cândida pulcherrima, C. revkaufi, C. tropicalis, Crypto-coccus curvatus, Cunninghamella echinulata, C. elegans, C. japonica, Li-pomyces starkeyi, L. lipoferus, Mortierella alpina, M. isabellina, M. ramannia-na, M. vinacea, Mucor circinelloides, Phycomyces blakesleanus, Pythium irregulare, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, R. gracilis, R. graminis, R. mucilaginosa, R. pinicola, Trichosporon pullans, T. cutaneum e Yarrowia lipolytica, são usados.

Desses gêneros naturalmente oleaginosos, alguns também produzem naturalmente carotenóides e alguns não. Na maioria dos casos, apenas baixos níveis (menos de cerca de 0,05% em peso celular seco) de carotenóides são produzidos por levedos ou fungos oleaginosos que ocorrem naturalmente. Níveis maiores de p-caroteno são, algumas vezes, produzidos, mas altos níveis de outros carotenóides geralmente não são observados.

Em geral, qualquer organismo que é naturalmente oleaginoso e não produz carotenóide (por exemplo, produz menos de cerca de 0,05% de peso celular seco, não produz o carotenóide de interesse) pode ser utilizado como uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, o organismo é um levedo ou fungo de um gênero tal como, mas não limitado a, Cândida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomy-ces, Mortierella, Pythium, Trichosporon e Yarrowia; em algumas modalidades, o organismo é de uma espécie incluindo, mas não limitado a, Mortierella alpina e Yarrowia lipolytica.

Comparavelmente, a presente invenção pode utilizar qualquer organismo naturalmente oleaginoso que produz carotenóide como uma célula hospedeira. Em geral, a presente invenção pode ser utilizada para aumentar o fluxo de carbono na via de isoprenóide em organismos que produzem naturalmente carotenóides (particularmente para outros organismos que não Blakeslea e Phycomyces) e/ou para desviar a produção de um carotenóide (por exemplo, p-caroteno) para outro (por exemplo, astaxantina). Introdução de uma ou mais modificações carotenogenicas (por exemplo, expressão aumentada de um ou mais polipeptídeos carotenogenicos endogenos ou heterólogos) de acordo com a presente invenção, pode obter esses objeti-vos.

Em determinadas modalidades da invenção, o organismo oleaginoso que produz carotenóide utilizado é um levedo ou fungo, por exemplo, um gênero tal como, mas não limitado a, Blakeslea, Mucor, Phycomyces, Khodosporidium e Rhodotorula; em algumas modalidades, o organismo é de uma espécie tal como Mucor circinelloides e Phodotorula glutinis.

Quando é desejável utilizar gêneros que são naturalmente não-oleaginosos como células hospedeiras de acordo com a presente invenção, gêneros de levedos ou fungos não-oleaginosos incluem, mas não estão limitados a, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Kluyve-romyces, Neurospora, Penicillium, Pichia (Hansenula), Puccinia, Saccha-romyces, Sclerotium, Trichoderma e Xanthophyllomyces (Phaffia); em algumas modalidades, o organismo é de uma espécie incluindo, mas não limitado a, Aspergillus nidulans, A. niger, A. terreus, Botrytis cinema, Cercospora nicotianae, Fusarium fujikuroi (Gibberella zeae), Kluyveromyces lactis, K. lactis, Neurospora crassa, Pichia pastoris, Puccinia distincta, Saccharomy-ces cerevisiae, Sclerotium rolfsii, Trichoderma reesei e Xanthophyllomyces dendrorhous {Phaffia rhodozyma).

Será apreciado que o termo "não-oleaginoso", conforme usado aqui, abrange gêneros que têm naturalmente alguma capacidade de acumular lipídio, especialmente citoplasmicamente, mas não o fazem em um nível suficiente para qualificá-los como "oleaginosos" conforme definido aqui, bem como gêneros que não têm naturalmente qualquer capacidade de acumular lipídio extra, por exemplo, lipídio extra-membranoso. Será ainda apreciado que, em algumas modalidades da invenção, será suficiente aumentar o nível natural de oleaginidade de uma célula hospedeira em particular, mesmo se a célula modificada não é qualificada como oleaginosa, conforme definido a-qui.

Conforme com organismos naturalmente oleaginosos, alguns dos fungos naturalmente não-oleaginosos produzem naturalmente carotenóides, enquanto que outros não. Gêneros de fungos naturalmente não-oleaginosos que não produzem naturalmente carotenóides (por exemplo,produzem menos de cerca de 0,05% em peso celular seco, não produzem carotenóide de interesse) podem, desejavelmente, ser usados como células hospedeiras de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Aspergillus, Kluyveromyces, Penicillium, Saccharomyces e Pi-chia; espécies incluem, mas não estão limitadas a, Aspergillus niger e Saccharomyces cerevisiae. Gêneros de fungos naturalmente não-oleaginosos que não produzem naturalmente carotenóides e que podem, desejavelmente, ser usados como células hospedeiras de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Neurospora, Puccinia, Sclerotium, Trichoderma e Xanthophyl-lomyces (Phaffia); espécies incluem, mas não estão limitadas a, Xanthophyl-lomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma).

Conforme discutido acima, qualquer um de uma variedade de organismos pode ser empregado como células hospedeiras de acordo com a presente invenção. Em determinadas modalidades da invenção, células hospedeiras serão células de Yarrowia lipolytica. Vantagens de Y. lipolytica incluem, por exemplo, genética e biologia molecular tratável, disponibilidade de seqüência genômica (veja, por exemplo, Sherman e colaboradores, Nu-cleicAcids Res. 32 (edição de Banco de Dados): D315-8, 2004), adequabili-dade a várias condições de crescimento com custo eficaz e capacidade de crescer em alta densidade celular. Além disso, Y. lipolytica é naturalmente oleaginoso, de modo que menos manipulações podem ser requeridas para gerar um gênero de Y. lipolytica oleaginoso que produz carotenóide do que poderia ser requerido para outros organismos. Além disso, já existe uma experiência comercial extensiva com Y. lipolytica.

Saccharomyces cerevisiae é também uma célula hospedeira útil de acordo com a presente invenção, particularmente em virtude de sua tra-tabilidade experimental e a experiência extensiva que os pesquisadores a-cumularam com o organismo. Embora cultura de Saccharomyces sob determinadas condições ricas em carbono possa resultar em produção aumentada de etanol, isso geralmente pode ser gerenciado através de alterações no processo e/ou genéticas.Hospedeiros úteis adicionais incluem Xanthophyllomyces den-drorhous (Phaffia rhodozyma), o qual é experimentalmente tratável e naturalmente carotenogênico. Gêneros de Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) podem produzir vários cárotenóides, incluindo astaxan-tina.

Aspergillus niger e Mortierella alpina acumulam grandes quantidades de ácido cítrico e ácido graxo, respectivamente; Mortierella alpina também é oleaginoso.

Neurospora ou Gibberella também são úteis. Eles são não naturalmente oleaginosos e tendem a produzir níveis muito baixos de cárotenóides, assim, modificação extensiva pode ser requerida de acordo com a presente invenção. Neurospora e Gibberella são considerados relativamente tratáveis de um ponto de vista experimental. Ambos são fungos filamento-sos, de modo que a produção em escalas comerciais pode ser um desafio que precisa ser superado na utilização de tais gêneros.

Mucor circinelloides é outra espécie útil disponível. Embora sua genética molecular seja geralmente menos acessível do que aquela de alguns outros organismos, ele produz (3-caroteno naturalmente, assim, pode requerer menos modificação do que outras espécies disponíveis.

Genética molecular pode ser realizada em Blakeslea, embora esforço significativo possa ser requerido. Além disso, condições de fermentação com custo eficaz podem ser desafiadoras conforme, por exemplo, pode ser requerido que os dois tipos combinados sejam misturados. Fungos do gênero Phycomyces são também possíveis fontes as quais têm o potencial de impor desafios ao processo de fermentação e esses fungos também podem ser menos passíveis de manipulação do que vários outros organismos hospedeiros potenciais.

Aqueles habilitados na técnica apreciarão que a seleção de uma célula hospedeira particular para uso de acordo com a presente invenção também afetará, por exemplo, a seleção de seqüências de expressão utilizadas com qualquer polipeptídeo heterólogo a ser introduzido na célula e também influenciará vários aspectos de condições de cultura, etc. Muito sesabe sobre os diferentes requisitos regulatórios de gene, requisitos de seqüência de objetivação de proteína e requisitos de cultura de diferentes células hospedeiras a serem utilizadas com a presente invenção (veja, por e-xemplo, com relação a Yarrowià, Barth e colaboradores, FEMS Microbiol Rev. 19: 219, 1997; Madzak e colaboradores, J Biotechnol. 109: 63, 2004; veja, por exemplo, com relação a Xanthophyllomyces, Verdoes e colaboradores, Appl Environ Microbiol 69: 3728-38, 2003; Visser e colaboradores, FEMS Yeast Res 4: 221-31, 2003; Martinez e colaboradores, Antonie Van Leeuwenhoek. 73(2): 147-53, 1998; Kim e colaboradores, Appl Environ Microbiol. 64(5): 1947-9, 1998; Wery e colaboradores, Gene 184(1): 89-97, 1997; veja, por exemplo, com relação a Saccharomyces, Guthrie e Fink, Me-thods in Enzymology 194: 1-933, 1991). Em determinados aspectos, por e-xemplo, seqüências de objetivação da célula hospedeira (ou análogos intimamente relacionados) podem ser úteis para incluir proteínas heterólogas de direcionamento à localização subcelular. Assim, tais seqüências de objetivação úteis podem ser adicionadas à seqüência heteróloga para localização intracelular apropriada de atividade. Em outros aspectos (por exemplo, adição de seqüências de objetivação mitocondrial), seqüências de objetivação heterólogas podem ser eliminadas ou alteradas na seqüência heteróloga selecionada (por exemplo, alteração ou remoção de seqüências de objetivação de cloroplasta de planta do organismo fonte). Manipulação de Oleaginidade

Todos os organismos vivos sintetizam lipídios para uso em suas membranas e várias outras estruturas. Contudo, a maioria dos organismos não acumula mais de cerca de 10% de seu peso celular seco como lipídio total e a maior parte desse lipídio geralmente reside dentro das membranas celulares.

Trabalho bioquímico significativo foi feito para definir as enzimas metabólicas necessárias para conferir oleaginidade a microorganismos (primariamente em virtude de manipulação de óleos de células simples, tais como fontes comerciais de ácido araquidônico e ácido docosahexaenóico; veja, por exemplo, Ratledge Biochimie 86: 807, 2004, os conteúdos dosquais são aqui incorporados por referência). Embora esse trabalho bioquímico seja convincente, antes da presente invenção não havia relatos de olea-ginidade de novo sendo estabelecida através de engenharia genética com os genes que codificam as enzimas metabólicas chave.

Deve ser observado que organismos oleaginosos tipicamente não acumulam lipídio quando crescidos sob condições de excesso de carbono e limitação de nitrogênio ou outro nutriente. Sob essas condições, o organismo elimina prontamente o nutriente limitante, mas continua a assimilar a fonte de carbono. O carbono "em excesso" é canalizado para a biossín-tese de lipídio, de modo que lipídios (usualmente triacilgliceróis) se acumulam no citosol, tipicamente na forma de corpos.

Em geral, acredita-se que, de forma a ser oleaginoso, um organismo deve produzir acetil-CoA e NADPH no citosol os quais podem, então, ser utilizados pela maquinaria de sintase de ácido graxo para gerar lipídios. Em pelo menos alguns organismos oleaginosos, acetil-CoA é gerada no citosol através da ação da liase de ATP-citrato, a qual catalisa a reação: (1) citrato + CoA + ATP - acetil-CoA + oxaloacetato + ADP + P,.

Naturalmente, de forma que a liase de ATP-citrato gere níveis apropriados de acetil-CoA no citosol, ela deve primeiro ter um reservatório disponível de seu substrato, ácido citrico. Ácido citrico é gerado nas mitocondrias de todas as células eucariotas através do ciclo de ácido tricarboxíli-co (TCA) e pode ser movido para o citosol (na troca por malato) pela translo-case de citrato/malato.

Na maioria dos organismos oleaginosos e em alguns organismos não-oleaginosos, a enzima dehidrogenase de isocitrato, a qual opera como parte do ciclo de TCA nas mitocondrias, é fortemente AMP-dependente. Assim, quando AMP é eliminado das mitocondrias, essa enzima é inativada. Quando dehidrogenase de isocitrato é inativa, isocitrato se acumula nas mitocondrias. Esse isocitrato acumulado é, então, equilibrado com ácido citrico, presumivelmente através da ação de aconitase. Portanto, sob condições de baixo AMP, citrato se acumula nas mitocondrias. Conforme mencionado acima, citrato nas mitocondrias é prontamente transportadopara o citosol.

Eliminação de AMP o qual, em organismos oleaginosos, acredita-se que inicie a cascata que leve ao acúmulo de citrato (e, portanto, acetil-CoA) no citoplasma, ocorre como um resultado da eliminação de nutriente mencionada acima. Quando células oleaginosas são crescidas na presença de fonte de carbono em excesso, mas sob condições limitativas para nitrogênio ou algum outro nutriente, a atividade de deaminase de AMP, a qual catalisa a reação:

(2) AMP —► 5'-monofosfato de inosina + NH3

É fortemente induzida. A atividade aumentada dessa enzima elimina o AMP celular no citosol e nas mitocôndrias. Acredita-se que eliminação de AMP das mitocôndrias inativa a dehidrogenase de isocitrato AMP-dependente, resultando em acúmulo de citrato nas mitocôndrias e, portanto, no citosol. Essa série de eventos é representada diagramaticamente na Figura 2.

Conforme mencionado acima, oleaginidade requer acetil-CoA citosólica e NADPH citosólico. Acredita-se que, em muitos organismos oleaginosos, níveis apropriados de NADPH citosólico são proporcionados através da ação da enzima málica (Enzima 3 na Figura 2). Alguns organismos oleaginosos (por exemplo, üpomyces e algumas Cândida) não parecem ter enzimas málicas, contudo, de modo que evidentemente outras enzimas podem proporcionar atividade comparável, embora espera-se que uma fonte dedicada de NADPH seja, provavelmente, requerida para síntese de ácido graxo (veja, por exemplo, Wynn e colaboradores, Microbiol 145: 1911, 1999; Ratledge, Adv. Appl. Microbiol. 51: 1, 2002, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade).

Assim, de acordo com a presente invenção, a oleaginidade de um organismo hospedeiro pode ser intensificada através de modificação da expressão ou atividade de um ou mais polipeptídeos envolvidos na geração de acetil-CoA citosólico e/ou NADPH. Por exemplo, modificação da expressão ou atividade de um ou mais de carboxilase de acetil-CoA, decarboxilase de piruvato, dehidrogenase de isocitrato, liase de ATP-citrato, enzima málicae AMP-deaminase pode intensificar a oleaginidade de acordo com a presente invenção. Polipeptídeos exemplificativos os quais podem ser utilizados ou derivados de modo a intensificar a oleaginidade de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, os polipeptídeos de carboxila-se de acetil-CoA, decarboxilase de piruvato, dehidrogenase de isocitrato, liase de ATP-citrato, enzima málica e AMP-deaminase proporcionados na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4, Tabela 5 e Tabela 6, respectivamente.

Em algumas modalidades da invenção, onde uma célula hospedeira oleaginosa é empregada, enzimas e componentes regulatórios relevantes para a oleaginidade já estão no lugar, mas poderiam ser modificados, se desejado, por exemplo, através de alteração da expressão ou atividade de um ou mais polipeptídeos oleagínicos e/ou através de introdução de um ou mais polipeptídeos oleagínicos heterólogos. Naquelas modalidades da invenção onde uma célula hospedeira não-oleaginosa é empregada, geralmente espera-se que pelo menos um ou mais polipeptídeos oleagínicos heterólogos sejam introduzidos.

A presente invenção considera não apenas introdução de polipeptídeos oleaginosos heterólogos, mas também ajuste dos níveis de expressão ou atividade de polipeptídeos oleagínicos endógenos ou heterólogos incluindo, por exemplo, alteração de padrões de expressão constitutiva ou induzível. Em algumas modalidades da invenção, padrões de expressão são ajustados de modo que o crescimento em condições com limitação de nutrientes não seja requerido para induzir à oleaginidade. Por exemplo, modificações genéticas compreendendo alteração e/ou adição de seqüências regulatórias (por exemplo, elementos promotores, elementos terminadores) podem ser utilizadas para conferir regulação particular de padrões de expressão. Tais modificações genéticas podem ser utilizadas em conjunto com genes endógenos (por exemplo, para regulação de polipeptídeo(s) oleagíni-co(s) endógeno(s)); alternativamente, tais modificações genéticas podem ser incluídas de modo a conferir regulação de expressão de pelo menos um po-lipeptídeo heterólogo (por exemplo, polipeptídeo(s) oleagínico(s)). Por e-xemplo, promotores incluindo, mas não limitado a, promotores Tef1, Gpd1, podem ser usados em conjunto com genes endógenos e/ou genes heterólo-gos para modificação de expressão de padrões de polipeptídeos oleagínicos endógenos e/ou polipeptídeos oleagínicos heterólogos. Similarmente, seqüências terminadoras exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, uso de seqüências terminadoras XPR2 de Y. lipolytica.

Em algumas modalidades, pelo menos um polipeptídeo oleagíni-co é introduzido em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades da invenção, uma pluralidade (por exemplo, dois ou mais) de diferentes polipeptídeos oleagínicos é introduzida na mesma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a pluralidade de polipeptídeos oleagínicos contém polipeptídeos do mesmo organismo fonte; em outras modalidades, a pluralidade inclui polipeptídeos independentemente selecionados de diferentes organismos fonte.

Exemplos representativos de uma variedade de polipeptídeos oleagínicos que podem ser introduzidos em ou modificados dentro de células hospedeiras de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles proporcionados nas Tabelas 1-6. Conforme mencionado acima, espera-se que pelo menos alguns desses polipeptídeos (por exemplo, enzima málica e liase de ATP-citrato) mostrem atuar desejavelmente em conjunto e possivelmente junto com um ou mais componentes da sintase de ácido graxo de modo que, em algumas modalidades da invenção, será desejável utilizar dois ou mais polipeptídeos oleagínicos do mesmo organismo fonte.

Em geral, organismos fonte para polipeptídeos oleagínicos a serem usados de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Blakeslea, Cândida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon, Yarrowia, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibbe-rella), Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia (Hansenula), Puccini-a, Saccharomyces, Sclerotium, Trichoderma e Xanthophyllomyces (Phaffia). Em algumas modalidades, as espécies fonte para polipeptídeos de carboxi-lase de acetil CoA, liase de ATP-citrato, enzima málica e/ou deaminase de AMP incluem, mas não estão limitadas a, Aspergillus nidulans, Cryptococcus neoformans, Fusarium fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Ustilago maydis e Yarrowia lipolytica. Em algumas modalidades, espécies fonte para polipeptí-deos de decarboxilase de piruvato ou dehidrogenase de isocitrato incluem, mas não estão limitadas a, Neurospora crassa, Xanthophyllomyces dendro-rhous (Phaffia rhodozyma), Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Mucor circinelloides, Rhodotorula glutinis, Cândida utilis, Mortierella alpina e Yarrowia lipolytica.

Produção de Carotenóide por Manipulação

Carotenóides são sintetizados a partir de precursores de isopre-nóide, alguns dos quais também estão envolvidos na produção de esteróides e esteróis. A via de biossíntese de isoprenóide mais comum, algumas vezes referida como a "via de mevalonato", é representada de modo geral na Figura 3. Conforme mostrado, acetil-CoA é convertida, via hidróximetiglutaril-CoA (HMG-CoA), em mevalonato. O mevalonato é, então, fosforilado e convertido no composto com cinco carbonos pirofosfato de isopentenila (IPP). Após isomerização de IPP em pirofosfato de dimetilalila (DMAPP), três reações de condensação seqüenciais com moléculas adicionais de IPP geram a molécula com dez carbonos pirofosfato de geranila (GPP), seguido pela molécula com quinze carbonos pirofosfato de farnesila (FPP) e finalmente o composto de vinte carbonos pirofosfato de geranilgeranila (GGPP).

Uma via de biossíntese de isoprenóide alternativa que é utilizada por alguns organismos (particularmente bactérias) e é algumas vezes denominada a "via mevalonato-independente" é representada na Figura 4. Essa via é iniciada pela síntese de 1-deoxi-D-xiloglicose-5-fosfato (DOXP) a partir de piruvato e gliceraldeído-3-fosfato. DOXP é, então, convertida, via uma série de reações mostradas na Figura 4, em IPP, o qual isomeriza em DMAPP e é, então, convertido, via GPP e FPP, em GGPP conforme mostrado na Figura 3 e discutido acima.

Várias proteínas envolvidas na biossíntese de isoprenóide foramidentificadas e caracterizadas em uma série de organismos. Além disso, vários aspectos da via de biossíntese de isoprenóide são conservados através dos reinos fúngico, bacteriano, vegetal e animal. Por exemplo, polipeptídeos correspondendo à tiolase de acetoacetil-CoA, sintase de HMG-CoA, reduc-tase de HMG-CoA, quínase de mevalonato, quínase de fosfomevalonato, decarboxilase de pirofosfato de mevalonato, isomerase de IPP, sintase de FPP e sintase de GGPP mostrados na Figura 3 foram identificados em e isolados de uma ampla variedade de organismos e células. Exemplos representativos de uma ampla variedade de tais polipeptídeos são proporcionados nas Tabelas 7-15. Um ou mais dos polipeptídeos selecionados daqueles proporcionados em qualquer uma das Tabelas 7-15 podem ser utilizados ou derivados para uso nos métodos e composições de acordo com a presente invenção.

De acordo com a presente invenção, a produção de carotenóide em um organismo hospedeiro pode ser ajustada através de modificação da expressão ou atividade de uma ou mais proteínas envolvidas na biossíntese de isoprenóides. Em algumas modalidades, tal modificação envolve introdução de um ou mais polipeptídeos heterólogos da biossíntese de isoprenóide na célula hospedeira; alternativa ou adicionalmente, modificações podem ser feitas na expressão ou atividade de um ou mais polipeptídeos endógenos ou heterólogos da biossíntese de isoprenóide. Dada a conservação considerável de componentes dos polipeptídeos da biossíntese de isoprenóide, espera-se que polipeptídeos heterólogos da biossíntese de isoprenóide freqüentemente funcionem mesmo em organismos significativamente divergentes. Além disso, seria desejável introduzir mais de um polipeptídeo heterólogo da biossíntese de isoprenóide, em muitos casos polipeptídeos de diferentes organismos fonte funcionarão juntos. Em algumas modalidades da invenção, uma pluralidade de diferentes polipeptídeos heterólogos da biossíntese de isoprenóide é introduzida na mesma célula hospedeira. Em algumas modalidades, essa pluralidade contém apenas polipeptídeos do mesmo organismo fonte (por exemplo, duas ou mais seqüências de, ou seqüências derivadas de, o mesmo organismo fonte); em outras modalidades, a pluralidade incluipolipeptídeos independentemente selecionados de diferentes organismos fonte (por exemplo, duas ou mais seqüências de, ou seqüências derivadas de, pelo menos dois organismos fonte independentes).

Em algumas modalidades da presente invenção que utilizam polipeptídeos heterólogos da biossíntese de isoprenóide, os organismos fonte incluem, mas não estão limitados a, fungos dos gêneros Blakeslea, Cândida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phy-comyces, Pythium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon, Yarrowia, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia (Hansenula), Puccinia, Saccharomyces, S-chizosaccharomyces, Sclerotium, Trichodèrma, Ustilago e Xanthophyllomy-ces (Phaffia). Em determinadas modalidades, os organismos fonte são de uma espécie incluindo, mas não limitado a, Cryptococcus neoformans, Fusarium fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Ustilago maydis e Yarrowia lipoly-tica.

Conforme mencionado acima, a via de biossíntese de isoprenóide também está envolvida na produção de compostos de não-carotenóide, tais como esteróis, esteróides e vitaminas, tais como vitamina E ou vitamina K. Proteínas que atuam sobre intermediários da via de biossíntese de isoprenóide e divergem os mesmos para a biossíntese de compostos de não-carotenóide são, portanto, inibidores indiretos da biossíntese de carotenóide (veja, por exemplo, Figura 5, a qual ilustra pontos nos quais intermediários de isoprenóide são canalizados para outras vias de biossíntese). Tais proteínas são, portanto, consideradas polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide. Espera-se que reduções do nível ou atividade de tais polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide aumentem a produção de carotenóide em células hospedeiras de acordo com a presente invenção.

Em algumas modalidades da presente invenção, produção ou atividade de polipeptídeos competidores da biossíntese de carotenóide en-dógenos pode ser reduzida ou eliminada em células hospedeiras. Em algu-mas modalidades, essa redução ou eliminação da atividade de um polipeptí-deo competidor da biossíntese de isoprenóide pode ser obtida através de tratamento do organismo hospedeiro com inibidores de pequena molécula de enzimas da via de biossíntese de ergosterol. Enzimas da via de biossíntese de ergosterol incluem, por exemplo, sintase de esqualeno, epoxidase de esqualeno, ciclase de 2,3-oxidoesqualeno-lanosterol, 14oc-demetilase de lanosterol do citocroma P450, reductase de C-14 esterol, metil oxidase de C-4 esterol, metiltransferase de SAM:C-24 esterol, isomerase de C-8 esterol, desaturase de C-5 esterol, desaturase de C-22 esterol e reductase de C-24 esterol. Cada uma dessas enzimas é considerada um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide. Reguladores dessas enzimas também podem ser considerados polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide (por exemplo, as proteínas de levedo Sut1 (Acesso ao Genbank JC4374 Gl:2133159) e Mot3 (Acesso ao Genbank NP_013786 GL6323715), os quais podem ou não ter homólogos em outros organismos.

Em outras modalidades, redução ou eliminação da atividade de um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide pode ser obtida através de diminuição de atividade da via de biossíntese de ubiquinona. A etapa obrigatória na biossíntese de ubiquinona é a formação de para-hidróxibenzoato (PHB) a partir de tirosina ou fenilalanina em mamíferos ou corismato em bactérias, seguido por condensação de PHB e do precursor isopreno, resultando na adição de um grupo prenila. Essa reação é catalisada pela PHB-polipreniltransferase. A cadeia lateral de isoprenóide de ubiquinona é determinada pela enzima sintase de prenil-difosfato. O ácido 3-decaprenil-4-hidróxibenzóico resultante da reação de condensação de PHB e decaprenil-difosfato sofre outras modificações, as quais incluem hidroxila-ção, metilação e decarboxilação, de modo a formar ubiquinona (CoQ10). Assim, inibição da sintase de prenil-difosfato que leva ao farnesil-difosfato para carotenóides estendidos ou inibição de PHB-polipreniltransferase pode ser útil no aumento da quantidade de isoprenóide disponível para biossíntese de carotenóide. (Exemplos das enzimas sintase de prenil-difosfato e PHB-polipreniltransferase são representados nas Tabelas 29 e 30, respecti-vãmente).

Inibidores de pequena molécula conhecidos de enzimas competidoras da biossíntese de isoprenóide incluem, mas não estão limitados a, ácido zaragósico (incluindo análogos do mesmo, tais como TAN1607A (Bio-chem Biophys Res Commun, 15 de Fevereiro de 1996; 219(2): 515-520)), RPR 107393 (dihidrocloreto de 3-hidróxi-3-[4-(quinolin-6-il)fenil]-1-azabiciclo[2-2-2]octano; J Pharmacol Exp Ther. Maio de 1997; 281(2): 746-52), ER-28448 (sal trissódico de ácido 5-{N-[2-butenil-3-(2- metóxifenil)]-N-metilamino}-1,1-pentilidenobis(fosfônico); Journal of Lipid Research, Vol. 41, 1136-1144, Julho de 2000), BMS-188494 (The Journal of Clinicai Pharmaco-logy, 1998; 38: 1116-1121), TAK-475 (ácido l-[2-[(3R,5S)-1-(3-acetóxi-2,2-dimetilpropil)-7-cloro-1,2,3,5 -tetrahidro-2-oxo-5-(2,3-dimetóxifenil)-4,1-benzoxazepina-3-il]acetil]piperidin-4-acético; Eur J Pharmacol. 11 de Abril de 2003; 466(1-2): 155-61), YM-53601 (monohidrocloreto de (E)-2-[2-fluoro-2-(quinuclidin-3-ilideno) etóxi]-9H-carbazola; Br J Pharmacol. Setembro de 2000; 131(1): 63-70) ou esqualestatina I, que inibe a sintase de esqualeno; terbinafina, que inibe a epoxidase de esqualeno; várias azolas que inibem a 14oc-demetilase de lanosterol de citocroma P450; e fenpropimorph, que inibe a reductase de C-14 esterol e a isomerase de C-8 esterol. Em outras modalidades, polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide heterólo-gos podem ser utilizados (quer funcionais ou não funcionais; em algumas modalidades, mutantes dominantes-negativos são empregados).

Um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide particular útil de acordo com a presente invenção é sintase de esqualeno, a qual foi identificada e caracterizada a partir de uma variedade de organismos; exemplos representativos de seqüências de polipeptídeo de sintase de esqualeno são incluídos na Tabela 16. Em algumas modalidades da invenção que utilizam de sintase de esqualeno (ou modificações de sintase de esqualeno) organismos fonte incluem, mas não estão limitados a, Neurospora crassa, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Mucor circinelloides, Rhotorula glutinis, Cândida utilis, Mortierella alpina e Yarrowia lipolytica.A via da biossíntese de isoprenóide se ramifica da via de bios-síntese de isoprenóide no ponto onde GGPP é formado. A etapa obrigatória na biossíntese de carotenóide é a formação de fitoeno através de condensação cabeça-a-cabeça de duas moléculas de GGPP, catalisada pela sintase de fitoeno (freqüentemente denominada crtB; veja Figura 6). Uma série de reações de desidrogenação, cada uma das quais aumenta o número de ligações duplas conjugadas por dois, converte fitoeno em licopeno via neurospo-reno. A via se ramifica em vários pontos, antes e após produção de licopeno, de modo que uma faixa de carotenóides pode ser gerada. Por exemplo, a-ção de uma enzima ciclase sobre o licopeno gera y-licopeno; ação de uma desaturase, ao contrário, produz 3,4-didehidrolicopeno. y-caroteno é convertido em p-caroteno através da ação de uma ciclase, p-caroteno pode ser processado em qualquer um de uma série de produtos (veja, por exemplo, Figura 6C), incluindo astaxantina (via echinona, hidróxiechinona e foenico-xantina).

De acordo com a presente invenção, a produção de carotenóide em um organismo hospedeiro pode ser ajustada através de modificação da expressão ou atividade de uma ou mais proteínas envolvidas na biossíntese de carotenóide. Conforme indicado, em algumas modalidades, será desejável utilizar, como células hospedeiras, organismos que produzem naturalmente um ou mais carotenóides. Em alguns de tais casos, o foco estará sobre aumento da produção de um carotenóide naturalmente produzido, por exemplo, através de aumento do nível e/ou atividade de uma ou mais proteínas envolvidas na síntese desse carotenóide e/ou através de diminuição do nível ou atividade de uma ou mais proteínas envolvidas em uma via de biossíntese competitiva. Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, será desejável gerar a produção de um ou mais carotenóides não naturalmente produzidos pela célula hospedeira.

De acordo com algumas modalidades da invenção, será desejável introduzir um ou mais polipeptídeos carotenogenicos heterólogos em uma célula hospedeira. Conforme será evidente para aqueles habilitados na técnica, qualquer um de uma variedade de polipeptídeos heterólogos podeser empregado; seleção considerará, por exemplo, o carotenóide em particular cuja produção tem de ser intensificada. A presente invenção considera não apenas introdução de polipeptídeos carotenogênicos heterólogos, mas também ajuste dos níveis de expressão ou atividade de polipeptídeos carotenogênicos heterólogos ou endógenos incluindo, por exemplo, alteração de padrões de expressão constitutiva ou induzível. Em algumas modalidades da invenção, padrões de expressão são ajustados de modo que crescimento em condições com limitação de nutriente não é requerido para induzir à ole-aginidade. Por exemplo, modificações genéticas compreendendo alteração e/ou adição de seqüências regulatórias (por exemplo, elementos promotores, elementos terminadores) podem ser utilizadas para conferir regulação particular de padrões de expressão. Tais modificações genéticas podem ser utilizadas em conjunto com genes endógenos (por exemplo, para regulação de carotenogênico endógeno); alternativamente, tais modificações genéticas podem ser incluídas de modo a conferir regulação de expressão de pelo menos um polipeptídeo heterólogo (por exemplo, polipeptídeo carotenogênico)). Por exemplo, promotores incluindo, mas não limitado a, promotores Tef1, Gpd1, podem ser usados em conjunto com os genes endógenos e/ou genes heterólogos para modificação de padrões de expressão de polipeptí-deo(s) carotenogênico(s) endógeno(s) e/ou polipeptídeo(s) carotehogêni-co(s) heterólogo(s). Similarmente, seqüências terminadoras exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, uso de seqüências terminadoras XPR2 de Y. lipolytica.

Conforme indicado na Figura 6 e na literatura, proteínas envolvidas na biossíntese de carotenóide incluem, mas não estão limitadas a, sin-tase de fitoeno, dehidrogenase de fitoeno, ciclase de licopeno, cetolase de carotenóide, hidroxilase de carotenóide, sintase de astaxantina (uma enzima multifuncional única encontrada em alguns organismos fonte que, tipicamente, tem atividades de cetolase e hidroxilase), epsilon hidroxilase de carotenóide, ciclase de licopeno (subunidades beta e epsilon), glicosiltransferase de carotenóide e aciltransferase de acil CoA:diacilglicerol. Seqüências e-xemplificativas representativas para esses polipeptídeos da biossíntese decarotenóide são proporcionadas nas Tabelas 17-25.

Xantofilas podem ser distinguidas de outros carotenóides pela presença de grupos funcionais contendo oxigênio em seus grupos terminais cíclicos. Por exemplo, luteína e zeaxantina contêm um único grupo hidroxila sobre cada uma de suas estruturas de anel terminais, enquanto que asta-xantina contém um grupo ceto e um hidroxila sobre cada anel terminal. Essa propriedade torna xantofilas mais polares do que carotenos, tais como beta-caroteno e licopeno e, assim, reduz dramaticamente sua solubilidade em gorduras e lipídios. Xantofilas que ocorrem naturalmente são, freqüentemente, encontradas como ésteres dos grupos hidroxila terminais, mono- e diéste-res de ácidos graxos. Elas também ocorrem como glicosídeos em determinadas espécies de bactérias. A solubilidade e dispersibilidade de xantofilas podem ser grandemente modificadas através da adição de porções éster e se sabe que esterificação também pode afetar a absorção e/ou biodisponibi-lidade de um determinado carotenóide. É um objetivo da presente invenção maximizar a quantidade de uma xantofila em particular que se acumula dentro da fração intracelular de triacilglicerídeo de levedos oleaginosos e um mecanismo para obtenção desse objetivo é aumentar a natureza hidrofóbica do produto de xantofila que se acumula. Uma forma de obter isso é manipular a produção de mono- e/ou diésteres de acila graxa do composto de xantofila alvo.

Uma variedade de enzimas pode funcionar para esterificar carotenóides. Por exemplo, glicosiltransferases de carotenóide foram identificadas em várias espécies bacterianas (veja, por exemplo, Tabela 24). Além disso, aciltransferase de acil CoA:diacilglicerol (DGAT) e aciltransferases de acil CoA:monoacilglicerol (MGAT), as quais funcionam nas etapas finais da biossíntese de triacilglicerol, provavelmente servem a um papel adicional na esterificação de xantofilas. Polipeptídeos de DGAT exemplificativos são mostrados na Tabela 25. Além disso, outras enzimas podem modificar especificamente carotenóides e moléculas de estrutura similar (por exemplo, es-teróis) e estar disponíveis para modificação e produção de éster.

Em algumas modalidades da invenção, organismos fonte poten-ciais para polipeptídeos da biossíntese de carotenóide incluem, mas não estão limitados a, gêneros de fungos oleaginosos ou não-oleaginosos que produzem naturalmente carotenóides. Esses incluem, mas não estão limitados a, Botrytis, Cercospora, Fusar)um (Gibberella), Mucor, Neurospora, Phy-comyces, Puccina, Rhodotorula, Sclerotium, Trichoderma e Xanthophyllomy-ces. Espécies exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, Neurospora crassa, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), Mucor circinelloides e Rhodotorula glutinis. Naturalmente, carotenóides são produzidos por uma ampla variedade de diversos organismos, tais como plantas, algas, levedos, fungos, bactérias, cianobactérias, etc. qualquer um de tais organismos podem ser organismos fonte para polipeptídeos da biossíntese de carotenóide de acordo com a presente invenção.

Será apreciado que a modificação carotenogênica em particular a ser aplicada a uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção será influenciada por qual(is) carotenóide(s) se deseja produzir. Por exemplo, polipeptídeos da biossíntese de isoprenóide são relevantes para a produção da maioria dos carotenóides. Polipeptídeos da biossíntese de carotenóide também são amplamente relevantes. Cetolase é particularmente relevante para a produção de cantaxantina, assim como hidroxilase é para a produção de luteína e zeaxantina, dentre outros. Hidroxilase e cetolase (ou sintase de astaxantina) são particularmente úteis para a produção de asta-xantina.

Produção de Isolamento de Carotenóides

Conforme discutido acima, acúmulo de corpos lipídicos em organismos oleaginosos é geralmente induzido através de crescimento do organismo relevante na presença de uma fonte de carbono em excesso e nitrogênio limitativo. Condições específicas para indução de tal acúmulo foram previamente estabelecidas para uma série de diferentes organismos oleaginosos (veja, por exemplo, Wolf (ed.) Nonconventional yeasts in biotechno-logy Vol. 1, Springer- Verlag, Berlin, Alemanha, páginas 313- 338; Lipids 18(9): 623, 1983; Indian J. Exp. Biol. 35(3): 313, 1997; J. Ind. Microbiol. Bio-technol. 30(1): 75, 2003; Bioresour Technol. 95(3): 287, 2004, cada um dosquais é incorporado aqui por referência em sua totalidade).

Em geral, será desejável cultivar células hospedeiras modificadas da invenção sob condições que permitem acúmulo de pelo menos cerca de 20% de seu peso celular seco como lipídio. Em outras modalidades, as células hospedeiras modificadas da invenção são crescidas sob condições que permitem o acúmulo de pelo menos cerca de 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, .21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mesmo 80% ou mais de seu peso celular seco como lipídio. Em determinadas modalidades, as células hospedeiras utilizadas são células as quais são naturalmente oleaginosas e induzidas a produzir lipídio em níveis desejados. Em outras modalidades, as células hospedeiras são células as quais produzem lipídio naturalmente, mas têm de ser manipuladas para aumentar a produção de lipídio, de modo que níveis desejados de produção e acúmulo de lipídio sejam obtidos.

Em determinadas modalidades, as células hospedeiras da invenção não são naturalmente oleaginosas, mas foram manipuladas para produzir íipídio, de modo que níveis desejados de produção de lipídio são obtidos. Aqueles habilitados na técnica apreciarão que, em geral, condições de crescimento que são eficazes para indução do acúmulo de lipídio em um organismo fonte também podem ser úteis para indução do acúmulo de lipídio em uma célula hospedeira na qual os polipeptídeos oleagínicos do organismo fonte tenham sido introduzidos. Naturalmente, modificações podem ser requeridas à luz das características da célula hospedeira, modificações as quais estão dentro da capacidade daqueles habilitados na técnica.

Também será apreciado por aqueles habilitados na técnica que geralmente será desejável assegurar que a produção do carotenóide desejado pela célula hospedeira modificada da invenção ocorre em um tempo apropriado com relação à indução de oleaginidade, de modo que o(s) caro-tenóide(s) se acumula(m) nos corpos lipídicos. Em algumas modalidades, será desejável induzir à produção do(s) carotenóide(s) em uma célula hospedeira a qual não produz naturalmente o(s) carotenóide(s), de modo que níveis detectaveis do(s) carotenóide(s) sejam produzidos. Em determinadosaspectos, as células hospedeiras as quais não produzem naturalmente determinado^) carotenóide(s) são capazes de produção de outro(s) carotenói-de(s) (por exemplo, determinadas células hospedeiras podem, por exemplo, produzir naturalmente (3-caroteno, mas podem não produzir astaxantina); em outros aspectos, as células hospedeiras não produzem naturalmente qualquer carotenóide. Em outras modalidades, será desejável aumentar os níveis de produção de carotenóide(s) em uma célula hospedeira a qual não produz naturalmente baixos níveis do(s) carotenóide(s), de modo que níveis detectáveis aumentados do(s) carotenóide(s) são produzidos. Em determinados aspectos, as células hospedeiras as quais não produzem naturalmente o(s) carotenóide(s) (por exemplo, p-caroteno) também produzem carote-nóide(s) adicional (is) (por exemplo, astaxantina, etc); em ainda outros aspectos, as células as quais produzem naturalmente o(s) carotenóide(s) (por exemplo, p-caroteno), não produzem carotenóide(s) adicional (is).

Em determinadas modalidades da invenção, será desejável a-cumular carotenóides em níveis (isto é, considerando-se a quantidade total de carotenóides produzidos juntos) que são maiores do que pelo menos cerca de 1% do peso seco das células. Em algumas modalidades, o acúmulo total de carotenóide nos corpos lipídicos estará em um nível de pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 6%, pelo menos cerca de 7%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 9%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19%, pelo menos cerca de 20% ou mais do peso seco total das células. Em determinadas modalidades da invenção, será desejável obter níveis totais de acúmulo de carotenóide nos corpos lipídicos (isto é, considerando-se a quantidade total de todos os carotenóides produzidos juntos) que são maiores do que pelo menos cerca de 1% do peso seco das células. Em algumas modalidades, o acúmulo total de carotenóide nos corpos lipídicos estará em um nível de pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%,pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 6%, pelo menos cerca de 7%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 9%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19%, pelo menos cerca de 20% ou mais do peso seco total das células.

Já foi demonstrado que genes carotenogênicos bacterianos podem ser transferidos para outros organismos e são, portanto, particularmente úteis de acordo com a presente invenção (veja, por exemplo, Miura e colaboradores, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1226, 1998). Em outras modalidades, pode ser desejável utilizar genes de outros organismos fonte, tais como planta, alga ou microalgas; esses organismos proporcionam uma variedade de fontes potenciais para polipeptídeos de cetolase e hidroxilase. Outros organismos fonte adicionais incluem fontes fúngicas, de levedo, inseto, pro-tozoário e mamífero de polipeptídeos.

Em determinadas modalidades, os genes de sintase de fitoe-no/ciclase de licopeno multi-funcional de Mucor circinelloides e dehidrogena-se de fitoeno de Neurospora crassa podem ser expressos em Yarrowia //'-polytica. Subseqüente superexpressão do domínio catalítico de reductase de hidróximetilglutaril-CoA de N. crassa e/ou tratamento dos gêneros de Y. //'-polytica modificados com o inibidor da sintase de esqualeno ácido zaragósi-co aumenta adicionalmente a produção; finalmente, genes de Paracoccus marcusii que codificam as enzimas hidroxilase de carotenóide e cetolase de carotenóide são expressos em gêneros de Y. lipolytica que produzem 3-caroteno e essa modificação resulta no acúmulo de astaxantina. Abordagens similares para intensificar a produção de carotenóide poderiam ser empregadas em outros organismos hospedeiros oleaginosos e não-oleaginosos que podem ser conduzidas usando os mesmos ou polipeptídeos carotenogênicos homólogos ou com funcionalidade similar.

Deverá ser observado que, para organismos da invenção que produzem mais de um carotenóide, algumas vezes será possível ajustar asquantidades relativas de carotenóides individuais produzidos através de a-juste das condições de crescimento. Por exemplo, foi reportado que controle da concentração de oxigênio dissolvido em uma cultura durante cultivo pode regular os níveis relativos de produção de determinados carotenóides, tais como 3-caroteno, echinenona, 3-criptoxantina, 3-hidróxiechinenona, asteroi-denona, cantaxantina, zeaxantina, adonirubina, adonixantina e astaxantina (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Número 6.825.002 para Tsubokura e colaboradores, os conteúdos todos da qual são aqui incorporados por referência).

Particularmente para modalidades da presente invenção dirigidas à produção dé astaxantina, freqüentemente será desejável utilizar um ou mais genes de um organismo que produz naturalmente astaxantina. Onde múltiplos polipeptídeos heterólogos têm de ser expressos, pode ser desejável utilizar o mesmo organismo fonte para todos ou utilizar organismos fonte intimamente relacionados.

Uma vantagem proporcionada pela presente invenção é que, alem de permitir a produção de altos níveis de carotenóides, a presente invenção permite que aqueles compostos produzidos sejam prontamente isolados porque eles se acumulam nos corpos lipídicos dentro de organismos oleaginosos. Métodos e sistemas para isolamento de corpos lipídicos foram estabelecidos para uma variedade de organismos oleaginosos (veja, por e-xemplo, Patentes dos Estados Unidos 5.164.308; 5.374.657; 5.422.247; 5.550.156; 5.583.019; 6.166.231; 6.541.049; 6.727.373; 6.750.048; e 6.812.001, cada uma das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade). Em resumo, células são, tipicamente, recuperadas da cultura, freqüentemente através de secagem por pulverização, filtração ou centrifu-gação. Em alguns casos, as células são homogeneizadas e, então, submetidas à extração com líquido supercrítico ou extração com solvente (por e-xemplo, com solventes tais como clorofórmio, hexano, cloreto de metileno, metanol, isopropanol, acetato de etila, etc), proporcionando uma suspensão oleosa bruta. Essa suspensão oleosa pode, opcionalmente, ser refinada, conforme conhecido na técnica. Óleos refinados podem ser usados direta-mente como aditivos para alimentos ou rações. Alternativa ou adicionalmente, carotenóides pode ser isolados do óleo usando técnicas convencionais.

Dada a sensibilidade dos carotenóides em geral à oxidação, muitas modalidades da invenção empregam estabilizantes oxidativos (por exemplo, tocoferóis, vitamina C; etóxiquina; vitamina E, BHT, BHA, TBHQ, etc. ou combinações dos mesmos) durante e/ou após isolamento de carote-nóide. Alternativa ou adicionalmente, microencapsulação, por exemplo, com proteínas, pode ser empregada para adicionar uma barreira física à oxidação e/ou melhorar a manipulação (veja, por exemplo, Pedido de Patente U.S. 2004/0191365). Usos

Os carotenóides produzidos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados em qualquer uma de uma variedade de aplicações, por exemplo, explorando suas propriedades biológicas ou nutricionais (por e-xemplo, anti-oxidativa, anti-proliferativa, etc.) e/ou suas propriedades de pigmento. Por exemplo, de acordo com a presente invenção, carotenóides podem ser usados em produtos farmacêuticos (veja, por exemplo, Bertram, Nutr. Rev. 57: 182, 1999; Singh e colaboradores, Oncology 12: 1643, 1998; Rock, Pharmacol. Titer. 75: 185, 1997; Edge e colaboradores, J. Photochem Photobiol 41: 189, 1997; Pedido de Patente U.S. 2004/0116514; Pedido de Patente U.S. 2004/0259959), suplementos alimentícios (veja, por exemplo, Koyama e colaboradores, J. Photochem Photobiol 9: 265, 1991 ; Bauernfe-ind, Carotenoids as colorants and vitamin A precursors, Academic Press, NY, 1981 ; Pedido de Patente U.S. 2004/0115309; Pedido de Patente U.S. 2004/0234579), aplicações eletro-ópticas, aditivos para rações para animais (veja, por exemplo, Krinski, Pure Appl. Chem. 66: 1003, 1994; Polazza e colaboradores, Meth. Enzymol. 213: 403, 1992), cosméticos (como anti-oxidantes e/ou como cosméticos, incluindo fragrâncias; veja, por exemplo, Pedido de Patente U.S. 2004/0127554), etc. Os carotenóides produzidos de acordo com a presente invenção podem também ser usados como intermediários na produção de outros compostos (por exemplo, esteróides, etc).

Por exemplo, astaxantina e/ou ésteres da mesma podem serúteis em uma variedade de aplicações farmacêuticas e alimentos saudáveis, incluindo tratamento de doenças inflamatórias, asma, dermatite atópica, a-lergias, mieloma múltiplo, arteriosclerose, doença cardiovascular, doença hepática, doença cérebrovascular, trombose, doenças relacionadas à neo-angiogênese, incluindo câncer, reumatismo, retinopatia diabética; degenera-ção macular e distúrbio cerebral, hiperlipidemia, isquemia renal, diabetes, hipertensão, proliferação e metástase de tumor; e distúrbios metabólicos. Adicionalmente, carotenóides e astaxantina podem ser úteis na prevenção e tratamento de fadiga, para melhora da função renal em nefropatia por doenças inflamatórias, bem como prevenção e tratamento de outras doenças relacionadas ao estilo de vida. Ainda, descobriu-se que a astaxantina exerce um papel como inibidores de vários processos biológicos, incluindo inibidores de interleucina, inibidores de fosfodiesterase, inibidores de fosfolipase A2, inibidores de ciclooxigenase 2, inibidores de metaloproteinase da matriz, inibidores de proliferação de células do endotélio capilar, inibidores de lipoxi-genase. Veja, por exemplo, Publicação Japonesa No. 2006022121, publicada em 26/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301156 depositado em 17/10/ 2005); Publicação Japonesa No. 2006016408, publicada em 19/01/2006(Pedido JP No. 2005-301155 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006016409, publicada em 19/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301157 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006016407, publicada em 10/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301153 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008717, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301151 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008716, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301150 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008720, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005- 301158 depositada em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008719, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301154 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008718, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301152 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008713, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301147 depositado em 17/10/2005); Publi-cação Japonesa No. 2006008715, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301149 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008714, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301148 depositado em 17/10/2005); e Publicação Japonesa No. 2006008712, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301146 depositado em 17/10/2005).

Será apreciado que, em algumas modalidades da invenção, os carotenóides produzidos pelas células hospedeiras manipuladas conforme descrito aqui são incorporados em um produto final (por exemplo, suplemento para alimento ou ração, produto farmacêutico, cosmético, artigo contendo corante, etc.) no contexto da célula hospedeira. Por exemplo, células hospedeiras podem ser liofilizadas, congeladas a seco, congeladas ou de outro modo inativadas e, então, células inteiras podem ser incorporadas em ou usadas como o produto final. A célula hospedeira também pode ser processada antes de incorporação no produto para aumentar a biodisponibilidade (por exemplo, via lise). Alternativa ou adicionalmente, um produto final pode incorporar apenas uma parte da célula hospedeira (por exemplo, fracionada pelo tamanho, solubilidade), separada do todo. Por exemplo, em algumas modalidades da invenção, gotículas de lipídio são isoladas das células hospedeiras e são incorporadas em ou usadas como o produto final. Em outras modalidades, os carotenóides em si ou compostos de carotenóide individuais são isolados e reformulados no produto final.

Conforme estabelecido acima, ácido graxo e ésteres de glicosí-deo são os ésteres de carotenóide predominantes encontrados na natureza, enquanto que ésteres adicionais (por exemplo, com ácidos orgânicos ou fosfato inorgânico) podem ser sintetizados para gerar formas de produto úteis. Para distribuição, ésteres de carotenóide também podem ser formulados como sais da forma de éster (veja, por exemplo, Publicação de Patente US No. 20050096477).

A quantidade de carotenóide incorporado em um determinado produto pode variar dramaticamente dependendo do produto do(s) carote-nóide(s) envolvido(s) em particular. Quantidades podem oscilar, por exemplo, de menos de 0,01% em peso do produto.Em algumas modalidades da invenção, um ou mais carotenóides produzidos são incorporados em um componente de alimento ou ração (por exemplo, um suplemento alimentício). Tipos de produtos alimentícios nos quais carotenóides podem ser incorporados de acordo com a presente invenção não são particularmente limitados e incluem bebidas, tais como chás, sucos e licores; produtos de confeitaria, tais como geléias e biscoitos; alimentos e bebidas contendo gordura, tais como produtos lácteos; produtos alimentícios processados, tais como arroz e arroz macio (ou mingau); fórmulas infantis; ou semelhante. Em algumas modalidades desse aspecto da invenção, pode ser útil incorporar os carotenóides dentro de corpos de lipídios comestíveis, uma vez que isso pode facilitar incorporação em determinados produtos alimentícios contendo gordura.

Exemplos de matérias corantes nas quais carotenóides produzidos de acordo com a presente invenção podem ser incorporados incluem, por exemplo, rações para animais de estimação, tais como rações para gato, rações para cães e semelhantes, rações para peixes de aquário, peixe cultivado ou crustáceos, etc, ração para animais criados em fazenda (incluindo animais de criação e outros incluindo peixe ou crustáceos criados em aquicultura). Material para alimento ou ração no qual o(s) carotenóide(s) produzido^) de acordo com a presente invenção é(são) incorporado(s) é, de preferência, ingerível para o organismo o qual é o recipiente pretendido. Esse material para alimento ou ração pode ter quaisquer propriedades físicas atualmente conhecidas para um material alimentício (por exemplo, sólido, líquido, macio).

Em algumas modalidades da invenção, um ou mais carotenóides produzidos são incorporados em um produto cosmético. Exemplos de tais cosméticos incluem, por exemplo, cosméticos para a pele (por exemplo, loções, emulsões, cremes e semelhantes), batom, cosméticos anti-queimadura solar, cosméticos para maquiagem, fragrancias, produtos para uso diário (por exemplo, pasta de dente, lavagens bucais, agentes preventivos de mal hálito, sabões sólidos, xampus, condicionadores).

Em algumas modalidades, um ou mais carotenóides produzidossão incorporados em um produto farmacêutico. Exemplos de tais produtos farmacêuticos incluem, por exemplo, vários tipos de tabletes, cápsulas, a-gentes para bebida, pastilhas, gargarejos, etc. Em algumas modalidades, o produto farmacêutico é adequado para aplicação tópica. Formas de dosagem não estão particularmente limitadas e incluem cápsulas, óleos, grânu-los, subunidades de grânulos, pós, tabletes, pílulas, pastilhas ou semelhante. Óleos e cápsulas cheias de óleo podem proporcionar vantagens adicionais em virtude de sua falta de decomposição de ingrediente durante fabricação e porque as gotículas de lipídio contendo carotenoide da invenção podem ser prontamente incorporadas em formulações baseadas em óleo.

Produtos farmacêuticos de acordo com a presente invenção podem ser preparados de acordo com métodos estabelecidos na técnica incluindo, por exemplo, o procedimento comum conforme descrito na United States Pharmacopoeia, por exemplo.

Os carotenóides produzidos de acordo com a presente invenção podem ser incorporados em qualquer produto contendo pigmento incluindo, por exemplo, tecido, tinta, etc. Eles também podem ser incorporados em um produto o qual é um indicador ambiental ou um instrumento, tal como um bio-sensor para uso como um agente de detecção. EXEMPLIFICACÁO:

A Tabela 26 abaixo descreve determinados gêneros de Yarrowia lipolytica usados na exemplificação a seguir: TABELA 26: Gêneros de Yarrowia lipolytica.

<table>table see original document page 43</column></row><table>

(Os genotipos em LYC1, LYS1, XPR2 e PEX17 não foram de-terminados em cruzamentos, nem verificados com relação a gêneros na ATCC)

Todos os procedimentos de manipulação de DNA e biológica molecular básica descritos aqui são geralmente realizados de acordo com Sambrook e colaboradores ou Ausubel e colaboradores. (Sambrook J, Frits-ch EF, Maniatis T (eds). 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds). 1998. Current Proto-cols in Molecular Biology. Wiley: New York).

Exemplo 1: Produção de plasmídeos para construção de gêneros que produzem carotenóide

Plasmídeos foram gerados para construção de gêneros que produzem carotenóide. As seguintes subpartes descrevem a produção de plasmídeos que codificam polipeptídeos carotenogênicos. Plasmídeos usados nesse estudo e detalhes de sua construção são descritos na Tabela 27.

Detalhes adicionais de construção de plasmídeo e descrições de seu uso são encontrados no texto da sub-seção relevante. Todas as amplifi-cações por PCR usaram DNA genômico de NRRL Y-1095 como template, a menos que de outro modo especificado. O gene URA5 descrito abaixo é alé-lico, com a auxotrofia ura2-21 acima. Os promotores GPD1 e TEF1 são de Y. lipolitica, assim como o terminador XPR2.

GGS1 é o gene que codifica o gene de codificação de sintase de pirofosfato de geranilgeranila de Y. lipolitica. A seqüência de codificação de ácido nucleico e a proteína Ggs1 codificada de pMB4591 e pMB4683 são como segue:

atggattataacagcgcggatttcaaggagatatggggcaaggccgccgacaccgcgctgctgggacc

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acactcacttgcccctcggaagacgagtatctggagatggtggtgcacaagaccggtggactgtttcggctggctctgagacttatgctgtcggtggcatcgaaacaggaggaccatgaaaagatcaactttgatctcacac accttaccgacacactgggagtcatttaccagattctggatgattacctcaacctgcagtccacggaattga ccgagaacaagggattctgcgaagatatçagcgaaggaaagttttcgtttccgctgattcacagcatacgc accaacccggataaccacgagattctcaacattctcaaacagcgaacaagcgacgcttcactcaaaaa 5 gtacgccgtggactacatgagaacagaaaccaagagtttcgactactgcctcaagaggatacaggccat gtcactcaaggcaagttcgtacattgatgatctagcagcagctggccacgatgtctccaagctacgagcca ttttgcattattttgtgtccacctctgactgtgaggagagaaagtact ttgaggatgcgcagtga mdynsadfkeiwgkaadtallgpynylanmghnirehliaafgavikvdksdletishitkilhns ednsmlrrglpaahclfgvpqtinsanymyfvalqevlklksydavsifteeminlhrgqgmdlywretltcp 10 sedeylemvvhktgglfrlalrlmlsvaskqedhekinfdlthltdtlgviyqilddylnlqsteltenkgfcedis egkfsfplihsirtnpdnheilnilkqrtsdaslkkyavdymrtetksfdyclkriqamslkassyiddlaaagh dvsklrailhyfvstsdceerkyfedaq TABELA 27: Plasmídeos

<table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table>Determinados oligonucleotídeos mencionados na Tabela 27 a-

cima são como segue:

M04471 5'-CTGGGTGACCTGGAAGCCTT M04472 5'-AAGATCAATCCGTAGAAGTTCAG 5 M04475 5'-AAGCGATTACAATCTTCCTTTGGM04476 5'-CCAGTCCATCAACTCAGTCTCA

M04477 5'-GCATTGCTTATTACGAAGACTAC

M04478 5'-CCACTGTCCTÇCACTACAAACAC

M04534 5'-CACAAACGCGTTCACTGCGCATCCTCAAAGT

M04544 5'-CACAATCTAGACACAAATGGATTATAACAGCGCGGAT

M04566 5'-CACAAACTAGTTTGCCACCTACAAGCCAG AT

M04568 5'- CACAAGGTACCAATGTGAAAGTGCGCGTGAT

M04571 5'-CACAAGGTACCAGAGACCGGGTTGGCGG

M04591 5'- CACAAGCGGCCGCGCTAGCATGGGGATCGATCTCTTA-

TAT

M04592 5'-

CACAAGCGGCCGCGCTAGCGAATGATTCTTATACTCAGAAG M04593 5'-

CACAAGCGGCCGCACGCGTGCAATTAACAGATAGTTTGCC M04659 5'- CACAAGCTAGCTGGGGATGCGATCTCTTATATC 1A: Produção de PMB4628 (teflp-carRP LEU2) que codifica sintase de fitoe-no/ciclase de licopeno: carRP contendo íntron foi amplificado de DNA genô-mico de M. circinelloides (ATCC 90680) usando M04525 e M04541: M04525 5'-CACAAACGCGTTTAAATGGTATTTAGATTTCTCATT M04541 5'-CACAATCTAGACACAAATGCTGGTCACCTACATGGA e o fragmento de 1,9 kb resultante foi fosforilado com quínase de polinucleo-tídeo T4. O fragmento resultante teve a extremidade cega ligada no pBlues-criptSKII clivado com EcoRV, proporcionando pMB4599. O fragmento Xba\-Mlu\ de 1,9 kb do pMB4599 foi inserido no pMB4603 clivado com Nhe\ e Mlu\, proporcionando pMB4628. A seqüência de codificação de ácido nuclei-co contendo íntron e a proteína CarRP codificada do pMB4628 são como segue:

atgctgctcacctacatggaagtccacctctactacacgctgcctgtgctgggcgtcctgtcctggctgtcgc

ggccgtactacacagccaccgatgcgctcaaattcaaatttctgacactggttgccttcacgaccgcctccg

cctgggacaactacattgtctaccacaaggcgtggtcctactgccccacctgcgtcaccgctgtcattggct

acgtgcccttggaggagtacatgttcttcatcatcatgactctgttgaccgtggcattcaccaatctggtgatgc

gctggcacctgcacagcttctttatcaggcctgaaacgcccgtcatgcagtccgtcctggtccgtcttgtccccataacagccttattaatcactgcatacaaggcttgggtaagcaaacaaacaaatgatgtgccgcatcgc

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ggccttctgtttacccgaccaagtgctgcattcagacacattccacgacctgtccgtcagctgggacatcctg

cgcaaggcctccaagtccttttacacggcctctgctgtctttcccggcgacgtgcgccaagagctcggtgtg

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cagggatcaggaggatctcagatattactcagcttgtgtcgccagcagtgttggtgaaatgtgcactcgcat

catactggcccacgccgacaagcccgcctcccgccagcaaacacagtggatcattcagcgtgcgcgtg

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aattggcgaggagcgattgctctcactgtcgcatcgcctcatctaccaggcagacgagctcatggtggttgc

caacaagggcatcgacaagctgcccagccattgtcaaggcggcgtgcgtgcggcctgcaacgtctatgc

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mlliymevhlyytlpvlgvlswlsrpyytatdalkfkfltlvafttasawdnyivyhkawsycptcvtavigyvpl

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cpvlallwfgageymmixplavlvsialptlflcwvdvvaigagtwdislatstgkfvvphlpveefmffalintv

Ivfgtcaidrtmailhlfknkspyqrpyqhsksflhqilemtwafclpdqvlhsdtfhdlsvswdilrkasksfyt

asavfpgdvrqelgvlyafcratddlcdneqvpvqtrkeqlilthqfvsdlfgqktsaptaidwdfyndqlpas

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ankgidklpshcqggvraacnvyasigtklksykhhypsrahvgnskrveiallsvynlytapiatsstthcr

qgkmmlnti

Alternativamente, pMB4599 também foi usado como um templa-te para amplificação por PCR usando M04318, M04643, M04644 e M04639:

M04318 5'-GTAAAACGACGGCCAGT

M04643 5 '-CACACGGTCTCATGCCAAGCCTTGTATGCAGTGATTAA

M04639 5'-CCACTGTGTTTGCTGGCGG

M04644 5'- C AC ACG GTCTCTG GCATTTGGCG GTCCCTG G AAA

e produziu fragmentos de 0,5 e 0,95 kb, que foram subseqüentemente cliva-

dos com Acc65\ e Bsal e Bsa\ e PpiM\, respectivamente. Esses fragmentos

foram ligados ao pMB4599 que tinha sido digerido com Acc65\ e PpuMl,

proporcionando pMB4613, abrigando carRP sem íntron. O fragmento Xbal-

Mlul de 1,85 kb de pMB4613 pode ser inserido no pMB4603 clivado com

Nhel e Míul para proporcionar pCarRPdell.

1B: Produção de pMB4638 (teflp-carB ADE1) que codifica dehidrogenase de fitoeno: carB contendo íntron foi amplificado de DNA genômico de M. cir-cinelloides (ATCC 90680) usando MO4530 e M04542: MO4530 5'-CACAAACGCGTTTAAATGACATTAGAGTTATGAAC M04542 5'-CACAATCTAGACACAAATGTCCAAGAAACACATTGTC e o fragmento resultante de 1,9 kb foi fosforilado com quínase de polinucleo-tídeo T4 e a extremidade cega ligada ao pBS-SKII clivado com EcoRV, proporcionando pMB4606. pMB4606 foi, então, usado como um template para amplificação por PCR usando M04318 e M04648 e M04646 e M04647 e M04343 e M04645:

M04318 5 '-GTAAAACGACGGCCAGT M04648 5'-CACAAGGTCTCAAGCACGCATCCCGGAACTG M04646 5 '-CACACGGTCTÇAGGCATGTCGCCCTACGATGC M04647 5'-CACACGGTCTCATGCTTGCACCCACAAAGAATAGG M04343 5'-CAGGAAACAGCTATGAC

M04645 5 1 -CACACGGTCTCTTGCCCATATACATGGTCTGAAACG produzindo fragmentos de 0,4 e 0,85 e 0,7 kb, que foram subseqüentemente clivados com Acc65\ e Bsal e Bsal e Bsal e BamHl, respectivamente. Esses fragmentos foram ligados ao pBS-SKII que tinha sido cortado com v4cc65l e BamRl, proporcionando pMB4619, abrigando carB sem íntron. O fragmentoXba\-Mlu\ de 1,75 kb do pMB4619 foi inserido no pMB4629 clivado com Nhe\

e Mlu\, proporcionando pMB4638. A seqüência de codificação de ácido nu-

cleico resultante e a proteína CarB codificada do pMB4638 são como segue:

atgtccaagaaacacattgtcattatcggtgctggcgtgggtggcacggctacagctgctcgtttggcccgc

gaaggcttcaaggtcactgtggtggagaaaaacgactttggtggcggccgctgctccttgatccatcacca

gggccatcgctttgatcagggcccgtcgctctacctgatgcccaagtactttgaggacgcctttgccgatctg

gacgagcgcattcaagaccacctggagctgctgcgatgcgacaacaactacaaggtgcactttgacgac

ggtgagtcgatccagctgtcgtctgacttgacacgcatgaaggctgaattggaccgcgtggagggccccct

tggttttggccgattcctggatttcatgaaagagacacacatccactacgaaagcggcaccctgattgcgct

caagaagaatttcgaatccatctgggacctgattcgcatcaagtacgctccagagatctttcgcttgcacctg

tttggcaagatctacgaccgcgcttccaagtacttcaagaccaagaagatgcgcatggcattcacgtttcag

accatgtatatgggcatgtcgccctacgatgcgcctgctgtctacagcctgttgcagtacaccgagttcgctg

aaggcatctggtatccccgtggcggcttcaacatggtggttcagaagctagaggcgattgcaaagcaaaa

gtacgatgccgagtttatctacaatgcgcctgttgccaagattaacaccgatgatgccaccaaacaagtga

caggtgtaaccttggaaaatggccacatcatcgatgccgatgcggttgtgtgtaacgcagatctggtctatg

cttatcacaatctgttgcctccctgccgatggacgcaaaacacactggcttccaagaaattgacgtcttcttcc

atttccttctactggtccatgtccaccaaggtgcctcaattggacgtgcacaacatctttttggccgaggcttat

caggagagctttgacgaaatcttcaaggactttggcctgccttctgaagcctccttctacgtcaatgtgccctc

tcgcatcgatccttctgctgctcccgacggcaaggactctgtcattgtcttggtgcctattggtcatatgaagag

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ctgtgattgagcgtcgtctgggcatgtcgaatttcgccgacttgattgagcatgagcaagtcaatgatcccgc

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acgcccaagccaagaaagatcgagatggagaacacgcaagcacctttggaggagcctgatgctgaat

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ggccaaacgcccgcatcttttatcaataatttgttacctgaagtattccgcgttcataactctaatgtcatttaa

mskkhiviigagvggtataarlaregfkvtvvekndfgggrcslihhqghrfdqgpslylmpkyfedafadld

eriqdhlellrcdnnykvhfddgesiqlssdltrmkaeldrvegplgfgrfidfmkethihyesgtlialkknfesi

wdlirikyapeifrlhlfgkiydrasJcyflctkkrniTiiaftfqtmymgmspydapavysllqytefaegiwyp

rggfnmvvqkleaiakqkydaefynapvakintddatkqvtgvtlenghiidadawcnadlvyayhnllpp

crwtqntlaskkltsssisfywsmstkvpqldvhniflaeayqesfdeifkdfglpseasfyvnvpsridpsaapdgkdsvivlvpighmksktgdastenypamvdkarkmvlavierrlgmsnfadlieheqvndpavwq

skfnlwrgsilglshdvlqvlwfrpstkdstgrydnlffvgasthpgtgvpivlagskltsdqvvksfglctpkprk

iementqapleepdaestpx^wlraafwvmfmffyffpqsngqtpasfinnllpevfrvhnsnvi

1C. Produção de PMB4660 (teflp-carB URA3) que codifica dehidrogenase

de fitoeno: O fragmento Xho\-NoÜ de 4,3 kb e o fragmento No1\-Spe\ de 1,8

kb do pMB4638 foram ligados ao gene URA3 clivado com Bsa\ e Spel de 1,9

kb gerado através de amplificação por PCR de DNA genômico de Y. lipolyti-

ca usando M04684 e M04685 para criar pMB4660:

M04684 5'-CATTCACTAGTGGTGTGTTCTGTGGAGCATTC

M04685 5'-CACACGGTCTCATCGAGGTGTAGTGGTAGTGCAGTG

A seqüência de codificação de ácido nucleico resultante e a proteína CarB(i) codificada de pMB4660 são como segue: atgtccaagaaacacattgtcattatcggtgctggcgtgggtggcacggctacagctgctcgtttggcccgc gaaggcttcaaggtcactgtggtggagaaaaacgactttggtggcggccgctgctccttgatccatcacca gggccatcgctttgatcagggcccgtcgctctacctgatgcccaagtactttgaggacgcctttgccgatctg gacgagcgcattcaagaccacctggagctgctgcgatgcgacaacaactacaaggtgcactttgacgac ggtgagtcgatccagctgtcgtctgacttgacacgcatgaaggctgaattggaccgcgtggagggccccct tggttttggccgattcctggatttcatgaaagagacacacatccactacgaaagcggcaccctgattgcgct caagaagaatttcgaatccatctgggacctgattcgcatcaagtacgctccagagatctttcgcttgcacctg tttggcaagatctacgaccgcgcttccaagtacttcaagaccaagaagatgcgcatggcattcacgtttcag accatgtatatgggcatgtcgccctacgatgcgcctgctgtctacagcctgttgcagtacaccgagttcgctg aaggcatctggtatccccgtggcggcttcaacatggtggttcagaagctagaggcgattgcaaagcaaaa gtacgatgccgagtttatctacaatgcgcctgttgccaagattaacaccgatgatgccaccaaacaagtga caggtgtaaccttggaaaatggccacatcatcgatgccgatgcggttgtgtgtaacgcagatctggtctatg cttatcacaatctgttgcctccctgccgatggacgcaaaacacactggcttccaagaaattgacgtcttcttcc atttccttctactggtccatgtccaccaaggtgcctcaattggacgtgcacaacatctttttggccgaggcttat caggagagctttgacgaaatcttcaaggactttggcctgccttctgaagcctccttctacgtcaatgtgccctc tcgcatcgatccttctgctgctcccgacggcaaggactctgtcattgtcttggtgcctattggtcatatgaagag caagacgggcgatgcttccaccgagaactacccggccatggtggacaaggcacgcaagatggtgctgg ctgtgattgagcgtcgtctgggcatgtcgaatttcgccgacttgattgagcatgagcaagtcaatgatcccgc tgtatggcagagcaagttcaatctgtggagaggctcaattctgggtttgtctcatgatgtgcttcaggtgctgtg gttccgtcccagcacaaaggattctaccggtcgttatgataacctattctttgtgggtgcaagcacgcatcccggaactggtgttcccattgtccttgcaggaagcaagctcacctctgaccaagttgtcaagagctttggaaag

acgcccaagccaagaaagatcgagatggagaacacgcaagcacctttggaggagcctgatgctgaat

cgacattccctgtgtggttctggttgcgcgctgcctfttgggtcatgtttatgttcttttacttcttccctcaatccaat

ggccaaacgcccgcatcttttatcaataatttgttacctgaagtáttccgcgttcataactctaatgtcatttaa

mskkhiviigagvggtataarlaregfk\4vvekndfgggrcslihhqghrfdqgpslylmpkyfedafadld

eriqdhlellrcdnnykvhfddgesiqlssdltrmkaeldrvegplgfgrfldfmkethihyesgtlialkknfesi

wdlirikyapeifrlhlfgkiydraskyfktJdrniirnaftfqtaymgmspydapav^sllqytefaegiwyprg

gfnmvvqkleaiakqkydaefiynapvakintddatkqvtgvtlenghiidadawcnadlvyayhnllppc

rwtqntlaskkltsssisfywsmstkvpqldvhniflaeayqesfdeifkdfglpseasfyvnvpsridpsaap

dgkdsvivlvpighmksktgdastenypamvdkarkmvlavierrlgmsnfadlieheqvndpavwqs

kfnlwrgsilglshdvlqvlwfipstkdstgrydnlffvgasthpgtgvpivlagskltsdqvvksfgktpkprkie

mentqapleepdaestfpvwfwlraafvvvmfrnffyffpqsngqtpasfinnllpevfrvhnsnvi

1D. Produção de PMB4637 e pTef-HMG que codifica uma HMG1 truncada.

Para produção de uma variante truncada do gene da reductase de HMG-

CoA, o qual também codifica a seqüência líder de 77 aminoácidos derivada

de S. cerevisiae, os seguintes oligonucleotídeos são sintetizados:

PRIMER O 5'-TTCTAGACACAAAAATGGCTGCAGACCAATTGGTGA

PRIMER P 5'-CATTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATC

PRIMER Q 5'-GTTCTCTGGACGACCTAGAGG

M04658 5-CACACACGCGTACACCTATGACCGTATGCAAAT

Primers O e P são usados para amplificar um fragmento de 0,23 kb que codifica Met-Ala, seguido pelos resíduos 530 a 604 da proteína Hmg1 de S. cerevisiae, usando DNA genômico como template. Primers Q e M04658 são usados para amplificar um fragmento de 1,4 kb que codifica os 448 resíduos C-terminais da proteína Hmg1 de Y. lipolytica, usando DNA genômico como template. Esses fragmentos são ligados ao vetor de clonagem apropriado e os plasmídeos resultantes, designados pOP e pQM04658, são verificados através de seqüenciamento. O fragmento OP é liberado com Xba\ e /Asei e o fragmento QM04658 é liberado com Mae\ e MliA. Esses fragmentos são, então, ligados ao vetor de expressão de ADE1 TEF1p pMB4629 cortado com Xba\ e Mlu\ para produzir pTefHMG.

Alternativamente, o gene HMG^ nativo de Y. lipolytica pode sermodificado sem seqüências de S. cerevisiae conforme descrito na tabela acima usando os primers M04658 (descrito acima) e M04657, para criar pMB4637:

M04657 5 '-CACACTCTAGACACAAAAATGACCCAGTCTGTGAAGGTGG

A seqüência de codificação de ácido nucleico resultante e a proteína Hmg1trunc codificada do pMB4637 são como segue:

atgacccagtctgtgaaggtggttgagaagcacgttcctatcgtcattgagaagcccagc gagaaggaggaggacacctcttctgaagactccattgagctgactgtcggaaagcagcccaagcccgt gaccgagacccgttctctggacgacctagaggctatcatgaaggcaggtaagaccaagcttctggagga ccacgaggttgtcaagctctctctcgagggcaagcttcctttgtatgctcttgagaagcagcttggtgacaac acccgagctgttggcatccgacgatctatcatctcccagcagtctaataccaagactttagagacctcaaa gcttccttacctgcactacgactacgaccgtgtttttggagcctgttgcgagaacgttattggttacatgcctctc cccgttggtgttgctggccccatgaacattgatggcaagaactaccacattcctatggccaccactgagggt tgtcttgttgcctcaaccatgcgaggttgcaaggccatcaacgccggtggcggtgttaccactgtgcttactc aggaçggtatgacacgaggtccttgtgtttccttcccctctctcaagcgggctggagccgctaagatctggct tgattccgaggagggtctcaagtccatgcgaaaggccttcaactccacctctcgatttgctcgtctccagtctc ttcactctacccttgctggtaacctgctgtttattcgattccgaaccaccactggtgatgccatgggcatgaac atgatctccaagggcgtcgaacactctctggccgtcatggtcaaggagtacggcttccctgatatggacatt gtgtctgtctcgggtaactactgcactgacaagaagcccgcagcgatcaactggatcgaaggccgaggc aagagtgttgttgccgaagccaccatccctgctcacattgtcaagtctgttctcaaaagtgaggttgacgctct tgttgagctcaacatcagcaagaatctgatcggtagtgccatggctggctctgtgggaggtttcaatgcaca cgccgcaaacctggtgaccgccatctaccttgccactggccaggatcctgctcagaatgtcgagtcttcca actgcatcacgctgatgagcaacgtcgacggtaacctgctcatctccgtttccatgccttctatcgaggtcgg taccattggtggaggtactattttggagccccagggggctatgctggagatgcttggcgtgcgaggtcctca catcgagacccccggtgccaacgcccaacagcttgctcgcatcattgcttctggagttcttgcagcggagct ttcgctgtgttctgctcttgctgccggccatcttgtgcaaagtcatatgacccacaaccggtcccaggctccta ctccggccaagcagtctcaggccgatctgcagcgtctacaaaacggttcgaatatttgcatacggtcatag mtqsvkvvekhvpiviekpsekeedtssedsieltvgkqpkpvtetrslddleaimkagl ctklledhewkslegklplyalekqlgdntravgirrsiisqqsntktletsklpylhydydrvfgaccenvigy mplpvgvagpmnidgknyhipmattegclvastmrgckainagggvttvltqdgmtrgpcvsfpslkrag aakiwldseeglksmrkafiistsrfarlqslhstlagnllfirfrtttgdamgmnmiskgvehslavmvkeygf pdmdivsvsgnyctdkkpaainwiegrgksvvaeatipahivksvlksevdalvelnisknligsamagsvggmahaanMaiylatgqdpaqnvessncitlmsnvdgnlIisvsmpsievgtigggtilepqgamle

mlgvrgphietpganaqqlariiasgvlaaelslcsalaaghlvqshmthnrsqaptpakqsqadlqrlqng

snicirs

1E. Produção de PMB4692 (URA3 teflp-crtZ) que codifica hidroxilase de caroteno. A seguinte seqüência de ORP de hidroxilase de caroteno (CrtZ) foi sintetizada, baseado na seqüência de proteína de Novosphingobium aroma-ticivorans, usando tendência de códon de Y. lipolytica: 5'-

ttcaqacacaaaaatqqqtqqagccatqcaqaccctcqctqctatcctqatcqtcctcqqtacaqt

qcteqctatqqaqtttqtcqcttqqtcttctcataaqtatatcatqcatqqcttcqqatqqqqatggc

ataqaqaccatcacqaqccccatqaqqqatttcttqaqaaqaatqacttatacqccatcqttqgc

gctqccctctcqatactcatqtttgccctcqqctctcccatqatcatqqqcqctqacqcctqgtgqc

ccqqaacctqgatcqgactcqqtqtcctcttctatqqtqtcatctataccctcgtgcacgacggtct

ggtgcaccaacgatggtttagatgggtgcctaaacgaggttacgccaaacgactcgtgcaggcc

cataagctgcaccacgccaccattggcaaggaaggaggcgtctcattcqqtttcqtqttcqcccg

agatcccgccgttctgaagcaggagcttcgagctcaacgagaagcaggtatcgccgtgctgcga

qaqqctqtqqaeqgctagacgcqt

Essa seqüência foi clivada usando Xba\ e Mlu\ e ligada, junto com o fragmento /4cc65l-A//7el do promotor TEF1 do pMB4629, ao pMB4662 cortado com Acc65\ e Mlu\ para produzir pMB4692. A seqüência de codificação do ácido nucleico é representada em negrito sublinhado acima. A proteína crtZ codificada resultante do pMB4692 é como segue; mggamqtlaailivlgtvlamefvawsshkyimhgfgwgwhrdhhephegflekndlyaivgaalsilmf algspmimgadawwpgtwiglgvlfygviytlvhdglvhqrwfrwvpkrgyakrlvqahklhhatigkegg vsfgfvfardpavlkqelraqreagiavlreavdg

1F. Produção de PMB4698 (ADE1 teflp-crtW), que codifica cetolase de caroteno. A seguinte seqüência de ORP de cetolase de caroteno (CrtW) foi sintetizada, baseado na seqüência de proteína de uma seqüência ambiental isolada de Sargasso Sea (acesso ao Genbank AACY01034193.1 ): 5'-

ttctaqacacaaaaatgactcgatctatttcctggccttccacctactggcacctccaqccctcctqtt cttcttqqqtcqcaaacqaattctctcctcaaqcccqaaaaqqtctcqtcctcqctqqtctcattqqttccqcttggctqcttactctcggacttqqcttttcccttc

ccctccatcaaacgagctgqcttctcatcqqttqtctcqttctccttaqatctttcctgcacaccgga

ctttttatcqttqcccatqacqctatqcacqcttctcttqttcctqaccaccctqqccttaaccqttqq

attqqacqtqtctqtcttctcatqtatqctqqactctcctacaaaagatqctqccqaaatcaccqtcq

acaccaccaaqcccctqaaacaqttqaagaccctqactaccaacqatqcactaacaacaatatc

ctcqactqqtacgttcactttatqgqaaattacctcqqatqqcaacaattgcttaatctctcttgcqttt

qqctcgctctcaccttccqtqtttctqactactctqctcaattcttccacctqctccttttctctqtccttc

ctctcatcqtctcctcctqtcaactcttcctcqtqgqaacctqqctqccacaccqacqaqgcqcta

ctactcgacccgqcqttaccactcqatccctgaacttccaccctqctctttccttcqctqcttgctac

cacttcgqttaccaccqtqaacaccatqaatctccctctactccttqqttccaacttcctaaactc

cqagaaggttctctcatctaaacqcgt

Essa seqüência foi clivada usando Xba\ e Mlu\ e ligado ao pMB4629 cortado com Nhe\ e Mlu\ para produzir pMB4698. A seqüência de codificação de ácido nucleico é representada em negrito sublinhado acima. A proteína crtW codificada resultante de pMB4698 é como segue: mtrsiswpstywhlqpscsswvanefspqarkglvlagligsawlltlglgfslplhqtswlligclvllrsflhtglf ivahdamhaslvpdhpglrmvigrvcllmyaglsykrccmhn'hhqapetvedpdyqrctnnnildwyv hfmgnylgwqqllnlscvwlaltfrvsdysaqffhlllfsvlplivsscqlflvgtwlphrrgattrpgvttrslnfhpa Isfaacyhfgyhrehhespst pwfqlpklregsli

Exemplo 2: Manipulação de Yarrowia lipolvtica para produção aumentada de carotenóide

2A. Produção de Y. lipolvtica expressando sintase de pirofosfato de geranil-aeranila e dehidrooenase de fitoeno: MF350 (MATB ura2-21 leu2-35 adel) foi transformado com pMB4591 (teflp-GGS1) que tinha sido clivado a montante do URA5 com Ssp\; um transformante Ura+ trazendo o plasmídeo no locus ura2\6\ identificado e denominado MF364. Ele foi, subseqüentemente, transformado com pMB4638 {teflp-carB) que tinha sido clivado em ADE1 com Ssp\ e um transformante prototrófico foi escolhido, o qual abrigava ou plasmídeo no locus adel. Esse gênero foi denominado MF502. 2B. Produção de Y. lipolvtica expressando sintase de pirofosfato de geranil-geranila. dehidroaenase de fitoeno e sintase de fitoeno/ciclase de licopeno: MF502 foi transformado com pMB4628 (teflp-carRP) que tinha sido tratadocom Ssp\. Nove colônias prototróficas foram escolhidas, as quais eram inco-lores, laranja ou muito laranja sobre a lâmina de transformação (agar YNB com 1% de glicose e 0,1% de glutamato [YNBglut]) após dois a três dias de crescimento. Duas, MF597 e MF600 (aquelas muito laranjas), produziram mais de 4 mg de caroteno por g de peso celular seco (DCW) após quatro dias de crescimento em YPD a 30°C. Análise de Southern revela uma única banda Kpn\-Hind\\\ diferente no DNA genômico de MF597 e MF600, nenhuma das quais sugeria que integração homóloga ocorreu em leu2-270. 2C. Produção de Y. lipolytica expressando sintase de fitoeno/ciclase de lico-oeno e dehidrogenase de fitoeno: ATCC201249 (MATA urct3-302 \eu2-270 Iys8-11) foi transformado com pMB4628 clivado com Ssp\. Centenas de colônias Leu+ foram empoçadas, crescidas novamente e transformadas com pMB4660 (teflp-carB) que tinha sido clivado do URA3 com Sal\. Uma colônia que era perceptivelmente amarela após 5 dias a 30°C sobre YNBglut mais 0,6 mM de lisina foi selecionada, denominada MF447 e verificou-se que produzia 0,2 mg de caroteno por grama de peso celular seco após 4 dias de crescida em YPD.

MF447 foi estimulado com 1 g/L de ácido 5-fluoroorótico e segregantes Ura" selecionados. Surpreendentemente, descobriu-se que todos eles retinham a aparência amarela idêntica de seu precursor, implicando que a perda de um gene URA3 funcional não coincide com a perda de uma enzima CarB funcional. Análise de Southern demonstra que dois fragmentos de uma digestão com Kpnl-Hindlll de DNA de MF447 contém seqüências de URA3p-hibridização, apenas uma das quais também se hibridiza ao carB. A outra está ausente em MF578, o segregante Ura3" escolhido para outra manipulação. Resgate de plasmídeo e análise da seqüência de DNA abrangendo o íntron carRP em gêneros MF447, MF597 (Exemplo 2c) e MF600 (Exemplo 2c) revelou que os éxons 1 e 2 eram contíguos e eram, cada um, separados por uma seqüência de íntron que carecia do sítio Sspl interno original (presente no pMB4628).

2D. Produção de Y. lipolytica expressando sintase de fitoeno/ciclase de lico-peno. dehidrogenase de fitoeno e sintase de pirofosfato de oeranilgeranila:MF578 foi transformado com pMB4683 (tef1p-GGS1) que tinha sido clivado com Sah (a montante do URAS) ou com Stu\ (dentro da ORF do GGS1). Colônias Ura+ Leu+ em ambos os casos apareciam laranja brilhante sobre YNBglut+Lys e sobre YPD e várias produziam mais de 4 mg de caroteno por grama de peso celular seco quando crescidas conforme acima. Uma, MF633, continha uma única cópia do plasmídeo no locus GGS1, conforme inferido a partir de análise de Southern. As outras surgiram através de integrações não homólogas ou mais complexas.

2E. Produção de Y. lipolytica expressando sintase de fitoeno/ciclase de lico-peno, dehidrogenase de fitoeno e sintase de pirofosfato de geranilgeranila: MF364 é cruzado com MF578 e esporos do diplóide resultante são colocados em lâminas sobre YPD durante dois a três dias a 30 °C. Colônias laranja Leu+ Ade" Ura" são selecionadas com relação à presença de tefp-carB, tefp-carRPe tefp-GGS1 através de PCR e com relação à alta produção de caro-tenóide (>4 mg/g de peso celular seco) após crescimento em meio líquido YPD. Colônias reunindo esses critérios, bem como mostrando resistência ao ácido 5-fluoroóticò, uma indicação de que elas abrigam o alelo ura3-302, são escolhidas para outros estudos e aqui depois referidas como gêneros GBR-Pua. Tal gênero é selecionado para outra análise e modificação. Exemplo 3: Extração de carotenóides de células de Yarrowia lipolytica

Testagem em frasco de agitação de gêneros gerados foi conduzida usando meio YPD (1% de extrato de levedo, 2% de peptona, 2% de glicose). Culturas de 20 ml em frascos de 125 ml foram crescidas a 30°C. Células de Y. lipolytica foram coletadas de culturas de 72-96 horas e extrações foram realizadas para determinar a forma e quantidade de carotenóide. 1,8 ml de cultura foram colocados em um tubo de Eppendorf. As células foram empelotadas e lavadas duas vezes com 1 ml de H20. Após a segunda lavagem, as células resuspensas foram transferidas para um tubo com tampa de pressão pré-pesado com um furo perfurado em cima e as células foram liofilizadas durante a noite. Após secagem para término, o tubo foi pesado de forma a calcular o peso das células secas. 0,25 ml da cultura no mesmo frasco de agitação foram colocados em um tubo com tampa de roscade 2 ml para extração de carotenóide. As células foram empelotadas e o so-brenadante foi aspirado. Células empelotadas podem ser congeladas a -80 9C e armazenadas. Um volume igual de glóbulos de zircônia cúbica foram adicionados às pelotas de células, junto com 1 ml de solvente de extração gelado (uma mistura a 50/50 v/v de hexano e acetato de etila contendo buti-Ihidróxitolueno a 0,01% (BHT)). A mistura foi, então, agitada (Mini-BeadBeater-8, BioSpec Products, Inc.) em uma velocidade máxima durante 5 minutos a 4 eC. A mistura foi, então, centrifugada em velocidade máxima durante 1 minuto e o sobrenadante foi coletado e depositado em um frasco de vidro de 16 ml. O resíduos de células restantes foram re-extraídos pelo menos três vezes, sem a adição de glóbulos de zircônia; todos os sobrena-dantes foram empoçados no frasco de vidro de 16 ml. Após extração, o frasco de vidro foi centrifugado durante 5 minutos a 2000 rpm a 4 eC em uma centrífuga para bancada Sorvall e sobrenadante foi transferido para um novo frasco de vidro de 16 ml. Um Speed Vac foi usado para concentrar o sobrenadante (temperatura ambiente no escuro) e as amostras foram armazenadas a -20 eC ou -80 eC até imediatamente antes de análise por HPLC. Antes de análise por HPLC, as amostras foram resuspensas em 1 ml de solvente gelado e, então, transferidas para um frasco âmbar gelado. No decorrer do protocolo, cuidado foi tomado para evitar contato com oxigênio, luz, calor e ácidos.

Exemplo 4: Quantificação de produção de carotenóide através de HPLC

Para análise de carotenóide, amostras foram resuspensas em solvente de extração gelado (uma mistura a 50/50 v/v de hexano e acetato de etila contendo butilhidróxitolueno a 0,01% (BHT). Um Alliance 2795 HPLC (Waters) equipado com uma coluna Waters XBridge C18 (3,5 um, 2,1 x 50 mm) e uma coluna de proteção Thermo Basic 8 (2,1 x 10 mm) foi usada para decompor o carotenóide a 25 eC; amostras autênticas de carotenóide foram usadas como padrões. As fases móveis e taxas de fluxo são mostradas a-baixo (Solvente A = acetato de etila; Solvente B = água; Solvente C = metanol; Solvente D = acetonitrilo). O volume de injeção era de 10 jiL O detector é um detector com fileira de fotodiodo Waters 996. Os tempos de retençãopara moléculas lipofílicas incluem astaxantina (1,159 min), zeaxantina (1,335), B-apo-8'-carotenal (2,86 min), ergosterol (3,11 min), licopeno (3,69 min), 0-Caroteno (4,02 min) e fitoeno (4,13 min). Astaxantina, zeaxantina, B-apo-8'-carotenal, licopeno e 6-Caroteno são detectados a 475 nm, enquanto 5 que ergosterol e fitoeno foram detectados a 286 nm.

TABELA 28. Tempos de Retenção para Moléculas Lipofílicas

<table>table see original document page 59</column></row><table>Exemplo 5: Expressão de uma forma truncada de reductase de HMG-CoA resulta em produção aumentada de carotenóide

De forma a aumentar a produção de carotenóide, o fluxo de car- bono através da via de isoprenóide é intensificada através de introdução de uma variante truncada do gene de reductase de HMG-CoA.

Em uma abordagem, uma variante truncada do gene de reductase de HMG-CoA, o qual também codifica uma seqüência líder de 77 ami-noácidos derivada de Hmg1 de S. cerevisiae é introduzida em um gêneroGRPBua (descrito no Exemplo 2E acima). O plasmídeo pTefHMG pode ser clivado com SnaBI, BbvC\ ou Bsu36\ para dirigir a integração no locus adel ou com BamH\ para dirigir a integração ao locus HMG1 ou com EcoRV para promover integração aleatória, nos gêneros GRPBua, restaurando os mesmos para prototrofia de adenina. Transformantes Ade+ resultantes são sele-cionados para produção aumentada de carotenóide.

Alternativamente, o gene HMG1 nativo de Y. lipolytica pode sermodificado sem seqüências de S. cerevisiae conforme descrito no Exemplo 1D acima, para criar o pMB4637. Esse plasmídeo pode ser digerido conforme descrito para o pTefHMG e transformado em gêneros GRPBua e os transformantes resultantes selecionados conforme descrito para produção aumentada de carotenóide.

Em ainda outra abordagem, uma variante truncada do gene de reductase de HMG-CoA de N. crassa pode ser utilizada e introduzida em gêneros de Y. lipolytica. De forma a gerar um plasmídeo adequado para expressão da reductase de HMG-CoA heteróloga, p641P (Yeast 2001 ; 18 (2001): 97-113) é modificado através de substituição do promotor ICL1 pelo promotor GPD e através de adição de seqüências que conferem resistência à fleomicina. DNA genômico de Y. lipolytica é amplificado com dois primers. GPDdist: 5' CACACGGTacctgtaggttgggttgggtg GPDprox: 5' CACACGGATCCtgtttaattcaagaatgaatatagagaagagaag e o fragmento resultante (0,7 kb) é clivado com BamVW e Kpn\ e o p641P clivado com BamB\ e Kpn\, criando o plasmídeo "p641 Pgpd". O gene ble sob o controle do promotor GPD de A. nidulans é, então, excisado do pBCphleo (Silar, Fungai Genetics Newsletter 42:73) como um fragmento Bcl\-BamH\ de 3,2 kb e inserido no sítio Bamhl único do "p641Pgpd", na orientação que preserva o sítio BamH\ proximal ao promotor GPD, para criar o "p641Pgpdble".

DNA genômico de N. crasa é amplificado com dois primers: Neuhmg diant: 5' CACACGGATCCACATCAACAatggcatctgccacccttcccc Neuhmg rev: 5' CAC ACGG ATCcaagtgctgacgcggaacttg e o fragmento resultante é clivado com BamHl e inserido no "p641 Pgpdble" digerido com BamHl na orientação correta. O plasmídeo resultante "pZg", contém seqüências que codificam um domínio catalítico citosólico truncado de reductase de hidróximetilglutaril-CoA de N. crassa (acesso ao Genbank: XP_324892) sob o controle do promotor constitutivo GPD. Esse plasmídeo pode ser introduzido no gênero Y. lipolytica criado no Exemplo 2E acima e transformantes são selecionados por sua resistência à fleomicina (100 ug/ml). Transformantes resultantes são testados com relação à produção deP-caroteno, conforme descrito acima.

Exemplo 6: Introdução de genes heteróloaos de hidroxilase de caroteno e cetolase de caroteno em gêneros de Y. lioolvtica que produzem carotenóide para produção de astaxantina

Para introdução de hidroxilase de caroteno e cetolase de caroteno em Y. lipolytica que produz carotenóide, pMB4692 e pMB4698, descritos conforme nos Exemplos 1E e 1F acima, podem ser seqüencialmente introduzidos no gênero GRPBua (descrito no Exemplo 2E). Para a introdução de pMB4692, o plasmídeo pode ser clivado com Sa/I ou BsrG\ para dirigir a integração ao locus ura3 ou com Xba\ para promover integração aleatória, selecionado prototrofia de uracila. Transformantes GRPBua Ura+ abrigando pMB4692 são selecionados para produção de zeaxantina em YPD. Células produzidas zeaxantina são transformadas com pMB4698 (o qual pode ser clivado com Ppi/MI, Ssp\ ou BbvC\ para dirigir a integração ao locus adel ou com EcoRI para promover integração aleatória) e colônias prototróficas são selecionadas para produção de astaxantina.

Alternativamente, de modo que a transformação de plasmídeo possa ser revertida, em que pMB4698 é transformado primeiro e transformantes são selecionados para prototrofia de adenina. Transformantes GRPBua Ade+ abrigando pMB4698 são selecionados para produção de canta-xantina. Células GRPBua[pMB4698] que produzem cantaxantina são transformadas com pMB4692 e colônias prototróficas são selecionadas para produção de astaxantina.

Em outra abordagem, os genes de cetolase de carotenóide e hidroxilase de carotenóide de P. marcusii podem ser introduzidos nos gêneros descritos no Exemplo 2 acima de forma a converter p-caroteno em astaxantina. DNA genômico de P. marcusii é amplificado com dois primers. CrtZdiant: 5' CACACCGTCTCAAatgaccaatttcctgatcgtcgtc CrtZrev: 5' CACACAGATCtcacgtgcgctcctgcgcc,

e o fragmento resultante é clivado com BsmB\, modificado com o fragmento Klenow de DNA polimerase e clivado com Bgl\\. Esse fragmento é inserido no plNA1269 clivado com Pml\ e BamH\ (J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2(2000): 207-216), contendo o promotor hp4d, o terminador XPR2, o gene selecionável LEU2 e seqüências necessárias para seleção e propagação em E. coli. O plasmídeo resultante "pA" contém seqüências que codificam a hi-droxilase de caroteno de P. marcusii (gene crtZ) (acesso ao Genbank: CAB56060.1) sob o controle do promotor hp4d.

"pYEGITEF" é modificado através de substituição do terminador UP2 pelo terminador XPR2 como segue. pINA 1291 é digerido com Aviil, modificado com o fragmento Klenow de DNA poljmerase e clivado com Eco-Rl e o pequeno fragmento contendo LIP2t é ligado ao "pYEGITEF" que tinha sido digerido com Sacll, modificado com DNA polimerase T4 na presença de dNTP e clivado com EcoR\. O plasmídeo resultante é denominado "pYEGITEF-LIP2t" .

De forma a amplificar o gene de cetolase de carotenóide, DNA genômico de P. marcusii é amplificado com dois primers. CrtWdiant: 5' CACACCCTAGGCCatgagcgcacatgccctgc CrtWrev: 5' CACACAAGCTTtcatgcggtgtcccccttg

e o fragmento resultante é clivado com Avr\\ e Hind\\\ e inserido no "pYEGI-TEF-LIP2t"clivado com AvrH e Hind\\\. O plasmídeo resultante, "pBt", contém seqüências que codificam a cetolase de caroteno (gene crtW) (acesso ao Genbank: CAB56059.1) sob o controle do promotor constitutivo TEFL

De forma a combinar os dois cassetes de expressão em um único plasmídeo, "pBt" é clivado com C/al, modificado com o fragmento Klenow de DNA polimerase e clivado com EcoR\ e o fragmento contendo crté isolado, misturado com o par adaptador de oligonucleotídeo fosforilado: 5 ' AATTCGCGGCCGCT e 5' AGCGGCCGCG,

clivado com Noti e ligado ao "pA" digerido com Noti. O plasmídeo resultante, "pABt", contém o cassete TEF1p/crtWILIP2t e o cassete hp4dlcrtZ/XPR2t, bem como o gene selecionável LEU2.

"pABt" pode ser introduzido no gênero de Y. lipolytica descrito acima no Exemplo 4 (TEF1p/al-1/XPR2t; hp4d/carRP/LIP2t; GPDp/HMGRtmnc) e transformantes selecionados para prototrofia de leucina.Exemplo 7: Inativacão parcial de gene ERG9 de Y. lipolvtica que codifica sintase de esaualeno resulta em produção aumentada de carotenóide

7A. De forma a inativar parcialmente o gene ER9 que codifica sintase de esqualeno, o gene FOL3 vizinho é rompido, resultando em um requisito de ácido folínico. Esse gênero é, então, transformado com um fragmento de DNA com mutação abrangendo parcialmente os dois genes e transformantes Fol+ são selecionados com relação à atividade diminuída de sintase de esqualeno.

Os seguintes oligonucleotídeos são sintetizados: PRIMER K 5'-CCTTCTAGTCGTACGTAGTCAGC PRIMER L 5'-CCACTGATCTAGAATCTCTTTCTGG

e usados para amplificar um fragmento de 2,3 kb a partir de DNA genômico de Y. lipolytica abrangendo a maioria do gene FOL3, usando Pfu polimerase. O fragmento resultante é clivado com Xbal e fosforilado, então, ligado no pBluescriptSK", que tinha sido clivado com Kpn\, tratado com DNA polimerase T4 (T4pol) na presença de dNTPs e subseqüentemente clivado com Xba\. O plasmídeo resultante, designado pBS-fo13, foi, então, clivado com Acc65\ e EcoRI, tratado com T4pol conforme acima e ligado ao fragmento de ADE1 EcoRV-Spel de 3,4 (tratado com T4pol) do pMB4529.

O plasmídeo resultante, pBSfol3Aade, pode ser clivado com Bs/WI e Xbal para liberar um fragmento de 5,5 kb que é usado para transformar os gêneros GRBPua descritos acima para prototrofia à adenina. Os transformantes Ade+ resultantes são selecionados com relação a um requisito de ácido folínico e com relação à integração homóloga através de análise porPCR.

Gêneros que abrigam o alelo fol3AADE1 resultante podem ser transformados com um fragmento de DNA de 3,5 kb gerado através de am-plificação por PCR mutagênica usando os primers: PRIMERM 5'-GGCTCATTGCGCATGCTAACATCG PRIMERN 5'-CGACGATGCTATGAGCTTCTAGACG e DNA genômico de Y. lipolytica como template. O fragmento resultante contendo os três quartos N-terminais dá ORG de FOL3 e os nove décimos C-terminais da ORF de ERG9 é usado para transformar gêneros. Os transfor-mantes Fol+ Ade- são selecionados com relação à atividade diminuída de sintase de esqualeno através da sensibilidade a agentes tais como ácido zaragósico, itraconazola ou fluconazola. Adicionalmente, os transformantes resultante são selecionados com relação à produção aumentada de carote-nóide.

7B. Alternativamente, o fragmento de PCR produzido em 7A poderia ser clonado e alterado de uma forma tal a remover a região 3'-não traduzida do gene ERG9. Substituição da ruptura fol3AADE1 por esse fragmento resulta em expressão diminuída de sintase de esqualeno [Schuldiner e colaboradores (2005), Cell 123: 507-519] [Muhlrad e Parker (1999), RNA 5: 1299-1307], o qual pode ser confirmado conforme em 7A. Essa abordagem pode também ser usada em um gênero Fol+Ade", usando o marcador ADE1 para romper a 3'-UTR de ERG9.

7C. Em ainda outra abordagem, alelos ERG9 parcialmente de-fectivos podem ser identificados em S. cerevisiae usando técnicas de emba-ralhamento de plasmídeo [Boeke e colaboradores, (1987), Methods Enzy-mol. 154: 164-175] e usando sensibilidades ao fármaco como um fenótipo. Genes defectivos podem ser transferidos para Y. lipolytica usando técnicas padrões de biologia molecular.

Exemplo 8: Tratamento de gêneros de Y. lipolytica que produzem carotenói-de com inibidor de um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenói-de resulta em produção aumentada de carotenóide

Culturas produzidas no Exemplo 2 são tratadas com o inibidor de sintase de esqualeno, ácido zaragósico (ácido zaragósico a 0,5 nM) e monitoradas com relação à produção de p-caroteno, conforme descrito acima.

Exemplo 9: Construção de um gênero oleaginoso de Saccharomyces cerevisiae

Os genes que codificam as duas subunidades de liase de ATP-citrato de N. crassa, a deaminase de AMP de Saccharomyces cerevisiae e a enzima málica citosólica de M. circinelloides são superexpressos em gene-ros de S. cerevisiae de forma a aumentar o teor de lipídio total. Abordagens similares para intensificar a produção de lipídio poderiam ser empregadas em outros organismos hospedeiros, tais como Xanthophyllomyces dendro-rhous (Phaffia rhodozyma), usando os mesmos ou polipeptídeos oleagínicos homólogos, funcionalmente similares.

Kits Qiagen RNAEasy (Qiagen, Valencia, CA.) são usados para preparar RNA mensageiro a partir da biomassa liofilizada preparada de culturas de N. crassa. Subseqüentemente, RT-PCR é realizada em duas reações contendo o template de mRNA e qualquer um dos seguintes pares de primer: acl1:

Idiant: 5' CACACGGATCCTATAatgccttccgcaacgaccg 1rev: 5' CACACACTAGttaaatttggacctcaacacgaccc acl2:

2diant: 5" CACACGGATCCAATATAAatgtctgcgaagagcatcctcg 2rev: 5' CACACGCATGCttaagcttggaactccaccgcac

O fragmento resultante da reação com acM é clivado com Spe\ e BamHI e aquele da reação com acl2 é clivado com BamH\ e Sph\ e ambos são ligados juntos no YEp24 que tinha sido digerido com Nhe\ e Sph\, criando o plasmídeo "p12". O promotor bi-direcional GALI-10 é amplificado de DNA genômico de S. cerevisiae usando os primers: GaMO: 5' CACACGGATCCaatmcaaaaattcttactttttttttggatggac Ga11: 5' CACACGGATCCttttttctccttgacgttaaagtatagagg e fragmento resultante de 0,67 kb é clivado com BamH\ e ligado em qualquer orientação ao "p12" digerido com BamH\ para criar "p1ga12" e "p2gal", contendo GALI-acl1/GAL10-ac12 e GAL10-acl1/GALI-ac12, respectivamente (acesso ao Genbank: aciV. CAB91740.2; acl2: CAB91741.2).

De forma a amplificar o gene de S. cerevisiae que codifica dea-minase de AMP e um promotor adequado para expressão desse gene, DNA genômico de S. cerevisiae é amplificado usando dois pares de primer em reações distintas: AMD1 ORF:AMD1DIANT: 5' CACACGAGCTCAAAAatggacaatcaggctacacagag AMDIrev: 5' CACACCCTAGGtcacttttcttcaatggttctcttgaaattg GAL7p:

gal7prox: 5' CACACGAGCTCggaatattcaactgtttttttttatcatgttgatg gal7dist: 5' CACACGGAtccttcttgaaaatatgcactctatatcttttag e o fragmento resultante da reação com AMD1 (2,4 kb) é clivado com Saci e Avr\\ e aquele da reação com GAL7 (0,7 kb) é clivado com BamH\ e Sph\ e ambos são ligados juntos no YEp13 que tinha sido digerido com Nhe\ e Ba-mHI, criando o plasmídeo "pAMPD". Esse plasmídeo traz o gene de S. cere-visiae, AMD1, que codifica deaminase de AMP, sob o controle do promotor galactose-induzível GAL7.

RNA mensageiro é preparado a partir da biomassa liofilizada de M. circinelloides, conforme descrito acima, e o template de mRNA é usado em uma reação de RT-PCR com dois primers: MAEdiant: 5' CACACGCTAGCTACAAAatgttgtcactcaaacgcatagcaac MAErev: 5' CACACGTCGACttaatgatctcggtatacgagaggaac e o fragmento resultante é clivado com Nhe\ e Sa/I e ligado a pRS413TEF digerido com Xba\ e Xho\ (Mumberg, D. e colaboradores (1995) Gene, 156: 119-122), criando o plasmídeo "pTEFMAE", o qual contém seqüências que codificam a enzima málica citosólica NADP+-dependente de M. circinelloides (E.C. 1.1.1.40; gene mce; acesso ao Genbank: AY209191) sob o controle do promotor constitutivo TEFL

Os plasmídeos "plgal2", "pAMPD" e "pTEFMAE" são seqüencialmente transformados em um gênero de S. cerevisiae para restaurar a pro-totrofia para uracila ("plgal 2"), leucina ("pAMPD") e histidina ("pTEFMAE") (Guthrie e Fink, Methods in Enzymology 194: 1-933, 1991). Os transforman-tes resultantes são testados com relação ao teor de lipídio total após testa-gem em um frasco de agitação em meio sintético completo (SC) carecendo de uracila, leucina e histidina, conforme descrito no Exemplo 3 ou em um processo de fermentação em 2 etapas. No processo em 2 etapas, 1,5 ml de células de uma cultura noturna em tubo giratório de 2 ml contendo meio SC carecendo de uracila, leucina e histidina são centrifugados, lavados em águadestilada e resuspensos em 20 ml de um meio com limitação de nitrogênio adequado para acúmulo de lipídio (30 g/L de glicose, 1,5 g/L de extrato de levedo, 0,5 g/L de NH4CI, 7 g/L de KH2P04, 5 g/L de Na2HP04-12H20, 1,5 g/L de MgS04-7H20, 0,08 g/L de FeCI3-6H20, 0,01 g/L de ZnS04-7H20, 0,1 g/L de CaCI2-2H20, 0,1 mg/L de MnS04-5H20, 0,1 mg/L de CuS04-5H20, 0,1 mg/L de Co(N03)2-6H20; pH de 5,5 (J Am Oil Chem Soe 70: 891-894 (1993)).

O teor de lipídio intracelular dos gêneros de S. cerevisiae de controle e modificados é analisado usando a sonda fluorescente, Nile Red (J Micróbio/ Meth (2004) 56: 331-338). Em resumo, células diluídas em tampão são coradas com Nile Red, excitadas a 488 nm e os espectros de emissão fluorescentes na região de comprimento de onda de 400-700 nm são adquiridos e comparado com espectros correspondentes de células não coradas com Nile Red. Para confirmar os resultados a partir do método de estimativa rápida, o teor de lipídio total é determinado através de análise cromatográfi-ca gasosa dos ácidos graxos totais diretamente transmetilesterificados de células secas, conforme descrito (Appl Micróbio! Biotechnol. Novembro de 2002; 60(3): 275-80). Gêneros de S. cerevisiae não transformados produzem 6% e 10% de lipídio total (base peso em célula seca) após crescimento em YPD e meio de acúmulo de lipídio, respectivamente. Gêneros de levedo expressando os múltiplos polipeptídeos oleagínicos produzem 17% e 25% de lipídio total após crescimento em YPD e meio de acúmulo de lipídio, respectivamente.

Exemplo 10: Introdução de hidroxilase de caroteno heteróloaa em gêneros de Y. lipolvtica oue produzem carotenóide para produção de zeaxantina

MF578 (tef-carRP tef-carB) foi transformado com pMB4692 que tinha sido clivado com Sa/I. Várias colônias Ura+ inferidas como contendo tef-crtZ através de análise por PCR foram capazes de produzir zeaxantina em frascos de agitação YPD e, em um caso, todo caroteno foi eliminado.

As tabelas a seguir são mencionadas no decorrer da especificação:

Tabela 1. Exemplos de polipeptídeos de carboxilase de acetil-CoA• Fileira

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Tabela 2. Exemplos de polipeptídeos de decarboxilase de piruvato

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Tabela 3. Exemplos de polipeptídeos de dehidrogenase de isocitrato

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Tabela 4. Exemplos de polipeptídeos de liase de ATP-citrato

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Tabela 5. Exemplos de polipeptídeos de enzima málica

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Tabela 6. Exemplos de polipeptídeos de deaminase de AMP

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Tabela 7. Exemplos de polipeptídeos de tiolase de acetoacetil-CoA

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Tabela 8. Exemplos de polipeptídeos de sintase de HMG-CoA

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Tabela 9. Exemplos de polipeptídeos de reductase de HMG-CoA• Fileira

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Tabela 10. Exemplos de polipeptídeos de quínase de mevalonato

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Tabela 11. Exemplos de polipeptídeo de quínase de fosfomevalonato

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Tabela 12. Exemplos de polipeptídeos de decarboxilase de pirofosfato de mevalonato

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Tabela 13. Exemplos de polipeptídeos de isomerase de IPP

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Tabela 14. Exemplos de polipeptídeos de sintase de FPP

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Tabela 15. Exemplos de polipeptídeos de sintase de GGPP

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Tabela 16. Exemplos de polipeptídeos de sintase de esqualeno

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• Gl GenbankTabela 17. Exemplos de polipeptídeos de dehidrogenase de fitoeno

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Tabela 18. Exemplos de polipeptídeos de sintase de fitoeno e ciclase de li-copeno

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Tabela 19. Exemplos de polipeptídeos de cetolase de carotenóide

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Tabela 20. Exemplos de polipeptídeos de hidroxilase de carotenóide

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Tabela 21. Exemplos de polipeptídeos de sintase de astaxantina e polipeptídeos putativos de sintase de astaxantina

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Tabela 22. Exemplos de polipeptídeos de epsilon hidroxilase de carotenóide.

<table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table>Tabela 24. Exemplos de polipeptídeos de glicosiltransferase de carotenóide<table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 80</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table>Tabela 29. Exemplos de sintase de polipeptídeos de prenildifosfato

<table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table><table>table see original document page 87</column></row><table><table>table see original document page 88</column></row><table>

Conforme aqueles habilitados na técnica reconhecerão ou serão

capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita aqui. O escopo da presente invenção não se destina a estar limitado à descrição acima, mas antes, é conforme apresentado nas reivindicações a seguir.

Claims (63)

1. Fungo recombinante caracterizado por:a. o fungo ser oleaginoso pelo fato de poder acumular lipídio até pelo menos cerca de 20% de seu peso celular seco; eb. o fungo produzir pelo menos um carotenoide e poder acumular o carotenoide produzido em pelo menos cerca de 1% de seu peso celular seco;em que o fungo compreende pelo menos uma modificação selecionada do grupo consistindo de modificações carotenogênicas, modificações oleagínicas e combinações das mesmas e em que a pelo menos uma modificação altera a oleaginicidade do fungo, confere ao fungo oleaginidade, confere ao fungo a capacidade de produzir o pelo menos um carotenoide em um nível de pelo menos cerca de 1% de seu peso celular seco ou confere ao fungo a capacidade de produzir pelo menos um carotenoide o qual o fungo não produz naturalmente.

2. Fungo de acordo com a reivindicação 1 em que o fungo é naturalmente oleaginoso.

3. Fungo de acordo com a reivindicação 1 em que o fungo é não naturalmente oleaginoso.

4. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 em que o fungo não produz naturalmente o pelo menos um carotenoide.

5. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 em que o fungo produz naturalmente pelo menos um carotenoide.

6. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 em que o fungo não produz naturalmente pelo menos um carotenoide.

7. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 em que o fungo produz naturalmente pelo menos um carotenoide.

8. Fungo de acordo com a reivindicação 1 em que o fungo cresce como uma única célula.

9. Fungo de acordo com a reivindicação 1 em que o fungo é umlevedo.

10. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9em que o fungo contém pelo menos uma modificação oleagínica.

11. Fungo de acordo com a reivindicação 10 em que a pelo menos uma modificação oleagínica confere oleaginidade ao fungo.

12. Fungo de acordo com a reivindicação 10 em que a pelo me- nos uma modificação oleagínica altera a oleaginicidade do fungo.

13. Fungo de acordo com a reivindicação 10 em que o fungo ainda compreende pelo menos uma modificação carotenogênica em que a modificação carotenogênica confere ao fungo a capacidade de produzir o pelo menos um carotenóide em um nível de pelo menos cerca de 1% de seu peso celular seco ou confere ao fungo a capacidade de produzir pelo menos um carotenóide o qual o fungo não produz naturalmente.

14. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13 em que a pelo menos uma modificação oleagínica aumenta a expressão ou atividade de pelo menos um polipeptídeo oleagínico.

15. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13 em que a pelo menos uma modificação oleagínica diminui a expressão ou atividade de pelo menos um polipeptídeo oleagínico.

16. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13 em que a pelo menos uma modificação oleagínica aumenta a expressão ou atividade de pelo menos um polipeptídeo oleagínico e diminui a expressão ou atividade de pelo menos um outro polipeptídeo oleagínico.

17. Fungo de acordo com a reivindicação 11 em que o fungo é da espécie Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma).

18. Fungo de acordo com a reivindicação 11 em que o fungo é da espécie Saccharomyces cerevisiae.

19. Fungo de acordo com a reivindicação 14 ou 15 em que o pelo menos um polipeptídeo oleagínico é selecionado do grupo consistindo de polipeptídeo de carboxilase de acetil-CoA, polipeptídeo de decarboxilase de piruvato, polipeptídeo de dehidrogenase de isocitrato, polipeptídeo de liase de ATP-citrato, polipeptídeo de enzima málica, polipeptídeo de deami-nase de AMP e combinações dos mesmos.

20. Fungo de acordo com a reivindicação 14 ou 15 em que opelo menos um polipeptídeo oleagínico é pelo menos um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo de um polipeptídeo em qualquer uma das Tabelas 1 a 6.

21. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14-5 16 em que a pelo menos uma modificação oleagínica compreende expressão de pelo menos um polipeptídeo oleagínico heterólogo no fungo.

22. Fungo de acordo com a reivindicação 21 em que a pelo menos uma modificação oleagínica compreende expressão de pelo menos um gene heterólogo que codifica o pelo menos um polipeptídeo oleagínico hete- rólogo.

23. Fungo de acordo com a reivindicação 21 em que o pelo menos um polipeptídeo oleagínico heterólogo compreende um polipeptídeo de animal, um polipeptídeo de mamífero, um polipeptídeo de inseto, um polipeptídeo de planta, um polipeptídeo fúngico, um polipeptídeo de levedo, um polipeptídeo de alga, um polipeptídeo bacteriano, um polipeptídeo cianobac-teriano, um polipeptídeo archaebacteriano ou um polipeptídeo de protozoá-rio.

24. Fungo de acordo com a reivindicação 21 em que o pelo menos um polipeptídeo oleagínico heterólogo compreende pelo menos dois polipeptídeos oleagínicos heterólogos.

25. Fungo de acordo com a reivindicação 24 em que os pelo menos dois polipeptídeos oleagínicos heterólogos são de um único organismo fonte.

26. Fungo de acordo com a reivindicação 24 em que os pelo 25 menos dois proporcionas oleagínicos heterólogos são de pelo menos doisorganismos fonte diferentes.

27. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9 em que o fungo contém pelo menos uma modificação carotenogênica.

28. Fungo de acordo com a reivindicação 27 em que a pelo me-30 nos uma modificação carotenogênica confere ao fungo a capacidade de produzir o pelo menos um carotenóide em um nível de pelo menos cerca de 1% de seu peso celular seco.

29. Fungo de acordo com a reivindicação 27 em que a pelo menos uma modificação carotenogênica confere ao fungo a capacidade de produzir pelo menos um carotenóide o qual o fungo não produz naturalmente.

30. Fungo de acordo com a reivindicação 27 em que o fungo 5 ainda compreende pelo menos uma modificação oleagínica em que a modificação oleagínica altera a oleaginicidade do fungo ou confere ao fungo ole-aginidade.

31. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-30 em que a pelo menos uma modificação carotenogênica confere a capaci-10 dade ao fungo de produzir o pelo menos um carotenóide em um nível selecionado do grupo consistindo de pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5% e pelo menos cerca de 10% do peso celular seco do fungo.

32. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-15 31 em que o pelo menos um carotenóide é selecionado do grupo consistindode astaxantina, B-caroteno, cantaxantina, zeaxantina, luteína, licopeno e combinações dos mesmos.

33. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-31 em que o pelo menos um carotenóide é predominantemente astaxantina.

34. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-31 em que a pelo menos uma modificação carotenogênica aumenta a expressão ou atividade de um polipeptídeo carotenogênico.

35. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-31 em que a pelo menos uma modificação carotenogênica diminui a expres- são ou atividade de um polipeptídeo carotenogênico.

36. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 27-31 em que a pelo menos uma modificação carotenogênica aumenta a expressão ou atividade de pelo menos um polipeptídeo carotenogênico e diminui a expressão ou atividade de pelo menos um outro polipeptídeo caroteno-gênico.

37. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-36 em que a pelo menos uma modificação carotenogênica compreende ex-pressão de pelo menos um polipeptídeo carotenogênico heterólogo.

38. Fungo de acordo com a reivindicação 37 em que a pelo menos uma modificação carotenogênica compreende expressão de pelo menos um gene heterólogo que codifica o pelo menos um polipeptídeo carotenogê-nico heterólogo.

39. Fungo de acordo com a reivindicação 34 ou 35 em que o polipeptídeo carotenogênico é selecionado do grupo consistindo de: polipep-tídeos da biossíntese de isoprenóide, polipeptídeos da biossíntese de caro-tenóide, polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide e combi-nações dos mesmos.

40. Fungo de acordo com a reivindicação 39 em que os polipeptídeos da biossíntese de isoprenóide são selecionado do grupo consistindo de: polipeptídeo de tiolase de acetoacetil-CoA, polipeptídeo de sintase de HMG-CoA, polipeptídeo de reductase de HMG-CoA, polipeptídeo da quínase de mevalonato, polipeptídeo da quínase de fosfomevalonato, polipeptídeo de decarboxilase de pirofosfato de mevalonato, polipeptídeo de isomerase de IPP, polipeptídeo de sintase de FPP e polipeptídeo de sintase de GGPP.

41. Fungo de acordo com a reivindicação 39 em que os polipeptídeos da biossíntese de carotenóide são selecionados do grupo consistindo de: polipeptídeo de sintase de fitoeno, polipeptídeo de dehidrogenase de fitoeno, polipeptídeo de ciclase de licopeno, polipeptídeo de cetolase de carotenóide, polipeptídeo de hidroxilase de carotenóide, polipeptídeo de sintase de astaxantina, polipeptídeo de epsilon hidroxilase de carotenóide, polipeptídeo de glicosiltransferase de carotenóide, polipeptídeos de ciclase de licopeno (subunidades beta e epsilon) e polipeptídeo de aciltransferase de acil-CoA:diacilglicerol.

42. Fungo de acordo com a reivindicação 39 em que os polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide são selecionados do grupo consistindo de polipeptídeo da sintase de esqualeno, sintase de prenildi fosfato e polipreniltransferase de PHB.

43. Fungo de acordo com a reivindicação 39 em que o polipeptídeo carotenogênico é selecionado do grupo consistindo de quaisquer umdos polipeptídeos de qualquer uma das Tabelas 7-25, Tabela 29 e Tabela 30 e combinações dos mesmos.

44. Fungo de acordo com a reivindicação 37 em que o pelo menos um polipeptídeo carotenogênico heterólogo compreende um polipeptí-5 deo de animal, um polipeptídeo de mamífero, um polipeptídeo de inseto, um polipeptídeo de planta, um polipeptídeo fúngico, um polipeptídeo de levedo, um polipeptídeo de alga, um polipeptídeo bacteriano, um polipeptídeo ciano-bacteriano, um polipeptídeo archaebacteriano ou um polipeptídeo de proto-zoário.

45. Fungo de acordo com a reivindicação 37 em que o pelo me-nos um polipeptídeo carotenogênico heterólogo compreende pelo menos dois polipeptídeos carotenogênicos heterólogos.

46. Fungo de acordo com a reivindicação 45 em que os pelo menos dois polipeptídeos carotenogênicos heterólogos são de um único or-ganismo fonte.

47. Fungo de acordo com a reivindicação 45 em que os pelo menos dois polipeptídeos carotenogênicos heterólogos são de pelo menos dois organismos fonte diferentes.

48. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-20 cedentes em que o fungo acumula o pelo menos um carotenóide produzidoem um nível selecionado do grupo consistindo de: acima de cerca de 1%, acima de cerca de 2%, acima de cerca de 3%, acima de cerca de 5% e acima de cerca de 10% do peso celular seco do fungo.

49. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-25 cedentes caracterizado pelo fato de o fungo acumular lipídio na forma de corpos citoplásmicos.

50. Fungo de acordo com a reivindicação 49 em que o pelo menos carotenóide se acumular nos corpos oleosos citoplásmicos.

51. Gênero de Yarrowia lipolytica compreendendo uma ou mais 30 modificações selecionadas do grupo consistindo de uma modificação oleagí-nica, uma modificação carotenogênica e combinações das mesmas, de modo que o gênero acumula de 1% a 10% de seu peso celular seco como pelomenos um carotenoide.

52. Gênero de acordo com a reivindicação 51 caracterizado pelo fato de acumular de 20% a 50% de seu peso celular seco.

53. Gênero de acordo com a reivindicação 52 em que o gênero 5 acumula de 20% a 50% de seu peso celular seco como lipídio na forma decorpos oleosos citoplásmicos.

54. Gênero de acordo com a reivindicação 51 em que o gênero compreende uma modificação carotenogênica selecionada do grupo consistindo de: a. expressão de um polipeptídeo selecionado do grupo consis-tindo de um polipeptídeo de reductase de HMG-CoA endogeno truncado que carece do domínio de abrangência de membrana N-terminal, tiolase de ace-toacetil-CoA, sintase de HMG-CoA, sintase de FPP e sintase de GGPP;b. expressão de um polipeptídeo heterólogo selecionado do gru-15 po consistindo de sintase de fitoeno, desaturase de fitoeno, ciclase de lico-peno, cetolase de carotenoide, hidroxilase de carotenoide e combinações dos mesmos;c. expressão ou atividade diminuída de um polipeptídeo endogeno selecionado do grupo consistindo de polipeptídeo de sintase de esquale- no, polipeptídeo de sintase de prenildifosfato e polipeptídeo de poliprenil-transferase de PHB; e combinações dos mesmos.

55. Gênero de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-54 em que o gênero acumula 1-10% de seu peso celular seco como p-caroteno.

56. Gênero de acordo com a reivindicação 51 em que o gênerocompreende uma modificação carotenogênica selecionada do grupo consistindo de:a. expressão de um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo de um polipeptídeo de reductase de HMG-CoA endogeno truncado que carece do domínio de abrangência de membrana N-terminal, tiolase de ace-toacetil-CoA, sintase de HMG-CoA, sintase de FPP e sintase de GGPP;b. expressão de um polipeptídeo heterólogo selecionado do gru-po consistindo de sintase de fitoeno, desaturase de fitoeno, ciclase de lico-peno, cetolase de carotenoide, hidroxilase de carotenoide, sintase de asta-xantina, epsilon hidroxilase de carotenoide, ciclase de licopeno (subunidades beta e epsilon), glicosiltransferase de carotenoide, aciltransferase de acil-CoA:diacilglicerol e combinações dos mesmos;c. expressão ou atividade diminuída de um polipeptídeo de sintase de esqualeno endógeno; e combinações dos mesmos.

57. Gênero de acordo com qualquer uma das reivindicações 51-53 ou 56 em que o gênero acumula 1-10% de seu peso celular seco como astaxantina ou luteína.

58. Método de produção de um carotenoide, o método compreendendo as etapas de:a. cultivo do fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes sob condições que permitem a produção de carotenoide; eb. isolamento do carotenoide produzido.

59. Método de acordo com a reivindicação 58 em que a etapa de isolamento compreende fracionamento do meio de cultura para obter pelo menos uma fração enriquecida em carotenoide.

60. Método de acordo com a reivindicação 58 em que:a etapa de cultura compreende cultura do fungo sob condições que permitem acúmulo do carotenoide nos corpos oleosos citoplásmicos; ea etapa de isolamento compreende isolamento do óleo derivado dos corpos oleosos citoplásmicos.

61. Método de acordo com a reivindicação 58 em que o carotenoide é selecionado do grupo consistindo de astaxantina, p-caroteno, canta-xantina, zeaxantina, luteína, licopeno e combinações dos mesmos.

62. Método de acordo com a reivindicação 58 em que o carotenoide compreende astaxantina.

63. Método de preparo de um aditivo alimentício ou para ração contendo um carotenoide, o método compreendendo as etapas de:a. cultura do fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 -57 sob condições que permitem produção do carotenoide;b. isolamento do carotenóide; ec. combinação do carotenóide isolado com um ou mais de outros componentes alimentícios ou para ração.