JP2002209574A - 遺伝子破壊酵母 - Google Patents

遺伝子破壊酵母

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JP2002209574A
JP2002209574A JP2001011191A JP2001011191A JP2002209574A JP 2002209574 A JP2002209574 A JP 2002209574A JP 2001011191 A JP2001011191 A JP 2001011191A JP 2001011191 A JP2001011191 A JP 2001011191A JP 2002209574 A JP2002209574 A JP 2002209574A
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gene
yeast
ade1
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JP2001011191A
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Takeshi Fukuchi
健 福地
Satoshi Yokomizo
聡 横溝
Fumio Kosakata
史雄 小坂田
Keiji Matsumoto
圭司 松本
Masamichi Takagi
正道 高木
Akinori Ota
明徳 太田
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Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
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Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 酵母の特性を利用し、かつ遺伝子組み換えに
よる産業上有用な物質生産系を構築するために、ある特
定の遺伝子のみを破壊して栄養要求性を付加した酵母を
提供する。 【解決手段】 キャンディダ・マルトーサのホスホリボ
シルアミノイミダゾール−サクシノカルボキサミド合成
酵素（ＥＣ６．３．２．６）をコードするＡＤＥ１遺伝
子断片を用いた染色体ＤＮＡとの相同的組換えにより、
ＡＤＥ１遺伝子が破壊された酵母株を作製する。さら
に、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子を含んでなる
遺伝子発現カセットで当該破壊株を形質転換し、その形
質転換体を培養し、生分解性ポリエステルを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、酵母のある特定の
染色体ＤＮＡを相同的組換えの原理により破壊する方
法、及び破壊株に関する。また、当該破壊株を用いた産
業上有用な物質の生産に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術の発展により、原核生
物や真核生物を利用して産業上有用な物質を大量に製造
することが可能となった。真核生物のうち酵母でもサッ
カロミセス属は、古くから酒類など発酵性食品の生産に
利用されてきたほか、キャンディダ・マルトーサ（ Ｃ
ａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）では、かつて微生物蛋
白質として食飼料に利用されたことがあり、酵母自体の
安全性も確かめられている。
【０００３】酵母は増殖が速く、一般に細菌よりも高い
細胞密度で培養することができる。さらに、酵母は、細
菌と比べて菌体と培養液との分離が容易であることか
ら、生産物の抽出精製工程をより簡単にすることも可能
である。こうした特性を生かして、酵母は、組換えＤＮ
Ａによる有用生産物の製造宿主として利用されており、
その有用性が実証されている。
【０００４】種々の酵母のうち、キャンディダ属酵母は
サッカロミセス属と異なり、好気的条件下での培養でエ
タノールを生成せず、それによる増殖阻害も受けないこ
とから、高密度での連続培養による効率的な菌体製造及
び物質生産が可能である。さらに、無胞子酵母キャンデ
ィダ・マルトーサは、炭素鎖Ｃ6〜Ｃ40の直鎖炭化水素
やパーム油、ヤシ油等の油脂を唯一の炭素源として資化
・生育できるという特性を有している。この特性は、疎
水性化学物質の変換による有用物質の生産や反応の場と
して実用上有利であることから、種々の化合物の生産へ
の利用が期待されている（参考図書：Ｗｏｌｆ Ｋ．編
Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉ
ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａ Ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ
（１９９６） ｐ４１１−５８０）。また、その特性を
生かしてキャンディダ・マルトーサの遺伝子組換えによ
る有用物質の生産への利用も期待されており、そのため
の遺伝子発現系の開発が精力的に行われて来た（特開昭
６２−７４２８７公報、特開昭６２−７４２８８号公
報、特開平２−７２８２２号公報）。最近では、キャン
ディダ・マルトーサは、遺伝子組換えにより直鎖ジカル
ボン酸の生産に利用できることが公開されている（ＷＯ
９９／０４０１４）。
【０００５】
【発明が解決しようとしている課題】遺伝子組換えによ
る物質生産の宿主として酵母を用いる場合、大腸菌等を
用いる場合と同様、適当な栄養要求性などの選択符号が
付加された変異株を取得する必要がある。従来、栄養要
求性の付加には、ニトロソグアジニンやエチルメタンス
ルホン酸などの変異源を用いたランダム変異誘起処理に
よって変異株を取得していた。しかし、この変異導入法
では目的の栄養要求株が取得できるが、変異が目的の箇
所以外にも入っている可能性が否定できない。この事
が、酵母を宿主として開発する場合の障害となり、物質
生産の場としての利用が、大腸菌などと比較して遅れて
いる原因といえる。
【０００６】例えば、キャンディダ・マルトーサ用の宿
主ベクター系は早くから開発され、また、突然変異誘起
処理により栄養要求性が付加された変異株が多数取得さ
れているにもかかわらず、組換え体を用いた新たな有用
化学物質生産の工業化はされていない。この理由に、野
生株と同等の増殖能や直鎖炭化水素鎖の資化性能を持つ
適当な栄養要求性を持ったキャンディダ・マルトーサが
取得されていないことが挙げられる。キャンディダ・マ
ルトーサを突然変異処理することによって開発されたＣ
ＨＡ１株は、ＡＤＥ１遺伝子とＨＩＳ５遺伝子に変異が
あることが確認されているが（Ｋａｗａｉ Ｓ．等、Ａ
ｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５５：５９−６５
（１９９１））、増殖能が野生株より劣る。これは目的
の箇所以外の変異によるものと考えられている。
【０００７】さらに、ランダム変異により取得された変
異株のもう一つの問題点に、変異箇所の自然復帰があ
る。この場合、培養中に復帰株が優先的に増殖するた
め、組換え菌では物質生産性が落ちることがある。ま
た、復帰株は、自然界に流出した場合、生存・増殖する
可能性が高く、安全規準の面から問題がある。従って、
ランダム変異導入により取得した菌株を物質の生産の場
として利用するのは、適当でない。そこで、ある特定の
栄養要求性遺伝子のみ破壊された破壊株の取得が望まれ
ていた。
【０００８】先に述べたように、キャンディダ・マルト
ーサの変異株として、ＡＤＥ１遺伝子やヒスチジノール
−ホスフェート−アミノトランスフェラーゼ（ＨＩＳ５
遺伝子）、オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキ
シレース（ＵＲＡ３遺伝子）などの遺伝子変異株が多数
取得されている（参考図書：Ｗｏｌｆ Ｋ．編 Ｎｏｎ
ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ｐ４１１−５８０）。しか
し、ある特定の遺伝子のみを破壊することにより栄養要
求性を付加したキャンディダ・マルトーサは、現在まで
得られていない。酵母の特性を利用し、かつ遺伝子組換
えによる産業上有用な物質生産系を構築するためには、
そのような遺伝子破壊株が望まれていた。また、キャン
ディダ・マルトーサに限らず、そのような遺伝子破壊株
が望まれている。
【０００９】さらに、キャンディダ・マルトーサにおい
ては、直鎖炭化水素、パーム油、ヤシ油等の油脂を唯一
の炭素源として資化・生育するという特性を生かした産
業上有用な物質の生産が期待されていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換えの手
法を駆使することにより、酵母のホスホリボシルアミノ
イミダゾール−サクシノカルボキサミド合成酵素（ＥＣ
６．３．２．６）をコードするＤＮＡ（ＡＤＥ１遺伝
子）断片を用いた染色体ＤＮＡとの相同的組換えの原理
による、ＡＤＥ１遺伝子破壊株の作製を行い、アデニン
要求性酵母の取得に成功した。そして、当該遺伝子破壊
酵母の増殖能と遺伝子発現能力をキャンディダ・マルト
ーサの突然変異処理によるＡＤＥ１遺伝子変異株のＣＨ
Ａ１と比較し、ＣＨＡ１株より両能力が優れていること
を示すことにより、本発明を完成するに至った。
【００１１】すなわち、本発明はＡＤＥ１ＤＮＡ断片と
の相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＡＤＥ１遺伝子
が破壊された酵母に関する。また、同種又は異種の遺伝
子を含むＤＮＡ配列で形質転換されたＡＤＥ１遺伝子破
壊酵母の形質転換体に関する。
【００１２】さらにより詳しくいえば、キャンディダ・
マルトーサのＡＤＥ１遺伝子破壊株に異種遺伝子発現系
を導入した形質転換体を取得することにより、産業上有
用な物質の生産に利用する方法を提供する。具体的に
は、生分解性ポリエステルとして有用性のある３−ヒド
ロキシブチレート（以下、３ＨＢと略記する）と３−ヒ
ドロキシヘキサノエート（以下、３ＨＨと略記する）と
の２成分共重合ポリエステル（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ
−３ＨＨ）と略記する）を合成する酵素である、ポリエ
ステル重合酵素遺伝子とエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ
遺伝子発現系を本発明のキャンディダ・マルトーサのＡ
ＤＥ１遺伝子破壊株に導入し、これにより、Ｐ（３ＨＢ
−ｃｏ−３ＨＨ）を生産することに成功し、当該ＡＤＥ
１遺伝子破壊キャンディダ・マルトーサの有用性を示す
ことができた。すなわち、本発明はまた、ＡＤＥ１遺伝
子破壊株の形質転換体を用いるポリエステルの製造方法
であって、上記形質転換体を培養して得られる培養物か
ら、ポリエステルを採取するポリエステルの製造方法で
ある。以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】相同的組換えによるＡＤＥ１遺伝
子破壊を行う酵母には特に制限はなく、菌株の寄託機関
（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されているアシク
ロコニディウム属（ Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ
属）、アンブロシオザイマ属（ Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙ
ｍａ属），アルスロアスカス属（ Ａｒｔｈｒｏａｓｃ
ｕｓ属），アルキシオザイマ属（ Ａｒｘｉｏｚｙｍａ
属），アシュビア属（ Ａｓｈｂｙａ属），バブジェビ
ア属（ Ｂａｂｊｅｖｉａ属），ベンシングトニア属
（Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ属），ボトリオアスカス属
（ Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ属），ボトリオザイマ属
（ Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ属），ブレッタノマイセス属
（ Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ属），ビュレラ属（
Ｂｕｌｌｅｒａ属），ビュレロマイセス属（ Ｂｕｌｌ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ属），キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄ
ａ属）、シテロマイセス属（ Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ
属）， クラビスポラ属（ Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ
属），クリプトコッカス属（ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ属），シストフィロバシディウム属（ Ｃｙｓｔｏｆ
ｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属）， デバリオマイセス属
（ Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属），デッカラ属（ Ｄ
ｅｋｋａｒａ属），ディポダスコプシス属（ Ｄｉｐｏ
ｄａｓｃｏｐｓｉｓ属），ディポダスカス属（ Ｄｉｐ
ｏｄａｓｃｕｓ属），エニエラ属（ Ｅｅｎｉｅｌｌａ
属），エンドマイコプセラ属（ Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓ
ｅｌｌａ属），エレマスカス属（ Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ
属），エレモセシウム属（ Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ
属），エリスロバシディウム属（ Ｅｒｙｔｈｒｏｂａ
ｓｉｄｉｕｍ属），フェロマイセス属（ Ｆｅｌｌｏｍ
ｙｃｅｓ属），フィロバシディウム属（ Ｆｉｌｏｂａ
ｓｉｄｉｕｍ属），ガラクトマイセス属（ Ｇａｌａｃ
ｔｏｍｙｃｅｓ属），ゲオトリクム属（ Ｇｅｏｔｒｉ
ｃｈｕｍ属），ガイラーモンデラ属（ Ｇｕｉｌｌｉｅ
ｒｍｏｎｄｅｌｌａ属），ハンセニアスポラ属（ Ｈａ
ｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属），ハンセヌラ属（ Ｈａｎ
ｓｅｎｕｌａ属），ハセガワエア属（ Ｈａｓｅｇａｗ
ａｅａ属），ホルターマンニア属（ Ｈｏｌｔｅｒｍａ
ｎｎｉａ属）， ホルモアスカス属（ Ｈｏｒｍｏａｓ
ｃｕｓ属），ハイフォピキア属（ Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈ
ｉａ属），イサットヘンキア属（ Ｉｓｓａｔｃｈｅｎ
ｋｉａ属），クロエケラ属（ Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ
属），クロエケラスポラ属（ Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐ
ｏｒａ属），クルイベロマイセス属（ Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ属），コンドア属（ Ｋｏｎｄｏａ属），
クライシア属（ Ｋｕｒａｉｓｈｉａ属），クルツマノ
マイセス属（ Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ属），ロ
イコスポリディウム属（ Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕ
ｍ属），リポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ属），ロ
デロマイセス属（ Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ属），マ
ラセジア属（ Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ属），メトシュニ
コウィア属（ Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属），ムラ
キア属（ Ｍｒａｋｉａ属），マイクソザイマ属（ Ｍ
ｙｘｏｚｙｍａ属），ナドソニア属（ Ｎａｄｓｏｎｉ
ａ属），ナカザワエア属（ Ｎａｋａｚａｗａｅａ
属），ネマトスポラ属（ Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ
属），オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ属），オースポリ
ディウム属（ Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），パチソレ
ン属（ Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ属），ファチコスポラ属
（ Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ属），ファフィ
ア属（ Ｐｈａｆｆｉａ属），ピキア属（ Ｐｉｃｈｉ
ａ属），ロドスポリディウム属（ Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒ
ｉｄｉｕｍ属），ロドトルラ属（ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕ
ｌａ属），サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ属），サッカロマイコーデス属（ Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属）， サッカロマイコプシス属
（ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属），サイトエ
ラ属（ Ｓａｉｔｏｅｌｌａ属），サカグチア属（Ｓａ
ｋａｇｕｃｈｉａ属），サターノスポラ属（ Ｓａｔｕ
ｒｎｏｓｐｏｒａ属），シゾブラストスポリオン属（
Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ属），シゾサ
ッカロマイセス属（ Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ属），シュワニオマイセス属（ Ｓｃｈｗａｎ
ｎｉｏｍｙｃｅｓ属）， スポリディオボラス属（ Ｓ
ｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属），スポロボロマイセス属
（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ属），スポロパキデミ
ア属（ Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ属）， ス
テファノアスカス属（ Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ
属），ステリグマトマイセス属（ Ｓｔｅｒｉｇｍａｔ
ｏｍｙｃｅｓ属），ステリグマトスポリディウム属（
Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属），シンビ
オタフリナ属（ Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ属），
シンポディオマイセス属（ Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅ
ｓ属），シンポディオマイコプシス属（Ｓｙｍｐｏｄｉ
ｏｍｙｃｏｐｓｉｓ属），トルラスポラ属（ Ｔｏｒｕ
ｌａｓｐｏｒａ属），トリコスポリエラ属（ Ｔｒｉｃ
ｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ属），トリコスポロン属（ Ｔ
ｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属），トリゴノプシス属（ Ｔ
ｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ属），ツチヤエア属（ Ｔｓｕｃ
ｈｉｙａｅａ属），ウデニオマイセス属（ Ｕｄｅｎｉ
ｏｍｙｃｅｓ属），ワルトマイセス属（ Ｗａｌｔｏｍ
ｙｃｅｓ属），ウィカーハミア属（ Ｗｉｃｋｅｒｈａ
ｍｉａ属），ウィカーハミエラ属（ Ｗｉｃｋｅｒｈａ
ｍｉｅｌｌａ属），ウィリオプシス属（Ｗｉｌｌｉｏｐ
ｓｉｓ属），ヤマダザイマ属（ Ｙａｍａｄａｚｙｍａ
属），ヤロウィア属（ Ｙａｒｒｏｗｉａ属），ザイゴ
アスカス属（ Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ属），ザイゴサッカ
ロマイセス属（ Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
属），ザイゴウィリオプシス属（ Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉ
ｏｐｓｉｓ属）又はザイゴザイマ属（ Ｚｙｇｏｚｙｍ
ａ属）などの酵母を使用することができる。
【００１４】これら酵母の中でも、高密度での連続培養
による効率的な菌体製造及び物質生産が可能である点
で、キャンディダ属、ヤロウィア属、クルイベロマイセ
ス属、ハンセヌラ属などが好ましく、特に、宿主−ベク
ター系の研究が進んでおり、簡便に系が利用できるこ
と、また、直鎖炭化水素や油脂等の資化能力が高い点
で、キャンディダ属が好ましい。
【００１５】また、本発明のＡＤＥ１破壊株作製及びそ
の利用に関しては１例として、キャンディダ・マルトー
サを用いた。
【００１６】本発明に用いるキャンディダ・マルトーサ
の野生株ＩＡＭ１２２４７は、東京大学応用微生物学研
究所、あるいはＡＴＣＣ２８１４０としてＡｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手でき
る。また、キャンディダ・マルトーサのアデニン及びヒ
スチジン栄養要求マーカー変異株であるＣＨＡ１株はＡ
ＴＣＣ９０６２５として上記の機関から入手できる。
【００１７】本発明で得られたＡＤＥ１遺伝子破壊株キ
ャンディダ・マルトーサＡＣ１６株は、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所内特許微生物寄託センタ
ーにＦＥＲＭ ＢＰ−７３６６の受託番号で国際寄託さ
れている。
【００１８】相同的組換えとは、ＤＮＡの塩基配列が類
似の配列又は同じ配列（相同配列）を持つ部分で起こる
組換えを示す。
【００１９】遺伝子破壊とは、ある遺伝子の機能が発揮
できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変
異を入れる、別のＤＮＡを挿入する、あるいは、遺伝子
のある部分を欠失させることを示している。遺伝子破壊
の結果、その遺伝子がｍＲＮＡへ転写できなくなり、構
造遺伝子が翻訳されない、あるいは、転写されたｍＲＮ
Ａが不完全なため、翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配
列に変異又は欠失が生じ、本来の機能の発揮が不可能に
なる。
【００２０】ＡＤＥ１遺伝子とは、プロモーター領域を
含む５’非翻訳領域とホスホリボシルアミノイミダゾー
ル−サクシノカルボキサミド合成酵素（ＥＣ６．３．
２．６）をコードする領域並びにターミネーター領域を
含む３’非翻訳領域からなる遺伝子断片を示す。キャン
ディダ・マルトーサのＡＤＥ１遺伝子の塩基配列はＧｅ
ｎＢａｎｋ：Ｄ００８５５に公開されており、配列番号
１にＤＮＡ配列を示した。
【００２１】ＡＤＥ１ＤＮＡ断片とは、微生物細胞内で
染色体上のＡＤＥ１遺伝子と相同的組換えを起こすこと
ができ、それによってＡＤＥ１遺伝子を破壊できるＤＮ
Ａを示している。
【００２２】ＡＤＥ１酵素とは、ホスホリボシルアミノ
イミダゾール−サクシノカルボキサミド合成酵素（ＥＣ
６．３．２．６）を示す。
【００２３】同種遺伝子とは、宿主酵母の染色体上に存
在している遺伝子またはその一部のＤＮＡを意味する。
異種遺伝子とは、宿主酵母の染色体上に本来存在しない
遺伝子またはその一部のＤＮＡを意味する。
【００２４】遺伝子発現カセットとは、転写プロモータ
ーＤＮＡ配列、発現を目的とする遺伝子をコードするＤ
ＮＡ、及び転写を終結するターミネーターを含むＤＮＡ
から構成される環状プラスミド状のもので染色体外で機
能するものと、染色体ＤＮＡに組み込むタイプがある。
【００２５】遺伝子発現産物とは、遺伝子によって発現
される物質（遺伝子発現物）が所望の蛋白質や酵素の場
合、それ自体が遺伝子発現産物である。また、遺伝子発
現物が各種酵素類や補酵素類であり、該酵素類が宿主酵
母内で触媒活性を発現することにより生産される、遺伝
子発現物とは直接異なる物質も遺伝子発現産物である。
【００２６】ＰＨＡとは、ポリヒドロキシアルカノエー
トの略であり、３−ヒドロキシアルカン酸の共重合し
た、生分解性ポリエステルを示している。
【００２７】ＯＲＦ２とは、アエロモナス・キャビエ由
来のポリエステル重合酵素をコードする遺伝子（特開平
１０−１０８６８２）を、キャンディダ・マルトーサで
発現するように設計したＤＮＡを示している。配列番号
６にその塩基配列を示した。
【００２８】ＯＲＦ３とは、アエロモナス・キャビエ由
来のエノイルＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子
（特開平１０−１０８６８２）を、キャンディダ・マル
トーサで発現するように設計したＤＮＡを示している。
配列番号７にその塩基配列を示した。
【００２９】以下に、ＡＤＥ１遺伝子破壊株の作製方
法、該破壊株によるポリエステルの製造方法の一例を説
明する。
【００３０】（１）ＡＤＥ１遺伝子破壊株の作製方法 遺伝子破壊株作製に関しては、ＡＤＥ１酵素が発現しな
い破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能
である。遺伝子破壊の方法は種々の方法が報告されてい
るが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相
同的組換えによる遺伝子破壊が好ましい（Ｎｉｃｋｏｌ
ｏｆｆ Ｊ．Ａ．編 Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４７：２９１−３０２（１
９９５） 、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｔ
ｏｔｏｗａ、ＮＪ））。相同的組換えの中でも、自然復
帰しない破壊株が取得でき、その結果、組換え体を取り
扱う上で安全性が高い菌株が得られる、という点で、１
段階破壊法（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕ
ｐｔｉｏｎ）が好ましい。
【００３１】１段階破壊法に使用するＡＤＥ１ＤＮＡ断
片は、通常、遺伝子内部の部分ＤＮＡを除去し、残った
両端部分を再度連結した形のＤＮＡ断片が用いられる。
このＤＮＡ断片を作製するためには、例えば、ＰＣＲ法
（ポリメラーゼ連鎖反応法）や、ベクターからの制限酵
素による切り出しと再連結によって調製できる。ＡＤＥ
１ＤＮＡ断片の両端の相同性領域長は、１０塩基以上あ
ればよく、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは
３００塩基以上である。また、両端それぞれの相同性
は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上
である。
【００３２】除去する部分ＤＮＡは、除去によりＡＤＥ
１遺伝子が酵素活性を発揮できなくなる部分であり、且
つ自然復帰によりＡＤＥ１酵素活性が回復しない長さの
ＤＮＡである。このような部分ＤＮＡの鎖長は特に限定
しないが、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１
００塩基以上である。
【００３３】本発明では、約５５３ｂｐのＡＤＥ１酵素
をコードするＤＮＡ断片を除去し、５’側６３０ｂｐＤ
ＮＡ断片と３’側４００ｂｐのＤＮＡ断片を連結した破
壊用ＤＮＡを用いた（図１）。除去した部分はＡＤＥ１
酵素蛋白質の約８０％にあたる。また、５’側及び３’
側のＤＮＡ断片と元のＡＤＥ１遺伝子との相同性は両Ｄ
ＮＡとも１００％である。本発明で用いた破壊用ＤＮＡ
断片の塩基配列を配列番号２に示した。
【００３４】本発明の用いたＤＮＡ断片の調製は、ｐＵ
Ｃ１１９−ＡＤＥ１（ＫａｗａｉＳ．等、Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５５：５９−６５（１９９
１））を用いて行った。すなわち、プラスミドｐＵＣ１
１９−ＡＤＥ１ で形質転換された大腸菌を培養し、そ
れよりプラスミドを調製する。このプラスミドから適当
な制限酵素でＡＤＥ１遺伝子の構造遺伝子（ＡＤＥ１酵
素蛋白質をコードする遺伝子）の１部分を除去するよう
に切断し、ベクター側を回収し再度リガーゼを用いて連
結する。このようにして破壊用ＤＮＡを含むベクターが
できる。
【００３５】破壊用ＤＮＡを含むベクターは適当な大腸
菌、例えばＪＭ１０９やＤＨ５αに導入し、該大腸菌を
大量培養し、それより塩化セシウム超遠心法により高純
度のプラスミドを大量調製する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等
編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ １．４２−１．４７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９））。このベクターを直接遺伝子破壊に用い
ることができるが、１段階破壊法を行うため、精製した
ベクターよりＡＤＥ１領域を含む相同性のある部分を適
当な制限酵素で切り出し、それを破壊用ＤＮＡとして利
用するのが望ましい。本発明では、制限酵素ＳａｌＩで
切断し、ＤＮＡ断片を精製することなく菌体内に導入す
ることにより相同的組換えによってＡＤＥ１遺伝子を破
壊することができた。
【００３６】キャンディダ・マルトーサの形質転換法に
は、プロトプラスト法、酢酸リチウム法（Ｔａｋａｇｉ
Ｍ．等、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６７：５５１−
５（１９８６））、電気パルス法（Ｋａｓｕｓｋｅ
Ａ．等 Ｙｅａｓｔ ８：６９１−６９７（１９９
２））が知られているが、本発明では電気パルス法を用
いて行った。電気パルス発生には市販の機器が利用でき
る。本発明では、ＢＴＸ社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ
ＵＳＡ）製のＥＬＥＣＴＲＯ ＣＥＬＬ ＭＡＮＩＰ
ＵＬＡＴＯＲ ６００を用いた。キュベットはＢＩＯ
ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ ＣＯ．ＬＴ
Ｄ（Ｔｏｋｙｏ Ｊａｐａｎ）製のＢＭ６２００（２ｍ
ｍ ｇａｐ ｂｌｕｅ ｃａｐ）を用いた。電気パルス
後、適当な培地で培養し、得られた培養菌体より目的の
ＡＤＥ１破壊株をスクリーニングする。
【００３７】形質転換体を取得する種々の方法が開発さ
れているが、そのうちナイスタチン濃縮（Ｓｎｏｗ
Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ ２１１：２０６−２０７（１９６
６））と呼ばれる方法を利用することができる。本法
は、酵母からランダム変異により得られる変異株を効率
的に選択するために開発された方法であるが、遺伝子破
壊株にも応用できると考えられる。例えば、本発明の好
ましい態様によれば、電気パルス後、培養した菌体を最
少培地等に植菌し培養する。菌を洗浄し、窒素源不含最
少培地で培養後、窒素源含有最少培地で短時間培養す
る。この培養液に直接ナイスタチンを添加し、１時間３
０℃で好気的に培養することにより、野生株を優先的に
殺傷できる。この菌液を適当な寒天培地プレートに塗抹
し、３０℃で２日間程度培養すると、赤色コロニーが得
られる。
【００３８】得られた赤色コロニーから、ＰＣＲ法やゲ
ノミックサザンハイブリダイゼーション法（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ等編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ
Ｅｄｉｔｉｏｎ ９．３１−９．５７、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ（１９８９））により容易に遺伝子破壊を確認す
ることができる。ＰＣＲ法では、ＡＤＥ１遺伝子の両端
をプライマーに用いると、アガロースゲル電気泳動にお
いて、野生株では正常な大きさのＤＮＡバンドが検出さ
れるが、破壊株では欠失させた配列分だけ短いバンドが
検出される。本発明では、約１ｋｂｐのＤＮＡバンドが
検出された。しかし、遺伝子破壊などの染色体ＤＮＡと
の置換や組み込みの場合、遺伝子が目的以外の箇所、例
えば相同性の高い未知の部分に挿入される可能性を想定
すべきであり、その場合、ＰＣＲ法では確認できない場
合がある。ＰＣＲ法は得られた破壊株が多い場合に、候
補株を選択する手段として用いるのが望ましい。
【００３９】破壊株等を確認するためには、ゲノミック
サザン解析が必須である。本法を行うことにより、容易
にかつ確かに目的の箇所だけに遺伝子の組換えが生じた
ことを証明することができる。破壊株とコントロールと
しての野生株の染色体ＤＮＡを調製し、適当な制限酵素
で切断後アガロースゲル電気泳動を行う。本発明では、
２種類の制限酵素を用い３種類の切断方法で確認を試み
た。アガロースゲルからＤＮＡをナイロン膜上に移しと
り、破壊株のゲノム上に残っていると考えられるＡＤＥ
１遺伝子の制限酵素ＨｐａＩＮｄｅＩ切断ＤＮＡ断片２
７０ｂｐをＧｅｎｅＩｍａｇｅラベリング・検出キット
（アマシャム社製）を用いて、添付の説明書にしたがっ
て酵素標識し、サザンハイブリダイゼーション検出用プ
ローブとした。ハイブリダイズ後、洗浄し、添付の説明
書に従って蛍光発色試薬でＤＮＡバンドを検出した。検
出バンドを野生株（ＩＡＭ１２２４７）のものと比較し
た。その結果、２株が３種類の切断方法で、ＡＤＥ１遺
伝子内部の５５０ｂｐ分が短くなっていることが確認で
きた。
【００４０】得られたＡＤＥ１遺伝子破壊株は、ＡＤＥ
１酵素を合成できないため、ＡＴＰの前駆体であるアデ
ニンを合成できない。従って、アデニンを含まない培地
や、アデニンの無い環境下では生存はできない。
【００４１】得られたＡＤＥ１遺伝子破壊株の１株をキ
ャンディダ・マルトーサＡＣ１６と命名した。 （２）ＡＤＥ１遺伝子破壊株による異種遺伝子発現：ポ
リエステルの生産方法 本発明で得たＡＤＥ１破壊株を用いて同種遺伝子あるい
は異種遺伝子を発現させることができる。酵母は、大腸
菌ではできない糖鎖付加蛋白質を培地中に分泌すること
ができるため、ＡＤＥ１破壊株を用いてこのような蛋白
質の生産が可能である。
【００４２】導入できる同種遺伝子は特に限定しない
が、例えば、産業上有用な生産物の製造例として、ＷＯ
９９／０４０１４に公開されているような、キャンディ
ダ・マルトーサに同株由来のＰ４５０酵素遺伝子を導入
することによる、ジカルボン酸の製造が挙げられる。ま
た、異種遺伝子も特に限定はしないが、例えば、リパー
ゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子等の導入による、当該蛋白
質の製造が挙げられる。
【００４３】本発明に用いたキャンディダ・マルトーサ
等の一部のキャンディダ属酵母においては、ｍＲＮＡか
ら蛋白質が翻訳される段階で、一部コドンの翻訳のされ
方が他の生物と異なっていることが知られている。キャ
ンディダ・マルトーサではロイシンコドンのＣＵＧがセ
リンに翻訳されるため（Ｏｈａｍａ Ｔ．等、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２１：４０３９４０４５
（１９９３））、大腸菌由来ｌａｃＺ遺伝子が、活性
を持つβガラクトシダーゼに翻訳されない（Ｓｕｇｉｙ
ａｍａ Ｈ．等、Ｙｅａｓｔ １１：４３−５２（１９
９５））。このように異種遺伝子を発現させる場合に
は、それがキャンディダ・マルトーサ内で機能を持つ蛋
白質に翻訳されるという保証はない。従って、キャンデ
ィダ・マルトーサを宿主として異種遺伝子を発現させる
場合、原則としてロイシンコドンのみ変換すれば良い
が、さらに効率よく発現させるため他のアミノ酸コドン
をキャンディダ・マルトーサのものに合わせても良い。
コドンの変換は、例えばＷｏｌｆ Ｋ．編 Ｎｏｎｃｏ
ｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅａｓｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．の中のＭａｕｅｒｓｂｅｒｇｅｒ
Ｓ．等著、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ ｐ５２
４−５２７ を参考にして行えば良い。
【００４４】ポリエステル合成に関与する遺伝子として
は、下記一般式のポリエステルの合成に関与する遺伝子
であればどのような遺伝子でも良い。下記一般式はポリ
エステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の構造式を示して
いて、Ｘ及びＹは整数であり、それぞれ３ＨＢと３ＨＨ
の重合個数を示す。
【００４５】
【化１】 例えば、特開平１０−１０８６８２号公報に記載されて
いるポリエステル重合酵素遺伝子断片を用いることがで
きる。また、本ポリエステル重合酵素遺伝子と共にポリ
エステル合成に関与する遺伝子を導入しても良い。これ
らの遺伝子としては、たとえば、β酸化経路の中間体の
エノイル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−Ｃ
ｏＡに変換する（Ｒ）体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラ
ターゼ（Ｆｕｋｕｉ Ｔ．等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１７０：６９−７５
（１９９９）、特開平１０−１０８６８２号公報）や、
アセチル−ＣｏＡを二量化して３−ヒドロキシブチリル
−ＣｏＡを合成するβケトチオラーゼ・ＮＡＤＨ依存性
ヒドラターゼ遺伝子（Ｐｅｏｐｌｅｓ ＯＰ等、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５３０３
（１９８９））などが挙げられる。これらの遺伝子は実
質的な酵素活性を有する限り、当該遺伝子の塩基配列に
欠失、置換、挿入等の変異が生じていても良いものとす
る。但し、異種遺伝子の場合、上記したようにキャンデ
ィダ・マルトーサ内で機能を持つ蛋白質に翻訳されると
いう保証はないため、アミノ酸コドンを変更する必要が
ある。
【００４６】本研究ではアエロモナス・キャビエ由来の
ポリエステル重合酵素とエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ
（特開平１０−１０８６８２公報、Ｆｕｋｕｉ Ｔ．
等、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅ
ｒｓ、１７０：６９−７５（１９９９）を用いた。しか
し、本酵素遺伝子が正常に翻訳されず、酵素活性を示さ
ない可能性が高いため、両酵素のアミノ酸コドンをキャ
ンディダ・マルトーサの最適コドンに合わせＤＮＡを全
合成した。アエロモナス・キャビエ由来のポリエステル
重合酵素とエノイル−ＣｏＡヒドラターゼの全合成ＤＮ
Ａ配列を、それぞれ配列表の配列番号６と７に示した。
ただし、これらの配列番号に示した塩基配列は、これに
限定されるものではなく、当該酵素のアミノ酸配列がキ
ャンディダ・マルトーサ内で発現される塩基配列であれ
ば、いかなる塩基配列でも用いることができる。
【００４７】酵母における遺伝子発現カセットは、当該
遺伝子の５’側上流にプロモーター、５’上流域活性化
配列（ＵＡＳ）等のＤＮＡ配列の連結、当該遺伝子の
３’下流にポリＡ付加シグナル、ターミネーター等のＤ
ＮＡ配列の連結して作製する。これらのＤＮＡ配列は当
該酵母で機能する配列であればどのような配列でも利用
できる。
【００４８】プロモーターには恒常的に発現を行うもの
や誘導的に発現を行うものがある。いずれのプロモータ
ーを用いても良いが、宿主と同じキャンディダ・マルト
ーサ由来であることが望ましい。一例として、キャンデ
ィダ・マルトーサのＡＬＫ１プロモーター及びＡＬＫ１
ターミネーター（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ００４８１）（Ｔ
ａｋａｇｉ Ｍ．等、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、５：２２１７−２２２６（１９８９））を利用す
ることができる。
【００４９】本発明の形質転換に用いられる遺伝子発現
カセットは一例として、次のように構築することができ
る。構築に用いるベクターは、大腸菌において自律増殖
するプラスミドであればどのようなベクターでもよく、
更に酵母において自律増殖可能な領域を合わせ持ってい
ても良い。酵母において自律増殖できるベクターは、菌
体内に保持されることが知られている。また、遺伝子発
現カセットを染色体に組み込むこともできる。一例とし
てキャンディダ・マルトーサにおいて自律増殖可能なｐ
ＵＴＵ１を用いることができる（Ｍ．Ｏｈｋｕｍａ，ｅ
ｔ ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７
３，３９４８−３９５３（１９９８））。
【００５０】本発明では、ＯＲＦ２及びＯＲＦ３のそれ
ぞれ５’上流にキャンディダ・マルトーサのＡｌｋ１遺
伝子のプロモーターＡＬＫ１ｐ（配列番号８）、ターミ
ネーターＡＬＫ１ｔ（配列番号９）を連結した。
【００５１】プロモーターおよびターミネーターと構造
遺伝子を連結するための制限酵素部位を調製するために
は、ＰＣＲ法が利用できる。ＰＣＲに用いるプライマー
配列は配列番号１０から配列番号１３に示す。ＰＣＲの
条件は目的遺伝子断片が増幅できればどのような条件を
用いても良い。
【００５２】プロモーター部分は配列番号８を鋳型にし
て配列番号１０と配列番号１１を用いて、５’末端がＳ
ａｌＩ、３’末端がＮｄｅＩのＡＬＫ１ｐを作製するこ
とができる。ターミネーター部分は配列番号９を鋳型に
して配列番号１２と配列番号１３を用いて、５’末端が
ＨｉｎｄＩＩＩ、３’末端がＥｃｏＲＶのＡＬＫ１ｔを
作製することができる。ベクターにはｐＵＴＵ１とキャ
ンディダ・マルトーサのＡｄｅ１遺伝子を用いて、マー
カー遺伝子をウラシルからアデニンに変更したベクター
ｐＵＴＡ１を使用することができる。ｐＵＣＮＴ（ＷＯ
９４／０３６１３に記載）のＰｖｕＩＩ、ＮｄｅＩサイ
トにＡＬＫ１ｔを結合し、またｐＵＣＮＴのＨｉｎｄＩ
ＩＩ、ＳｓｐＩサイトにＡＬＫ１ｔを結合してｐＵＡＬ
１を構築することができる。次にｐＵＡＬ１のＮｄｅ
Ｉ、ＰｓｔＩサイトにＯＲＦ２を結合し、プラスミドｐ
ＵＡＬ−ＯＲＦ２を構築することができる。また、ｐＵ
ＡＬ１を構築する途中に構築するｐＵＣＮＴ−ＡＬＫ１
ｔのＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトにＯＲＦ３を結合
し、さらにＡＬＫ１ｐを結合することで、ｐＵＡＬ−Ｏ
ＲＦ３を構築することができる。
【００５３】つぎに、プラスミドｐＵＡＬ−ＯＲＦ２か
らＥｃｏＴ２２Ｉを用いて、ＯＲＦ２とともに上流にあ
るプロモーター、下流にあるターミネーターを一緒に切
り出し、ｐＵＴＡ１のＰｓｔＩサイトに結合し、ｐＵＴ
Ａ−ＯＲＦ２を構築することができる。さらに、ｐＵＡ
Ｌ−ＯＲＦ３からＳａｌＩを用いてＯＲＦ３とともに上
流にあるプロモーター、下流にあるターミネーターを一
緒に切り出し、ｐＵＴＡ−ＯＲＦ２のＳａｌＩサイトに
結合したプラスミドｐＵＴＡ−ＯＲＦ２３（図２上）を
構築することができる。以上の方法により、キャンディ
ダ・マルトーサにおいてポリエステルを製造するための
遺伝子発現カセットを構築することができる。
【００５４】本発明の菌株に、前述の形質転換法を用い
て遺伝子発現カセットを形質転換し、ｐＵＴＡ−ＯＲＦ
２３を有するキャンディダ・マルトーサＡＣ１６（ＯＲ
Ｆ２３）株を作製することができる。
【００５５】ポリエステル合成に関与する遺伝子発現カ
セットで形質転換された酵母を培養することによるポリ
エステルの製造は、次のようにして行うことができる。
培養に用いる炭素源としては、酵母が資化できるもので
あればどのようなものでも良い。また、プロモーターの
発現が誘導型である場合には、適時誘導物質を添加すれ
ば良い。誘導物質が主要炭素源である場合もある。炭素
源以外の栄養源としては窒素源、無機塩類、その他の有
機栄養源を含む培地が使用できる。培養温度はその菌の
生育可能な温度であれば良いが、２０℃から４０℃が好
ましい。培養時間には特に制限はないが、１〜７日程度
で良い。その後、得られた培養菌体又は培養物からポリ
エステルを回収すれば良い。
【００５６】炭素源としてはグルコース、グリセリン、
シュークロース等の炭水化物や油脂類や脂肪酸類、さら
にはｎ−アルカン等を用いることができる。油脂として
は、例えばナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油な
どが挙げられる。脂肪酸としてはヘキサン酸、オクタン
酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン
酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸などの飽和
・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩
など脂肪酸誘導体が挙げられる。一例としてキャンディ
ダ・マルトーサの培養において、炭素源として油脂を用
いて培養することもできる。また、資化ができないかま
たは効率よく資化できない油脂の場合、培地中にリパー
ゼを添加することによって改善することもできる。さら
に、リパーゼ遺伝子を形質転換することにより、油脂資
化能を付与することもできる。
【００５７】窒素源としては、例えばアンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えばリン
酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げら
れる。
【００５８】その他の有機栄養源としてはアミノ酸類、
例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロ
リンなどや、ビタミン類、例えばビタミンＢ１、ビタミ
ンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン
酸、ビタミンＣ等が挙げられる。
【００５９】ポリエステルの菌体からの回収は多くの方
法が報告されている。本発明においては、例えば、次の
ような方法が使用できる。培養終了後、培養液を遠心分
離器などで菌体を分離・回収し、その菌体を蒸留水およ
びメタノール等により洗浄した後、乾燥させる。この乾
燥菌体をクロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステ
ルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液
を濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノ
ールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿
させる。沈殿したポリエステルを濾過や遠心分離によっ
て上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収す
ることができる。
【００６０】得られたポリエステルの分析は、例えば、
ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法などにより行うこ
とができる。
【００６１】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技
術範囲を限定するものではない。
【００６２】
【実施例】酵母菌の培養用に使用した試薬は、特に断ら
ない限り和光純薬から販売されているものを用いた。
【００６３】（培地組成） ＬＢ培地：１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキ
ス、５ｇ／Ｌ食塩。ＬＢプレートの場合は、寒天を１６
ｇ／Ｌになるように加える。 ＹＰＤ培地：１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌポリペ
プトン、２０ｇ／Ｌグルコース。ＹＰＤプレートの場合
は、寒天を２０ｇ／Ｌになるように加える。アデニン含
有ＹＰＤ培地の場合は、アデニンを０．１ｇ／Ｌ加え
る。 ＹＭ培地：３ｇ／Ｌ酵母エキス、３ｇ／Ｌマルトエキ
ス、５ｇ／Ｌバクトペプトン、１０ｇ／Ｌグルコース。 ＳＤ培地：６．７ｇ／Ｌアミノ酸不含イーストニトロジ
ェンベース（ＹＮＢ）、２０ｇ／Ｌグルコース。アデニ
ン含有培地の場合はアデニンを２４ｍｇ／Ｌ添加する。
ＳＤプレートの場合は寒天を２０ｇ／Ｌになるように加
える。 Ｍ培地：０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム０．１ｇ／Ｌ食
塩、０．４ｍｇ／Ｌチアミン、０．４ｍｇ／Ｌピリドキ
シン、０．４ｍｇ／Ｌパントテン酸カルシウム、２ｍｇ
／Ｌイノシトール、０．００２ｍｇ／Ｌビオチン、０．
０５ｍｇ／Ｌ塩化鉄、０．０７ｍｇ／Ｌ硫酸亜鉛、０．
０１ｍｇ／Ｌホウ酸、０．０１ｍｇ硫酸銅、０．０１ｍ
ｇヨウ化カリウム、８７．５ｍｇ／Ｌリン酸２水素カリ
ウム、１２．５ｍｇ／Ｌリン酸１水素２カリウム、０．
１ｇ／Ｌ塩化カルシウム、２０ｇ／Ｌグルコース。硫酸
アンモニウム含有Ｍ培地の場合は、１ｇ／Ｌ硫酸アンモ
ニウムを加える。硫酸アンモニウム及びアデニン含有Ｍ
培地の場合は、Ｍ培地に１ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムと
２４ｍｇ／Ｌのアデニンを加える。 ポリエステル産生用培地：６．７ｇ／ＬＹＮＢ、１０ｇ
／Ｌカサミノ酸に炭素源として、ｎ−アルカンあるいは
油脂を２０ｇ／Ｌ添加する。
【００６４】酵母の液体培養は、５０ｍｌ試験管、５０
０ｍｌ坂口フラスコあるいは２Ｌ坂口フラスコを用いて
行った。５０ｍｌ試験管の場合３００ｒｐｍ、５００ｍ
ｌ坂口フラスコの場合１００〜１１０ｒｐｍ、２Ｌ坂口
フラスコの場合９０〜１００ｒｐｍで振とう培養した。
培養温度は、液体培養とプレート培養ともに３０℃であ
る。
【００６５】（制限酵素処理）制限酵素処理は、メーカ
ーの推奨する反応条件、あるいはＳａｍｂｒｏｏｋ等
編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の
方法に従って行った。
【００６６】本発明の実施において、多くの市販のキッ
トを用いたが、特に断らない限り添付の使用説明書に従
って行った。
【００６７】（実施例１）破壊用ＤＮＡの作製 ＡＤＥ１遺伝子を含む大腸菌用ベクターｐＵＣ１１９−
ＡＤＥ１（ＫａｗａｉＳ．等、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．、５５：５９−６５（１９９１））（４．６
４ｋｂｐ）をＭｕｎＩ、ＨｐａＩで切断後、ＴＡＫＡＲ
Ａ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて
平滑化処理を行う。平滑化処理を行った分割ＤＮＡを１
％アガロースで電気泳動し、ベクター及びＡＤＥ１両サ
イド側（４．１９ｋｂｐ）とＭｕｎＩ／ＨｐａＩ切断断
片（５５０ｂｐ）を分離する。ベクター及びＡＤＥ１両
サイド側をアガロースゲルよりＥＡＳＹＴＲＡＰ（宝酒
造社製）を用いて回収し、ＴＡＫＡＲＡ Ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２（宝酒造社製）を用いてＡＤＥ
１両サイドを連結した。反応液を大腸菌コンピテントセ
ルＤＨ５α（宝酒造社製）１００μｌに５％以下の溶液
比になるように添加し、該大腸菌を形質転換した。ＬＢ
培地を適当量加え１時間振盪培養後、ＬＢプレートに塗
抹し３７℃で１晩培養する。出現したコロニーを数個取
得し、常法によりＬＢ培地で培養し、培養菌体よりプラ
スミドＤＮＡを抽出した。該プラスミドを制限酵素Ｓａ
ｌＩで切断し、アガロースゲル電気泳動で１．０３ｋｂ
ｐのバンドの出現を確認し、目的とする破壊用ベクター
を得た。この形質転換した大腸菌をＬＢ培地で大量培養
し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ １．４２−１．４７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
（１９８９）に従って塩化セシウムによる超遠心法で該
ベクターを大量に調製した。そして、直接破壊法を行う
ため、破壊用ＡＤＥ１ＤＮＡをＳａｌＩで切り出した。
全ＤＮＡ量で５ｍｇ／ｍｌの水溶液に調製し、切り出し
たＤＮＡは未精製のまま遺伝子破壊に用いた。
【００６８】（実施例２）遺伝子破壊実験 キャンディダ・マルトーサＩＡＭ１２２４７株をＹＭ培
地１０ｍｌに植菌し１晩前培養した。次に、前培養液１
ｍｌを１００ｍｌのＹＭ培地（５００ｍｌ坂口フラス
コ）に植菌し、６時間培養後、遠心により集菌した。菌
を１Ｍソルビトール５００μｌに懸濁し、破壊用ＤＮＡ
１００μｇを加え静かに撹拌した。
【００６９】遺伝子導入は電気パルス法により行った。
遺伝子導入装置はＢＴＸ社製のＥＬＥＣＴＲＯ ＣＥＬ
Ｌ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＯＲ ６００を用いた。キュベ
ットはＢＩＯ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯ
Ｎ ＣＯ．ＬＴＤ製のＢＭ６２００を用いた。調製した
コンピテント細胞／ＤＮＡ溶液を１００μｌ取りキュベ
ットに注入し、パルス装置にセットした。続いて、静電
容量４０μＦ、抵抗値２４６ｏｈｍ、電圧１．９ＫＶの
条件で電気パルスをかけた。パルス後、それぞれのキュ
ベットに１Ｍソルビトールを１ｍｌ加え、穏やかに混合
し、室温で１時間放置した。その後、ＹＭ培地１００ｍ
ｌに移し１晩培養した。
【００７０】（実施例３）破壊株のスクリーニング 次にＹＭ培地で培養した菌を硫酸アンモニウム不含Ｍ培
地５０ｍｌ（５００ｍｌ坂口フラスコ）に植菌し、１晩
培養した。続いて硫酸アンモニウム含有Ｍ培地１００ｍ
ｌに懸濁し、６時間３０℃で培養した。この培養液にナ
イスタチン（シグマ社製）の３ｍｇ／ｍｌエタノール溶
液を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、１時間
培養した。ナイスタチン処理菌を滅菌水で２回洗浄し、
５０ｍｌの滅菌水に再度懸濁した。この菌液をＹＰＤプ
レートに塗抹した。３０℃で２日間プレートを培養した
ところ、赤色コロニーが２４個得られた。これらの株は
いずれもＳＤ培地で生育できないことを確認した。
【００７１】（実施例４）ＰＣＲ法による解析 多数の赤色コロニーからの破壊株の１次スクリーニング
をＰＣＲ法用いて行った。得られた赤色コロニーをＹＰ
Ｄ培地で培養し、これより染色体ＤＮＡを染色体抽出キ
ットのジェントルくん（宝酒造社製）を用いて抽出し
た。この染色体ＤＮＡを用いて 、ＡＤＥ１遺伝子の両
端のプライマー（配列番号３及び配列番号４）を用いて
ＰＣＲを行った。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ａｍｐｌｉｔａｑ ｋｉｔを用いて行った。遺伝子増幅
はＢｉｏｍｅｔｒａ社製ＴＲＩＯ−Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏ
ｃｋTMを用いた。９４℃１分、５０℃１分、７０℃３分
を１サイクルとして３０サイクル行った。野生株では
１．５ｋｂのＤＮＡが増幅され、遺伝子破壊株では１．
０ｋｂと短くなったＤＮＡが増幅される。ＰＣＲ反応液
を１％アガロースゲルで電気泳動を行い、１．０ｋｂｐ
のＤＮＡ断片の検出を行った。その結果２４株中３株の
ＡＤＥ１遺伝子が短くなっており、破壊されていると考
えられた。図３に３株中２株のＰＣＲパターンを示し
た。
【００７２】（実施例５）ゲノミックサザンハイブリダ
イゼーション法による解析 これら３株の染色体ＤＮＡを染色体抽出キットのジェン
トルくん（宝酒造社製）を用いて抽出した。得られた染
色体ＤＮＡ５μｇずつを３種類の方法、ＤｒａＩ、Ｄｒ
ａ＋ＮｄｅＩ、ＮｄｅＩで切断し０．８％アガロースゲ
ルで電気泳動を行った。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓ
ｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ９．３１−９．５７、Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に従ってゲルからハイボ
ンドＮ＋フィルター（アマシャム社製）に１晩トランス
ファーした。サザンブロット検出用プローブは、ＡＤＥ
１遺伝子内の配列であるＨｐａＩＮｄｅＩ断片（２７０
ｂｐ）をＧｅｎｅＩｍａｇｅラベリング・検出キット
（アマシャム社製）で酵素標識したものを用いた。ハイ
ブリダイズ後、洗浄し、同キットの蛍光発色試薬でＤＮ
Ａバンドを検出した。検出バンドを野生株ＩＡＭ１２２
４７のものと比較したところ、２株がＡＤＥ１遺伝子内
部の５５０ｂｐ分が短くなっており（図４）、染色体上
のＡＤＥ１遺伝子の破壊を確認できた。図５にサザンハ
イブリダイゼーションにより明らかになった、ＡＤＥ１
遺伝子破壊キャンディダ・マルトーサ染色体の破壊され
たＡＤＥ１遺伝子付近の制限酵素地図を示した。５５３
ｂｐｓはＭｕｎＩ−ＨｐａＩ間の欠失した部分を示して
ある。ｐｒｏｂｅはサザンハイブリダイゼーションに用
いた部分ＤＮＡを示してある。図４に示したように、こ
のプローブを用いた場合、染色体ＤＮＡの下側に記した
塩基の長さが確認された。野生株ＩＡＭ１２２４７で
は、この値に５５３ｂｐｓ加えた値が確認された。
【００７３】このようにして得られたＡＤＥ１遺伝子破
壊株の１株をキャンディダ・マルトーサＡＣ１６と命名
した。
【００７４】（実施例６）ＡＤＥ１遺伝子破壊株の増殖
能の検討 遺伝子破壊ＡＣ１６株の完全培地（アデニン（１００ｍ
ｇ／Ｌ）及びヒスチジン（１００ｍｇ／Ｌ）含有ＹＰＤ
培地）での増殖能をＩＡＭ１２２４７株及びＣＨＡ１と
比較した。酵母をＹＰＤ培地１０ｍｌに植菌し、１晩培
養後１％で同培地１０ｍｌに植菌した。一定時間ごとに
ＯＤ６００ｎｍを測定した。その結果ＡＣ１６株及び野
生株は１５時間で培養終期に達したが、ＡＣ１６株は野
生株の８３％までしか増殖しなかった。一方、ＣＨＡ１
はＡＣ１６株と同等の濃度まで増殖したが、ＡＣ１６株
の方が６時間早かった（図６）。このように、ＡＣ１６
株の方がＣＨＡ１株より完全培地での増殖能が優れてい
ることが示された。
【００７５】（実施例７）ＡＤＥ１遺伝子破壊株の油脂
資化性の検討 遺伝子破壊株のなかでＡＣ１６株の油脂資化性能力を野
生株ＩＡＭ１２２４７及びＣＨＡ１株と比較した。油脂
は、パーム油、ヤシ油、及び炭素数１４のｎ−アルカン
であるテトラデカンを用いた。油２％を添加したＹＮＢ
培地５０ｍｌ（５００ｍｌ坂口フラスコ）に植菌し１晩
培養し、この菌液を同量の培地に１０％植菌し、一定時
間ごとにＯＤ６００ｎｍを測定した。その結果、ヤシ油
とパーム油では、今回取得したＡＣ１６株は野生株より
１５％程度増殖能が劣るが、ＣＨＡ１株より４倍程度高
い油脂資化能（３２時間では６倍）を持っていることが
わかった。テトラデカンの場合は、ＣＨＡ１は油脂より
高い増殖能を示したが、野生株の５５％、ＡＣ１６株の
８０％であった。このように、ＡＤＥ１破壊株はＣＨＡ
１株より油脂及びアルカン資化能力が優れていた。図７
に各炭素源での増殖曲線を示した。
【００７６】（実施例８）ポリエステル合成に関与する
遺伝子の合成 ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子として、アエロ
モナス・キャビエの由来のＰＨＡ重合酵素と、β酸化経
路の中間体のエノイルＣｏＡをモノマーである（Ｒ）−
３−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換する（Ｒ）体特異的
エノイルＣｏＡヒドラターゼ（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，ｅｔ
ａｌ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ，ｖｏｌ．１７０，６９−７５（１９９９））の
アミノ酸配列をもとに、当該酵素遺伝子を設計した。
【００７７】塩基配列の設計に当たって、キャンディダ
・マルトーサはＣＴＧコドンをロイシンではなくセリン
に翻訳する酵母であるため、ロイシンコドンにはＣＴＧ
を割り当てなかった。また、各アミノ酸に対応するコド
ンは キャンディダ・マルトーサにおいて使用頻度の高
いコドンを優先的に選択した。コドンの使用頻度はＷｏ
ｌｆ Ｋ．編 Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｙｅ
ａｓｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．の中の
Ｍａｕｅｒｓｂｅｒｇｅｒ Ｓ．等著、Ｃａｎｄｉｄａ
ｍａｌｔｏｓａ ｐ５２４−５２７を参考にした。配
列番号６及び７にそれぞれ設計したＯＲＦ２とＯＲＦ３
を示した。この塩基配列にしたがってＤＮＡを全合成し
た。
【００７８】（実施例９）ポリエステル合成用組換えプ
ラスミドの構築 前記ＯＲＦ２、ＯＲＦ３がキャンディダ・マルトーサで
発現するように、それぞれの５’上流にキャンディダ・
マルトーサのＡｌｋ１遺伝子のプロモーターＡＬＫ１ｐ
（配列番号８）を、３’下流にキャンディダ・マルトー
サのＡｌｋ１遺伝子のターミネーターＡＬＫ１ｔ（配列
番号９）を連結することにした。プロモーターおよびタ
ーミネーターと構造遺伝子を連結するための制限酵素部
位を調製するためには、ＰＣＲ法を利用した。ＰＣＲの
条件は９４℃１分、５５℃２分、７２℃３分を１サイク
ルとし、これを２５回繰り返して、目的遺伝子断片を増
幅した。ポリメラーゼは宝酒造（株）のＥｘＴａｑを使
用した。プロモーター部分は配列番号８を鋳型にして配
列番号１０と配列番号１１を用いて、５’末端がＳａｌ
Ｉ、３’末端がＮｄｅＩのＡＬＫ１ｐを作製した。ター
ミネーター部分は配列番号９を鋳型にして配列番号１２
と配列番号１３を用いて、５’末端がＨｉｎｄＩＩＩ、
３’末端がＥｃｏＲＶのＡＬＫ１ｔを作製した。最終的
にＯＲＦ２とＯＲＦ３を連結するベクターにはｐＵＣ１
９にキャンディダ・マルトーサの自己複製領域（ＡＲ
Ｓ）（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ｄ２９７５８）およびＵＲＡ
３遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ Ｄ１２７２０）を連結し
たｐＵＴＵ（Ｍ．Ｏｈｋｕｍａ，ｅｔ ａｌ， Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ．２７３， ３９４８−
３９５３（１９９８））とキャンディダ・マルトーサの
ＡＤＥ１遺伝子を用いて、マーカー遺伝子をウラシルか
らアデニンに変更したベクターであるｐＵＴＡ１（図２
下）を使用した。ｐＵＴＡ１は、ｐＵＴＵ１からＸｈｏ
Ｉを用いてＵＲＡ３遺伝子を除去し、これにＳａｌＩを
用いて切り出したＡＤＥ１遺伝子断片を接続し構築し
た。
【００７９】ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３に記
載）のＰｖｕＩＩ、ＮｄｅＩサイトにＡＬＫ１ｐを結合
し、またｐＵＣＮＴのＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩサイト
にＡＬＫ１ｔを結合してｐＵＡＬ１を構築した。次にｐ
ＵＡＬ１のＮｄｅＩ、ＰｓｔＩサイトにＯＲＦ２を結合
し、プラスミドｐＵＡＬ−ＯＲＦ２を構築した。また、
ｐＵＡＬ１を構築する途中に構築するｐＵＣＮＴ−ＡＬ
Ｋ１ｔのＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトにＯＲＦ３を
結合し、さらにＡＬＫ１ｐを結合することで、ｐＵＡＬ
−ＯＲＦ３を構築した。
【００８０】つぎに、プラスミドｐＵＡＬ−ＯＲＦ２か
らＥｃｏＴ２２Ｉを用いて、ＯＲＦ２とともに上流にあ
るプロモーター、下流にあるターミネーターを一緒に切
り出し、ｐＵＴＡ１のＰｓｔＩサイトに結合し、ｐＵＴ
Ａ−ＯＲＦ２を構築した。さらに、ｐＵＡＬ−ＯＲＦ３
からＳａｌＩを用いてＯＲＦ３とともに上流にあるプロ
モーター、下流にあるターミネーターを一緒に切り出
し、ｐＵＴＡ−ＯＲＦ２のＳａｌＩサイトに結合したプ
ラスミドｐＵＴＡ−ＯＲＦ２３（図２上）を構築した。
以上の方法により、キャンディダ・マルトーサにおいて
ポリエステルを製造するための遺伝子発現カセットを構
築した。
【００８１】（実施例１０）ポリエステル産生用形質転
換株の作製 ＡＣ１６株及びＣＨＡ１株への形質転換は、当該酵母を
ＹＭ培地でＯＤ６００ｎｍが０．８〜１．０になるまで
培養し、遠心により菌体を回収した。この菌体に上記の
発現ベクターを導入した。遺伝子導入に際して、コンピ
テント細胞の調製から遺伝子導入までＧＥＮＯ ＴＥＣ
Ｈ社製ＦａｓｔＴｒａｃｋTM−Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎSM Ｋｉｔを用いて行った。遺伝子
導入した菌体をＭ培地プレートに塗抹し２日間培養し
た。ｐＵＴＡ−ＯＲＦ２３にはＡＤＥ１遺伝子が組み込
まれているため、アデニンの合成ができる。従って、ア
デニン不含の培地で生育する菌が形質転換体である。ア
デニン不含の培地より生育した菌を回収し、形質転換体
ＡＣ１６（ＯＲＦ２３）株とした。同様にＣＨＡ１株か
らＣＨＡ１（ＯＲＦ２３）株を得た。また、ポリエステ
ル合成酵素を含まないコントロールベクターｐＵＴＡ１
を用いて、同様にＡＣ１６株とＣＨＡ１株を形質転換
し、形質転換体ＡＣ１６（ＣＴ）株、及びＣＨＡ１（Ｏ
ＲＦＣＴ）株を得た。
【００８２】（実施例１１）ポリエステル生産培養 ポリエステル生産のための本培養はすべて２Ｌ坂口フラ
スコを用いて行った。まずＳＤ培地１０ｍｌに各組み換
え株のグリセロールストック１００μｌを植菌し、１晩
培養した。培養した酵母菌はグルコース飢餓用の硫酸ア
ンモニウム含有Ｍ培地（１００ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム
添加）５０ｍｌに１ｍｌを植菌した。この培地で２日間
培養し、培地中のグルコースを完全に枯渇させる。次に
この菌１０ｍｌをポリエステル産生用培地５０ｍｌ（５
００ｍｌ坂口フラスコ）に植菌し、８時間培養後、同じ
ポリエステル生産用培地５００ｍｌに全量植菌し本培養
を行った。本培養は１２０時間行った。培養液をオート
クレーブ後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノー
ルで洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥菌体を粉
砕し、クロロホルムを１００ｍｌ添加し１晩攪拌してポ
リエステル抽出操作を行った。クロロホルム溶液を濾過
により回収しエバポレーターで１−２ｍｌにまで濃縮
後、濃縮液に１０ｍｌのヘキサンを添加してヘキサン不
溶物を析出させた。ＡＣ１６（ＯＲＦ２３）株は沈殿物
が得られたが、 ＣＨＡ１（ＯＲＦ２３）株では痕跡程
度の沈殿しか得られなかった。ＡＣ１６（ＣＴ）株では
沈殿物は全く得られなかった。 ＡＣ１６（ＯＲＦ２
３）株から得られたヘキサン沈殿物を乾燥後、４００Ｍ
ＨｚプロトンＮＭＲ分析（ＪＥＯＬ、ＪＮＭ−ＥＸ４０
０）を行った。図８にＮＭＲチャートを示した。また、
各ピークとポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の
プロトンとの対応を番号で示した。解析から３ＨＨ分率
は９．７％であった。また、ポリエステルの生産量は酵
母乾燥重量の０．１％であった。 ＣＨＡ１（ＯＲＦ２
３）株でも同様にポリエステルが確認できたが生産量は
０．０５％以下であった。これより、本発明のキャンデ
ィダ・マルトーサのＡＤＥ１遺伝子破壊株を用いて共重
合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産でき
ることがわかった。さらに、本破壊株形質転換体は突然
変異処理により得られたＡＤＥ１遺伝子変異酵母のＣＨ
Ａ１よりポリエステル生産能力に優れていることが示さ
れ、本発明のＡＤＥ１遺伝子破壊酵母の有用性が明らか
になった。
【００８３】
【発明の効果】本発明により、酵母のＡＤＥ１遺伝子が
破壊された菌株の有用性が示された。キャンディダ・マ
ルトーサのＡＤＥ１遺伝子破壊株では、遺伝子組換え用
宿主酵母として、遺伝子の発現や遺伝子の発現産物の製
造に用いることが期待できる。さらに異なる栄養要求性
を付加することも可能であり、組換え体として安全に使
用できる酵母の開発に繋がる。
【００８４】
【配列表】 <110> 鐘淵化学工業株式会社 ＫＡＮＥＫＡ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ <120> 遺伝子破壊株 <130> ＴＫＳ−４３６０ <160> 13 <210> 1 <211> 1820 <212> DNA <213> Candida maltosa <220> <221> CDS <222> 538..1413 <223> Ade1 <400> 1 gatccccttc ttcaaacctt taaatgacat tgtttcgttt ctctatgttt ggtatcggtt 60 cttcttcttc ttcaaaaaaa aggggggcac tattcaaaaa aaaatattat aacagtatga 120 tttttttccc tctcccgtcg attgaggttt tttttttctc tttcgtcttg gtcttttgct 180 tttcactcca aaaatggaaa cacgcgcggc tcaactcgaa atccgtgatc aaaaaaataa 240 aggctgtgag tttcgagcca ataattatga attagtggta ttttttttaa agataaataa 300 tcaagaatcg cattagggag acgaatatgc gttattcaaa taaaaagaca attcttttag 360 ggtagcattt cccttcaagt tcatcccaca tgtacattaa tgtcaatgat gtcgcagaag 420 ttaaattagc agaagaaaaa aaaaatgtga attactccga gtcaactctt ctttctcttc 480 ttctttttct tctttatcac cataatcacc accaccacca ccaccaccag ctcccagatg 540 acttcaacta acttagaagg aactttccca ttgattgcca aaggtaaagt cagagatatt 600 taccaagttg acgacaacac tcttttattc gttgctactg atagaatttc cgcatacgat 660 gtgattatgt ctaatggtat cccaaataaa ggtaaaatct 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gcaacatatg 1560 cttgaccatt agcaaaactt ctacctaaat ctattttgac tctgtccaaa gtttgacctt 1620 gagctttgtg gatcgacatc gcccacgaca agatcatttg gtttgttttt atggtgggtt 1680 attggcactt ggtgcaactg atggtttaac tttggaagag gctaagaaat tgaagacttg 1740 gaatgaagaa cgtgcatctg atttcaaatt gggtgaagaa ttgacttata cttgttataa 1800 aatgtatcat gatgttgatc 1820 <210> 2 <211> 1032 <212> DNA <213> Candida maltosa <400> 2 attataacag tatgattttt ttccctctcc cgtcgattga ggtttttttt ttctctttcg 60 tcttggtctt ttgcttttca ctccaaaaat ggaaacacgc gcggctcaac tcgaaatccg 120 tgatcaaaaa aataaaggct gtgagtttcg agccaataat tatgaattag tggtattttt 180 tttaaagata aataatcaag aatcgcatta gggagacgaa tatgcgttat tcaaataaaa 240 agacaattct tttagggtag catttccctt caagttcatc ccacatgtac attaatgtca 300 atgatgtcgc agaagttaaa ttagcagaag aaaaaaaaaa tgtgaattac tccgagtcaa 360 ctcttctttc tcttcttctt tttcttcttt atcaccataa tcaccaccac caccaccacc 420 accagctccc agatgacttc aactaactta gaaggaactt tcccattgat tgccaaaggt 480 aaagtcagag atatttacca agttgacgac aacactcttt tattcgttgc tactgataga 540 atttccgcat acgatgtgat tatgtctaat ggtatcccaa ataaaggtaa aatcttaacc 600 aaattgtctg aattctggtt tgatttcttg ccaattaact tctaatggtg ttgctggtaa 660 agatggtgtt gctatgcctg aagacattgt cactgaaacc aagagcaaat acgttgaagc 720 ttacgaaaat ttaactggtg acaaatggca agaataaatt aaggatatct attattaaag 780 ctttctattt atcccaaact ttcgtagtat tttctgacat gttcagatgt ttttacttta 840 tctttcctga aatttttgat ttctaaccga ctcttgcatg tagctcttga taatgcaaca 900 tatgcttgac cattagcaaa acttctacct aaatctattt tgactctgtc caaagtttga 960 ccttgagctt tgtggatcga catcgcccac gacaagatca tttggtttgt ttttatggtg 1020 ggttattggc ac 1032 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 taacagtatg atttttttcc ctct 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aacaaaccaa atgatcttgt cgtg 24 <210> 5 <211> 264 <212> DNA <213> Candida maltosa <220> <221> CDS <223> probe <400> 5 aacttctaat ggtgttgctg gtaaagatgg tgttgctatg cctgaagaca ttgtcactga 60 aaccaagagc aaatacgttg aagcttacga aaatttaact ggtgacaaat ggcaagaata 120 aattaaggat atctattatt aaagctttct atttatccca aactttcgta gtattttctg 180 acatgttcag atgtttttac tttatctttc ctgaaatttt tgatttctaa ccgactcttg 240 catgtagctc ttgataatgc aaca 264 <210> 6 <211> 1785 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> 1..1785 <223> ORF2 <400> 6 atg tct caa cca tct tat ggt cca ttg ttc gaa gct ttg gct cat tac 48 aat gat aaa ttg ttg gct atg gct aaa gct caa acc gaa aga act gct 96 caa gcc ttg ttg caa act aac ttg gat gat ttg ggt caa gtt ttg gaa 144 caa ggt tct caa caa cca tgg caa ttg att caa gct caa atg aat tgg 192 tgg caa gat caa tta aaa ttg atg caa cac act ttg tta aaa tct gct 240 ggt caa cca tct gaa cca gtt att act cca gaa aga tct gat aga aga 288 ttt aaa gct gaa gct tgg tct gaa caa cca att tat gat tac tta aaa 336 caa tcc tat ttg tta act gct aga cat ttg ttg gct tct gtt gat gct 384 ttg gaa ggt gtc cca caa aaa tct aga gaa aga ttg aga ttc ttt act 432 aga caa tac gtc aac gct atg gct cca tct aat ttc ttg gct act aac 480 cca gaa ttg tta aaa ttg act ttg gaa tcc gat ggt caa aat ttg gtt 528 aga ggt ttg gct tta ttg gct gaa gat ttg gaa aga tct gct gat caa 576 tta aac att aga ttg act gat gaa tcc gct ttt gaa tta ggt aga gat 624 ttg gct ttg act cca ggt aga gtt gtt caa aga act gaa tta tat gaa 672 tta att caa tac tct cca act act gaa acc gtt ggt aaa acc cca gtt 720 ttg atc gtt cca cca ttc att aat aaa tat tac att atg gat atg aga 768 cca caa aac tcc ttg gtc gct tgg ttg gtc gct caa ggt caa acc gtt 816 ttc atg att tcc tgg aga aac cca ggt gtt gct caa gct caa att gat 864 tta gat gat tat gtt gtt gat ggt gtc att gct gct ttg gat ggt gtt 912 gaa gcc gct act ggt gaa aga gaa gtt cac ggt att ggt tac tgt att 960 ggt ggt acc gct ttg tct tta gct atg ggt tgg ttg gcc gcc aga aga 1008 caa aaa caa aga gtt aga act gct act ttg ttt act act ttg ttg gat 1056 ttc tcc caa cca ggt gaa ttg ggt att ttt att cat gaa cca att atc 1104 gcc gcc tta gaa gcc caa aat gaa gct aaa ggt att atg gat ggt aga 1152 caa ttg gcc gtc tcc ttc tct ttg ttg aga gaa aac tct tta tat tgg 1200 aat tac tat att gat tct tac tta aaa ggt caa tct cca gtt gct ttt 1248 gat ttg ttg cac tgg aac tct gat tct act aat gtt gcc ggt aaa act 1296 cat aac tct ttg ttg aga aga tta tat ttg gaa aat caa ttg gtt aaa 1344 ggt gaa tta aaa att aga aac act aga att gat tta ggt aaa gtt aaa 1392 act cca gtt ttg ttg gtt tct gcc gtt gat gat cac att gct tta tgg 1440 caa ggt acc tgg caa ggt atg aaa ttg ttc ggt ggt gaa caa aga ttt 1488 tta ttg gcc gaa tcc ggt cat att gct ggt att att aat cca cca gct 1536 gct aac aaa tac ggt ttc tgg cac aat ggt gct gaa gct gaa tct cca 1584 gaa tct tgg ttg gct ggt gcc acc cat caa ggt ggt tcc tgg tgg cca 1632 gaa atg atg ggt ttt att caa aac aga gat gaa ggt tct gaa cca gtc 1680 cca gcc aga gtc cca gaa gaa ggt ttg gct cca gct cca ggt cac tat 1728 gtc aaa gtt aga tta aac cca gtt ttc gct tgt cca acc gaa gaa gat 1776 gct gct taa 1785 <210> 7 <211> 405 <212> DNA <213>Artificial Sequence <220> <221> CDS <222> 1..404 <223> ORF3 <400> 7 atg tct gct caa tcc ttg gaa gtt ggt caa aaa gct aga tta tct aaa 48 aga ttc ggt gcc gcc gaa gtt gct gct ttt gct gcc tta tct gaa gat 96 ttc aac cca ttg cac ttg gat cca gct ttt gct gct act acc gcc ttc 144 gaa aga cca atc gtc cat ggt atg ttg tta gct tct tta ttt tcc ggt 192 ttg ttg ggt caa caa ttg cca ggt aaa ggt tct att tat ttg ggt caa 240 tct tta tct ttc aaa ttg cca gtc ttt gtc ggt gat gaa gtt acc gct 288 gaa gtt gaa gtt act gct ttg aga gaa gat aaa cca att gct act ttg 336 act act aga att ttc act caa ggt ggt gct tta gct gtt acc ggt gaa 384 gct gtt gtc aaa ttg cca taa 405 <210> 8 <211> 1017 <212> DNA <213> Candida maltosa <220> <223> promoter ALK1p <400> 8 atgcatgaac aggatttaat cccaagaaaa aagtctattt tctattttca caaggaaact 60 ggaaaaacct ttttgtgttt tgaagtagct ccgtaataac ctgtaaaaaa ataaattttg 120 aagatttgac ttgctgatga aaatgctatc agtgtagctc tagacttgat actagactat 180 gatggcaaca catggtggtc aacgtgcaag acatcaccca atgagaagac tgctaaccag 240 aaaaaaaagg ggacaaaaga aaaactcgag agaaaaagtc aaattggtgt aaaattggct 300 atttttggta ctttcctaat ggggaaatta attgtttaaa attccagttt ttccagagtt 360 aagatttcga ccaattattt ttaatccata tgatcttcat cattatcaac ttgtgaaaaa 420 taataatcga ggtacgttta atacgagata ttagtctacg gctatgaatg ttggatatac 480 ttcattgacg atcagaagct tgattggtta ttcaggtgca tgtgtggata taaacccaac 540 aaattatcta gcaactgtgc cttccccaca ttggtcaaag aaaccctaaa gcaaattaaa 600 atctggataa ataaatcatt catttcacat tttccggtta gtataaggtt ttttaaattt 660 ttttttacag tttagccctt tcaattacca aatacggtaa caatgtgctt tgtaacatgc 720 aggggatttt ctccgttgct gttttctcca catgctttta atgtgtaata aattaaaaaa 780 attacaaaga aaaaccggca tataagcatc ggagtttaca ttgttaacta actgcaaaat 840 ggcgatgttt caaatcaaca aaatttaaaa aaaccccaaa aaaaaagtat catataaatt 900 aaactcaaaa tccttttgat tgcataaaat ttttaaatct cttctttttt ttctttttta 960 ctttcttatc tattctattc tttttttata tatctaattc atttataaca tctggtc 1017 <210> 9 <211> 218 <212> DNA <213> Candida maltosa <220> <223> terminater ALK1t <400> 9 atagatggat ttttcttttt tatgtgtatt tccggttaat aaatgtttaa attttttttt 60 taataaaaat atttgtagtt atttatatgc aaaaaaaaaa aatattcaaa gcaatcttcc 120 tttctttctt tatctttccc ccatgctaag gtctaaaaca ccacaactta aaacccaact 180 taaccgtata atactaagat caatctccaa agatgcat 218 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tttttcagct ggagctcgtc gacatgcatg aacaggattt aatccc 46 <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>primer <400> 11 ccggaattcc atatgcagat gttataaatg aattagata 39 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cggaagctta tagatggatt tttctttttt at 32 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tttttgatatc gagctcgtcg acatgcatct ttggagattg atctt 45
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＵＣ１１９−ＡＤＥ１の簡単な図及びＡＤ
Ｅ１破壊用ＤＮＡの作製法を示してある。
【図２】 本発明で用いた、アエロモナス・キャビエ由
来のポリエステル重合酵素とエノイル−ＣｏＡヒドラタ
ーゼ発現カセットｐＵＴＡ−ＯＲＦ２３（図２上）、及
び、両酵素発現遺伝子を含まないコントロールカセット
ｐＵＴＡ１（図２下）を示してある。
【図３】 ＰＣＲ法による、ＡＤＥ１遺伝子破壊株の１
次スクリーニングの結果を示してある。Ｃ１６及びＣ１
７が破壊株と考えられた。
【図４】 ゲノミックサザンハイブリダイゼーション法
によるＡＤＥ１遺伝子破壊の確認を示してある。Ｃ１６
及びＣ１７が正常に破壊されていた。
【図５】 サザンハイブリダイゼーションにより明らか
になった、ＡＤＥ１遺伝子破壊キャンディダ・マルトー
サ染色体の破壊されたＡＤＥ１遺伝子付近の制限酵素地
図を示してある。
【図６】 ＡＤＥ１遺伝子破壊株ＡＣ１６のＹＰＤ培地
での増殖曲線を示してある。
【図７】 ＡＤＥ１遺伝子破壊株ＡＣ１６のヤシ油、パ
ーム油、及びテトラデカンを炭素源としたときの増殖曲
線を示してある。
【図８】 ＡＣ１６（ＯＲＦ２３）株で生産したポリエ
ステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の４００ＭＨｚプロ
トンＮＭＲのチャートを示した。また、ポリエステルの
各プロトンの帰属を番号で示してある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 高木 正道 東京都府中市栄町１−31−10 (72)発明者 太田 明徳 埼玉県大宮市ブラザ57−２ Ｆターム(参考） 4B024 AA17 AA20 BA07 BA80 DA12 GA11 HA20 4B064 AD83 CA06 CA19 CB24 CC24 DA20 4B065 AA10Y AA73X AB01 AC20 BA02 CA12 CA54

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ＡＤＥ１ＤＮＡ断片との相同的組換えによ
    り、染色体ＤＮＡのＡＤＥ１遺伝子が破壊された酵母。
  2. 【請求項２】酵母がアシクロコニディウム属、アンブロ
    シオザイマ属，アルスロアスカス属，アルキシオザイマ
    属，アシュビア属，バブジェビア属，ベンシングトニア
    属，ボトリオアスカス属，ボトリオザイマ属，ブレッタ
    ノマイセス属，ビュレラ属，ビュレロマイセス属，キャ
    ンディダ属、シテロマイセス属， クラビスポラ属，
    クリプトコッカス属，シストフィロバシディウム属，
    デバリオマイセス属，デッカラ属，ディポダスコプシス
    属，ディポダスカス属，エニエラ属，エンドマイコプセ
    ラ属，エレマスカス属，エレモセシウム属，エリスロバ
    シディウム属，フェロマイセス属，フィロバシディウム
    属，ガラクトマイセス属，ゲオトリクム属，ガイラーモ
    ンデラ属，ハンセニアスポラ属，ハンセヌラ属，ハセガ
    ワエア属，ホルターマンニア属， ホルモアスカス属，
    ハイフォピキア属，イサットヘンキア属，クロエケラ
    属，クロエケラスポラ属，クルイベロマイセス属，コン
    ドア属，クライシア属，クルツマノマイセス属，ロイコ
    スポリディウム属，リポマイセス属，ロデロマイセス
    属，マラセジア属，メトシュニコウィア属，ムラキア
    属，マイクソザイマ属，ナドソニア属，ナカザワエア
    属，ネマトスポラ属，オガタエア属，オースポリディウ
    ム属，パチソレン属，ファチコスポラ属，ファフィア
    属，ピキア属，ロドスポリディウム属，ロドトルラ属，
    サッカロマイセス属，サッカロマイコーデス属， サッ
    カロマイコプシス属，サイトエラ属，サカグチア属，サ
    ターノスポラ属，シゾブラストスポリオン属，シゾサッ
    カロマイセス属，シュワニオマイセス属， スポリディ
    オボラス属，スポロボロマイセス属，スポロパキデミア
    属， ステファノアスカス属，ステリグマトマイセス
    属，ステリグマトスポリディウム属，シンビオタフリナ
    属，シンポディオマイセス属，シンポディオマイコプシ
    ス属，トルラスポラ属，トリコスポリエラ属，トリコス
    ポロン属，トリゴノプシス属，ツチヤエア属，ウデニオ
    マイセス属，ワルトマイセス属，ウィカーハミア属，ウ
    ィカーハミエラ属，ウィリオプシス属，ヤマダザイマ
    属，ヤロウィア属，ザイゴアスカス属，ザイゴサッカロ
    マイセス属，ザイゴウィリオプシス属、又はザイゴザイ
    マ属のいずれかである請求項１記載のＡＤＥ１遺伝子破
    壊酵母。
  3. 【請求項３】酵母がキャンディダ属、ヤロウィア属、ク
    ルイベロマイセス属、ハンセニアスポラ属のいずれかで
    ある請求項１記載のＡＤＥ１遺伝子破壊酵母。
  4. 【請求項４】酵母がキャンディダ属である請求項１記載
    のＡＤＥ１遺伝子破壊酵母。
  5. 【請求項５】酵母がキャンディダ・マルトーサである請
    求項４記載のＡＤＥ１遺伝子破壊酵母。
  6. 【請求項６】酵母がキャンディダ・マルトーサＡＣ１６
    （ＦＥＲＭ ＢＰ−７３６６）である請求項５記載のＡ
    ＤＥ１遺伝子破壊酵母。
  7. 【請求項７】同種又は異種の遺伝子を含むＤＮＡ配列で
    形質転換された請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵
    母のＡＤＥ１遺伝子破壊酵母の形質転換体。
  8. 【請求項８】ＡＤＥ１遺伝子破壊酵母がキャンディダ属
    である請求項７記載の形質転換体。
  9. 【請求項９】ＡＤＥ１遺伝子破壊酵母がキャンディダ・
    マルトーサである請求項８記載の形質転換体。
  10. 【請求項１０】ＡＤＥ１遺伝子破壊酵母がキャンディダ
    ・マルトーサＡＣ１６（ＦＥＲＭ ＢＰ−７３６６）で
    ある請求項９記載の形質転換体。
  11. 【請求項１１】請求項７〜１０のいずれか１項に記載の
    形質転換体を培養して得られる培養物から、同種又は異
    種の遺伝子発現産物を採取することを特徴とする、遺伝
    子発現産物の製造方法。
  12. 【請求項１２】請求項１１記載の遺伝子発現産物がポリ
    エステルであることを特徴とする、ポリエステルの製造
    方法。
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