WO2002057442A1 - Gene interrompu de levure - Google Patents

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WO2002057442A1
WO2002057442A1 PCT/JP2002/000326 JP0200326W WO02057442A1 WO 2002057442 A1 WO2002057442 A1 WO 2002057442A1 JP 0200326 W JP0200326 W JP 0200326W WO 02057442 A1 WO02057442 A1 WO 02057442A1
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genus
gene
yeast
ade1
strain
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PCT/JP2002/000326
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Takeshi Fukuchi
Satoru Yokomizo
Fumio Osakada
Keiji Matsumoto
Masamichi Takagi
Akinori Ota
Original Assignee
Kaneka Corporation
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02006—Phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthase (6.3.2.6)

Definitions

  • the present invention relates to a method for blasting certain chromosomal DNA of yeast based on the principle of homologous recombination, and a blastocyst strain. It also relates to the production of industrially useful substances using the disrupted strain.
  • yeast Saccharomyces has long been used for the production of fermentable foods such as alcoholic beverages, and Candida maltosa has been used as a microbial protein in food and feed.
  • Candida maltosa has been used as a microbial protein in food and feed.
  • the safety of the yeast itself has been confirmed.
  • Yeast grows quickly and can generally be cultured at higher cell densities than bacteria.
  • yeast is easier to separate bacterial cells and culture solution than bacteria, so that the process of extracting and purifying a product can be simplified. Utilizing these characteristics, yeast has been used as a host for producing useful products from recombinant DNA, and its usefulness has been demonstrated.
  • Candida yeast differs from Saccharomyces in that it does not produce ethanol in aerobic culture and does not inhibit its growth, so efficiency in continuous culture at high density is high. Cell production and substance production are possible.
  • Et al is, asporogenous yeast Candida maltosa are characteristic of being able to assimilate and growth linear hydrocarbons and palm oil carbon chain C 6 -C 4 Q, the oil palm oil and the like as the sole carbon source have. This property is practically advantageous as a place for producing and reacting useful substances by conversion of hydrophobic chemical substances, and is expected to be used for the production of various compounds (Reference book: Wolf K Ed. No nconventional Y eastsin B iotechnolog y.
  • Candida maltosa can be used for the production of useful substances by genetic recombination utilizing its properties, and gene expression systems for this purpose have been energetically developed (Japanese Patent Application Laid-open No. Sho 62). — 74287, JP 62-74288, JP 2-72822). Recently, it has been disclosed that Candida maltosa can be used for the production of linear dicarboxylic acids by genetic recombination (WO 99/040 14).
  • mutant strains When yeast is used as a host for substance production by genetic recombination, it is necessary to obtain a mutant strain to which a selection code such as an appropriate auxotrophy is added, as in the case of using E. coli or the like.
  • a selection code such as an appropriate auxotrophy
  • mutant strains Conventionally, to add auxotrophy, mutant strains have been obtained by random mutagenesis using a mutagen such as nitrosoguanidine or ethylmethanesulfonic acid.
  • a mutagen such as nitrosoguanidine or ethylmethanesulfonic acid.
  • the desired auxotrophic strain can be obtained by this mutagenesis method, the possibility that the mutation is present in a part other than the target part cannot be denied. This is an obstacle to the development of yeast as a host, and it can be said that its use as a place for producing substances is delayed compared to E. coli and the like.
  • Candida maltosa For example, a host vector system for Candida maltosa was developed from an early stage, and despite the fact that many mutated auxotrophs have been obtained by mutagenesis, new recombinant The production of valuable useful chemicals has not been industrialized. The reason for this is that Candida maltosa with the appropriate auxotrophy, which has the same growth ability as the wild type and the ability to assimilate linear hydrocarbon chains, has not been obtained.
  • the CHA1 strain developed by mutating Candida maltosa has been confirmed to have mutations in the ADE1 gene and the HIS5 gene (Kawai S., et al., Agric Biol. Chem., 55: 59-65 (1991)), the growth ability is inferior to that of the wild strain. This is thought to be due to mutations other than the target.
  • mutant strains obtained by random mutation Another problem with mutant strains obtained by random mutation is the spontaneous reversion of the mutation site.
  • the productivity of the recombinant bacterium may decrease.
  • the reverted strain is likely to survive and proliferate if leaked to the natural world, and there is a problem in terms of safety standards. Therefore, it is not appropriate to use strains obtained by random mutagenesis as a place for producing substances. Absent. Therefore, it has been desired to obtain a ruptured strain in which only a specific auxotrophic gene has been blasted.
  • mutant strains of Candida maltosa include genes such as ADE1 gene, histidinol-phosphate-aminotransferase (HIS5 gene), orotidine-15, _phosphate decarboxylace (URA3 gene), etc.
  • a large number of mutant strains have been obtained (Reference book: Wo1f K. ed., Nonconventional Yeastsin Biotec hnolog y .: 411-580).
  • Candida maltosa which has added auxotrophy by disrupting only certain genes, has not yet been obtained.
  • a genetically disrupted strain was desired.
  • not only Candida maltosa but such a gene-broken strain is desired.
  • Candida maltosa is expected to produce industrially useful substances by utilizing straight-chain hydrocarbons, palm oil, palm oil, and other fats and oils as the sole carbon source.
  • yeast phospholiposylaminoimidazole-succinocarpoxamide synthase (EC6.3.2.3.6) ) was constructed by the principle of homologous recombination with chromosome DNA using the DNA (ADE 1 gene) fragment encoding the ADE 1 gene fragment, and adenine-requiring yeast was successfully obtained.
  • the growth ability and gene expression ability of the gene-disrupted yeast are superior to those of the CHA 1 strain of the AD E1 gene mutant obtained by mutation of Candida damaltosa.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a yeast in which the ADE1 gene of chromosomal DNA has been destroyed by homologous recombination with an ADE1 DNA fragment.
  • the present invention also relates to a transformant of the ADE1 gene-broken yeast transformed with a DNA sequence containing a homologous or heterologous gene.
  • the present invention relates to a method for producing a gene expression product, wherein a homologous or heterologous gene expression product is collected from a culture obtained by culturing a transformant of the ADE1 gene-broken yeast.
  • the present invention provides a method for producing a substance useful in industry by obtaining a transformant obtained by introducing a homologous or heterologous gene expression system into an ADE1 gene disrupted strain of Candida maltosa.
  • a two-component copolymerized polyester of 3-hydroxybutyrate (hereinafter abbreviated as 3HB) and 3-hydroxyhexanoate (hereinafter abbreviated as 3HH) (hereinafter P (3HB—co—3HH) ) Is useful as a biodegradable polyester, and polyester polymerase and Enolue CoA hydratase are enzymes that synthesize the polyester.
  • the present invention relates to a method for producing a polyester using a transformant of the ADE1 gene-disrupted strain, and a method for producing a polyester by collecting the polyester from a culture obtained by culturing the transformant.
  • yeast that disrupts the ADE1 gene by homologous recombination and the genus acycloconidium (Aciculoconidium), which is deposited at the strain's depository (eg, IFO, ATCC, etc.), Genus Ambrosiozyma (genus Amb rosioz yraa), genus Anolesroascus (genus Arthroascus), genus A / rexiozyma (genus Ar xiozyma), genus Ashvia (genus Ashybya), genus Babjevia (genus Babjevia), Genus Bensingtonia (genus Bensingtonia), genus Potrioascus (genus Botryoascus), genus Botryozyma (genus Botryozyma), genus Botryozyma), genus Botryozyma), genus Botryozyma), genus Bretta
  • Candida Jarowia, Kluyveromyces, Hanseniaspora, Hansenula, etc. are preferable in that they can be produced.Particularly, research on a host-vector system is in progress, and the system can be easily used.
  • the genus Cyandida is preferred because of its high ability to assimilate linear hydrocarbons and oils and fats.
  • Candida maltosa was used for the production and use of the ADE1 broken plant strain of the present invention.
  • the wild strain I AMI2247 of Candida maltosa used in the present invention can be obtained from the Institute of Applied Microbiology of the University of Tokyo, or AmericanTyeCutltureCollecntio n (ManasassasVA, USA) as ATCC 28140.
  • the CHA 1 strain which is a mutant of Candida maltosa adenine and histidine auxotrophic marker, is available from the above organization as ATCC 90625.
  • the ADE1 gene-disrupted strain Candida maltosa AC16 obtained in the present invention was obtained from the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, located at 1-1, Tsukuba-Higashi 1-chome, Ibaraki, Japan. It has been deposited internationally under the Budapest Treaty under the accession number of FERM BP-7366, dated January 15, 2000. Homologous recombination refers to recombination that occurs at a portion where the base sequence of DNA is similar or has the same sequence (homologous sequence).
  • Gene disruption is the insertion of a mutation into the base sequence of a gene, the insertion of another DNA, or the deletion of a portion of the gene so that the function of the gene cannot be achieved. Is shown.
  • the gene cannot be transcribed into mRNA, and the structural gene is not translated or the transcribed mRNA is incomplete, resulting in mutation or deletion in the amino acid sequence of the translated structural protein. In other words, the original function cannot be exhibited.
  • the ADE 1 gene is a 5 'untranslated region including a promoter region, a region encoding phospholiposilaminoimidazole-succinocarboxamide synthase (EC 6.2.3.6), and a 3' region including a terminator region. Indicates a gene fragment consisting of an untranslated region.
  • the nucleotide sequence of the AD E1 gene of Candida maltosa has been published in GenBank: DO0855, and the DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 1. did.
  • An ADE1 DNA fragment refers to a DNA that can undergo homologous recombination with the ADE1 gene on the chromosome in a microbial cell, thereby destroying the ADE1 gene.
  • the ADE1 enzyme refers to phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide synthase (EC 6. 3.2.6).
  • a homologous gene is a gene or a part of a gene present on the chromosome of the host yeast.
  • a heterologous gene refers to a gene that is not naturally present on the chromosome of the host yeast or a portion of the DNA.
  • a gene expression cassette is a circular plasmid consisting of a transcription promoter DNA sequence, DNA encoding a gene to be expressed, and DNA containing a terminator that terminates transcription, and functions extrachromosomally. And the chromosome DN
  • a gene expression product is itself a gene expression product when the substance expressed by the gene (gene expression product) is a desired protein or enzyme.
  • the gene expression product is various enzymes and coenzymes, and a substance that is produced by expressing the catalytic activity in the host yeast and that is directly different from the gene expression product is also a gene expression product. .
  • PHA is an abbreviation of polyhydroxylanecanoate, and indicates a biodegradable polyester obtained by copolymerizing 3-hydroxylanecanoic acid.
  • ORF 2 refers to a DNA designed to express a gene encoding a polyester synthase derived from Aeromonas cinerea (Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-108682) in Candida maltosa.
  • SEQ ID NO: 6 shows its nucleotide sequence.
  • ORF 3 refers to a DNA designed to express a gene encoding Enol-1 CoA hydratase from Aeromonas capillaris (Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-108682) in Candida maltosa.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence.
  • any method can be used as long as a disrupted strain that does not express the ADE1 enzyme can be obtained.
  • Various methods of gene disruption have been reported, but gene disruption by homologous recombination is preferred in that only a specific gene can be disrupted (Nicko 1 off JA ed. Methodsin Molecular Biology, 47: 291-302 (1955), Huma na Press Inc., Totowa, NJ).
  • homologous recombination a shyrup strain that does not return spontaneously can be obtained, and as a result, a strain that is highly safe in handling the recombinant can be obtained.
  • a simple one-stepgenedisruption force that can be performed only with ⁇ .
  • the ADE1 DNA fragment used in the one-step crushing method is usually a DNA fragment obtained by removing the partial DNA inside the gene and reconnecting the remaining both ends.
  • This DNA fragment can be prepared, for example, by PCR (polymerase chain reaction) or by excision and religation from a vector with a restriction enzyme.
  • the length of the homology region at both ends of the ADElNA fragment may be at least 10 bases, preferably at least 200 bases, and more preferably at least 300 bases.
  • the homology at each end is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the portion of DNA to be removed is a portion at which the ADE1 gene cannot exert its enzymatic activity by removal, and has a length such that the ADE1 enzyme activity is not restored by spontaneous reversion.
  • the chain length of such partial DNA is not particularly limited, it is preferably at least 50 bases, more preferably at least 100 bases.
  • a 555 bp DNA fragment encoding the ADE1 enzyme was removed, and a DNA for crushing was used in which a 630 bp DNA fragment on the 5 ′ side and a 400 bp DNA fragment on the 3 side were ligated (FIG. 1). ).
  • the removed portion accounts for about 80% of the ADE 1 enzyme protein.
  • the homology between the 5, 5 and 3 'DNA fragments and the original ADE1 gene is 100% for both DNAs.
  • SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of the DNA fragment for disruption used in the present invention.
  • the preparation of the DNA fragment used in this specification was performed using pUC 1 19—ADE 1 (Kawai S. et al., Agric. Biol. Chem., 55: 59-65 (1991)). That is, Escherichia coli transformed with the plasmid pUC119-ADE1 is cultured, and a plasmid is prepared therefrom. This plasmid is digested with an appropriate restriction enzyme to remove one part of the structural gene of the ADE1 gene (gene encoding the ADE1 enzyme protein), the vector is recovered, and ligated again using ligase. Thus, a vector containing the DNA for blasting is obtained.
  • the vector containing the DNA for blasting is introduced into an appropriate E. coli, for example, JM109 or DH5a, and the E. coli is cultured in a large amount, and then a large amount of a highly pure plasmid is prepared by a cesium chloride ultracentrifugation method.
  • Mo lecularc 1 onlng A laboratory Manual, S econd Edition 1.42—1.47, Old Spring Harbor Laboratory Press (1 989)).
  • This vector can be directly used for gene disruption as it is.However, in order to carry out the one-step disruption method, a homologous portion containing the ADE1 region is cut out from the purified vector with an appropriate restriction enzyme, and the resulting fragment is subjected to a single step. Should be used as DNA for blasting.
  • the ADE1 gene could be broken by homologous recombination by digesting with the restriction enzyme Sa1I and introducing the DNA fragment into the cells without purification.
  • Transformation methods for Candida maltosa include the protoplast method, the lithium acetate method (Takagi M., et al., JB acteriol, 167: 551-5 (1986)), and the electric pulse method (Ka suske A., et al., Yeast). 8: 69 1-697 (1992)), but in the present invention, the electric pulse method was used.
  • a commercially available device can be used for electric pulse generation.
  • ELECTRO CELL MAN I PULATOR 600 manufactured by BTX (San Diego, CA USA) was used.
  • the cuvette used was BM6200 (2 mm gablueca) manufactured by BIO MED I CAL COR PORATION CO. LTD (Tokyo Japan).
  • the cells are cultured in an appropriate medium, and the target ADE1 disrupted strain is screened from the obtained cultured cells.
  • Various methods for obtaining transformants have been developed. Among them, nystatin enrichment (Snow R. Nature 21 1: 206—207 (1966)) A so called method can be used. This method was developed to efficiently select mutant strains obtained by random mutation from yeast, but is also considered applicable to gene-broken strains.
  • the cultured cells are inoculated into a minimal medium or the like and cultured. Wash the bacteria, culture in a minimal medium without a nitrogen source, and then culture in a minimal medium with a nitrogen source for a short time.
  • the wild strain can be killed preferentially.
  • This bacterial solution is spread on a suitable agar medium plate and cultured at 30 ° C for about 2 hours to obtain red colonies.
  • agarose gel electrophoresis detects a normal-sized DNA band in the wild-type strain, but a band shorter by the deleted sequence in the disrupted strain. Is detected. In the present invention, a DNA band of about 1 kbp was detected.
  • chromosomal DNA such as gene disruption
  • Genomic Southern analysis is indispensable in order to confirm the ruptured strains. By carrying out this method, it can be easily and surely proved that gene recombination has occurred only in the intended place.
  • confirmation was attempted with three types of cleavage methods using two types of restriction enzymes. Transfer DNA from agarose gel onto nylon membrane, and label 264 bp of DNA fragment cut with restriction enzyme Hpa IN de I of ADE 1 gene, which is considered to remain on the genome of the shredded strain, to Gene Image.
  • the obtained ADE 1 gene-broken strain cannot synthesize adenine, a precursor of ATP, because it cannot synthesize the ADE 1 enzyme. Therefore, it cannot survive in a medium without adenine or in an environment without adenine.
  • Candida maltosa AC16 One of the obtained ADE1 gene disrupted strains was named Candida maltosa AC16.
  • the homologous gene that can be introduced is not particularly limited.
  • the heterologous gene is not particularly limited, and examples thereof include production of the protein by introducing a lipase gene, an amylase gene, and the like.
  • some Candida yeasts such as Candida maltosa used in the present invention, some codons are translated differently from other organisms at the stage of protein translation from mRNA. It has been known.
  • Candida maltosa the CTG of the oral isin codon is translated into serine (Ohama T., et al., Nucleic Acid Res., 21: 40394045 (1993)). It is not translated into active ⁇ -galactosidase (Sugiyama H. et al., East 11: 43-52 (1955)).
  • Candida Maru When expressing a heterologous gene using Tosa as a host, only leucine codon may be converted in principle, but other amino acid codons may be matched to those of Candida maltosa for more efficient expression.
  • the codon conversion can be performed by referring to C andida maltosap 524-527, for example, by Mauersberger S. in No nconventiona 1 Ye astsin Biotechno 1 ogy.
  • any gene may be used as long as it is a gene involved in the synthesis of a polyester represented by the following general formula.
  • the following general formula shows the structural formula of polyester P (3HB—co—3HH), where X and Y are integers and indicate the number of 3HB and 3HH polymerized, respectively.
  • a polyester synthase gene fragment described in JP-A-10-108682 can be used.
  • a gene involved in polyester synthesis may be introduced together with the present polyester synthase gene.
  • These genes include, for example, the (R) -form-specific enol _CoA hydratase (Fkui), which converts the enol-I-CoA, an intermediate in the beta-oxidation pathway, to (R) -3-hydroxyhydroxy-CoA. T.
  • the gene expression cassette in yeast is constructed by connecting a promoter and a DNA sequence such as an upstream activating sequence (UAS) 5 ′ upstream of the gene, and adding a poly-A addition signal and a terminator 3 ′ downstream of the gene. These DNA sequences are linked to each other. Any of these DNA sequences can be used as long as they function in the yeast.
  • UAS upstream activating sequence
  • Promoters include those that constantly express and those that inducibly express. Although any promoter may be used, it is preferable that the promoter be derived from the same Candida maltosa as the host.
  • the ALK1 promoter and ALK1 terminator of Candida maltosa (GenBank D00481) (TakagiM., Etc., Agric. Biol. Chem., 5: 2217—2
  • the gene expression cassette used for the transformation of the present invention can be constructed as follows.
  • the vector used for the construction may be any vector as long as it is a plasmid that autonomously propagates in Escherichia coli, and may further have a region that can autonomously propagate in yeast. Batter that can autonomously grow in yeast is known to be retained in the cells.
  • the gene expression cassette is Can be incorporated.
  • pUTU1 capable of autonomous growth in Candida maltosa can be used (M. Ohkuma, eta1, J. Biol. Chem., Vol. 273, 3948-3953 (1998)).
  • the promoter ALK1p of the Candida maltosa A1k1 gene (SEQ ID NO: 8) is located 5 ′ upstream of ORF 2 and ORF3, respectively, and the terminator ALK1t (SEQ ID NO: 9) was linked.
  • PCR can be used.
  • the primer sequences used for PCR are shown in SEQ ID NO: 10 to SEQ ID NO: 13. Any conditions can be used for the PCR as long as the target gene fragment can be amplified.
  • SEQ ID NO: 8 As a type II promoter sequence and using SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, ALK1p having 5, SalI at the end and NdeI at the 3 'end can be prepared.
  • SEQ ID NO: 9 As a type II for the terminator and using SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, ALK1t having 5 ′ end at HindIII and 3 ′ end at EcoRV can be prepared.
  • pUTA1 in which the marker gene is changed from peracil to adenine using pUTUl and the Adel gene of Candida maltosa can be used.
  • ORF2 can be constructed by binding ORF2 to the NdeI and PstI sites of UAL1; plasmid; UAL—ORF2 can be constructed.
  • pUAL-ORF3 can be constructed by binding ORF3 to the NdeI and HindIII sites of pUCNT_ALK1t, which is constructed during construction of pUALl, and further binding ALK1p. .
  • Plasmid; UAL—ORF2 was used to excise the upstream promoter and downstream terminator together using the EcoT22I from ORF2, and bound to the PstI site of pUTAl: pUT A—ORF 2 can be constructed.
  • pUTA Plasmid pUTA_ORF23 (FIG. 2 upper) bound to the Sa1I site of ORF2 can be constructed.
  • a gene expression ability set for producing polyester in Candida maltosa can be constructed.
  • the strain of the present invention can be transformed with the gene expression cassette using the above-described transformation method to prepare a Candida 'maltosa AC16 (ORF23) strain having pUTA-ORF23.
  • the production of polyester by culturing yeast transformed with a gene expression cassette involved in polyester synthesis can be performed as follows.
  • the carbon source used for the culture any carbon source can be used as long as yeast can assimilate.
  • an inducer may be added as needed.
  • the inducer may be the primary carbon source.
  • a medium containing a nitrogen source, inorganic salts, and other organic nutrients can be used.
  • the culture temperature may be any temperature at which the bacteria can grow, but is preferably 20 ° C to 40 ° C.
  • the culture time is not particularly limited, but may be about 1 to 7 days. Thereafter, the polyester may be recovered from the obtained cultured cells or culture.
  • Examples of the carbon source include carbohydrates, fats and oils, and fatty acids.
  • Examples of the carbohydrate include glucose, sucrose, glycerin, and n-alkane.
  • Examples of fats and oils include rapeseed oil, coconut oil, palm oil, palm kernel oil and the like.
  • Fatty acids include, for example, saturated and unsaturated fatty acids such as hexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, lauric acid, oleic acid, palmitic acid, linoleic acid, linolenic acid, myristic acid, and fats such as esters and salts of these fatty acids. Acid derivatives.
  • the cultivation can be performed using oils and fats as a carbon source.
  • the improvement can be achieved by adding lipase to the medium. Further, by transforming the lipase gene, the ability to assimilate fats and oils can be imparted.
  • nitrogen source examples include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium phosphate, and other ammonium salts, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and the like.
  • inorganic salts include potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, and sodium chloride.
  • organic nutrients include amino acids, such as glycine, alanine, serine, threonine, proline, and vitamins, such as vitamin B1, vitamin B12, biotin, nicotinamide, pantothenic acid, and vitamin C. No.
  • inducer examples include enzymes involved in fatty acid metabolism (eg, Alkl, Alk2, Alk3, A1k4, Alk5) induced by fats and oils or their decomposed fatty acids. (Oh kuma M. et al., J. Biol. Chem., 273: 3948-3953 (1998)).
  • the following method can be used. After completion of the culture, the culture is centrifuged to separate and collect the cells, and the cells are washed with distilled water and methanol and then dried. The polyester is extracted from the dried cells using an organic solvent such as black-mouthed form. Cell components are removed by, for example, filtering the organic solvent solution containing the polyester, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate the polyester. The supernatant is removed by filtering or centrifuging the precipitated polyester, and the polyester is recovered by drying.
  • an organic solvent such as black-mouthed form.
  • Cell components are removed by, for example, filtering the organic solvent solution containing the polyester, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate the polyester.
  • the supernatant is removed by filtering or centrifuging the precipitated polyester, and the polyester is recovered by drying.
  • the obtained polyester can be analyzed by, for example, gas chromatography / nuclear magnetic resonance.
  • FIG. 1 shows a simplified diagram of pUC119-ADE1 and a method for preparing DNA for ADE1 disruption.
  • FIG. 2 shows a polyester polymerization enzyme derived from Aeromonas capris and an enol mono-CoA hydratase expression cassette pUTA-ORF23 (top of FIG. 2) used in the present invention, and a control cassette not containing both enzyme-expressed genes.
  • PUT A 1 Figure 2, bottom
  • FIG. 3 shows the results of the primary screening of the ADE1 gene broken strain by the PCR method. C16 and C17 were considered to be strains.
  • FIG. 4 shows confirmation of ADE1 gene disruption by the genomic Southern hybridization method. C 16 and C 17 were successfully blasted.
  • FIG. 5 shows a restriction map of the ADE1 gene disrupted Candida maltosa chromosome near the broken ADE1 gene, as revealed by Southern hybridization.
  • FIG. 6 shows a growth curve of the ADE1 gene disrupted strain AC16 in YPD medium.
  • FIG. 7 shows a growth curve of ADE1 gene-broken strain AC16 when palm oil, coconut oil, and tetradecane were used as carbon sources.
  • FIG. 8 shows a 40 OMHz proton NMR chart of the polyester P (3HB_co—3HH) produced in the AC16 (ORF23) strain. The assignment of each proton of the polyester is indicated by a number.
  • the reagents used for culturing the yeasts were those sold by Wako Pure Chemical unless otherwise noted.
  • LB medium 10 g, L tryptone, 5 gZL yeast extract, 5 gZL salt.
  • agar For LB plate, add agar to 16 gZL.
  • YPD medium 10 g / L yeast extract, 20 gZL polypeptone, 20 gZL glucose.
  • agar for YPD plate, add agar to 20 g / L.
  • adenine-containing YPD medium add 0.1 g / L of adenine.
  • YM medium 3 gZL yeast extract, 3 gZL manoleto extract, 5 gZL bactopeptone, 10 g / L gnorecose ⁇ SD medium: 6.7 g / L amino acid-free yeast nitrogen base (YNB), 20 g / L glucose. If the medium contains adenine, add 24 mg / L of adenine. In case of SD plate, add agar to 20 gZL.
  • M medium 0.5 g / L magnesium sulfate, 0.1 g ZL salt, 0.4 mg / L thiamine, 0.4 mg ZL pyridoxine, 0. AmgZL calcium pantothenate, 2 mg / L inositol, 0.002 mg ZL biotin, 0 .05 mg / L iron chloride, 0.07 mg ZL zinc sulfate, 0.01 mg / L boric acid, 0.01 mg copper sulfate, 0.01 mg potassium iodide, 87.5 mg ZL potassium dihydrogen phosphate, 12.5 mg / L potassium dihydrogen phosphate, 0.1 g / L calcium salt, 20 g ZL glucose.
  • M medium containing ammonium sulfate add 1 g / L ammonium sulfate.
  • M medium containing ammonium sulfate and adenine add IgZL of ammonium sulfate and 24 nig / L of adenine to the M medium.
  • Yeast liquid culture was performed using 5 Oml test tubes, 50 Om 1 Sakaguchi flasks or 2 L Sakaguchi flasks. Shaking culture was carried out at 300 rpm for a 5 Om1 test tube, 100 to 500 ml for a Sakaguchi flask; and 10 to 100 rpm for a L 10 rpm and 2 L Sakaguchi flask. The culture temperature was 30 ° C for both liquid culture and plate culture.
  • Restriction enzyme treatment is performed according to the reaction conditions recommended by the manufacturer, or according to the method described in Sambrook, etc., JVlo ecularcloning: AL aboratory Manual, S econd Edition N Cold Spring Spring Harbor Laboratory Press (1989). I went.
  • Both sides of the vector and ADE1 were recovered from agarose gel using EAS YTRAP (Takara Shuzo), and ADE1 both sides were ligated using TAKARA LigationKitVer2 (Takara Shuzo).
  • the reaction solution was added to 100 ⁇ l of E. coli competent cell D # 5 ⁇ (Takara Shuzo) at a solution ratio of 5% or less to transform the E. coli.
  • An appropriate amount of LB medium was added, and after shaking culture for 1 hour, the cells were spread on an LB plate and cultured at 37 ° C for 1 ⁇ .
  • Several emerging colonies were collected, cultured in an LB medium by a conventional method, and plasmid DNA was extracted from the cultured cells.
  • the plasmid was digested with the restriction enzyme Sa1I, and the appearance of a band of 1.03 kbp was confirmed by agarose gel electrophoresis.
  • the target disruption vector was obtained.
  • This transformed Escherichia coli was cultured in LB medium in large scale, and the molecular cloning: AL aboratory Manual, S Econd Edition 1.42—1.47, Old Spring Harbor Laboratory (1 989)
  • the vector was prepared in a large amount by ultracentrifugation using cesium chloride according to the procedure described above.
  • ADE1 DNA for blasting was cut out with Sa1I.
  • An aqueous solution having a total DNA content of 5 mg / ml was prepared, and the cut-out DNA was used for gene disruption without purification.
  • Example 2 Gene disruption experiment
  • Candida maltosa I AMI 2247 strain was inoculated in 1 Om1 of YM medium and precultured for 1 ⁇ . Next, 1 ml of the preculture was inoculated into 100 ml of a YM medium (500 ml Sakaguchi flask), cultured for 6 hours, and collected by centrifugation. The bacteria were suspended in 50 ⁇ m of 1M sorbitol, and 100 ⁇ l of DNA for crushing was added, followed by gentle stirring. Gene transfer was performed by the electric pulse method.
  • the gene transfer apparatus used was an EL ECTRO CELL MAN I PULATOR 600 manufactured by BTX.
  • the cuvette used was BM6200 manufactured by BIO MED I CAL CORPORATION CO. LTD.
  • the bacteria cultured in the YM medium were inoculated into 50 ml of an ammonium sulfate-free M medium (500 ml 1 Sakaguchi flask), and subcultured 1B. Subsequently, the cells were suspended in 100 ml of M medium containing ammonium sulfate and cultured at 30 ° C. for 6 hours. Was added 3 mg / m 1 Etanoru solution nystatin in the culture solution (manufactured by Shi lumps Co.) to a final concentration of 10 mu ⁇ Zm 1, and incubated for 1 hour. The nystatin-treated bacteria were washed twice with sterile water and resuspended in 50 ml of sterile water. This bacterial solution was spread on a YPD plate. After culturing the plate at 30 ° C for 2 days, 24 red holes were obtained. It was confirmed that none of these strains could grow on SD medium. (Example 4) Analysis by PCR method
  • the primary screening of shredded strains from many red colonies was performed using the PCR method.
  • the obtained red colonies were cultured in a YPD medium, and chromosomal DNA was extracted therefrom using Jyuntoru (Takara Shuzo), a chromosome extraction kit.
  • PCR was performed using primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) at both ends of the ADE1 gene.
  • PCR was performed using Perkin Elmer Am 1 itaqkit.
  • Gene amplification was performed using Bio-Tra's TRIO-Thermob1ock TM . 30 cycles were performed with 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 50 ° C, and 3 minutes at 70 ° C.
  • chromosomal DNAs of these three strains were extracted using a chromosome extraction kit Gentle-Kun (Takara Shuzo). Portionwise obtained chromosomal DNA 5 [mu] ⁇ , 3 kinds of methods, was cut with D ra I, D ra I + Nd e I, N de I, were subjected to electrophoresis in 0.8% Agarosugeru. Molarcular Cloning: From gel to Hybond N + filter (Amersham) according to 9.31—9.57, Co IdSpring Harbor Laboratory Press (1989). ⁇ ⁇ Transferred.
  • a probe for detection of Southern hybridization was obtained by enzymatically labeling the Hpa I Nde I fragment (264 bp), which is a sequence in the ADE1 gene, with a Genelma gel labeling 'detection kit (Amersham). (SEQ ID NO: 5). After hybridization, the plate was washed, and the DNA band was detected with the fluorescent coloring reagent of the same kit. Comparing the detection band with that of the wild-type strain I AMI 2247, the two strains (C16, C17) show a shortening of about 550 bp within the ADE1 gene (Fig. 4). Was confirmed. Fig.
  • FIG. 5 shows a restriction map of the ADE1 gene disrupted candy maltosa chromosome in the vicinity of the disrupted ADE1 gene, as revealed by Southern hybridization.
  • 555 bp indicates the deleted portion between MunI and HpaI.
  • the probe shows the partial DNA used for Southern hybridization. As shown in FIG. 4, when this probe was used, the lengths of the bases described below the chromosomal DNA were confirmed. In wild-type strain IAM12247, a value of about 550 bp was found.
  • Candida maltosa AC16 One strain of the ADE1 gene-broken strain obtained in this manner was named Candida maltosa AC16. (Example 6) Examination of growth ability of AD E1 gene-broken strain
  • the proliferative ability of the gene-broken AC16 strain in a complete medium was compared with that of the wild-type strains IAM12247 and CHA1.
  • the yeast was inoculated into 10 ml of YPD medium, and 1% cultured, and then inoculated into 1 Om1 of the same medium at 1%.
  • the OD 660 nm was measured at regular intervals.
  • the AC 16 strain and the wild strain reached the end of culture in 15 hours, but the AC 16 strain grew to only 83% of the wild strain.
  • CHA1 grew to the same concentration as the AC16 strain, but the AC16 strain was 6 hours earlier (Fig. 6). As described above, it was shown that the AC 16 strain had better growth ability in the complete medium than the CHA 1 strain.
  • CTG was not assigned to leucine codons because Candida maltosa is a yeast that translates CTG codons into serine instead of leucine.
  • a codon frequently used in Candida maltosa was preferentially selected.
  • the codon usage frequency was determined by referring to C andidama 1 tosap 524-527, written by Mauersberger S. in Nonconventionai Ye asstin Biotnolog y., Edited by Wolf K., Designed as SEQ ID NOS: 6 and 7, respectively.
  • the ORFs 2 and 3 were obtained, and DNA was completely synthesized according to the nucleotide sequence.
  • the promoter ALK1p (SEQ ID NO: 8) of the A1k1 gene of Candida manoletosa was placed 5 ′ upstream of each, 3 'We decided to connect the terminator ALK1t (SEQ ID NO: 9) of the Candida maltosa A1k1 gene downstream.
  • PCR was used to prepare restriction enzyme sites for linking the promoter and terminator to the structural gene. The conditions for syring ⁇ 1 were 94 ° ⁇ 1 minute, 55 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes as one cycle, and this was repeated 25 times to amplify the target gene fragment.
  • the polymerase used was EXT aq from Takara Shuzo Co., Ltd.
  • ALK1p having SalI at the 5 'end and NdeI at the 3' end was prepared using SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 by converting SEQ ID NO: 8 into type III.
  • SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 for the terminator part with SEQ ID NO: 9 as the type ALK1t having HindIII at the 5 ′ end and EcoRV at the 3 ′ end was prepared.
  • the vector linking ORF 2 and ORF 3 contains the self-replicating region (ARS) of Candida maltosa (GenBank D29758) and the URA3 gene (GenB) in pUC19.
  • ARS self-replicating region
  • pUTUl (M. Ohkum a, eta 1, J. Biol. Chem., vol. 273, 3948—39) 53 (1998)) and AUT1 gene of Candida maltosa, and pUT A1 (Fig. 2, bottom), a vector in which the chiral gene was changed from peracil to adenine.
  • pUTAl was constructed by removing the URA3 gene from pUTUl using XhoI and connecting the ADE1 gene fragment cut out using Sa1I to this. '
  • Bind ALK1 to the PvuI I and Nde I sites of pUCNT (described in WO 94/0361 3) and! > 11 ⁇ 1 ⁇ ⁇ 11 (1 1 1 1, S Kit site was linked to AL Kit; UAL 1 was constructed. Then; pUAL 1 site was N de I, P st I site Plasmid pUAL—ORF 2 was constructed by combining ORF 2 and constructed during the construction of pUAL 1 UCNT—ORF 3 was bound to the Nde I and Hind III sites of ALK 1 t, and ALK By combining 1p, UAL-ORF 3 was constructed.
  • the yeast was cultured in a YM medium until the OD 660 nm reached 0.8 to 1.0, and the cells were collected by centrifugation.
  • An expression vector (pUTA-ORF 23) was introduced. From gene preparation to gene transfer, gene transfer was carried out using FastTrack JM — Easy Transformation SMit manufactured by GENOTECH. The transfected cells were smeared on an M medium plate and cultured for 2 days.
  • pUTA—ORF 23 contains the ADE1 gene, Can be synthesized. Therefore, a bacterium that grows on an adenine-free medium is a transformant.
  • the bacteria grown from the adenine-free medium were collected and used as a transformant AC16 (ORF23) strain.
  • CHA1 (ORF 23) strain was obtained from CHA1 strain.
  • the AC16 strain and the CHA1 strain were similarly transformed, and the transformants AC16 (CT) and CHA1 (ORFCT) were transformed. Obtained.
  • the port-form solution was collected by filtration, concentrated to 1-2 ml with an evaporator, and 10 ml of hexane was added to the concentrated solution to precipitate hexane insolubles.
  • the AC16 (ORF23) strain produced a precipitate, whereas the CHA1 (ORF23) strain produced only traces of precipitate. No precipitate was obtained with the AC16 (CT) strain.
  • the hexane precipitate obtained from the AC16 (ORF23) strain was dried and then subjected to 40 OMz proton NMR analysis (JEOL, JNM-EX400).
  • Figure 8 shows the NMR chart. The correspondence between each peak and the polyester P (3H Bc Q-3HH) protein is indicated by a number.
  • the usefulness of a strain in which the yeast ADE1 gene has been disrupted has been shown.
  • Candida maltosa strain of the AD E1 gene it can be expected to be used as a host enzyme for gene recombination for gene expression and production of gene expression products. It is also possible to add different auxotrophy, which will lead to the development of yeasts that can be safely used as recombinants.

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Description

明細書
遺伝子破壌酵母 技術分野
本発明は、 酵母のある特定の染色体 DNAを相同的組換えの原理により破壌す る方法、 及び破壌株に関する。 また、 当該破壊株を用いた産業上有用な物質の生 産に関する。 背景技術
遺伝子組換え技術の発展により、 原核生物や真核生物を利用して産業上有用な 物質を大量に製造することが可能となった。 真核生物のうち酵母でもサッカロミ セス属は、 古くから酒類など発酵性食品の生産に利用されてきたほか、 キャンデ ィダ ·マルトーサ （C a n d i d a ma l t o s a) では、 かって微生物蛋白 質として食飼料に利用されたことがあり、 酵母自体の安全性も確かめられている。 酵母は増殖が速く、 一般に細菌よりも高い細胞密度で培養することができる。 さらに、 酵母は、 細菌と比べて菌体と培養液との分離が容易であることから、 生 産物の抽出精製工程をより簡単にすることも可能である。 こうした特性を生かし て、 酵母は、 組換え DNAによる有用生産物の製造宿主として利用されており、 その有用性が実証されている。
種々の酵母のうち、 キャンディダ属酵母はサッカロミセス属と異なり、 好気的 条件下での培養でエタノールを生成せず、 それによる増殖阻害も受けないことか ら、 高密度での連続培養による効率的な菌体製造及び物質生産が可能である。 さ らに、 無胞子酵母キャンディダ ·マルトーサは、 炭素鎖 C6〜C4Qの直鎖炭化水 素やパーム油、 ヤシ油等の油脂を唯一の炭素源として資化 ·生育できるという特 性を有している。 この特性は、 疎水性化学物質の変換による有用物質の生産や反 応の場として実用上有利であることから、 種々の化合物の生産への利用が期待さ れている （参考図書： Wo l f K. 編 No n c o n v e n t i o n a l Y e a s t s i n B i o t e c h n o l o g y. A Fia n db o o k、 S p r i n g e r—Ve r l a g、 B e r l i n (1 996) p 41 1— 580) 0 また、 その特性を生かしてキャンディダ ·マルトーサの遺伝子組換えによる有用 物質の生産への利用も期待されており、 そのための遺伝子発現系の開発が精力的 に行われて来た （特開昭 62— 74287号公報、 特開昭 62— 74288号公 報、 特開平 2— 72822号公報） 。 最近では、 キヤンディダ ·マルトーサは、 遺伝子組換えにより直鎖ジカルボン酸の生産に利用できることが公開されている (WO 99/040 14) 。
遺伝子組換えによる物質生産の宿主として酵母を用いる場合、 大腸菌等を用い る場合と同様、 適当な栄養要求性などの選択符号が付加された変異株を取得する 必要がある。 従来、 栄養要求性の付加には、 ニトロソグアジニンやェチルメタン スルホン酸などの変異源を用いたランダム変異誘起処理によって変異株を取得し ていた。 しカゝし、 この変異導入法では目的の栄養要求株が取得できるが、 変異が 目的の箇所以外にも入っている可能性が否定できない。 この事が、 酵母を宿主と して開発する場合の障害となり、 物質生産の場としての利用が、 大腸菌などと比 較して遅れている原因といえる。
例えば、 キャンディダ ·マルトーサ用の宿主ベクター系は早くから開発され、 また、 突然変異誘起処理により栄養要求性が付加された変異株が多数取得されて いるにもかかわらず、 組換え体を用いた新たな有用化学物質生産の工業化はされ ていない。 この理由に、 野生株と同等の増殖能や直鎖炭化水素鎖の資化性能を持 つ適当な栄養要求性を持ったキャンディダ ·マルトーサが取得されていないこと が挙げられる。 キャンディダ 'マルトーサを突然変異処理することによって開発 された CHA1株は、 ADE 1遺伝子と H I S 5遺伝子に変異があることが確認、 されているが （Kawa i S. 等、 Ag r i c. B i o l . C h e m. 、 55 ： 59 - 65 (199 1) ) 、 増殖能が野生株より劣る。 これは目的の箇所以外 の変異によるものと考えられている。
さらに、 ランダム変異により取得された変異株のもう一つの問題点に、 変異箇 所の自然復帰がある。 この場合、 培養中に復帰株が優先的に増殖するため、 組換 ぇ菌では物質生産性が落ちることがある。 また、 復帰株は、 自然界に流出した場 合、 生存 ·増殖する可能性が高く、 安全規準の面から問題がある。 従って、 ラン ダム変異導入により取得した菌株を物質の生産の場として利用するのは、 適当で ない。 そこで、 ある特定の栄養要求性遺伝子のみ破壌された破壌株の取得が望ま れていた。
先に述べたように、 キャンディダ 'マルトーサの変異株として、 ADE 1遺伝 子やヒスチジノール一ホスフェート一ァミノ トランスフェラーゼ （H I S 5遺伝 子） 、 ォロチジン一 5，_ホスフェートデカルボキシレース （URA3遺伝子） などの遺伝子変異株が多数取得されている （参考図書： Wo 1 f K. 編 No n c o n v e n t i o n a l Ye a s t s i n B i o t e c hn o l o g y. ： 41 1— 580) 。 し力、し、 ある特定の遺伝子のみを破壊することによ り栄養要求性を付加したキャンディダ■マルトーサは、 現在まで得られていない。 酵母の特性を利用し、 かつ遺伝子組換えによる産業上有用な物質生産系を構築す るためには、 そのような遺伝子破壌株が望まれていた。 また、 キャンディダ ·マ ルトーサに限らず、 そのような遺伝子破壌株が望まれている。
さらに、 キャンディダ .マルトーサにおいては、 直鎖炭化水素、 パーム油、 ャ シ油等の油脂を唯一の炭素源として資化 ·'生育するという特性を生かした産業上 有用な物質の生産が期待されていた。 発明の要約
本発明者等は、 上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 遺伝子組換えの 手法を駆使することにより、 酵母のホスホリポシルァミノイミダゾールーサクシ ノカルポキサミド合成酵素 （EC6. 3. 2. 6) をコードする DNA (ADE 1遺伝子） 断片を用いた染色体 DN Aとの相同的組換えの原理による、 ADE 1 遺伝子破壊株の作製を行い、 アデニン要求性酵母の取得に成功した。 そして、 当 該遺伝子破壊酵母の増殖能と遺伝子発現能力をキヤンディダ■マルトーサの突然 変異処理による AD E 1遺伝子変異株の C HA 1と比較し、 C HA 1株より両能 力が優れていることを示すことにより、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 ADE 1DNA断片との相同的組換えにより、 染色体 D NAの ADE 1遺伝子が破壌された酵母に関する。 また、 本発明は、 同種又は異 種の遺伝子を含む DN A配列で形質転換された AD E 1遺伝子破壌酵母の形質転 換体に関する。 さらに、 本発明は、 ADE 1遺伝子破壌酵母の形質転換体を培養して得られる 培養物から、 同種又は異種の遺伝子発現産物を採取する、 遺伝子発現産物の製造 方法に関する。 より詳しくは、 キャンディダ 'マルトーサの ADE 1遺伝子破壊 株に同種又は異種遺伝子発現系を導入した形質転換体を取得することにより、 産 業上有用な物質の生産に利用する方法を提供する。 ここで、 3—ヒドロキシプチ レート （以下、 3 HBと略記する） と 3—ヒドロキシへキサノエート （以下、 3 HHと略記する） との 2成分共重合ポリエステル （以下、 P (3HB— c o— 3 HH) と略記する） は、 生分解性ポリエステルとして有用であり、 また、 ポリエ ステル重合酵素とエノィルー C o Aヒドラターゼは、 当該ポリエステルを合成す る酵素である。 このポリエステル重合酵素遺伝子とエノィル _C o Aヒ ドラター ゼ遺伝子の発現系を、 本発明のキヤンディダ ·マルトーサの AD E 1遺伝子破壌 株に導入し、 これにより P (3HB- C G-3HH) を生産することに成功し、 当該 ADE 1遺伝子破壌キャンディダ■マルトーサの有用性を示すことができた。 すなわち、 本発明は、 ADE 1遺伝子破壊株の形質転換体を用いるポリエステル の製造方法であって、 上記形質転換体を培養して得られる培養物からポリエステ ルを採取するポリエステルの製造方法に関する。 発明の詳細な開示
以下、 本発明について詳細に説明する。
相同的組換えによる AD E 1遺伝子破壊を行う酵母には特に制限はなく、 菌株 の寄託機関 （例えば I FO、 ATCC等） に寄託されているァシクロコニディウ ム属 (Ac i c u l o c o n i d i um属） ， アンブロシォザイマ属 （Amb r o s i o z yraa属） ， ァノレスロアスカス属 (Ar t h r o a s c u s属) ， ァ /レキシォザイマ属 （Ar x i o z yma属） ， ァシュビア属 （A s h b y a属） ， バブジエビア属 （B a b j e v i a属） ， ベンシングトニア属 （B e n s i n g t o n i a属） ， ポトリオァスカス属 （B o t r y o a s c u s属） ， ボトリオ ザイマ属 （B o t r y o z yma属） ， ブレツタノマイセス属 （B r e t t a n omy c e s属） ， ビユレラ属 （B u 1 1 e r a属） ， ビユレロマイセス属 （B u 1 l e r omy c e s属） ， キャンディダ属 (C a n d i d a属） ， シテロマ イセス属 (C i t e r o my c e s属） ， クラビスポラ属 (C 1 a v i s p o r a属) ， タリプトコッカス属 （C r y p t o c o c c u s属） ， シス トフィロノ シディゥム属 （Cy s t o f i l o b a s i d i um属) , デバリオマイセス属 (D e b a r y omy c e sfe) , テツカラ J禺 (D e k k a r a属) , ティホダ スコプシス属 （D i p o d a s c o p s i s属） ， ディボダスカス属 （D i p o d a s c u s属) ， ェェエラ属 (E e n i e l l a属) ， ェンドマイコプセラ属 (En d omy c o p s e 1 l a,禺) , ェレマスカス属 (E r e m a s c u s属 ) ， ェレモセシウム属 （E r emo t h e c i um属） ， エリスロバシディゥム 属 (E r y t h r o b a s i d i um属） ， フエロマイセス属 (F e 1 1 o my c e s属） ， ブイロパシディゥム属 （F i 1 o b a s i d i u m属） ， ガラクト マイセス属 （G a l a c t omy c e s属） ， ゲォトリクム属 (G e o t r i c h u m属) ， ガイラーモンデラ属 (G u i 1 1 i e rmo n d e l l a属) ， ノヽ ンセ -ァスポラ属 (Ha n s e n i a s p o r a属) ， ハンセヌラ属 (Ha n s e n u 1 a属） ， ノヽセガワエア属 (Ha s e g a w a e a属) ， ホノレターマン二 ァ属 (Ho l t e rma n n i a属) ， ホノレモアスカス属 （Ho rmo a s c u s属） ， ハイフォピキア属 （Hy p h o p i c h i a属） ， ィサットヘンキア属 ( I s s a t c h e n k i a ) , クロエケラ属 (K l o e c k e r a属) ， ク 口エケラスポラ属 (K l o e c k e r a s p o r aS) ， クノレイベロマイセス属 (K l u y v e r omy c e s属） ， コンドア属 （Ko n d o a属） ， クライシ ァ属 （Ku r a i s h i a属） ， タノレツマノマイセス属 （Ku r t z ma n om y c e s属) , ロイコスポリアイゥム属 (L e u c o s p o r i d i u m属) , リポマイセス属 （L i p omy c e s属） ， ロデロマイセス属 (L o d d e r o my c e s属) ， マラセジァ属 (Ma l a s s e z i a属） ， メ トシュ-コウイ ァ属 （Me t s c h n i k ow i a属） ， ムラキア属 （M r a k i a属） , マイ クソザイマ属 （My X o z yma属） ， ナドソニァ属 (N a d s o n i a属） ， ナカザヮエア属 (Na k a z a wa e a^) ， ネマトスポラ属 (N e m a t o s p o r a属） ， ォガタエァ属 （Og a t a e a属） ， オースポリディゥム属 （O o s p o r i d i u m属) ， ノヽ0チソレン属 (P a c h y s o l e n属) ， ファチ コスポラ属 （P h a c h y t i c h o s p o r a属） ， ファフィァ属 （P h a f f i a属） ， ピキァ属 （P i c h i a属） ， 口ドスポリディゥム属 （Rh o d o s p o r i d i um属） ， 口 ドトノレラ属 (Rh o d o t o r u l a属) ， サッカ ロマイセス属 (S a c c h a r o my c e s属） , サッカロマイコーデス属 (S a c c h a r omy c o d e s ) ， サッカロマイコプシス属 (S a c c h a r omy c o p s i s属） ， サイトエラ属 (S a i t o e l l a属） , サカグチア 属 （S a k a g u c h i a属） ， サターノスポラ属 (S a t u r n o s p o r a 属) , シゾブラストスポリオン属 （S c h i z o b l a s t o s p o r i o n属 ) , シゾサッカロマイセス属 (S c h i z o s a c c h a r omy c e s ) ， シュヮニォマイセス属 (S c hwa nn i omy c e s属) , スポリディオボラ ス属 （S p o r i d i o b o l u s属） ， スポロポロマイセス属 (S p o r o b o l omy c e s属) , スホロノヽ テ ^ァ (S p o r o p a c hy d e rm i a属) .， ステファノァスカス属 (S t e p h a n o a s c u s属) ， ステリグマ トマイセス属 （S t e r i gma t omy c e s属） ， ステリグマトスポリディ ゥム属 (S t e r i gma t o s p o r i d i um属) ， シンビオタフリナ属 ( Symb i o t a p h r i n a ) ， シンポディォマィセス属 (S y mp o d i o my c e s属) ， シンポアイォマィコプシス属 ( S y m p o d i o m y c o s i s属） ， トノレラスポラ属 （To r u l a s p o r a属） ， トリコスポリエラ 属 (Tr i c h o s p o r i e l l a属) ， トリコスポロン属 (T r i c h o s p o r o n属） ， トリゴノプシス属 （T r i g o n o p s i s属） ， ツチヤエァ 属 (T s u c h i y a e a属) ， ゥデニォマイセス属 (Ud e n i omy c e s 属） ， ワルトマイセス属 （Wa l t omy c e s属） ， ウイカーハミァ属 （W i c k e r h am i a^; , ウイカーノヽミエラ (W i c k e r h am i e l l a 属） ， ウイリオプシス属 （W i 1 1 i o p s i s属） ， ヤマダザイマ属 （Yam a d a z ymaJS) , ャロウィァ属 （Y a r r o w i a属） ' ザィゴァスカス属 (Zy g o a s c u s属) ， ザィゴサッカロマイセス属 (Zy g o s a c c h a r omy c e s属) ， ザィゴウイリォプシス属 (Z y g o w i 1 1 i o p s i s 属） 又はザィゴザイマ属 （Zy g o z yma属） などの酵母を使用することがで きる。
これら酵母の中でも、 高密度での連続培養による効率的な菌体製造及び物質生 産が可能である点で、 キャンディダ属、 ャロウィァ属、 クルイべロマイセス属、 ハンセニァスポラ属、 ハンセヌラ属などが好ましく、 特に、 宿主一ベクター系の 研究が進んでおり、 簡便に系が利用できること、 また、 直鎖炭化水素や油脂等の 資化能力が高い点で、 キヤンディダ属が好ましい。
また、 本発明の ADE 1破壌株作製及びその利用に関しては、 1例として、 キ ヤンディダ■マルトーサを用いた。
本発明に用いるキャンディダ'マルトーサの野生株 I AMI 2247は、 東京 大学応用微生物学研究所、 あるいは AT CC 28140として Ame r i c a n Ty e Cu l t u r e Co l l e c t i o n (M a n a s s a s V A、 USA) から入手できる。 また、 キャンディダ ·マルトーサのアデニン及び ヒスチジン栄養要求マーカー変異株である CHA 1株は ATCC 90625とし て上記の機関から入手できる。
本発明で得られた ADE 1遺伝子破壊株キャンディダ■マルトーサ AC 16株 は、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人産業技 術総合研究所特許生物寄託センターに、 平成 12年 1 1月 1 5日付で FERM B P- 7366の受託番号で、 ブダぺスト条約に基づいて国際寄託されている。 相同的組換えとは、 DNAの塩基配列が類似の配列又は同じ配列 （相同配列） を持つ部分で起こる組換えを示す。
遺伝子破壌とは、 ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、 その遺 伝子の塩基配列に変異を入れる、 別の DNAを挿入する、 あるいは、 遺伝子のあ る部分を欠失させることを示している。 遺伝子破壌の結果、 その遺伝子が mRN Aへ転写できなくなり、 構造遺伝子が翻訳されない、 あるいは、 転写された mR NAが不完全なため、 翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生 じ、 本来の機能の発揮が不可能になる。
ADE 1遺伝子とは、 プロモーター領域を含む 5'非翻訳領域、 ホスホリポシ ルァミノイミダゾールーサクシノカルボキサミド合成酵素 （EC 6. 3. 2. 6 ) をコードする領域、 並びに、 ターミネータ一領域を含む 3'非翻訳領域からな る遺伝子断片を示す。 キャンディダ■マルトーサの AD E 1遺伝子の塩基配列は Ge nB a n k ： DO 0855に公開されており、 配列番号 1に DNA配列を示 した。
ADE 1DNA断片とは、 微生物細胞内で染色体上の AD E 1遺伝子と相同的 組換えを起こすことができ、 それによつて ADE 1遺伝子を破壊できる DN Aを 示している。
ADE 1酵素とは、 ホスホリボシルァミノイミダゾール一サクシノカルボキサ ミド合成酵素 （EC 6. 3. 2. 6) を示す。
同種遺伝子とは、 宿主酵母の染色体上に存在している遺伝子またはその一部の
DN Aを意味する。 異種遺伝子とは、 宿主酵母の染色体上に本来存在しない遺伝 子またはその一部の DN Aを意味する。
遺伝子発現カセットとは、 転写プロモーター DNA配列、 発現を目的とする遺 伝子をコードする DNA、 及ぴ転写を終結するターミネータ一を含む DNAから 構成される環状プラスミド状のもので、 染色体外で機能するものと、 染色体 DN
Aに組み込むタイプがある。
遺伝子発現産物とは、 遺伝子によって発現される物質 （遺伝子発現物） が所望 の蛋白質や酵素の場合、 それ自体が遺伝子発現産物である。 また、 遺伝子発現物 が各種酵素類や補酵素類であり、 該酵素類が宿主酵母内で触媒活性を発現するこ とにより生産される、 遺伝子発現物とは直接異なる物質も遺伝子発現産物である。
PHAとは、 ポリヒ ドロキシァノレカノエートの略であり、 3—ヒ ドロキシァノレ カン酸の共重合した、 生分解性ポリエステルを示している。
OR F 2とは、 ァエロモナス 'キヤビエ由来のポリエステル重合酵素をコード する遺伝子 （特開平 10— 108682号公報） を、 キャンディダ ·マルトーサ で発現するように設計した DN Aを示している。 配列番号 6にその塩基配列を示 した。
ORF 3とは、 ァエロモナス ·キヤビエ由来のエノィル一 C o Aヒ ドラターゼ をコードする遺伝子 （特開平 10— 108682号公報） を、 キャンデイダ -マ ルトーサで発現するように設計した DNAを示している。 配列番号 7にその塩基 配列を示した。
以下に、 ADE 1遺伝子破壌株の作製方法、 該破壌株によるポリエステルの製 造方法の一例を説明する。 ( 1 ) ADE 1遺伝子破壌株の作製方法
遺伝子破壌株作製に関しては、 ADE 1酵素が発現しない破壌株が得られれば いかなる方法も用いることが可能である。 遺伝子破壌の方法は種々の方法が報告 されているが、 ある特定の遺伝子のみ破壌できるという点で、 相同的組換えによ る遺伝子破壌が好ましい （N i c k o 1 o f f J . A. 編 Me t h o d s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y、 47 : 291— 302 (1 995 ) 、 Huma n a P r e s s I n c. , To t owa、 NJ) 。 相同的組換 えの中でも、 自然復帰しない破壌株が取得でき、 その結果、 組換え体を取り扱う 上で安全性が高い菌株が得られるという点で、 遺伝子を菌体内に入れる操作 1段 階のみで行うことができる簡便な 1段階破壌法 （o n e— s t e p g e n e d i s r u p t i o n) 力、好まし ヽ。
1段階破壌法に使用する ADE 1DNA断片は、 通常、 遺伝子内部の部分 DN Aを除去し、 残った両端部分を再度連結した形の DNA断片が用いられる。 この DNA断片を作製するためには、 例えば、 PCR法 （ポリメラーゼ連鎖反応法） や、 ベクターからの制限酵素による切り出しと再連結によって調製できる。 AD E 1 DN A断片の両端の相同性領域長は、 10塩基以上あればよく、 好ましくは 200塩基以上、 より好ましくは 300塩基以上である。 また、 両端それぞれの 相同性は、 好ましくは 90 %以上、 より好ましくは 95 %以上である。
除去する部分 DN Aは、 除去により AD E 1遺伝子が酵素活性を発揮できなく なる部分であり、 且つ自然復帰により ADE 1酵素活性が回復しない長さの DN Aである。 このような部分 DNAの鎖長は特に限定しないが、 好ましくは 50塩 基以上、 より好ましくは 100塩基以上である。
本発明では、 555 b pの ADE 1酵素をコードする DNA断片を除去し、 5 '側 630 b pの DNA断片と 3，側 400 b pの D N A断片を連結した破壌用 D NAを用いた （図 1) 。 除去した部分は ADE 1酵素蛋白質の約 80%にあたる。 また、 5，側及び 3'側の DN A断片と元の ADE 1遺伝子との相同性は、 両 DN Aとも 100%である。 本発明で用いた破壊用 DN A断片の塩基配列を配列番号 2に示した。
本宪明で用いた DNA断片の調製は、 pUC 1 1 9— ADE 1 (K a w a i S. 等、 Ag r i c. B i o l . C h e m. 、 55 ： 59- 65 (199 1) ) を用いて行った。 すなわち、 プラスミド pUC l 1 9— AD E 1で形質転換され た大腸菌を培養し、 それよりプラスミドを調製する。 このプラスミドから適当な 制限酵素で ADE 1遺伝子の構造遺伝子 （ADE 1酵素蛋白質をコードする遺伝 子） の 1部分を除去するように切断し、 ベクター側を回収し、 再度リガーゼを用 いて連結する。 このようにして破壌用 DNAを含むベクターができる。
破壌用 DNAを含むベクターは適当な大腸菌、 例えば JM109や DH5aに 導入し、 該大腸菌を大量培養し、 それより塩化セシウム超遠心法により高純度の プラスミドを大量調製する （S amb r o o k等編、 Mo l e c u l a r c 1 o n l n g ： A l a b o r a t o r y Ma n u a l、 S e c o n d E d i t i o n 1. 42—1. 47、 C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s (1 989) ) 。 このベクターをこのまま直接に 遺伝子破壌に用いることができるが、 1段階破壌法を行うため、 精製したベクタ 一より AD E 1領域を含む相同性のある部分を適当な制限酵素で切り出し、 それ を破壌用 DN Aとして利用するのが望ましい。 本発明では、 制限酵素 S a 1 Iで 切断し、 DNA断片を精製することなく菌体内に導入することにより、 相同的糸且 換えによって ADE 1遺伝子を破壌することができた。
キャンディダ ·マルトーサの形質転換法には、 プロトプラスト法、 酢酸リチウ ム法 （T a k a g i M. 等、 J B a c t e r i o l、 167 : 551— 5 ( 1 986) ) 、 電気パルス法 （Ka s u s k e A. 等 Ye a s t 8 : 69 1 -697 (1 992) ) が知られているが、 本発明では電気パルス法を用いて 行った。 電気パルス発生には市販の機器が利用できる。 本発明では、 BTX社 （ S a n D i e g o、 CA U S A) 製の E L E C T R O CELL MAN I PULATOR 600を用いた。 キュベットは B I O MED I CAL CO R PORAT I ON CO. LTD (To ky o J a p a n) 製の BM620 0 (2mm g a b l u e c a ) を用いた。 電気パルス後、 適当な培地 で培養し、 得られた培養菌体より目的の ADE 1破壌株をスクリーニングする。 形質転換体を取得する種々の方法が開発されているが、 そのうちナイスタチン 濃縮 （Sn ow R. Na t u r e 21 1 : 206— 207 (1966) ) と 呼ばれる方法を利用することができる。 本法は、 酵母からランダム変異により得 られる変異株を効率的に選択するために開発された方法であるが、 遺伝子破壌株 にも応用できると考えられる。 例えば、 本発明の好ましい態様によれば、 電気パ ルス後、 培養した菌体を最少培地等に植菌し培養する。 菌を洗浄し、 窒素源不含 最少培地で培養後、 窒素源含有最少培地で短時間培養する。 この培養液に直接ナ イスタチンを添加し、 30°〇で1時間、 好気的に培養することにより、 野生株を 優先的に殺傷できる。 この菌液を適当な寒天培地プレートに塗抹し、 30°Cで 2 曰間程度培養すると、 赤色コロニーが得られる。
得られた赤色コロニーから、 PCR法ゃゲノミックサザンハイブリダィゼーシ ョン法 (S amb r o o k等編、 Mo l e c u l a r c 1 o n i n g ： A L a b o r a t o r y Ma nu a l、 S e c o n d E d i t i o n 9. 31 一 9. 57、 C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s ( 1 98 9) ) により容易に遺伝子破壌を確認することができる。
PCR法では、 ADE 1遺伝子の両端をプライマーに用いると、 ァガロースゲ ル電気泳動において、 野生株では正常な大きさの DNAバンドが検出されるが、 破壊株では欠失させた配列分だけ短いバンドが検出される。 本発明では、 約 l k b pの DNAバンドが検出された。 しかし、 遺伝子破壌などの染色体 DNAとの 置換や組み込みの場合、 遺伝子が目的以外の箇所、 例えば相同性の高い未知の部 分に挿入される可能性を想定すべきであり、 その場合、 PCR法では確認できな い場合がある。 PCR法は得られた破壌株が多い場合に、 候補株を選択する手段 として用いるのが望ましい。
破壌株等を確認するためには、 ゲノミックサザン解析が必須である。 本法を行 うことにより、 容易にかつ確かに目的の箇所だけに遺伝子の組換えが生じたこと を証明することができる。 破壌株とコントロールとしての野生株の染色体 DN A を調製し、 適当な制限酵素で切断後、 ァガロースゲル電気泳動を行う。 本発明で は、 2種類の制限酵素を用い 3種類の切断方法で確認を試みた。 ァガロースゲル から DN Aをナイロン膜上に移しとり、 破壌株のゲノム上に残っていると考えら れる ADE 1遺伝子の制限酵素 Hp a I N d e I切断 DNA断片 264 b pを、 G e n e I ma g eラベリング■検出キット （アマシャム社製） を用いて、 添付 の説明書にしたがって酵素標識し、 サザンハイブリダィゼーシヨン検出用プロ一 ブ （配列番号 5) とした。 ハイブリダィズ後、 洗浄し、 添付の説明書に従って蛍 光発色試薬で DNAバンドを検出した。 検出バンドを野生株 （IAM1 2247
) のものと比較した。 その結果、 2株が 3種類の切断方法で、 ADE 1遺伝子内 部の約 550 b p分が短くなっていることが確認できた。
得られた ADE 1遺伝子破壌株は、 ADE 1酵素を合成できないため、 ATP の前駆体であるアデニンを合成できない。 従って、 アデニンを含まない培地や、 アデニンの無い環境下では生存はできない。
得られた ADE 1遺伝子破壌株の 1株をキャンディダ■マルトーサ AC 1 6と 命名した。
(2) ADE 1遺伝子破壌株による異種遺伝子発現：ポリエステルの生産方法 本発明で得た A D E 1破壌株を用いて同種遺伝子あるいは異種遺伝子を発現さ せることができる。 酵母は、 大腸菌ではできない糖鎖付加蛋白質を培地中に分泌 することができるため、 ADE 1破壊株を用いてこのような蛋白質の生産が可能 である。
導入できる同種遺伝子は特に限定しないが、 例えば、 産業上有用な生産物の製 造例として、 WO 99/040 14に公開されているような、 キャンディダ -マ ルトーサに同株由来の P 450酵素遺伝子を導入することによる、 ジカルボン酸 の製造が挙げられる。 また、 異種遺伝子も特に限定はしないが、 例えば、 リパー ゼ遺伝子、 アミラーゼ遺伝子等の導入による、 当該蛋白質の製造が挙げられる。 本発明に用いたキャンディダ ·マルトーサ等の一部のキャンディダ属酵母にお いては、 mRNAから蛋白質が翻訳される段階で、 一部コドンの翻訳のされ方が 他の生物と異なっていることが知られている。 キャンディダ ·マルトーサでは口 イシンコドンの CTGがセリンに翻訳されるため （Oh ama T. 等、 Nu c l e i c Ac i d R e s. 、 21 : 40394045 (1 993) ) 、 大腸 菌由来 1 a c Z遺伝子が、 活性を持つ β ガラクトシダーゼに翻訳されない （S u g i y a m a H. 等、 Ye a s t 1 1 : 43— 52 (1 995) ) 。 この ように異種遺伝子を発現させる場合には、 それがキャンディダ ·マルトーサ内で 機能を持つ蛋白質に翻訳されるという保証はない。 従って、 キャンディダ .マル トーサを宿主として異種遺伝子を発現させる場合、 原則としてロイシンコドンの み変換すれば良いが、 さらに効率よく発現させるため他のアミノ酸コドンをキヤ ンデイダ'マルトーサのものに合わせても良い。 コドンの変換は、 例えば Wo 1 f K. 編 No n c o n v e n t i o n a 1 Ye a s t s i n B i o t e c h n o 1 o g y . の中の M a u e r s b e r g e r S . 等著、 C a n d i d a ma l t o s a p 524- 527を参考にして fiえば良い。
ポリエステル合成に関与する遺伝子としては、 下記一般式のポリエステルの合 成に関与する遺伝子であればどのような遺伝子でも良い。 下記一般式はポリエス テル P (3HB— c o— 3HH) の構造式を示していて、 X及び Yは整数であり、 それぞれ 3 H Bと 3 HHの重合個数を示す。
Figure imgf000015_0001
例えば、 特開平 10— 108682号公報に記載されているポリエステル重合 酵素遺伝子断片を用いることができる。 また、 本ポリエステル重合酵素遺伝子と 共にポリエステル合成に関与する遺伝子を導入しても良い。 これらの遺伝子とし ては、 たとえば、 β酸化経路の中間体のエノィル一 C o Aを （R) —3—ヒドロ キシァシルー C o Aに変換する （R) 体特異的エノィル _C o Aヒドラターゼ （ F k u i T. 等、 F EMS Mi c r o b i o l o g y Le t t e r s、 1 70 : 69— 75 (1 999) 、 特開平 10— 108682号公報） や、 ァセ チル一 C o Aを二量化して 3—ヒドロキシブチリル _C o Aを合成する β ケト チオラーゼ · NADH依存性ヒドラターゼ遺伝子 （P e o p l e s OP等、 J. B i o l . C h e m. 264 ： 15298-1 5303 (1 989) ) などが挙 げられる。 これらの遺伝子は実質的な酵素活性を有する限り、 当該遺伝子の塩基 配列に欠失、 置換、 揷入等の変異が生じていても良いものとする。 伹し、 異種遺 伝子の場合、 上記したようにキャンディダ ·マルトーサ内で機能を持つ蛋白質に 翻訳されるという保証はないため、 アミノ酸コドンを変更する必要がある。
本研究ではァエロモナス ·キヤビエ由来のポリエステル重合酵素とエノィル一 C o Aヒドラターゼ （特開平 10— 108682号公報、 F u k u i T. 等、 F EMS M i c r o b i o l o g y L e t t e r s, 170 : 69-75 (
1999) を用いた。 しかし、 本酵素遺伝子が正常に翻訳されず、 酵素活性を示 さない可能性が高いため、 両酵素のアミノ酸コドンをキャンディダ■マルトーサ の最適コドンに合わせ DNAを全合成した。 ァエロモナス ·キヤビエ由来のポリ エステル重合酵素とエノィルー C o Aヒドラターゼの全合成 DNA配列を、 それ ぞれ配列表の配列番号 6と 7に示した。 ただし、 これらの配列番号に示した塩基 配列は、 これに限定されるものではなく、 当該酵素のアミノ酸配列がキャンディ ダ ·マルトーサ内で発現される塩基配列であれば、 いかなる塩基配列でも用いる ことができる。
酵母における遺伝子発現カセットは、 当該遺伝子の 5'側上流にプロモーター、 5，上流域活性化配列 （UAS) 等の DN A配列を連結し、 当該遺伝子の 3 '下流 にポリ A付加シグナル、 ターミネータ一等の DN A配列を連結して作製する。 こ れらの DNA配列は当該酵母で機能する配列であればどのような配列でも利用で きる。
プロモーターには恒常的に発現を行うものや誘導的に発現を行うものがある。 いずれのプロモーターを用いても良いが、 宿主と同じキャンディダ■マルトーサ 由来であることが望ましい。 一例として、 キャンディダ 'マルトーサの ALK1 プロモーター及び ALK 1ターミネータ一 （G e n B a n k D 00481 ) ( T a k a g i M. 等、 Ag r i c. B i o l . Ch em. 、 5 : 2217— 2
226 (1 98 9) ) を利用することができる。
本発明の形質転換に用いられる遺伝子発現カセットは一例として、 次のように 構築することができる。 構築に用いるベクターは、 大腸菌において自律増殖する プラスミドであればどのようなベクターでもよく、 更に酵母において自律増殖可 能な領域を合わせ持つていても良い。 酵母において自律増殖できるベタターは、 菌体内に保持されることが知られている。 また、 遺伝子発現カセットを染色体に 組み込むこともできる。 一例としてキャンディダ■マルトーサにおいて自律増殖 可能な pUTU 1を用いることができる （M. Oh k uma, e t a 1 , J. B i o l . Ch em. ， v o l . 273, 3948— 3953 (1998) ) 。 本発明では、 ORF 2及び ORF 3のそれぞれ 5'上流にキャンディダ■マル トーサの A 1 k 1遺伝子のプロモーター ALK 1 p (配列番号 8) を、 3 '下流 にターミネータ一 ALK 1 t (配列番号 9) を連結した。
プロモーターおよびターミネータ一と構造遺伝子を連結するための制限酵素部 位を調製するためには、 PCR法が利用できる。 PCRに用いるプライマー配列 は配列番号 10から配列番号 1 3に示す。 P C Rの条件は目的遺伝子断片が増幅 できればどのような条件を用いても良い。
プロモーター部分は配列番号 8を铸型にして配列番号 10と配列番号 1 1を用 いて、 5，末端が S a l I、 3'末端が Nd e Iの ALK1 pを作製することがで きる。 ターミネータ一部分は配列番号 9を鎵型にして配列番号 12と配列番号 1 3を用いて、 5'末端が H i n d I I I、 3 '末端が E c o R Vの A L K 1 tを作 製することができる。 ベクターには、 pUTUlとキャンディダ 'マルトーサの Ad e 1遺伝子を用いて、 マーカー遺伝子をゥラシルからアデニンに変更したベ クタ一 pUT A 1を使用することができる。 pUCNT (WO 94/03613 に記載） の P v u I I、 Nd e Iサイトに ALK1 pを結合し、 また pUCNT の H i n d I I I、 S s p Iサイトに A LKl tを結合して p UA L 1を構築す ることができる。 次に！） UAL 1の Nd e I、 P s t Iサイトに ORF 2を結合 し、 プラスミ ド； UAL— ORF 2を構築することができる。 また、 pUAL l を構築する途中に構築する pUCNT_ALK 1 tの Nd e I、 H i n d I I I サイトに ORF 3を結合し、 さらに ALK1 pを結合することで、 pUAL— O RF 3を構築することができる。
次に、 プラスミ ド; UAL— ORF 2から E c oT 22 Iを用いて、 ORF 2 とともに上流にあるプロモーター、 下流にあるターミネータ一を一緒に切り出し、 pUTAlの P s t Iサイトに結合し、 ： pUT A— OR F 2を構築することがで きる。 さらに、 ： UAL— ORF 3から S a 1 Iを用いて ORF 3とともに上流 にあるプロモーター、 下流にあるターミネータ一を一緒に切り出し、 pUTA— ORF 2の S a 1 Iサイトに結合したプラスミド pUTA_ORF 23 (図 2上 ) を構築することができる。 以上の方法により、 キャンディダ ·マルトーサにお いてポリエステルを製造するための遺伝子発現力セットを構築することができる。 本発明の菌株に、 前述の形質転換法を用いて遺伝子発現カセットを形質転換し、 pUTA— ORF 23を有するキャンディダ 'マルトーサ AC 16 (ORF 23 ) 株を作製することができる。
ポリエステル合成に関与する遺伝子発現カセットで形質転換された酵母を培養 することによるポリエステルの製造は、 次のようにして行うことができる。 培養 に用いる炭素源としては、 酵母が資化できるものであればどのようなものでも良 い。 また、 プロモーターの発現が誘導型である場合には、 適時誘導物質を添加す れば良い。 誘導物質が主要炭素源である場合もある。 炭素源以外の栄養源として は、 窒素源、 無機塩類、 その他の有機栄養源を含む培地が使用できる。 培養温度 はその菌の生育可能な温度であれば良いが、 20°Cから 40°Cが好ましい。 培養 時間には特に制限はないが、 1〜7日程度で良い。 その後、 得られた培養菌体又 は培養物からポリエステルを回収すれば良い。
炭素源としては、 炭水化物、 油脂類、 脂肪酸類などが挙げられる。 炭水化物と しては、 例えばグルコース、 シユークロース、 グリセリン、 n—アルカンなどが 挙げられる。 油脂としては、 例えばナタネ油、 ヤシ油、 パーム油、 パーム核油な どが挙げられる。 脂肪酸としては、 例えばへキサン酸、 オクタン酸、 デカン酸、 ラウリン酸、 ォレイン酸、 パルミチン酸、 リノール酸、 リノレン酸、 ミリスチン 酸などの飽和 ·不飽和脂肪酸、 あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩などの脂肪 酸誘導体が挙げられる。 一例としてキャンディダ ·マルトーサの培養において、 炭素源として油脂を用いて培養することもできる。 また、 資化ができないかまた は効率よく資化できない油脂の場合、 培地中にリパーゼを添加することによって 改善することもできる。 さらに、 リパーゼ遺伝子を形質転換することにより、 油 脂資化能を付与することもできる。
窒素源としては、 例えばアンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等のアンモ-ゥム塩の他、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス などが挙げられる。 無機塩類としては、 例えばリン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸 マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウムなどが挙げられる。
その他の有機栄養源としては、 アミノ酸類、 例えばグリシン、 ァラニン、 セリ ン、 スレオニン、 プロリンなどや、 ビタミン類、 例えばビタミン B 1、 ビタミン B 12、 ピオチン、 ニコチン酸アミド、 パントテン酸、 ビタミン Cなどが挙げら れる。
誘導物質としては、 例えば、 油脂類又はその分解した脂肪酸類などにより誘導 される、 脂肪酸の代謝に関係した酵素 （A l k l、 A l k 2、 A l k 3、 A 1 k 4、 A l k 5など） （Oh k uma M. 等、 J. B i o l . Ch em. 、 27 3 ： 3 948-3953 (1 9 98) ) が挙げられる。
ポリエステルの菌体からの回収は多くの方法が報告されている。 本発明におい ては、 例えば、 次のような方法が使用できる。 培養終了後、 培養液を遠心分離器 などにかけて菌体を分離 ·回収し、 その菌体を蒸留水おょぴメタノール等により 洗浄した後、 乾燥させる。 この乾燥菌体からクロ口ホルム等の有機溶剤を用いて ポリエステルを抽出する。 このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液を濾過するこ と等によつて菌体成分を除去し、 そのろ液にメタノールやへキサン等の貧溶媒を 加えてポリエステルを沈殿させる。 沈殿したポリエステルを濾過や遠心分離する ことによって上澄み液を除去し、 これを乾燥させてポリエステルを回収すること ができる。
得られたポリエステルの分析は、 例えば、 ガスクロマトグラフ法ゃ核磁気共鳴 法などにより行うことができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 pUC 1 19 -ADE 1の簡単な図及び AD E 1破壌用 DNAの作製 法を示してある。
図 2は、 本発明で用いた、 ァエロモナス 'キヤビエ由来のポリエステル重合酵 素とエノィル一 C o Aヒドラターゼ発現カセット pUTA— ORF 23 (図 2上 ) 、 及び、 両酵素発現遺伝子を含まないコントロールカセッ ト PUT A 1 (図 2 下） を示してある。 図 3は、 PCR法による、 AD E 1遺伝子破壌株の 1次スクリーエングの結果 を示してある。 C 1 6及び C 1 7が破壌株と考えられた。
図 4は、 ゲノミックサザンハイブリダイ.ゼーション法による AD E 1遺伝子破 壊の確認を示してある。 C 1 6及び C 1 7が正常に破壌されていた。
図 5は、 サザンハイプリダイゼーシヨンにより明らかになった、 ADE 1遺伝 子破壊キャンディダ■マルトーサ染色体の破壌された AD E 1遺伝子付近の制限 酵素地図を示してある。
図 6は、 ADE 1遺伝子破壌株 AC 16の YPD培地での増殖曲線を示してあ る。
図 7は、 ADE 1遺伝子破壌株 AC 16のパーム油、 ヤシ油、 及びテトラデカ ンを炭素源としたときの増殖曲線を示してある。
図 8は、 AC 16 (ORF 23) 株で生産したポリエステル P (3HB_ c o — 3HH) の 40 OMH zプロトン NMRのチャートを示した。 また、 ポリエス テルの各プロトンの帰属を番号で示してある。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 ただし、 本発明は、 こ れら実施例にその技術範囲を限定するものではない。
酵母菌の培養用に使用した試薬は、 特に断らない限り和光純薬から販売されて いるものを用いた。
(培地組成）
LB培地： 10 g,Lトリプトン、 5 gZL酵母エキス、 5 gZL食塩。 LBプ レートの場合は、 寒天を 1 6 gZLになるように加える。
YPD培地： 10 g/ L酵母エキス、 20gZLポリペプトン、 20 gZLグル コース。 YPDプレートの場合は、 寒天を 20 g/Lになるように加える。 アデ ニン含有 YPD培地の場合は、 アデニンを 0. 1 g/L加える。
YM培地： 3 gZL酵母エキス、 3 gZLマノレトエキス、 5gZLバクトぺプト ン、 10 g/Lグノレコース π SD培地： 6. 7 g/Lアミノ酸不含イーストニトロジェンベース （YNB) 、 20 g/Lグルコース。 アデニン含有培地の場合はアデニンを 24m g/L添加 する。 SDプレートの場合は寒天を 20 gZLになるように加える。
M培地： 0. 5 g/L硫酸マグネシウム、 0. l gZL食塩、 0. 4mg/Lチ ァミン、 0. 4mgZLピリ ドキシン、 0. AmgZLパントテン酸カルシウム、 2mg/Lイノシトール、 0. 002mgZLビォチン、 0. 05mg/L塩化 鉄、 0. 07mgZL硫酸亜鉛、 0. O lmg/Lホウ酸、 0. O lmg硫酸銅、 0. O lmgヨウ化カリウム、 87. 5mgZLリン酸 2水素カリウム、 12. 5mg/Lリン酸 1水素 2カリウム、 0. 1 g/L塩ィ匕カルシウム、 20 gZL グルコース。 硫酸アンモェゥム含有 M培地の場合は、 1 g/L硫酸アンモニゥム を加える。 硫酸アンモニゥム及びアデニン含有 M培地の場合は、 M培地に l gZ Lの硫酸アンモニゥムと 24nig/Lのアデニンを加える。
ポリエステル産生用培地： 6. 7 g/LYNBN 10 gZLカサミノ酸に炭素源 として、 n—アルカンあるいは油脂を 20 g/L添加する。
酵母の液体培養は、 5 Om l試験管、 50 Om 1坂口フラスコあるいは 2 L坂 口フラスコを用いて行った。 5 Om 1試験管の場合 300 r pm、 500m l坂 口フラスコの場合 100〜； L 10 r pm、 2 L坂口フラスコの場合 90〜100 r pmで振とう培養した。 培養温度は、 液体培養とプレート培養ともに 30°Cで あった。
(制限酵素処理）
制限酵素処理は、 メーカーの推奨する反応条件、 あるいは S amb r o o k等 、 JVlo 丄 e c u l a r c l o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma n u a l、 S e c o n d E d i t i o nN Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s (1989) に記載の方法に従って行つ た。
本発明の実施において、 多くの市販のキットを用いたが、 特に断らない限り添 付の使用説明書に従って行った。 (実施例 1) 破壌用 DNAの作製
ADE 1遺伝子を含む大腸菌用ベクター！) UC 1 1 9一 ADE 1 (K a w a i S. 等、 Ag r i c. B i o l . Ch era. 、 55 ： 59-65 (1991) ) (4. 64 k b p) を Mu n I、 Hp a Iで切断後、 TAKARA B 1 u n t i n g K i t (宝酒造社製） を用いて平滑化処理を行った。 平滑化処理を行 つた分割 DNAを 1 %ァガロースで電気泳動し、 ベクター及び ADE 1両サイド 側 （4. 1 9 k b p) と Mu n I/Hp a I切断断片 （約 550 b p ) を分離し た。 ベクター及び ADE 1両サイド側をァガロースゲルより EAS YTRAP ( 宝酒造社製） を用いて回収し、 TAKARA L i g a t i o n K i t V e r 2 (宝酒造社製） を用いて ADE 1両サイドを連結した。 反応液を大腸菌コン ピテントセル D Η5α (宝酒造社製） 1 00 μ 1に 5 %以下の溶液比になるよう に添加し、 該大腸菌を形質転換した。 LB培地を適当量加え 1時間振盪培養後、 LBプレートに塗抹し 37°Cで 1晚培養した。 出現したコロニーを数個取得し、 常法により LB培地で培養し、 培養菌体よりプラスミ ド DNAを抽出した。 該プ ラスミドを制限酵素 S a 1 Iで切断し、 ァガロースゲル電気泳動で 1. 03 k b pのバンドの出現を確認し、 目的とする破壊用ベクターを得た。 この形質転換し た大腸菌を LB培地で大量培養し、 Mo l e c u l a r c l o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma nu a l、 S e c o n d Ed i t i o n 1. 4 2— 1. 47、 C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s (1 989) に従って塩化セシウムによる超遠心法で該ベクターを 大量に調製した。 そして、 1段階破壌法を行うため、 破壌用 ADE 1DNAを S a 1 Iで切り出した。 全 D N A量で 5 m g /m 1の水溶液に調製し、 切り出した DN Aは未精製のまま遺伝子破壌に用いた。 (実施例 2) 遺伝子破壌実験
キャンディダ ·マルトーサ I AMI 2247株を YM培地 1 Om 1に植菌し 1 晚前培養した。 次に、 前培養液 1 m 1を 100 m 1の YM培地 （ 500 m 1坂口 フラスコ） に植菌し、 6時間培養後、 遠心により集菌した。 菌を 1Mソルビトー ル 50 Ομΐに懸濁し、 破壌用 DNA 100μ を加え静かに撹拌した。 遺伝子導入は電気パルス法により行った。 遺伝子導入装置は B T X社製の E L ECTRO CELL MAN I PULATOR 600を用いた。 キュベット は B I O MED I CAL CORPORAT I ON CO. LTD製の BM6 200を用いた。 調製したコンビテント細胞 ZDNA溶液を 10 Ομΐ取り、 キ ュベットに注入し、 パルス装置にセットした。 続いて、 静電容量 40 F、 抵抗 値 246 o hm、 電圧 1. 9 KVの条件で電気パルスをかけた。 パルス後、 それ ぞれのキュベットに 1Mソルビトールを lm 1加え、 穏やかに混合し、 室温で 1 時間放置した。 その後、 YM培地 100 m 1に移し 1晚培養した。 (実施例 3 ) 破壌株のスクリーニング
次に YM培地で培養した菌を硫酸アンモニゥム不含 M培地 50m l (500m 1坂口フラスコ） に植菌し、 1B免培養した。 続いて硫酸アンモニゥム含有 M培地 100m lに懸濁し、 30°Cで 6時間培養した。 この培養液にナイスタチン （シ ダマ社製） の 3 m g /m 1ェタノール溶液を終濃度 10 μ§ Zm 1となるように 添加し、 1時間培養した。 ナイスタチン処理菌を滅菌水で 2回洗浄し、 50m l の滅菌水に再度懸濁した。 この菌液を YPDプレートに塗抹した。 30°Cで 2日 間プレートを培養したところ、 赤色コ口-一が 24個得られた。 これらの株はい ずれも S D培地で生育できないことを確認した。 (実施例 4) PCR法による解析
多数の赤色コロニーからの破壌株の 1次スクリーユングを P CR法を用いて行 つた。 得られた赤色コロニーを YPD培地で培養し、 これより染色体 DNAを染 色体抽出キットのジユントルくん （宝酒造社製） を用いて抽出した。 この染色体 DNAを用いて、 ADE 1遺伝子の両端のプライマー （配列番号 3及び配列番号 4) を用いて P CRを行った。 PCRは P e r k i n E l me r Am 1 i t a q k i tを用いて行った。 遺伝子増幅は B i ome t r a社製 TR I O— T h e r mo b 1 o c kTMを用いた。 94°C1分、 50°C1分、 70°C3分を 1サイクルとして 30サイクル行った。 野生株では 1. 561^ 1) 1)の0 が増 幅され、 遺伝子破壌株では 1. 0 k b pと短くなつた DNAが増幅される。 PC R反応液を 1 %ァガロースゲルで電気泳動を行い、 1. 0 k b pの DNA断片の 検出を行った。 その結果、 24株中 3株の ADE 1遺伝子が短くなつており、 破 壌されていると考えられた。 図 3に、 3株中 2株 （C 16， C 17) の PCRパ ターンを示した。
(実施例 5 ) ゲノミックサザンハイプリダイゼーション法による解析
これら 3株の染色体 DN Aを染色体抽出キットのジェントルくん （宝酒造社製 ) を用いて抽出した。 得られた染色体 DNA 5μ§ずつを、 3種類の方法、 D r a I、 D r a I +Nd e I、 N d e Iで切断し、 0. 8%ァガロースゲルで電気 泳動を行った。 Mo l e c u l a r c l o n i n g : A L a b o r a t o r y Ma n u a l、 S e c o n d E d i t i o n 9. 31— 9. 57、 Co I d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s (19 89) に従って、 ゲルからハイボンド N +フィルター （アマシャム社製） に 1晚 トランスファーした。 サザンハイプリダイゼーシヨン検出用プローブは、 ADE 1遺伝子内の配列である H p a I Nd e I断片 (264 b p) を Ge n e lma g eラベリング '検出キット （アマシャム社製） で酵素標識したものを用いた （ 配列番号 5) 。 ハイブリダィズ後、 洗浄し、 同キットの蛍光発色試薬で DN Aバ ンドを検出した。 検出バンドを野生株 I AMI 2247のものと比較したところ、 2株 （C 16, C 17) において ADE 1遺伝子内部の約 550 b p分が短くな つており （図 4) 、 染色体上の ADE 1遺伝子の破壌を確認できた。 図 5にサザ ンハイプリダイゼーシヨンにより明らかになった、 A D E 1遺伝子破壌キャンデ ィダ■マルトーサ染色体の破壌された AD E 1遺伝子付近の制限酵素地図を示し た。 555 b pは Mu n I—Hp a I間の欠失した部分を示してある。 p r o b eはサザンハイプリダイゼーシヨンに用いた部分 DN Aを示してある。 図 4に示 したように、 このプローブを用いた場合、 染色体 DNAの下側に記した塩基の長 さが確認された。 野生株 I AM 12247では、 この値に約 550 b pカロえた値 が確認された。
このようにして得られた ADE 1遺伝子破壌株の 1株をキャンディダ■マルト ーサ AC 16と命名した。 (実施例 6) AD E 1遺伝子破壌株の増殖能の検討
遺伝子破壌 AC 16株の完全培地 （アデェン （100mg/L) 及ぴヒスチジ ン （10 OmgZL) 含有 YPD培地） での増殖能を、 野生株 I AM 1 2247 及ぴ C H A 1と比較した。 酵母を Y P D培地 10m lに植菌し、 1晚培養後 1 % で同培地 1 Om 1に植菌した。 一定時間ごとに OD 660 nmを測定した。 その 結果 AC 16株及び野生株は 1 5時間で培養終期に達したが、 AC 16株は野生 株の 83%までしか増殖しなかった。 一方、 CHA 1は AC 16株と同等の濃度 まで増殖したが、 AC 16株の方が 6時間早かった （図 6) 。 このように、 AC 16株の方が CHA 1株より完全培地での増殖能が優れていることが示された。
(実施例 7) ADE 1遺伝子破壌株の油脂資化性の検討
遺伝子破壌株のなかで AC 1 6株の油脂資化性能力を、 野生株 I AMI 224 7及び CHA 1株と比較した。 油脂は、 パーム油、 ヤシ油、 及び炭素数 14の n —アルカンであるテトラデカンを用いた。 油 2%を添加した YNB培地 5 Om 1 (50 Om 1坂口フラスコ） に植菌し 1晚培養し、 この菌液を同量の培地に 10 %植菌し、 一定時間ごとに OD 660 nmを測定した。 その結果、 パーム油とャ シ油では、 今回取得した AC 1 6株は野生株より 1 5%程度増殖能が劣るが、 C HA1株より 4倍程度高い油脂資化能 （32時間では 6倍） を持っていることが わかった。 テトラデカンの場合は、 CHA1は油脂 （パーム油とヤシ油） より高 い増殖能を示したが、 野生株の 55%、 AC 16株の 80%であった。 このよう に、 ADE 1破壌株は、 CHA 1株より油脂及びアルカン資化能力が優れていた。 図 7に各炭素源での増殖曲線を示した。 (実施例 8) ポリエステル合成に関与する遺伝子の合成
ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子として、 ァエロモナス ■ キヤビエ由来 の PHA重合酵素と、 β酸化経路の中間体のエノィルー C ο Αをモノマーである (R) — 3—ヒドロキシァシルー C o Aに変換する （R) 体特異的エノィルー C o Aヒドラターゼ （F u k u i T. 等、 FEMS M i c r o b i o l o g y L e t t e r s, v o l . 1 70, 69— 75 (1999) ) のァミノ酸配列 をもとに、 当該酵素遺伝子を設計した。
塩基配列の設計に当たって、 キャンディダ ·マルトーサは CTGコドンをロイ シンではなくセリンに翻訳する酵母であるため、 ロイシンコドンには CTGを割 り当てなかった。 また、 各アミノ酸に対応するコドンは、 キャンディダ 'マルト ーサにおいて使用頻度の高いコドンを優先的に選択した。 コドンの使用頻度は、 "Wo l f K. 編 No n c o n v e n t i o n a i Ye a s t s i n B i o t e c n o l o g y. の中の M a u e r s b e r g e r S . 等著、 C a n d i d a m a 1 t o s a p 524-527を参考にした。 配列番号 6及び 7にそれぞれ設計した ORF 2と ORF 3を示した。 この塩基配列にしたがって DN Aを全合成した。
(実施例 9) ポリエステル合成用組換えプラスミ ドの構築
前記〇RF 2、 ORF 3がキャンディダ 'マルトーサで発現するように、 それ ぞれの 5'上流にキャンディダ ·マノレトーサの A 1 k 1遺伝子のプロモーター A LK 1 p (配列番号 8) を、 3'下流にキャンディダ ·マルトーサの A 1 k 1遺 伝子のターミネータ一 ALK 1 t (配列番号 9) を連結することにした。 プロモ 一ターおよびターミネータ一と構造遺伝子を連結するための制限酵素部位を調製 するためには、 PCR法を利用した。 卩〇1 の条件は94°〇1分、 55°C2分、 72 °C 3分を 1サイクルとし、 これを 25回繰り返して、 目的遺伝子断片を増幅 した。 ポリメラーゼは宝酒造 （株） の E X T a qを使用した。 プロモーター部分 は配列番号 8を铸型にして配列番号 10と配列番号 1 1を用いて、 5'末端が S a l I、 3'末端が N d e Iの ALK 1 pを作製した。 ターミネータ一部分は配 列番号 9を铸型にして配列番号 1 2と配列番号 1 3を用いて、 5'末端が H i n d I I I、 3'末端が E c oRVの ALK 1 tを作製した。 最終的に ORF 2と OR F 3を連結するベクターには、 p UC 19にキャンディダ■マルトーサの自 己複製領域 （ARS) (Ge n B a n k D 29758 ) および UR A 3遺伝 子 （Ge n B a n k D 12720) を連結した pUTUl (M. Oh k um a, e t a 1 , J. B i o l . C h e m. ， v o l . 273, 3948— 39 53 (1998) ) とキャンディダ■マルトーサの AD E 1遺伝子を用いて、 マ 一力一遺伝子をゥラシルからアデニンに変更したベクターである pUT A 1 (図 2下） を使用した。 pUTAlは、 pUTUlから Xh o Iを用いて URA3遺 伝子を除去し、 これに S a 1 Iを用いて切り出した AD E 1遺伝子断片を接続し 構築した。 '
pUCNT (WO 94/0361 3に記載） の P v u I I、 Nd e Iサイトに ALK 1 を結合し、 また！>11〇1^丁の《^ 11 (1 1 1 1、 S s p Iサイトに AL Ki tを結合して; UAL 1を構築した。 次に; pUAL 1の N d e I、 P s t I サイトに ORF 2を結合し、 プラスミド pUAL— ORF 2を構築した。 また、 pUAL 1を構築する途中に構築する！ UCNT— ALK 1 tの N d e I、 H i n d I I Iサイトに ORF 3を結合し、 さらに ALK 1 pを結合することで、 UAL— ORF 3を構築した。
次に、 プラスミド pUAL— ORF 2から E c o T 22 Iを用いて、 ORF 2 とともに上流にあるプロモーター、 下流にあるターミネータ一を一緒に切り出し、 pUTA 1の P s t Iサイトに結合し、 pUTA— ORF 2を構築した。 さらに、 pUAL— ORF 3から S a 1 Iを用いて OR F 3とともに上流にあるプロモー ター、 下流にあるターミネータ一を一緒に切り出し、 ： UTA— ORF 2の S a 1 Iサイトに結合したプラスミド pUTA— ORF 23 (図 2上） を構築した。 以上の方法により、 キャンディダ■マルトーサにおいてポリエステルを製造する ための遺伝子発現カセットを構築した。
(実施例 10) ポリエステル産生用形質転換株の作製
AC 16株及び CHA 1株への形質転換は、 当該酵母を YM培地で OD 660 nmが 0. 8〜1. 0になるまで培養し、 遠心により菌体を回収し、 この菌体に 上記の発現ベクター （pUTA— ORF 23) を導入して行った。 遺伝子導入に 際して、 コンビテント細胞の調製から遺伝子導入まで、 GENO TECH社製 F a s tT r a c k JM— Ye a s t Tr a n s f o rma t i o n SM i t を用いて行った。 遺伝子導入した菌体を M培地プレートに塗抹し 2日間培養した。 pUTA— ORF 23には ADE 1遺伝子が組み込まれているため、 アデニンの 合成ができる。 従って、 アデニン不含の培地で生育する菌が形質転換体である。 アデニン不含の培地より生育した菌を回収し、 形質転換体 AC 16 (ORF 23 ) 株とした。 同様に CHA1株から CHA1 (ORF 23) 株を得た。 また、 ポ リエステル合成酵素を含まないコントロールベクター p UT A 1を用いて、 同様 に AC 16株と CHA1株を形質転換し、 形質転換体 AC 16 (CT) 株、 及び CHA 1 (ORFCT) 株を得た。
(実施例 1 1) ポリエステル生産培養
ポリエステル生産のための本培養はすべて 2 L坂口フラスコを用いて行った。 まず SD培地 1 Om 1に各組み換え株のグリセロールストツク 10 Ομΐを植菌 し、 1晚培養した。 培養した酵母菌は、 グルコース飢餓用の硫酸アンモェゥム含 有 Μ培地 （100 g/L硫酸アンモニゥム添加） 50mlに、 1 m 1を植菌した。 この培地で 2日間培養し、 培地中のグルコースを完全に枯渴させた。 次にこの菌 1 Om 1をポリエステル産生用培地 5 Om 1 (500m l坂口フラスコ） に植菌 し、 8時間培養後、 同じポリエステル産生用培地 500m lに全量植菌し、 本培 養を 1 20時間行った。 培養液をオートクレープ処理後、 遠心分離によって菌体 を回収し、 メタノールで洗浄した後、 凍結乾燥した。 得られた乾燥菌体を粉砕し、 これにクロ口ホルムを 100m l添加し、 1晚攪拌してポリエステル抽出操作を 行った。 クロ口ホルム溶液を濾過により回収し、 エバポレーターで 1— 2m 1に まで濃縮後、 濃縮液に 10mlのへキサンを添加してへキサン不溶物を析出させ た。 AC 16 (ORF 23) 株は沈殿物が得られたが、 CHA1 (ORF 23) 株では痕跡程度の沈殿しか得られなかった。 AC 1 6 (CT) 株では沈殿物は全 く得られなかった。 AC 16 (ORF 23) 株から得られたへキサン沈殿物を乾 燥後、 40 OMH zプロ トン NMR分析 （J EOL、 J NM— EX 400) を行 つた。 図 8に NMRチャートを示した。 また、 各ピークとポリエステル P (3H B-c Q-3HH) のプロ トンとの対応を番号で示した。 解析から 3 HH分率は 9. 7%であった。 また、 ポリエステルの生産量は酵母乾燥重量の 0. 1%であ つた。 CHA1 (ORF 23) 株でも同様にポリエステルが確認できたが、 生産 量は 0. 05%以下であった。 これより、 本発明のキャンディダ■マルトーサの AD E 1遺伝子破壌株を用いて、 共重合ポリエステル P (3HB— C O_3HH ) が生産できることがわかった。 さらに、 本破壌株形質転換体は、 突然変異処理 により得られた ADE 1遺伝子変異酵母の CHA 1よりもポリエステル生産能力 に優れていることが示され、 本発明の ADE 1遺伝子破壌酵母の有用性が明らか になった。 産業上の利用可能性
本発明により、 酵母の ADE 1遺伝子が破壌された菌株の有用性が示された。 キャンディダ 'マルトーサの AD E 1遺伝子破壌株では、 遺伝子組換え用宿主酵 母として、 遺伝子の発現や遺伝子の発現産物の製造に用いることが期待できる。 さらに異なる栄養要求性を付加することも可能であり、 組換え体として安全に使 用できる酵母の開発に繋がる。

Claims

請求の範囲
1 . A D E 1 D NA断片との相同的組換えにより、 染色体 D NAの A D E 1遺 伝子が破壌された酵母。
2 . 酵母がァシクロコニディウム属、 アンプ口シォザイマ属， ァルスロァスカ ス属， アルキシォザイマ属， ァシュビア属， バブジエビア属， ベンシングトエア 属， ボトリオァスカス属， ボトリオザイマ属， プレツタノマイセス属， ビユレラ 属， ビユレロマイセス属， キャンディダ属， シテロマイセス属， クラビスボラ属， タリプトコッカス属， シストフイロバシディウム属， デバリオマイセス属， デッ カラ属， ディボダスコプシス属， ディボダスカス属， ェニエラ属， エンドマイコ プセラ属， エレマスカス属， ェレモセシウム属， エリスロパシディウム属， フエ ロマイセス属， フイロバシディウム属， ガラク トマイセス属， ゲオトリクム属， ガイラーモンデラ属， ハンセニァスポラ属， ハンセヌラ属， ハセガワエア属， ホ ルターマンニァ属， ホルモアスカス属， ハイフォピキア属， ィサットヘンキア属， クロエケラ属， クロエケラスポラ属， ク ィべロマイセス属， コンドア属， クラ イシァ属， タノレツマノマイセス属， ロイコスポリディウム属， リポマイセス属， ロデロマイセス属， マラセジァ属， メ トシュニコウイァ属， ムラキア属， マイク ソザイマ属， ナドソユア属， ナカザヮエア属， ネマトスボラ属， ォガタエァ属， オースポリディウム属， パチソレン属， ファチコスポラ属， ファフィァ属， ピキ ァ属， ロドスポリディウム属， ロドトルラ属， サッカロマイセス属， サッカロマ イコーデス属， サッカロマイコプシス属， サイトエラ属， サカグチア属， サター ノスポラ属， シゾブラストスポリオン属， シゾサッカロマイセス属， シュヮ-ォ マイセス属， スポリディオボラス属， スポロポロマイセス属， スポロパキデミア 属， ステファノァスカス属， ステリグマトマイセス属， ステリグマトスポリディ ゥム属， シンビォタフリナ属， シンポディォマイセス属， シンポディォマイコプ シス属， トルラスボラ属， トリコスポリエラ属， トリコスポロン属， トリゴノプ シス属， ツチヤエァ属， ゥデニォマイセス属， ワルトマイセス属， ウイカーハミ ァ属， ウイカーハミエラ属， ウイリオプシス属， ヤマダザイマ属， ャロウィァ属, ザィゴァスカス属， ザィゴサッカロマイセス属， ザィゴウイリオプシス属又はザ ィゴザイマ属のいずれかである請求の範囲 1記載の ADE 1遺伝子破壌酵母。
3. 酵母がキャンディダ属、 ャロウィァ属、 クルイべロマイセス属、 ハンセ- ァスポラ属又はハンセヌラ属のいずれかである請求の範囲 1記載の ADE 1遺伝 子破壌酵母。
4. 酵母がキヤンディダ属である請求の範囲 1記載の AD E 1遺伝子破壌酵母。
5. 酵母がキャンディダ 'マルトーサである請求の範囲 4記載の ADE 1遺伝 子破壊酵母。
6. 酵母がキャンディダ 'マルトーサ AC 16 (FERM BP— 7366) である請求の範囲 5記載の ADE 1遺伝子破壌酵母。
7. 同種又は異種の遺伝子を含む DN A配列で形質転換された請求の範囲 1〜 6のいずれか 1項に記載の AD E 1遺伝子破壌酵母の形質転換体。
8. ADE 1遺伝子破壊酵母がキャンディダ属である請求の範囲 7記載の形質 転換体。
9. ADE 1遺伝子破壌酵母がキャンディダ■マルトーサである請求の範囲 8 記載の形質転換体。
10. ADE 1遺伝子破壌酵母がキャンディダ■マルトーサ AC 16 (F ER M B P- 7366) である請求の範囲 9記載の形質転換体。
1 1 · 請求の範囲 7〜 10のいずれか 1項に記載の形質転換体を培養して得ら れる培養物から、 同種又は異種の遺伝子発現産物を採取することを特徴とする、 遺伝子発現産物の製造方法。
12. 遺伝子発現産物がポリエステルであることを特徴とする、 請求の範囲 1記載の遺伝子発現産物の製造方法。
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