KR20030072381A - 유전자 파괴 효모 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효모의 특성을 이용하여 유전자 재조합에 의해 산업상 유용한 물질을 생산하는 시스템을 제작하기 위해서, 어떠한 특정 유전자만을 파괴하여 영양요구성을 부여한 효모를 제공한다.

본 발명에서는, ADE1 유전자가 파괴된 효모 균주는 캔디다 말토사의 포스포리보실아미노이미다졸 숙시노카복사미드 합성효소를 코딩하는 ADE1 유전자 단편을 사용하여 염색체 DNA와의 상동적 재조합에 의해 제작한다. 또한, 본 발명에서는 이러한 파괴 유전자를, 생분해성 폴리에스테르 합성효소 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트에 의해 형질전환시키고, 얻어진 형질전환체를 배양하여 생분해성 폴리에스테르를 제조한다.

Description

유전자 파괴 효모{GENE DISRUPTED YEAST}

유전자 재조합 기술의 발전에 의해, 원핵생물이나 진핵생물을 이용하여 산업상 유용한 물질을 대량으로 제조할 수 있게 되었다. 진핵생물 중, 효모, 특히 사카로마이세스(Saccharomyces)속에 속하는 효모는 예로부터 술과 기타 알콜성 음료를 포함한 발효 식품의 생산에 이용되어 왔으며, 캔디다 말토사(Candida maltosa)는, 일찍이 미생물 단백질을 함유하는 식·사료에 이용되어 왔다. 따라서, 효모 자체의 안전성도 검증되어 있다.

효모는 증식이 빠르고, 일반적으로 세균과 비교하여 더 높은 밀도로 배양할 수 있다. 또한, 효모의 균체는 세균과 비교하여 배양액으로부터 쉽게 분리할 수 있으므로, 생산물의 추출 정제 공정을 보다 간단하게 할 수 있다. 이러한 특성을 이용하여, 효모는 재조합 DNA에 의한 유용 생산물의 제조에서의 숙주로서 사용되고 있어, 그 유용성이 입증되어 있다.

각종 효모 중, 캔디다(Candida)속 효모는 사카로마이세스속에 속하는 것과달리, 호기적인 조건하에서의 배양한 경우 에탄올을 생성하지 않으며, 또한 그들의 증식이 에탄올에 의해 저해되지 않는다. 따라서, 고밀도의 연속 배양에 의해, 그 균체들의 효율적인 제조와 그에 의한 효율적인 물질 생산이 가능하다. 또한, 무포자 효모 캔디다 말토사는 C₆∼C₄₀의 직쇄 탄화수소, 팜유 및 야자유 등의 유지를 유일한 탄소원으로서 자화·생육할 수 있는 특성을 가지고 있다. 이 특성은, 소수성 화학물질의 변환에 의한 유용 물질의 생산이나 그 효모를 반응 장소로서 사용하는데 유용하므로, 각종 화합물의 생산에서의 그 유용성이 기대된다(참고: Wolf K. (ed.): Nonconventional Yeasts in Biotechno1ogy. A Handbook, Springer-Verlag, Berlin(1996), p411-580). 또한, 그 특성은 캔디다 말토사의 유전자 재조합에 의한 유용 물질의 생산에도 이용할 수 있을 것으로 기대되고 있으므로, 상기 목적에 대한 유전자 발현 시스템의 개발이 활발하게 행해져왔다(일본 특개소62-74287호 공보, 특개소62-74288호 공보, 특개평2-72822호 공보). 최근에는, 캔디다 말토사가 유전자 재조합에 의해 직쇄 디카복실산의 생산에 이용할 수 있음이 공개되었다 (WO99/04014).

유전자 재조합에 의한 물질 생산용 숙주로서 효모를 사용하는 경우, 대장균(Escherichia coli) 등을 사용하는 경우와 마찬가지로, 적당한 영양 요구성 등의 선택 부호가 부가된 변이주를 취득할 필요가 있다. 이러한 변이주는 니트로소구아니딘 또는 에틸메탄설포네이트 등의 변이원과 랜덤 돌연변이 유발에 의해 취득되고 있다. 그러나, 이러한 변이 유발법은 원하는 영양요구 변이주를 얻을 수있지만, 돌연변이가 원하는 부위 이외의 부위에서 변형시킬 가능성을 부정할 수 없다. 이것은 효모를 숙주로 개발하는데 장애가 되어, 물질 생산 장소로서 효모를 이용하는데 있어서, 대장균 등에 비해 지연되는 원인이라 말할 수 있다.

예를 들면, 캔디다 말토사용 숙주-벡터 시스템은 오래전에 개발되어, 돌연변이 유발 처리에 의해 그들의 영양요구 변이주가 많이 얻어지고 있음에도 불구하고, 그 효모의 재조합체를 이용한 상업적으로 유용한 새로운 화학물질이 생산되지 않고 있다. 그 이유로는 야생주에 필적하는 증식능이나 직쇄 탄화수소쇄 자화능을 가진 어떠한 영양요구 변이주도 지금까지 얻어지지 않음을 들 수 있다. 캔디다 말토사를 돌연변이 처리함으로써 개발한 CHA1 주는, ADE1 유전자와 HIS5 유전자에 변이가 있음이 확인되었으나(Kawai S.등, Agric. Biol. Chem., 55: 59-65(1991)), 야생주와 비교하여 그 증식능이 뒤떨어진다. 이것은 원하는 부위 이외의 부위에서의 변이에 기인한 것으로 생각된다.

랜덤 돌연변이에 의해 취득된 변이주의 또다른 문제점은 변이 부위의 자연 복귀이다. 이 경우, 배양 중에 복귀주가 우선적으로 증식하므로, 재조합체의 물질 생산성이 감소할 수 있다. 또한, 이러한 복귀주는 자연계에 유출할 경우, 생존·증식할 가능성이 높고, 안전성 기준의 면에서 문제가 될 소지가 있다. 따라서, 랜덤 돌연변이 유발에 의해 취득한 효모 균주를 물질의 생산의 장소로서 이용하는 것은 적합하지 않다. 그래서, 어떤 특정 영양 요구성 유전자만이 파괴된 파괴주의 취득이 요망되고 있다.

상술한 바와 같이, ADE1 유전자나 히스티디놀 포스페이트 아미노트랜스퍼라제(HIS5 유전자), 오로티딘 5'-포스페이트 디카복실라제(URA3 유전자) 등에서 변이가 일어난 다수의 캔디다 말토사 변이주가 취득되어 있다(참고:Wol K.(ed): Nonconventional Yeasts in Biotechno1ogy. p411-580). 그러나, 어떠한 특정의 유전자만을 파괴하여 영양 요구성을 부가한 캔디다 말토사는, 현재까지 얻어지지 않았다. 효모의 특성을 이용함으로써 유전자 재조합 기술에 의해 산업상 유용한 물질을 생산하는 시스템을 구축하기 위해서는, 상기한 유전자 파괴주가 요망되고 있다. 캔디다 말토사의 상기 유전자 파괴주 뿐만 아니라 다른 효모 종의 유전자 파괴주가 요망되고 있다.

또한, 캔디다 말토사에서는, 그 특성, 즉, 직쇄 탄화수소, 및 팜유와 야자유 등의 유지를 유일한 탄소원으로서 자화·생육할 수 있는 능력을 이용하여 산업상 유용한 물질을 생산함이 기대되고 있다.

[발명의 요약]

본 발명자들은 상기 과제를 해결하고자 예의 연구한 결과, 유전자 재조합 기술을 이용하여 포스포리보실아미노이미다졸 숙시노카복사미드 합성 효소(EC6.3.2.6 )를 코딩하는 DNA(ADE1 유전자) 단편을 사용하여 염색체 DNA와의 상동적 재조합의 원리에 의해 ADE1 유전자가 파괴된 효모 균주를 제조하여, 아데닌 요구성 효모의 취득에 성공하였다. 상기 유전자 파괴 효모의 증식능과 유전자 발현 능력을 캔디다 말토사를 돌연변이 처리하여 유도한 ADE1 유전자 변이주 CHA1와 비교하여, CHA1 주보다 상기 두 능력이 뛰어남을 입증함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 ADE1 DNA 단편과의 상동적 재조합에 의해, 염색체 DNA의ADE1 유전자가 파괴된 효모에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 동종 또는 이종의 유전자를 포함하는 DNA 서열로 형질전환된 ADE1 유전자 파괴 효모의 형질전환체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 ADE1 유전자 파괴 효모의 형질전환체를 배양하여 얻어진 배양물로부터, 동종 또는 이종의 유전자 발현 산물을 채취하는 유전자 발현 산물의 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 캔디다 말토사의 ADE1 유전자 파괴주에 동종 또는 이종 유전자 발현 시스템을 도입하여 얻어진 형질전환체를, 산업상 유용한 물질의 생산에 이용하는 방법을 제공한다. 여기서, 3-히드록시부티레이트(이하, "3HB"라 함)와 3-히드록시헥사노에이트(이하, "3HH"라 함)의 2성분 공중합 폴리에스테르(이하, "P(3HB-co-3HH)"라 함)는 생분해성 폴리에스테르로서 유용하며, 또한 폴리에스테르 중합효소와 에노일-CoA 히드라타제는 그 폴리에스테르의 합성에 관여하는 효소이다. 본 발명자들은 이 폴리에스테르 중합효소 유전자와 에노일-CoA 히드라타제 유전자의 발현 시스템을, 본 발명에 의한 캔디다 말토사의 ADE1 유전자 파괴주에 도입하여, P(3HB-co-3HH)의 생산에 성공함으로써, 그 ADE1 유전자 파괴 캔디다 말토사의 유용성을 나타낼 수 있었다. 따라서, 본 발명은 ADE1 유전자 파괴주의 형질전환체를 사용하여 폴리에스테르를 제조하는 방법으로서, 상기 형질전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 폴리에스테르를 채취하는 폴리에스테르의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 효모의 어떤 특정 염색체 DNA를 상동적 재조합의 원리에 의해 파괴하는 방법, 및 유전자 파괴주에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 파괴주를 사용한 산업상 유용한 물질의 생산에 관한 것이다.

도 1은 pUC119-ADE1 및 ADE1 파괴용 DNA의 제작법을 나타내는 개략도.

도 2는 아에로모나스 캐비에 유래의 폴리에스테르 중합효소와 에노일-CoA 히드라타제 발현 카세트 pUTA-ORF23(도 2, 위쪽), 및, 두 효소 발현 유전자를 포함하지 않은 컨트롤 카세트 pUTA1(도 2, 아래쪽)를 나타내는 도면.

도 3은 PCR 법에 의한, ADE1 유전자 파괴주의 1차 스크리닝의 결과를 나타내는 도면. C16 및 C17이 파괴주로 생각됨.

도 4는 게노믹 서든 하이브리다이제이션에 의한 ADE1 유전자 파괴 확인을 나타내는 도면. C16 및 C17에서, 유전자가 정상적으로 파괴되었음을 확인함.

도 5는 서든 하이브리다이제이션에 의해 확인된 바와 같이 ADE1 유전자 파괴 캔디다 말토사 염색체의 파괴된 ADE1 유전자 부근의 제한 효소 지도.

도 6은 YPD 배지에서의 ADE1 유전자 파괴주 AC16의 증식 곡선을 나타내는 도면.

도 7은 ADE1 유전자 파괴주 AC16의 팜유, 야자유, 및 테트라데칸을 탄소원으로 했을 때의 증식 곡선을 나타내는 도면.

도 8은 AC16(ORF23)주에서 생산한 폴리에스테르 P(3HB-co-3HH)의 400MHz 프로톤 NMR의 차트. 폴리에스테르의 각 프로톤의 귀속을 번호로 나타냄.

[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 그 기술 범위가 한정되는 것은 아니다.

효모균의 배양용으로 사용되는 시약은, 특별한 기재가 없는 한 와코퓨어 케미컬 인더스트리에서 판매하는 제품을 사용하였다.

(배지 조성)

LB 배지: 1Og/L 트립톤, 5g/L 효모 엑기스, 5g/L 염화나트륨. LB 플레이트의 경우, 한천을 16g/L로 되도록 첨가한다.

YPD 배지: 10g/L 효모 엑기스, 20g/L 폴리펩톤, 20g/L 글루코오스. YPD 플레이트의 경우는, 한천을 20g/L로 되도록 첨가한다. 아데닌 함유 YPD 배지의 경우는, 아데닌을 0.1g/L 첨가한다.

YM 배지: 3g/L 효모 엑기스, 3g/L 말트 엑기스, 5g/L 박토-펩톤, 10g/L 글루코스.

SD배지: 6.7g/L 아미노산 불함유 효모 질소 베이스(YNB), 20g/L 글루코스. 아데닌 함유 배지의 경우는 아데닌을 24mg/L 첨가한다. SD 플레이트의 경우는 한천을 20g/L로 되도록 첨가한다.

M 배지: 0.5g/L 황산마그네슘, 0.1g/L 염화나트륨, 0.4mg/L 티아민, O.4mg/L 피리독신, 0.4mg/L 판토텐산칼슘, 2mg/L 이노시톨, 0.002mg/L 비오틴, O.05mg/L 염화철, 0.07mg/L 황산아연, 0.01mg/L 붕산, 0.01mg 황산구리, 0.01mg 요오드화칼륨, 87.5mg/L 인산이수소칼륨, 12.5mg/L 인산일수소이칼륨, 0.1g/L 염화칼슘, 20g/L 글루코스. 황산암모늄 함유 M 배지의 경우, 1g/L 황산암모늄을 첨가한다. 황산암모늄 및 아데닌 함유 M 배지의 경우, M배지에 1g/L의 황산암모늄과 24mg/L의 아데닌을 첨가한다.

폴리에스테르 생산용 배지: 6.7g/L YNB, 10g/L 카사미노산에 탄소원으로서, n-알칸 또는 유지를 20g/L 첨가한다.

효모의 액체 배양은 50㎖ 시험관, 500㎖ 사카구치 플라스크 또는 2L 사카구치 플라스크를 사용하여 행하였다. 진탕배양은 50㎖ 시험관의 경우, 300rpm으로, 500㎖ 사카구치 플라스크의 경우 100∼11Orpm으로, 2L 사카구치 플라스크의 경우 90∼100rpm으로 행하였다. 배양 온도는, 액체 배양과 플레이트 배양 둘다 30℃였다.

(제한 효소 처리)

제한 효소 처리는, 제조사의 추천 반응 조건, 또는 Sambrook 등(ed), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)의 기재 방법에 따라 행하였다.

본 발명의 실시예에서, 많은 시판의 키트를 사용하였으며, 특별히 기재가 없는 한 첨부의 사용 설명서에 따라 행하였다.

이하, 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.

상동적 재조합에 의한 ADE1 유전자 파괴를 행하는 효모에는 특별한 제한은 없으나 균주 기탁 기관(예를 들면 IFO,ATCC 등)에 기탁되어 있는 아시쿨로코니디움속(Aciculoconidium)속, 암브로시오지마속 (Ambrosiozyma)속, 아르스로아스커스 (Arthroascus)속, 아르시오지마(Arxiozyma)속, 아쉬비아(Ashbya)속, 바브제비아 (Babjevia)속, 벤싱토니아(Bensingtonia)속, 보트리오아스커스(Botryoascus)속, 보트리오지마(Botryozyma)속, 브레타노마이세스 (Brettanomyces)속, 뷰렐라(Bullera)속, 뷸레로마이세스(Bulleromyces)속, 캔디다(Candida)속, 시테로마이세스(Citer omyces)속, 클라비스포라(Clavispora)속, 크립토코커스(Cryptococcus)속, 시스토필로바시디움(Cystofilobasidium)속, 데바리오마이세스(Debaryomyces)속, 덱카라 (Dekkara)속, 디포다스콥시스(Dipodascopsis)속, 디포다스커스(Dipodascus)속, 에에니엘라(Eeniella)속, 엔도마이콥셀라(Endomycopsella)속, 에레마스커스(Eremas cus)속, 에레모테쿰(Eremothecium)속, 에리트로바시디움(Erythrobasidium)속, 펠로마이세스(Fellomyces)속, 필로바시디움(Filobasidium)속, 갈락토마이세스(Galacto myces)속, 게오트리쿰(Geotrichum)속, 가일러몬델라(Guilliermondella)속, 한세니아스포라(Hanseniaspora)속, 한세눌라(Hansenula)속, 하세가와에아(Hasegawaea)속, 홀터만니아(Holtermannia)속, 호르모아스커스(Hormoascus)속, 하이포피키아 (Hyphopichia)속, 이사트켄키아(Issatchenkia)속, 클로엑케라(Kloeckera)속, 클로엑케라스포라(Kloeckeraspora)속, 클뤼베로마이세스(Kluyveromyces)속, 콘도아 (Kondoa)속, 쿠라이쉬아(Kuraishia)속, 쿠르츠마노마이세스(Kurtzmanomyces)속, 류코스포리디움(Leucosporidium)속, 리포마이세스(Lipomyces)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 말라세지아(Malassezia)속, 메츠슈니코위아(Metschnikowia)속, 마르키아(Mrakia)속, 마이소지마(Myxozyma)속, 나드소니아(Nadsonia)속, 나카자와에아(Nakazawaea)속, 네마토스포라(Nematospora)속, 오가타에아(Ogataea)속, 오스포리디움(Oosporidium)속, 파치솔렌(Pachysolen)속, 파치티코스포라(Phachyti chospora)속, 파피아(Phaffia)속, 피키아(Pichia)속, 로도스포리디움(Rhodo sporidium)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 사카로마이코데스(Saccharomycodes)속, 사카로마이콥시스(Saccharomycopsis)속, 사이토엘라(Saitoella)속, 사카구치아(Sakaguchia)속, 사투르노스포라(Saturnospora)속, 쉬조블라스토스포리온(Schizoblastosporion)속, 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces)속, 슈완니오마이세스(Schwanniomyces)속, 스포리디오볼러스 (Sporidiobolus)속, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)속, 스포로파키데르미아 (Sporopachydermia)속, 스테파노아스커스 (Stephanoascus)속, 스테리그마토마이세스(Sterigmatomyces)속, 스테리그마토스포리디움(Sterigmatosporidium)속, 심비오타프리나(Symbiotaphrina)속, 심포디오마이세스(Sympodiomyces)속, 심포디오마이콥시스(Sympodiomycopsis)속, 토룰라스포라(Torulaspora)속, 트리코스포리엘라(Tri chosporiella)속, 트리코스포론(Tricho sporon)속, 트리고놉시스(Trigonopsis)속, 츠키야에아(Tsuchiyaea)속, 우데니오마이세스(Udeniomyces)속, 왈토마이세스 (Waltomyces)속, 윅커하미아(Wickerhamia)속, 윅커하미엘라(Wickerhamiella)속, 윌리옵시스(Williopsis)속, 야마다지마 (Yamadazyma)속, 야로위아(Yarrowia)속, 지고아스커스(Zygoascus)속, 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)속, 지고윌리옵시스(Zygowilliopsis)속 또는 지고지마 (zygozyma)속 등의 효모를 사용할 수 있다.

이들 효모 중에서도, 고밀도 연속 배양에 의한 효율적인 균체 제조 및 물질 생산능의 관점에서, 캔디다속, 야로위아속, 클뤼베로마이세스속, 한세니아스포라속, 한세눌라속 등이 바람직하다. 특히, 숙주-벡터 시스템의 연구가 진척되어 있고, 상기 시스템의 이용 용이성, 및 직쇄 탄화수소나 유지 등의 높은 자화능의 관점에서, 캔디다속이 바람직하다.

또한, 본 발명에 의한 ADE1 유전자 파괴주 제조 및 그 자화에는 캔디다 말토사를 일례로 사용하였다.

본 발명의 실시에 사용된 캔디다 말토사의 야생주 IAM 12247는, 도쿄대학 응용 미생물학 연구소, 또는 등록번호 ATCC28140로서 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 입수할 수 있다. 또, 캔디다 말토사의 아데닌 및 히스티딘 영양 요구 마커 변이주인 CHA1 주는 ATCC90625로서 상기의 기관으로부터 입수할 수 있다.

본 발명에 의해 얻어진 캔디다 말토사의 ADE1 유전자 파괴 AC16주는, 일본 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1-1-1 센트랄 6의 일본 국립 산업기술 종합연구소 특허생물기탁센터에, 2000년 11월 15일자로 FERM BP-7366의 수탁 번호로서, 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁되어 있다.

상동적 재조합이라 함은 유사한 서열 또는 상동 서열을 갖는 두 개의 DNA 염기서열 사이에서 일어나는 재조합을 의미한다.

유전자 파괴라 함은 유전자의 기능을 더 이상 발휘할 수 없게 하기 위해서,그 유전자의 염기서열에 변이를 일으키거나, 다른 DNA를 삽입하거나, 유전자의 일부를 결실시킴을 의미한다. 유전자 파괴의 결과, 그 유전자가 mRNA로 전사될 수 없기 때문에, 구조 유전자가 번역되지 않거나, 또는 전사된 mRNA가 불완전해지기 때문에, 번역된 구조 단백질의 아미노산 서열에 변이 또는 결실이 생겨서, 본래의 기능을 수행할 수 없는 단백질을 생성하게 된다.

ADE1 유전자라 함은, 프로모터 영역을 포함하는 5' 비번역 영역, 포스포리보실아미노이미다졸 숙시노카르복사미드 합성효소(EC6.3.2.6)를 코딩하는 영역, 및, 터미네이터 영역을 포함하는 3' 비번역 영역으로 되는 유전자 단편을 의미한다. 캔디다 말토사의 ADE1 유전자의 염기서열은 GenBank:D00855에 공개되어 있다. 그 DNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.

ADE1 DNA 단편이라 함은 미생물 세포내의 염색체상의 ADE1 유전자와 상동적 재조합을 일으킴에 의해, 그 ADE1 유전자를 파괴할 수 있는 DNA를 의미한다.

ADE1 효소라 함은 포스포리보실아미노이미다졸 숙시노카복사미드 합성효소(EC6.3.2.6)를 의미한다.

"동종 유전자"라 함은 숙주 효모 염색체상에 존재하는 유전자, 또는 그 일부의 DNA를 의미한다. "이종 유전자"라 함은 숙주 효모의 염색체상에 본래 존재하지 않는 유전자 또는 그 일부의 DNA를 의미한다.

유전자 발현 카세트는 전사 프로모터 DNA 서열, 발현될 유전자를 코딩하는 DNA, 및 전사를 종결하는 터미네이터를 포함하는 DNA로 구성되는 환상 플라스미드이며, 염색체 밖에서 기능하는 타입과 염색체 DNA에 도입되는 타입이 있다.

유전자 발현 산물에 관해서는 유전자에 의해서 발현되는 물질(유전자 발현물)이 원하는 단백질이나 효소인 경우, 물질 그 자체가 유전자 발현 산물이다. 유전자 발현물인 각종 효소류나 보효소류의 촉매 활성을 숙주 효모내에서 발현함에 의해 생산되는, 유전자 발현 산물과는 직접적으로 다른 물질도 유전자 발현 산물이다.

"PHA"는 폴리히드록시알카노에이트의 약어이며, 3-히드록시알칸산의 공중합에 의해 얻어진 생분해성 폴리에스테르를 나타낸다.

"ORF2"라 함은 아에로모나스 캐비에(Aeromonas caviae) 유래의 폴리에스테르 중합효소를 코딩하는 유전자(일본 특개평10-108682호 공보)를, 캔디다 말토사에서 발현할 수 있도록 설계한 DNA를 의미한다. 그 염기서열을 서열번호 6에 나타내었다.

"ORF3"이라 함은 아에로모나스 캐비에 유래의 에노일-CoA 히드라타제를 코딩하는 유전자(일본 특개평10-108682호 공보)를, 캔디다 말토사에서 발현할 수 있도록 설계한 DNA를 의미한다. 그 염기서열을 서열번호 7에 나타냈다.

이하에, ADE1 유전자 파괴주의 제조 방법, 그 파괴주에 의한 폴리에스테르의 제조 방법의 일례를 설명한다.

(1) ADE1 유전자 파괴주의 제조 방법

ADE1 효소를 발현할 수 없는 파괴주를 얻을 수 있으면 유전자 파괴주 제조에, 어떠한 방법도 사용할 수 있다. 유전자 파괴 방법은 여러 가지 방법이 보고되어 있지만, 상동적 재조합에 의한 유전자 파괴가 어떠한 특정 유전자만을 파괴할수 있는 점에서 바람직하다(Nickoloff J. A.(ed), Methods in Molecular Biology, 47: 291-302(1995), Humana Press Inc., Totowa, NJ). 상동적 재조합 기술 중에서도, 유전자를 효모 세포내로 형질전환시키는 한 번의 조작 단계만을 포함하는 간편한 1단계 유전자 파괴 기술이, 자연 복귀하지 않는 파괴주를 취득할 수 있어서, 그 결과, 재조합체의 취급 안전성이 높은 균주를 얻을 수 있는 점에서 바람직하다

통상 1단계 유전자 파괴법에 사용하는 ADE1 DNA 단편은, 유전자내의 부분 DNA를 제거하고, 남은 양 말단 부분을 재차 연결한 형태의 DNA 단편이다. 이러한 DNA 단편을 제조하기 위해서는, 예를 들면, PCR법(중합효소 연쇄 반응법)을 이용하거나, 제한 효소에 의해 벡터로부터 잘라내어 다시 연결하여 제조할 수 있다. ADE1 DNA 단편의 양 말단의 상동적 영역의 길이는 10염기 이상이면 충분하고, 바람직하게는 200염기 이상, 보다 바람직하게는 300염기 이상이다. 또한, 양 말단 각각의 상동성은, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상이다.

제거되는 부분 DNA는, 그 제거에 의해 ADE1 유전자가 효소 활성을 발현할 수 없게 되는 부분이다. 상기 부분 DNA의 길이는 자연 복귀에 의해 ADE1 효소 활성이 회복될 수 없는 길이이다. 이러한 부분 DNA의 쇄 길이에 특별한 제한은 없지만, 50염기 이상이 바람직하고, 100염기 이상이 보다 바람직하다.

본 발명에서는, 555bp의 ADE1 효소를 코딩하는 DNA 단편을 제거하고, 5'측 630bp의 DNA 단편과 3'측 400bp의 DNA 단편을 연결하여 제조한 파괴용 DNA를 사용하였다(도 1). 제거한 부분은 ADE1 효소 단백질의 약 80%에 해당한다. 또, 5'측 및 3'측의 DNA 단편 모두 본래의 ADE1 유전자와 100%의 상동성을 갖는다. 본 발명에서 사용한 파괴용 DNA 단편의 염기서열을 서열 번호 2에 나타냈다.

본 발명에서 사용한 DNA 단편은 pUC119-ADE1(Kawai S.등, Agric. Biol. Chem., 55:59-65(1991))을 사용하여 제조하였다. 따라서, 플라스미드 pUC119-ADE1로 형질전환시킨 대장균을 배양하여, 그것으로부터 플라스미드를 얻었다. 이 플라스미드로부터 적당한 제한 효소를 이용하여 ADE1 유전자의 구조 유전자(ADE1 효소 단백질을 코딩하는 유전자)의 일부분을 잘라내고, 벡터측을 회수하여 다시 리가제를 사용하여 연결한다. 그 결과 파괴용 DNA를 포함하는 벡터를 제조할 수 있다.

파괴용 DNA를 포함하는 벡터는 적당한 대장균의 균주, 예를 들면 JM109나 DH5α에 형질전환시키고, 그 대장균을 대량 배양하여, 염화세슘 초원심법에 의해 고순도의 플라스미드를 대량 제조한다(Sambrook 등(ed), Molecular cloning: A Laboratory Manual, Second Edition 1.42-1.47, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)). 이 벡터를 그대로 직접 유전자 파괴에 사용할 수 있지만, 1단계 파괴법을 행하기 위하여 상기 정제한 벡터로부터 ADE1 영역을 포함하는 상동성이 있는 부분을 적당한 제한 효소로 잘라내어, 그것을 파괴용 DNA로서 이용함이 바람직하다. 본 발명에서는, 제한 효소SalI으로 절단하고, 그 DNA 단편을 정제하지 않고 효모내에 도입함으로써, 상동적 재조합에 의해서 ADE1 유전자를 파괴할 수 있다.

캔디다 말토사의 형질전환법으로는, 원형질체법, 초산리튬법(Takagi M. 등, J Bacterio1, 167;551-5(1986)), 전기 펄스법(Kasuske A. 등 Yeast 8:691-697(1992))이 알려져 있지만, 본 발명에서는 전기 펄스법을 사용하였다. 전기 펄스 발생에는 시판의 기기를 이용할 수 있다. 본 발명에서는, BTX 사(San Diego, CA USA)제의 ELECTRO CELL MANIPULATOR 600을 사용하였다. 사용된 큐베트(cuvette)는 BIO MEDICAL CORPORATION CO. LTD(Tokyo, Japan)제의 BM6200(2mm gap blue cap)였다. 전기 펄스 후, 효모를 적당한 배지에서 배양하고, 얻어지 배양 균체로부터 목적의 ADE1 파괴주를 스크리닝한다.

형질전환체 취득용으로 개발된 각종 방법들 중에서, 소위 니스타틴 (nystatin) 농축법(Snow R. Nature 211:206-207(1966))을 이용할 수 있다. 이 방법은 원래 랜덤 돌연변이에 의해 얻어진 변이주를 효율적으로 선별하기 위해 개발된 방법이지만, 유전자 파괴주에도 응용할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들면, 본 발명의 바람직한 태양에서는, 전기 펄스 후, 배양한 균체를 최소 배지 등에 식균하여 배양한다. 배양한 균체를 세정하고, 질소원 불포함 최소 배지에서 배양한 뒤, 질소원 함유 최소 배지에서 단시간 배양한다. 이 배양 배지에 직접 니스타틴을 첨가하고, 30℃에서 1시간, 호기적으로 배양함으로써, 야생주를 우선적으로 죽일 수 있다. 이 균 현탁액을 적당한 한천 배지 플레이트에 도말하고, 30℃에서 약 2일 정도 배양함으로써, 적색 콜로니를 얻는다.

얻어진 적색 콜로니로부터, PCR법이나 게노믹 서든 하이브리다이제이션법 (Sambrook 등(eds), Molecular cloning: A Laboratory Manua1, Second Edition 9.31-9.57, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))에 의해 용이하게 유전자가 파괴된 것들을 확인할 수 있다.

PCR의 경우, ADE1 유전자의 양 말단을 프라이머로 사용하면, 아가로스 겔 전기영동에서, 야생주에서는 정상적인 크기의 DNA 밴드가 검출되지만, 파괴주에서는 결실된 서열에 의하여 짧은 밴드가 검출된다. 본 발명에서는, 약 1kbp의 DNA 밴드가 검출되었다. 그러나, 유전자 파괴 등과 같은 염색체 DNA에서의 유전자 치환이나 삽입의 경우, 유전자가 의도한 부위 이외의 부위, 예를 들면 알려지지 않은 상동성이 높은 부위에, 삽입될 가능성을 상정해야 한다. 그 경우, PCR법으로는 확인할 수 없는 경우가 있다. PCR법은, 다수의 파괴주가 얻어지는 경우, 후보주를 선택하는 수단으로서 바람직하게 사용된다.

파괴주 등을 확인하기 위해서는, 게노믹 서든 해석(genomic southern analysis)이 필수이다. 이 방법을 수행함으로써, 용이하게 또한 확실히 목적하는 부위에만 유전자 재조합이 일어났음을 증명할 수 있다. 파괴주의 염색체 DNA와 컨트롤로서 야생주의 염색체 DNA를 제조하고, 적당한 제한 효소로 절단한 후에, 아가로스 겔 전기영동을 행하였다. 본 발명에서는, 2종류의 제한 효소를 사용하여 3종류의 절단 방법으로 확인을 시도하였다. 아가로스 겔로부터 나일론막상으로 DNA를 옮기고, 파괴주의 게놈상에 남아 있는 것으로 생각되는, 제한 효소 HpaI와 NdeI로 절단된 ADE1 유전자의 DNA 단편 264bp를, GeneImage 라벨링/검출 키트(Amersham사제)을 사용하여, 첨부된 설명서에 따라 효소 표지하고, 그 표지물을 서든 하이브리다이제이션에 의한 검출용 프로브(서열 번호 5)로서 사용하였다. 하이브리다이제이션 후, 막을 세정하고, 첨부 설명서에 따라 형광발색시약을 사용하여 DNA 밴드를 검출하였다. 검출된 밴드를 야생주(IAM 12247)의 것과 비교하였다. 그 결과, 2 균주가 3종류의 절단 방법에 의해, ADE1 유전자 중의 약 550bp 부분이 짧아져 있음을 확인하였다.

얻어진 ADE1 유전자 파괴주는 ADE1 효소를 합성할 수 없으므로, ATP의 전구체인 아데닌을 합성할 수 없다. 따라서, 아데닌을 포함하지 않은 배지나, 아데닌이 없는 환경 하에서는 생존할 수 없다.

상기의 ADE1 유전자 파괴주 중 하나를 캔디다 말토사 AC16이라 명명하였다.

(2) ADE1 유전자 파괴주에 의한 이종유전자 발현: 폴리에스테르의 생산 방법

본 발명에서 얻어진 ADE1 파괴 유전자를 사용하여 동종 유전자 또는 이종 유전자를 발현시킬 수 있다. 효모는 대장균과 달리, 당쇄 부가 단백질을 배지내로 분비할 수 있으므로, ADE1 파괴주를 사용하여 상기 단백질을 생산할 수 있다.

도입할 수 있는 동종 유전자에 특별한 제한은 없지만, 산업상 유용한 생산물의 제조 예로서, WO99/04014에 개시되어 있는 바와 같이, 캔디다 말토사 유래의 P450 효소 유전자를 동일 균주에 도입함에 의한 디카복실산의 제조를 들 수 있다. 또, 이종 유전자도 특별한 제한은 없지만, 예를 들면, 리파아제 유전자, 아밀라제 유전자 등의 도입에 의한 상기 단백질의 제조를 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 캔디다 말토사 등의 일부의 캔디다속 효모에서는, mRNA로부터 단백질이 번역되는 단계에서, 일부 코돈이 다른 생물과는 다른 방식으로 번역된다. 캔디다 말토사에서는 류신 코돈 CTG가 세린으로 번역되기 때문에(Ohama T. 등, Nucleic Acid Res., 21:4039-4045(1993)), 대장균 유래의 lacZ 유전자가 활성이 있는 β-갈락토시다아제로 번역되지 않는다(Sugiyama H. 등, Yeast 11:43-52(1995)). 따라서, 이종 유전자를 발현시키는 경우에는, 그 유전자가 항상 캔디다 말토사내에서 기능을 갖는 단백질로 번역된다고 보장할 수는 없다. 그러므로, 캔디다 말토사를 숙주로 하여 이종 유전자를 발현시키는 경우, 원칙으로서 류신 코돈만을 변환시킬 필요가 있으나, 캔디다 말토사내에서의 코돈의 이용성에 따라서 다른 아미노산 코돈을 변환시켜도 좋다. 코돈의 변환은, 예를 들면 Wolf K.(ed) Nonconventional Yeasts in Biotechnology 중의 Mauersberger S.등 저, Candida maltosa p524-527를 참고하여 행할 수 있다.

폴리에스테르 합성에 관여하는 유전자로는, 하기 일반식의 폴리에스테르의 합성에 관여하는 유전자이면 어떠한 유전자여도 좋다. 하기 일반식은 폴리에스테르 P(3HB-co-3HH)의 구조식을 나타내고, X와 Y 각각은 정수이고, 각각 중합에 관여하는 3HB와 3HH 단위의 개수를 나타낸다.

예를 들어, 일본 특개평10-108682호 공보에 기재되어 있는 폴리에스테르 중합효소 유전자 단편을 사용해도 좋다. 이 폴리에스테르 중합효소 유전자 외에, 폴리에스테르 합성에 관여하는 어떠한 다른 유전자를 더 도입해도 좋다. 이러한 유전자로는, 예를 들면, β-산화 경로의 중간체인 에노일-CoA를 (R)-3-히드록시아실-CoA로 변환하는 (R)체 특이적 에노일-CoA 히드라타제 유전자(Fukui T.등, FEMS Microbiology Letters, 170:69-75(1999), 일본 특개평10-108682호 공보)와,아세틸-CoA를 2량화하여 3-히드록시부티릴-CoA를 합성하는 β-케토티오라제 NADH-의존성 히드라타제 유전자(Peoples O.P. 등, J. Biol. Chem. 264:15298-15303(1989))등을 들 수 있다. 이들 유전자는 발현 산물이 실질적인 효소 활성을 갖는 한, 그 염기서열에 결실, 치환, 삽입 등의 하나 이상의 변이를 포함해도 좋다. 그러나, 이종 유전자의 경우, 상기와 같이, 캔디다 말토사내에서 기능할 수 있는 단백질로 항상 번역된다는 보장은 없으므로, 아미노산 코톤 변경이 필요하다.

본 발명에서는, 아에로모나스 캐비에 유래의 폴리에스테르 중합효소와 에노일-CoA 히드라타제(일본 특개평10-108682호 공보, Fukui T.등, FEMS Microbiology Letters, 170:69-75(1999)를 사용하였다. 그러나, 이들 효소의 유전자는 정상적으로 번역되지 않아서, 효소 활성이 발현되지 않을 가능성이 높고, 두 효소에 대한 아미노산 코돈을 캔디다 말토사에 최적인 코돈으로 변경하여 두 DNA를 전(全)합성하였다. 아에로모나스 캐비에 유래의 폴리에스테르 중합효소와 에노일-CoA 히드라타제의 전합성 DNA 서열을, 각각 서열목록의 서열 번호 6과 7에 나타낸다. 그러나, 이들 서열 식별 번호에 나타낸 염기서열은, 어떠한 제한적인 의미를 갖는 것은 아니다. 또한 그 효소들의 아미노산 서열이 캔디다 말토사에서 발현된다면 어떠한 다른 염기서열이어도 좋다.

상기 효모에서 사용되는 유전자 발현 카세트는, 해당 유전자의 5' 상류측에 프로모터와, 5' 상류측 활성화 서열(UAS) 등의 DNA 서열을 연결하고, 3' 하류측에 poly(A) 부가 시그널과 터미네이터 등의 DNA 서열을 해당 유전자에 연결하여 제작한다. 이들의 DNA 서열은 해당 효모에서 기능하는 서열이면 어떠한 서열이어도 좋다.

프로모터는 구성적인 발현 타입과 유도적인 발현 타입이 있다. 어느 타입의 프로모터를 사용해도 좋지만, 숙주와 동일 효모인 캔디다 말토사 유래의 프로모터가 바람직하다. 일례로서, 캔디다 말토사의 ALK1 프로모터와 ALK1 터미네이터 (GenBank D00481)(Takagi M. 등, Agric. Biol. Chem., 5:2217-2226 (1989))를 이용할 수 있다.

본 발명에서 형질전환 목적으로 사용되는 유전자 발현 카세트는 일례로, 다음과 같이 제작할 수 있다. 제작에 사용되는 벡터는, 대장균에서 자율 증식할 수 있는 플라스미드이면 어떠한 벡터라도 좋으며, 또한 효모에서 자율 증식할 수 있는 영역을 가져도 좋다. 효모에서 자율 증식할 수 있는 벡터는, 효모 균체내에 유지되는 것으로 알려져 있다. 또한, 유전자 발현 카세트를 염색체내로 도입할 수 있다. 일례로서 캔디다 말토사에서 자율 증식할 수 있는 pUTU1을 사용할 수 있다(M. Ohkuma, 등, J. Biol. Chem., vol.273, 3948-3953(1998)).

본 발명에서는, ORF2 및 ORF3의 각각 5' 상류측에 캔디다 말토사의 Alk1 유전자의 프로모터 ALK1p(서열 번호 8)를 연결하고, 3' 하류측에 터미네이터 ALK1t(서열 번호 9)를 연결하였다.

프로모터와 터미네이터를 구조 유전자에 연결하기 위한 제한 효소 부위는 PCR법을 이용하여 만들 수 있다. PCR에 사용하기 적합한 프라이머 서열은 서열 번호 10 ∼ 서열 번호 13에 나타낸다. PCR은 원하는 유전자 단편을 증폭할 수 있는 한 어떠한 조건하에서도 수행할 수 있다.

프로모터 부분은, 서열 번호 8을 주형으로 하고 서열 번호 10과 서열 번호 11을 프라이머로 하여, 5'말단PvuII 부위와 3'-말단EcoRI 부위를 갖는 ALK1p를 제작할 수 있다. 터미네이터 부분은, 서열 번호 9를 주형으로 하고 서열 번호 12와 서열 번호 13을 프라이머로 하여, 5'말단HindIII 부위와 3'말단EcoRV 부위인 ALK1t를 제작할 수 있다. 벡터로는, 마커 유전자를 우라실에서 아데닌으로 변경함으로써 pUTU1과 캔디다 말토사의 Ade1 유전자로부터 유래한 벡터 pUTA1를 사용할 수 있다. pUCNT(WO94/03613에 기재됨)의PvuII-EcoRI 부위에 ALK1p를 결합하고, pUCNT의HindIII-SspI 부위에 ALK1t를 결합하여 pUAL1를 제작할 수 있다. 다음에, pUAL1의NdeI-PstI 부위에 ORF2를 결합함으로써, 플라스미드 pUAL-ORF2를 제작할 수 있다. 또한, pUAL1을 제작하는 과정에서 제작된 pUCNT-ALK1t의NdeI-HindIII 부위에 ORF3를 결합한 다음, ALK1p를 더 결합함으로써, pUAL-ORF3을 제작할 수 있다.

다음에, 플라스미드 pUAL-ORF2로부터EcoT22I를 사용하여, ORF2와 함께 상류에 있는 프로모터와 하류에 있는 터미네이터를 함께 잘라, pUTA1의PstI 부위에 결합하여, pUTA-ORF2를 제작할 수 있다. 또한, pUAL-ORF3로부터SalI를 사용하여 ORF3와 함께 상류에 있는 프로모터와 하류에 있는 터미네이터를 함께 잘라, pUTA-ORF2의SalI 부위에 결합한 플라스미드 pUTA-ORF23(도 2 위쪽)를 제작할 수 있다. 이상 방법에 의해, 캔디다 말토사에서 폴리에스테르를 제조하기 위한 유전자 발현 카세트를 제작할 수 있다.

본 발명의 효모 균주에, 상술한 형질전환법을 사용하여 유전자 발현 카세트를 형질전환시켜, pUTA-ORF23를 갖는 캔디다 말토사 AC16(ORF23)주를 제조할 수 있다.

폴리에스테르 합성에 관여하는 유전자 발현 카세트로 형질전환된 효모를 배양함에 의한 폴리에스테르의 제조는, 다음 방식에 의해 행할 수 있다. 배양에 사용되는 탄소원으로는, 효모에 의해 자화할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 좋다. 또한, 프로모터의 발현이 유도형인 경우에는, 적시에 유도 물질을 첨가하면 좋다. 유도 물질이 주요 탄소원인 경우도 있다. 탄소원 이외의 영양원으로는, 질소원, 무기 염류 및 기타의 유기 영양원을 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 배양 온도는 효모가 생육 가능한 온도이면 좋지만, 20℃ ∼ 40℃가 바람직하다. 배양 시간에 특히 제한은 없지만, 1∼7일 정도가 좋다. 그 후, 얻어진 배양균체 또는 배양물로부터 폴리에스테르를 채취할 수 있다.

탄소원으로는 탄수화물, 유지류 및 지방산류 등을 들 수 있다. 탄수화물로는, 예를 들면 글루코스, 슈크로스, 글리세롤, n-알칸 등을 들 수 있다. 유지로는, 예를 들면 유채씨유, 야자유, 팜유, 팜 커넬유 등을 들 수 있다. 지방산으로는, 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 라우린산, 올레인산, 팔미틴산, 리놀산, 리놀렌산, 미리스틴산 등의 포화·불포화 지방산, 및 이들 지방산의 에스테르나 염 등의 지방산 유도체를 들 수 있다. 일례로는, 캔디다 말토사는 탄소원으로서 유지를 사용하여 배양할 수 있다. 유지를 자화할 수 없는 경우, 또는 비효율적으로만 자화할 수 있는 경우에는, 배지내에 리파아제를 첨가함으로써 자화능을 개선할 수 있다. 또한, 리파아제 유전자를 형질전환시킴에 의해, 유지 자화능을 부여할 수도 있다.

질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스 등을 들 수 있다.

무기 염류로는, 예를 들면 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다.

기타의 유기 영양원으로는, 예를 들면 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 프롤린 등의 아미노산류와, 비타민 B1, 비타민 B12, 비오틴, 니코틴아미드, 판토텐산, 비타민 C 등의 비타민류를 들 수 있다.

유도 물질로는, 예를 들면, 유지류 또는 그들의 분해 산물, 즉 지방산에 의해 유도되고, 지방산의 대사에 관여하는 효소(Alk1, Alk2, Alk3, Alk4, Alk5 등)(Ohkuma M.등, J. Biol. Chem.,273: 3948-3953(1998))를 들 수 있다.

폴리에스테르를 효모 균체로부터 채취하는 방법에 관하여, 많은 방법이 보고되어 있다. 본 발명에서는, 예를 들면, 다음과 같은 방법을 사용 할 수 있다. 배양 종료 후, 배양액을 원심분리 등을 행하여 균체를 분리·채취하고, 그 균체를 증류수 및 메탄올 등에 의해 세정한 뒤, 건조시킨다. 이 건조 균체로부터 클로로포름 등의 유기 용제를 사용하여 폴리에스테르를 추출한다. 균체 성분을 제거하기 위해, 이 폴리에스테르를 포함한 유기 용제 용액을 여과 또는 다른 처리를 행하고, 메탄올 또는 헥산 등의 빈 용매를 여과액에 첨가하여 폴리에스테르를 침전시킨다. 상등액은 여과나 원심분리에 의해 제거하고, 이렇게 모은 폴리에스테르 침전물을 건조시킨다. 이렇게 하여 폴리에스테르를 채취할 수 있게 된다.

얻어진 폴리에스테르는 예를 들면 가스 크로마토그래피법, 핵자기 공명법에의해 해석할 수 있다.

(실시예 1) 파괴용 DNA의 제작

ADE1 유전자를 포함하는 대장균용 벡터 pUC119-ADEl(Kawai S.등, Agric. Biol. Chem., 55:59-65(1991))(4.64kbp)을MunI과HpaI으로 절단한 뒤, TAKARA Blunting Kit(다까라 슈조사제)를 사용하여 평활화 처리를 행하였다. 평활화 처리를 행한 분할 DNA를 1% 아가로스로 전기영동하여, 벡터와 ADE1양사이드측(4.19kbp)을 포함하는 단편과MunI/HpaI 절단 단편(약 550bp)을 분리하였다. 벡터와 ADE1 양사이드측 단편을 아가로스 겔로부터 EASYTRAP(다까라 슈조사제)를 사용하여 채취하고, TAKARA Ligation Kit Ver2(다까라 슈조사제)를 사용하여 ADE1 양사이드를 연결하였다. 반응액을 대장균 콤피텐트(competent) 세포 DH5α(다까라 슈조사제) 100㎕에 5% 이하의 용액비로 되도록 첨가하여, 그 대장균을 형질전환하였다. LB배지를 적당량 첨가하고, 1시간 진탕 배양한 뒤, 그 배양액을 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 출현한 콜로니를 몇 개 취득하여, 통상의 방법에 따라 LB배지에서 배양하고, 배양 균체로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 그 플라스미드를 제한 효소SalI으로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동으로 1.03kbp의 밴드의 출현을 확인하여, 목적으로 하는 파괴용 벡터를 얻었다. 이 형질전환한 대장균의 균주를 LB 배지에서 대량 배양하고, Molecular cloning:A Laboratory Manual, Second Edition 1.42-1.47, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)에 따른 염화세슘 초원심법에 의해 그 벡터를 대량으로 제조하였다. 또한, 1단계 파괴법을 행하기 위해, 파괴용 ADEl DNA를SalI으로 잘랐다. DNA 전량을 5mg/㎖의 수용액으로 제조하고, 자른 DNA는 정제없이 유전자 파괴에 사용하였다.

(실시예 2) 유전자 파괴 실험

캔디다 말토사 IAM 12247주를 YM배지 10㎖에 접종하고, 하룻밤 전배양하였다. 다음에, 전배양액 1㎖를 100㎖의 YM배지(500㎖ 사카구치 플라스크)에 접종하고, 6시간 배양한 뒤, 원심분리하여 집균하였다. 이 집균한 균을 1M 솔비톨 500㎕로 현탁시키고, 파괴용 DNA 100㎍을 첨가하여, 그 혼합물을 조심스럽게 교반하였다.

유전자 형질진환은 전기 펄스법에 의해 행하였다. 유전자 형질전환 장치는 BTX사제의 ELECTRO CELL MANIPULATOR 600을 사용하였다. 사용된 큐베트는 BIO MEDICAL CORPORATION CO. LTD제의 BM 6200 이었다. 제조한 콤피텐트 세포/DNA 현탁액을 100㎕ 취하여, 각 큐베트에 주입하고, 펄스 장치에 세팅하였다. 이어서, 정전 용량 40μF, 저항값 246 ohm, 전압 1.9KV의 조건으로 전기 펄스를 걸었다. 펄스 후, 각각의 큐베트에 1M 솔비톨을 1㎖ 첨가하고, 조심스럽게 혼합한 후, 실온에서 1시간 방치하였다. 그 후, 얻어진 혼합물을 YM 배지 100㎖에 옮겨 하룻밤 배양하였다.

(실시예 3) 파괴주의 스크리닝

다음에, YM배지에서 배양한 균을 황산암모늄 불함유 M 배지 50㎖(500㎖ 사카구치 플라스크)에 접종하고, 하룻밤 배양하였다. 그 다음, 그 배양한 균을 황산암모늄 함유 M 배지 100㎖에 현탁시켜, 30℃에서 6시간 배양하였다. 이 배양 배지에 3mg/㎖ 니스타틴(시그마사제)의 에탄올 용액을 최종 농도가 10㎍/㎖로 되도록 첨가하고, 1시간 배양하였다. 니스타틴 처리균을 멸균수로 2회 세정하고, 50㎖의 멸균수에 재차 현탁하였다. 이 균현탁액을 YPD 플레이트에 도말하였다. 30℃에서 2일간 플레이트를 배양한 결과, 적색 콜로니가 24개 얻어졌다. 이들 균주 모두 SD배지에서 생육할 수 없음을 확인하였다.

(실시예 4) PCR법에 의한 해석

다수의 적색 콜로니로부터의 파괴주에 대한 1차 스크리닝을 PCR법을 사용하여 행하였다. 얻어진 적색 콜로니를 YPD 배지에서 배양하고, 각 배양액으로부터 염색체 DNA를 염색체 추출 키트 Gentle-Kun(다까라 슈조사제)을 사용하여 추출하였다. 이 염색체 DNA와, ADE1 유전자 양 말단의 프라이머(서열 번호 3 및 서열 번호 4)을 사용하여 PCR를 행하였다. PCR는 Perkin Elmer Amplitaq kit를 사용하여 행하였다. 유전자 증폭은 Biometra사제 TRIO-Thermoblock^TM를 사용하였다. 94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 70℃에서 3분을 1 사이클로 하여 30사이클을 행하였다. 야생주에서는 1.56kbp의 DNA가 증폭되고, 유전자 파괴주에서는 1.0kbp의 짧은 DNA가 증폭되었다. PCR 반응액을 1% 아가로스 겔로 전기영동을 행하여, 1.0kbp의 DNA 단편의 검출을 행하였다. 그 결과, 24 균주 중 3 균주에서, ADE1 유전자가 짧아져 있어, 파괴된 것으로 생각되었다. 도 3에, 3 균주 중 2 균주(C16, C17)의 PCR 패턴을 나타냈다.

(실시예 5) 게노믹 서든 하이브리다이제이션에 의한 해석

이들 염색체 DNA를 염색체 추출 키트 Gentle-Kun(다까라 슈조사제)을 사용하여 추출하였다. 얻어진 각 염색체 DNA를 5㎍씩, 3종류의 방법, 즉DraI,DraI+NdeI, 또는NdeI로 절단하고, 0.8% 아가로스 겔로 전기영동을 행하였다. Molecular cloning: A Laboratory Manual, Second Edition 9.31-9.57, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)에 따라, 겔로부터 하이본드 N+ 필터(아마샴사제)로 하룻밤 트랜스퍼하였다. 서든 하이브리다이제이션에 사용된 검출용 프로브는 ADE1유전자내의 서열인HpaI-NdeI 단편(264bp)을 GeneImage 라벨링·검출 키트(아마샴사제)로 효소 표지한 것을 사용하였다(서열 번호 5). 하이브리다이제이션 후, 필터를 세정하고, 동일 키트에 부착된 형광 발색 시약을 사용하여 DNA 밴드를 검출하였다. 검출 밴드를 야생주 IAM 12247에서 얻어진 것과 비교한 결과, 2 균주(C16, C17)에서 ADE1 유전자 내부의 약 550bp분량이 짧아져 있으며(도 4), 다시말해 염색체상의 ADE1 유전자의 파괴를 확인할 수 있었다. 도 5에, 서든 하이브리다이제이션에 의해 밝혀진 ADE1 유전자 파괴 캔디다 말토사 염색체의 파괴된 ADE1 유전자 부근의 제한 효소 지도를 나타낸다. "555bp"는MunI-HpaI 간의 결실 부분을 나타낸다. "프로브"는 서든 하이브리다이제이션에 사용되는 부분 DNA를 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 이 프로브를 사용한 경우, 염색체 DNA의 아래쪽에 기재한 염기의 길이가 확인되었고, 야생주 IAM 12247에서는, 이 값에 약 550bp 더한 값이 확인되었다.

이렇게 얻어진 ADE1 유전자 파괴주 중의 한 균주를 캔디다 말토사 AC16이라 명명하였다.

(실시예 6) ADE1 유전자 파괴주의 증식능의 검토

유전자 파괴 AC16주의 완전 배지(아데닌(100mg/L)와 히스티딘(100mg/L)를 함유하는 YPD 배지)에서의 증식능을, 야생주 IAM 12247 및 CHA1의 증식능과 비교하였다. 각 효모를 YPD 배지 10㎖에 접종하고, 하룻밤 배양한 뒤, 1%의 접종 크기로, 동배지 10㎖에 접종하였다. 일정시간 간격으로 660nm에서 OD값을 측정하였다. 그 결과 AC16주 및 야생주는 15시간에 배양 종기(final stage)에 이르렀지만, AC16 주는 야생주의 83%까지 밖에 증식하지 않았다. 한편, CHA1은 AC16 주와 동등한 농도까지 증식했지만, AC16 주는 그 농도까지 6시간 빨리 도달하였다(도 6). 이와 같이, AC 16주가 CHA1 주보다 완전 배지에서의 증식능이 뛰어남이 확인되었다.

(실시예 7) ADE1 유전자 파괴주의 유지 자화성의 검토

유전자 파괴주 중에서, AC16주의 유지 자화능을, 야생주 IAM 12247 및 CHA1 주와 비교하였다. 유지로는 팜유, 야자유, 및 탄소수 14의 n-알칸인 테트라데칸을 사용하였다. 각 효모를 오일 2%을 첨가한 YNB 배지 50㎖(500㎖ 사카구치 플라스크)에 접종하고 하룻밤 배양한 후, 이 효모 현탁액을 동량의 배지에 10%의 접종 크기로 접종하고, 일정시간 간격으로 660nm에서 OD값을 측정하였다. 그 결과, 팜유와 야자유에서는, 이때 취득한 AC16 주는 야생주보다 15%정도 증식능이 뒤떨어지지만, CHA1 주보다 4배정도 높은 유지 자화능( 32시간에서는 6배)을 가짐을 확인하였다. 테트라데칸의 경우에는, CHA1은 유지(팜유와 야자유)에서보다 높은 증식능을 나타냈지만, 야생주의 55%, AC16주의 80%였다. 이와 같이, ADE1 파괴주는, CHA1 주보다 유지 및 알칸 자화능이 뛰어났다. 도 7에 각 탄소원에서의 증식 곡선을 나타냈다.

(실시예 8) 폴리에스테르 합성에 관여하는 유전자의 합성

폴리에스테르 합성에 관여하는 효소 유전자를, 아에로모나스 캐비에 유래의 PHA 중합효소와, β-산화 경로의 중간체인 에노일-CoA를 모노머 (R)-3-히드록시아실-CoA로 변환시키는 (R)체-특이적 에노일-CoA 히드라타제(Fukui T.등, FEMS Microbio1ogy Letters, vol. 170, 69-75(1999))의 아미노산 서열에 기초하여, 설계하였다.

염기서열의 설계에서, 캔디다 말토사는 CTG 코돈을 류신이 아니라 세린으로 번역하는 효모이기 때문에, 류신 코돈에는 CTG가 할당되지 않는다. 각 아미노산에 대응하는 코돈으로는 캔디다 말토사에서 사용 빈도가 높은 코돈을 우선적으로 선택하였다. 코돈의 사용 빈도는, Wolf K.(ed), Nonconventional Yeasts in Biotechnology 중의 Mauersberger S., 등 저, Candida maltosa p524-527를 참고로 하였다. 이렇게 설계한 ORF2와 ORF3는 서열 번호 6 및 7에 각각 나타냈다. 이 염기서열에 따라 DNA를 전(全)합성하였다.

(실시예 9) 폴리에스테르 합성용 재조합 플라스미드의 구축

상기 ORF2 및 ORF3가 캔디다 말토사에서 발현하도록, 캔디다 말토사의 Alk1 유전자의 프로모터 ALK1p(서열 번호 8)를 ORF2 및 ORF3의 각 5'상류에, 캔디다 말토사의 Alk1 유전자의 터미네이터 ALK1t(서열 번호 9)를 3'하류에 연결하였다. 프로모터 및 터미네이터를 구조 유전자에 연결하기 위한 제한 효소 부위를 제조하기 위해서는, PCR법을 이용하였다. PCR의 조건으로는 94℃ 1분, 55℃ 2분, 72℃ 3분을 1사이클로 하고, 이것을 25회 반복하여, 원하는 유전자 단편을 증폭하였다. 사용되는 중합효소는 다까라 슈조(주)의 ExTaq 이었다. 프로모터 부분은 서열 번호 8을 주형으로 하여 서열 번호 10과 서열 번호 11을 사용하여, 5'말단의PvuII, 3'말단의EcoRI를 갖는 ALK1p를 제작하였다. 터미네이터 부분은 서열 번호 9를 주형으로 하여 서열 번호 12와 서열 번호 13을 사용하여, 5'말단에HindIII, 3'말단에EcoRV의 ALK1t를 제작하였다. 최종적으로 ORF2와 ORF3를 연결하는 벡터로는,pUC19에 캔디다 말토사의 자율 증식 서열(ARS)(Gen Bank D29758) 및 URA3 유전자(Gen Bank D12720)를 연결한 pUTU1(M. Ohkum a, et al, J. Biol. Chem., vol. 273, 3948-3953(1998))과 캔디다 말토사의 ADE1 유전자를 사용하고, 마커 유전자를 우라실에서 아데닌으로 전환한 벡터인 pUTA1(도 2, 아래쪽)를 사용하였다. pUTA1는, pUTU1로부터XhoI를 사용하여 URA3 유전자를 제거하고, 이것에SalI를 사용하여 자른 ADE1 유전자 단편을 연결하여 제작하였다.

pUCNT(WO94/03613에 기재)의PvuII-EcoRI 부위에 ALK1p를 연결하고, pUCNT의HindIII-SspI 부위에 ALK1t를 연결하여 pUAL1를 제작하였다. 다음에 pUAL1의NdeI-PstI 부위에 ORF2를 연결하여, 플라스미드 pUAL-ORF2를 제작하였다. 또한, pUAL1를 구축하는 도중에 구축된 pUCNT-ALK1t의NdeI-HindIII 부위에 ORF3를 연결하고, ALK1p를 더 연결함으로써, pUAL-ORF3를 제작하였다.

다음에, 플라스미드 pUAL-ORF2로부터EcoT22I를 사용하여, ORF2와 함께 상류에 있는 프로모터와 하류에 있는 터미네이터를 함께 잘라내고, pUTA1의PstI 부위에 연결하여, pUTA-ORF2를 제작하였다. 또한, pUAL-ORF3로부터SalI를 사용하여 ORF3와 함께 상류에 있는 프로모터와 하류에 있는 터미네이터를 함께 잘라내고, pUTA-ORF2의SalI 부위에 연결하여 플라스미드 pUTA-ORF23(도 2, 위쪽)을 제작하였다. 이상의 방법에 의해, 캔디다 말토사에서 폴리에스테르를 제조하기 위한 유전자 발현 카세트를 제작하였다.

(실시예 10) 폴리에스테르 생산용 형질전환주의 제조

AC16 주 및 CHA1 주로 형질전환시키기 위해서는, 각각의 효모를 YM배지에서660nm에서의 OD값이 0.8∼1.0으로 될 때까지 배양하고, 원심분리하여 균체를 채취하고, 이 균체에 상기의 발현 벡터(pUTA-ORF23)를 도입하였다. 유전자 도입 시, 콤피텐트 세포의 제조로부터 유전자 도입까지의 공정은 GENO TECH사제 FastTrack^TM-Yeast Transformation_SMKit를 사용하여 행하였다. 유전자 형질전환 후 균체를 M배지 플레이트에 도말하고 2일간 배양하였다. pUTA-ORF23에는 ADE1 유전자가 삽입되어 있기 때문에, 아데닌을 합성할 수 있다. 따라서, 아데닌 불함유 배지에서 생육하는 균이 형질전환체이다. 아데닌 불함유 배지에서 생육한 균을 채취하여, 형질전환체 AC16(ORF23)주라 명명하였다. 마찬가지로, 형질전환체 CHA1주를 PUTA-ORF23을 CHA1 군주에 형질전환시켜 얻었다. 또한, 폴리에스테르 합성 효소를 포함하지 않은 컨트롤 벡터 pUTA1를 사용하여, 상기와 동일한 방식으로 AC16 주와 CHA1 주를 형질전환시켜, 형질전환체 AC16(CT)주, 및 CHA1(ORFCT)주를 얻었다.

(실시예 11) 폴리에스테르 생산 배양

폴리에스테르 생산을 위한 배양은 모두 2L의 사카구치 플라스크를 사용하여 행하였다. 우선, 각 재조합 균주를 함유하는 글리세롤 스톡 100㎕를 SD배지 10㎖에 접종하고, 하룻밤 배양하였다. 이렇게 배양한 효모균 1㎖를 글루코오스 기아용의 황산암모늄 함유 M배지(황산암모늄 100g/L 함유) 50㎖에 접종하였다. 이 배지에서 2일간 배양하여, 배지내의 글루코스를 완전하게 고갈시켰다. 다음에, 효모 10㎖를 폴리에스테르 생성 배지 50㎖(500㎖ 사카구치 플라스크)에 접종하고, 8시간 배양한 다음, 전체 배양액을 동일한 폴리에스테르 생성 배지 500㎖에 접종하고, 그생성 배양을 120시간 행하였다. 상기 배양액을 오토클레이브 처리한 뒤, 원심분리에 의해서 균체를 채취하고, 메탄올로 세정한 뒤, 동결 건조하였다. 얻어진 건조 균체를 분쇄하고, 이것에 클로로포름을 1OO㎖ 첨가하고, 하룻밤 교반하였다. 이 클로로포름 용액을 여과하여 채취하고, 증발기(evaporator)로 1∼2㎖까지 농축한 뒤, 농축액에 1O㎖의 헥산을 첨가하여 헥산 불용물을 석출시켰다. AC16(ORF23)주는 침전물을 얻을 수 있었지만, CHA1(ORF23) 주에서는 흔적 정도의 침전물만 얻을 수 있었다. AC16(CT)주에서는 침전물이 전혀 얻어지지 않았다. AC16(ORF23)주로부터 얻어진 헥산 침전물을 건조한 뒤, 400MHz 프로톤 NMR 해석(JEOL, JNM-EX400)를 행하였다. 도 8에 NMR 차트를 나타내었다. 폴리에스테르 P(3HB-co-3HH)의 각 프로톤에 대응하는 각 피크는 번호로 나타내었다. 해석 결과 3HH분율은 9.7%였다. 또, 폴리에스테르의 생산량은 효모 건조 중량의 0.1%였다. CHA1(ORF23)주에서도, 폴리에스테르의 생산량이 0.05% 이하임이 확인되었다. 본 발명에 의한 캔디다 말토사의 ADE1 유전자 파괴주를 사용하여, 공중합 폴리에스테르 P(3HB-co-3HH)를 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 파괴주 형질전환체는, 돌연변이 처리에 의해 얻어지는 ADE1 유전자 변이 효모의 CHA1보다도 폴리에스테르 생산능력이 뛰어남을 확인하였다. 본 발명의 ADE1 유전자 파괴 효모의 유용성이 입증되었다.

본 발명은 ADE1 유전자 파괴 효모 균주의 유용성을 증명하였다. 캔디다 말토사의 ADE1 유전자 파괴주는, 유전자 재조합용 숙주인 효모로서, 유전자의 발현이나 유전자의 발현 산물의 제조에 유용할 것으로 기대할 수 있다. 또한 다른 영양요구성을 부가할 수 있으며, 이것은 재조합체로서 안전하게 사용할 수 있는 효모의 개발을 유도한다.

Claims (12)

1. ADE1 DNA 단편과의 상동적 재조합에 의해, 염색체 DNA의 ADE1 유전자가 파괴된 효모.
2. 제1항에 있어서,

   상기 효모가 아시쿨로코니디움속(Aciculoconidium)속, 암브로시오지마속 (Ambrosiozyma)속, 아르스로아스커스(Arthroascus)속, 아르시오지마(Arxiozyma)속, 아쉬비아(Ashbya)속, 바브제비아(Babjevia)속, 벤싱토니아(Bensingtonia)속, 보트리오아스커스(Botryoascus)속, 보트리오지마(Botryozyma)속, 브레타노마이세스 (Brettanomyces)속, 뷰렐라(Bullera)속, 뷸레로마이세스(Bulleromyces)속, 캔디다(Candida)속, 시테로마이세스(Citeromyces)속, 클라비스포라(Clavispora)속, 크립토코커스(Cryptococcus)속, 시스토필로바시디움(Cystofilobasidium)속, 데바리오마이세스 (Debaryomyces)속, 덱카라(Dekkara)속, 디포다스콥시스 (Dipodascopsis)속, 디포다스커스(Dipodascus)속, 에에니엘라(Eeniella)속, 엔도마이콥셀라(Endomycopsella)속, 에레마스커스(Eremascus)속, 에레모테쿰 (Eremothecium)속, 에리트로바시디움(Erythrobasidium)속, 펠로마이세스 (Fellomyces)속, 필로바시디움(Filobasidium)속, 갈락토마이세스(Galactomyces)속, 게오트리쿰(Geotrichum)속, 가일러몬델라(Guilliermondella)속, 한세니아스포라 (Hanseniaspora)속, 한세눌라(Hansenula)속, 하세가와에아(Hasegawaea)속, 홀터만니아(Holtermannia)속, 호르모아스커스(Hormoascus)속, 하이포피키아(Hyphopichia)속, 이삿트켄키아(Issatchenkia)속, 클로엑케라(Kloeckera)속, 클로엑케라스포라 (Kloeckeraspora)속, 클뤼베로마이세스(Kluyveromyces)속, 콘도아(Kondoa)속, 쿠라이시아(Kuraishia)속, 쿠르츠마노마이세스(Kurtzmanomyces)속, 류코스포리디움 (Leucosporidium)속, 리포마이세스(Lipomyces)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 말라세지아(Malassezia)속, 메츠슈니코위아(Metschnikowia)속, 마르키아 (Mrakia)속, 마이소지마(Myxozyma)속, 나드소니아(Nadsonia)속, 나카자와에아 (Nakazawaea)속, 네마토스포라(Nematospora)속, 오가타에아(Ogataea)속, 오스포리디움(Oosporidium)속, 파치솔렌(Pachysolen)속, 파치티코스포라(Phachytichospora)속, 파피아(Phaffia)속, 피키아(Pichia)속, 로도스포리디움(Rhodosporidium)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 사카로마이코데스 (Saccharomycodes)속, 사카로마이콥시스(Saccharomycopsis)속, 사이토엘라 (Saitoella)속, 사카구치아(Sakaguchia)속, 사투르노스포라(Saturnospora)속, 쉬조블라스토스포리온(Schizoblastosporion)속, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharo myces)속, 슈완니오마이세스(Schwanniomyces)속, 스포리디오볼러스(Sporidiobolus)속, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)속, 스포로파키데르미아(Sporopachyder mia)속, 스테파노아스커스(Stephanoascus)속, 스테리그마토마이세스(Steri gmatomyces)속, 스테리그마토스포리디움(Sterigmatosporidium)속, 심비오타프리나 (Symbiotaphrina)속, 심포디오마이세스(Sympodiomyces)속, 심포디오마이콥시스 (Sympodiomycopsis)속, 토룰라스포라(Torulaspora)속, 트리코스포리엘라(Trichosporiella)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 트리고놉시스(Trigonopsis)속, 츠키야에아(Tsuchiyaea)속, 우데니오마이세스(Udeniomyces)속, 왈토마이세스(Waltomyces)속, 윅커하미아(Wickerhamia)속, 윅커하미엘라(Wickerhamiella)속, 윌리옵시스 (Williopsis)속, 야마다지마(Yamadazyma)속, 야로위아(Yarrowia)속, 지고아스커스 (Zygoascus)속, 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)속, 지고윌리옵시스 (Zygowilliopsis)속 또는 지고지마(zygozyma)속 중의 어느 하나에 속하는 ADE1 유전자 파괴 효모.
3. 제1항에 있어서,

   효모가 캔디다속, 야로위아속, 클뤼베로마이세스속, 한세니아스포라속 또는 한세눌라속 중 어느 하나에 속하는 ADE1 유전자 파괴 효모.
4. 제1항에 있어서,

   효모가 캔디다속에 속하는 ADE1 유전자 파괴 효모.
5. 제4항에 있어서,

   효모가 캔디다 말토사인 ADE1 유전자 파괴 효모.
6. 제5항에 있어서,

   효모가 캔디다 말토사 AC16(FERM BP-7366)인 ADE1 유전자 파괴 효모.
7. 동종 또는 이종의 유전자를 포함하는 DNA 서열로 형질전환된 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재한 ADE1 유전자 파괴 효모의 형질전환체.
8. 제7항에 있어서,

   ADE1 유전자 파괴 효모가 캔디다속에 속하는 형질전환체.
9. 제8항에 있어서,

   ADE1 유전자 파괴 효모가 캔디다 말토사인 형질전환체.
10. 제9항에 있어서,

    ADE1 유전자 파괴 효모가 캔디다 말토사 AC16(FER M BP-7366)인 형질전환체.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재한 형질전환체를 배양하여 얻어진 배양물로부터, 동종 또는 이종의 유전자 발현 산물을 채취함을 특징으로 하는 유전자 발현 산물의 제조 방법.
12. 제11항에 있어서,

    유전자 발현 산물이 폴리에스테르임을 특징으로 하는 유전자 발현 산물의 제조 방법.