BR112020005757A2 - produção de retinol - Google Patents

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Peter HOUSTON
Ethan Lam
Jenna MCMAHON
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Abstract

A presente invenção se refere a um processo enzimático inovador para produção de álcool de vitamina A (retinol) através de conversão de retinal, cujo processo inclui o uso de enzimas heterólogas que têm atividade como retinal redutase, particularmente, em que a reação leva a pelo menos cerca de 90 % de conversão de retinal em retinol. O dito processo é particularmente útil para produção biotecnológica da vitamina A.

Description

PTOSAIAVNA (11-15) Approved for use through 04/30/2017. OMB 0651-0032 U.S. Patent and Trademark Office; U.S. DEPARTMENT OF COMMERCE Under the Paperwork Reduction Act of 1995, no persons are required to respond to a collection of information unless it contains a valid OMB contro! number. o Attorney Docket Number | BHD-4662-3517 Application Data Sheet 37 CFR 1.76 — ApolcatonNameer fo Title of Invention | BIOSYNTHESIS OF RETINOIDS Applicant Information: Providing assignment information in this section does not substitute for compliance with any requirement of part 3 of Title 37 of CFR to have an assignment recorded by the Office. Applicant If the applicant is the inventor (or the remaining joint inventor or inventors under 37 CFR 1.45), this section should not be completed. The information to be provided in this section is the name and address of the legal representative who is the applicant under 37 CFR
1.43; or the name and address of the assignee, person to whom the inventor is under an obligation to assign the invention, or person who otherwise shows sufficient proprietary interest in the matter who is the applicant under 37 CFR 1.46. If the applicantis an applicant under 37 CFR 1.46 (assignee, person to whom the inventor is obligated to assign, or person who otherwise shows sufficient proprietary interest) together with one or more joint inventors, then the joint inventor or inventors who are also the applicant should be identified in this section. Legal Representative under 35 U.S.C. 117 Joint Inventor If applicant is the legal representative, indicate the authority to file the patent application, the inventor is: If the Applicant is an Organization check here. mM Organization Name | psv IP Asseis B V. Mailing Address Information For Applicant: Aácross 2 E EEE e fe qssemme [| [country | Posisicade — | [centre Prore Nami To fame [| Ema agaress [OO AY [Additional Applicant Data may be generated within this form by selecting the Add button. Assignee Information including Non-Applicant Assignee Information: Providing assignment information in this section does not substitute for compliance with any requirement of part 3 of Title 37 of CFR to have an assignment recorded by the Office.
PTO/AIANA (11-15) Approved for use through 04/30/2017. OMB 0651-0032 U.S. Patent and Trademark Office; U.S. DEPARTMENT OF COMMERCE Under the Paperwork Reduction Act of 1995, no persons are required to respond to a collection of information unless it contains a valid OMB contro! number. o Attorney Docket Number | BHD-4662-3517 Application Data Sheet 37 CFR 1.76 — ApolcatonNameer fo Title of Invention | BIOSYNTHESIS OF RETINOIDS Complete this section if assignee information, including non-applicant assignee information, is desired to be included on the patent application publication. An assignee-applicant identified in the "Applicant Information" section will appear on the patent application publication as an applicant. For an assignee-applicant, complete this section only if identification as an assignee is also desired on the patent application publication.
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See 37 CFR 1.4(d) for the manner of making signatures and certifications. | senao | Bryan H. Davidson/ Date (YYYY-MM-DD) | 1017-09-25 Additional Signature may be generated within this form by selecting the Add button.
PTOSAIAVNA (11-15) Approved for use through 04/30/2017. OMB 0651-0032 U.S.
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DEPARTMENT OF COMMERCE Under the Paperwork Reduction Act of 1995, no persons are required to respond to a collection of information unless it contains a valid OMB contro! number. as Attorney Docket Number | BHD-4662-3517 Application Data Sheet 37 CFR 1.76 — Apoicatamiemer Title of Invention | BIOSYNTHESIS OF RETINOIDS This collection of information is required by 37 CFR 1.76. The information is required to obtain or retain a benefit by the public which is to file (and by the USPTO to process) an application.
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Any comments on the amount of time you require to complete this form and/or suggestions for reducing this burden, should be sent to the Chief Information Officer, U.S.
Patent and Trademark Office, U.S.
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SEND TO: Commissioner for Patents, P.O.
Box 1450, Alexandria, VA 22313-1450.
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FOLHA DE DADOS DO PEDIDO 37 CFR 1.76 Nº de dossiê do Procurador: BHD-4662-3518: Título: BIOSSÍNTESE DE RETIÓIDES ORDEM DE SIGILO 37 CFR 5.2 Inventor 1 Peter PO THOUSTON Informação de residência [] Residência EUA [X] Não residente EUA Es o doe ot — aiseraugst Endereço do Inventor [ Endereço 1 — | Eyo DSM Nutritional Products, Ltd | | cidade = Karseraugst o Estado/Províneia [ Código Postal | CH4303 País le
INFORMAÇÃO DE CORRESPONDÊNCIA Número de cliente: P3117 E-mail:
INFORMAÇÃO DO PEDIDO TÍTULO: BIOSSÍNTESE DE RETIÓIDES Nº DO DOSSIÊ DO PROCURADOR: BHD4662-3518 Status de Entidade de Pequeno porte reivindicada [ ] TIPO DE PEDIDO: Provisório TIPO DE INVENÇÃO: Utilidade Nº total de Folhas de Desenho: Sugestão de figuras: [] Pedido de Não Publicação. Solicito por meio deste que o pedido anexo não seja publicado sob os 35 U.S. C. 122 (b) e certifico que a invenção revelada no pedido descrito não é e não vai ser objeto de um pedido depositado em outro país, ou ao sob um acordo internacional multilateral, que exige a publicação em 18 meses após o depósito.
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LD Autorização para Permitir Acesso: [ ] Autorização para permitir o acesso imediato ao pedido pelos escritórios participantes. Informações do Requerente: Requerente 1 Se o requerente é o inventor (ou o inventor conjunto permanecendo sob 37 CFR 1,45), esta seção não deve ser concluída. As informações a serem fornecidas nesta seção são o nome e endereço do representante legal que é recorrente nos termos do 37 CFR 1,43; ou o nome e endereço do cessionário, pessoa a quem o inventor tem a obrigação de atribuir a invenção, ou a pessoa que de outra forma mostra interesse suficiente na matéria que é recorrente nos termos do 37 CFR 1.46. Se o requerente for um candidato com menos de 37 CRF 1,46 (cessionário, pessoa a quem o inventor se obriga a ceder, ou a pessoa que de outra forma mostrar interesse suficiente), juntamente com um ou mais inventores conjuntos, os inventores comuns ou inventores que são também os requerentes devem ser identificados nesta seção. [x] Cessionário Se a requerente for uma Organização marcar aqui [x] Nome da Organização: bSM IP Assets B.V. Endereço 1: Het Overtoon 1 Endereço 2: Cidade: Heerlen Estado/Província: País: NL Código Postal: NL-6411 TE Telefone: Fax: E-mail:
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Nº de dossiê do Procurador: BHD-4662-3518:
Título: BIOSSÍNTESE DE RETIÓIDES
Assinatura: Bryan H.
Davidson Data: 25/09/2017 Primeiro Nome: BIYAN Último nome: Davidson Registro nº: 30251
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FOLHA DE DADOS DO PEDIDO 37 CFR 1.76 Nº de dossiê do Procurador: BHD4662-3516 Título: PRODUÇÃO DE RETINOL ORDEM DE SIGILO 37 CFR 5.2 eta E Nome dado Peter Po HOUSTON Informação de residência [] Residência EUA [X] Não residente EUA Cidade — JKaiseraugstÀúÚúÚúÚúÚúÚú] país deres E Patent Department, Wurmisweg 576 | código Postal | (CH4303 [Pais = ler
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INFORMAÇÃO DO PEDIDO TÍTULO: PRODUÇÃO DE RETINOL Nº DO DOSSIÊ DO PROCURADOR: BHD4662-3516 Status de Entidade de Pequeno porte reivindicada [ ] TIPO DE PEDIDO: Provisório TIPO DE INVENÇÃO: Utilidade Nº total de Folhas de Desenho: Sugestão de figuras: [] Pedido de Não Publicação.
Solicito por meio deste que o pedido anexo não seja publicado sob os 35 U.S. C. 122 (b) e certifico que a invenção revelada no pedido descrito não é e não vai ser objeto de um pedido depositado em outro país, ou ao sob um acordo internacional multilateral, que exige a publicação em 18 meses após o depósito.
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Informações do Requerente: Requerente 1 Se o requerente é o inventor (ou o inventor conjunto permanecendo sob 37 CFR 1,45), esta seção não deve ser concluída. As informações a serem fornecidas nesta seção são o nome e endereço do representante legal que é recorrente nos termos do 37 CFR 1,43; ou o nome e endereço do cessionário, pessoa a quem o inventor tem a obrigação de atribuir a invenção, ou a pessoa que de outra forma mostra interesse suficiente na matéria que é recorrente nos termos do 37 CFR 1.46. Se o requerente for um candidato com menos de 37 CRF 1,46 (cessionário, pessoa a quem o inventor se obriga a ceder, ou a pessoa que de outra forma mostrar interesse suficiente), juntamente com um ou mais inventores conjuntos, os inventores comuns ou inventores que são também os requerentes devem ser identificados nesta seção.
[x] Cessionário Se a requerente for uma Organização marcar aqui [x] Nome da Organização: bSM IP Assets B.V.
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FOLHA DE DADOS DO PEDIDO 37 CFR 1.76
Nº de dossiê do Procurador: BHD-4662-3516
Título: PRODUÇÃO DE RETINOL
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Davidson/ Data: 25/09/2017 Primeiro Nome: BIYAN Último nome: Davidson Registro nº: 30251
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FOLHA DE DADOS DO PEDIDO 37 CFR 1.76 Nº de dossiê do Procurador: BHD-4662-3517 Título: BIOSSÍNTESE DE RETINOIDES ORDEM DE SIGILO 37 CFR 5.2 e E Nome dado Peter PO HOUSTON Do Informação de residência [] Residência EUA [X] Não residente EUA Kaiseraugst Endereço do Inventor [endereçot — [toDSMNutitomalProdueis CM Endereço 2 Patent Depariment, Wurmisweg 576 | cidade = Karseraugst NS Estado/Províneia [ Código Postal | CHA303 pas e
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INFORMAÇÃO DO PEDIDO TÍTULO: BIOSSÍNTESE DE RETINOIDES Nº DO DOSSIÊ DO PROCURADOR: BHD-4662-3517 Status de Entidade de Pequeno porte reivindicada [ ] TIPO DE PEDIDO: Provisório TIPO DE INVENÇÃO: Utilidade Nº total de Folhas de Desenho: Sugestão de figuras: [] Pedido de Não Publicação.
Solicito por meio deste que o pedido anexo não seja publicado sob os 35 U.S. C. 122 (b) e certifico que a invenção revelada no pedido descrito não é e não vai ser objeto de um pedido depositado em outro país, ou ao sob um acordo internacional multilateral, que exige a publicação em 18 meses após o depósito.
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Endereço 1: Het Overioon 1 Endereço 2: Cidade: Heerlen Estado/Província: País: NL Código Postal: NL-6411 TE Telefone: Fax: E-mail:
FOLHA DE DADOS DO PEDIDO 37 CFR 1.76
Nº de dossiê do Procurador: BHD-4662-3517
Título: BIOSSÍNTESE DE RETINOIDES
Assinatura: Bryan H.
Davidson Data: 25/09/2017 Primeiro Nome: BIYAN Último nome: Davidson Registro nº: 30251
“PRODUÇÃO DE RETINOL”
[0001] A presente invenção se refere a um processo enzimático inovador para produção de álcool de vitamina A (retinol) através de conversão de retinal, cujo processo inclui o uso de enzimas heterólogas que têm atividade como retinal redutase, particularmente, em que a reação leva a pelo menos cerca de 90 % de conversão de retinal em retinol. O dito processo é particularmente útil para produção biotecnológica da vitamina A.
[0002] O retinol é um importante intermediário/precursor no processo de produção de retinoides, particularmente, como produção de vitamina A. Os retinoides, incluindo a vitamina A, são um dos fatores nutricionais muito importantes e indispensáveis para seres humanos que devem ser supridos através de nutrição. Os retinoides promovem o bem-estar dos seres humanos, entre outros, em relação à visão, ao sistema imunológico e ao crescimento.
[0003] Os métodos de produção química atuais para retinoides, incluindo vitamina A e precursores da mesma, têm algumas características indesejáveis, como, por exemplo, consumo de alta energia, etapas de purificação complicadas e/ou subprodutos indesejáveis. Portanto, nas últimas décadas, outras abordagens para fabricar retinoides, incluindo vitamina A e precursores da mesma, incluindo etapas de conversão microbiana, que seriam mais econômicas assim como ecológicas, foram investigadas.
[0004] Em geral, os sistemas biológicos que produzem retinoides são industrialmente intratáveis e/ou produzem os compostos em níveis tão baixos que o isolamento em escala comercial não é praticável. Há várias razões para isso, incluindo instabilidade dos retinoides em tais sistemas biológicos ou na produção relativamente alta de subprodutos.
[0005] Assim, uma tarefa em andamento consiste em aprimorar a especificidade de produto e/ou produtividade da conversão enzimática de betacaroteno em vitamina A. Particularmente, é desejável otimizar a produtividade de enzimas envolvida na conversão de retinal em retinol, isto é, buscar por enzimas com alta atividade de redução de retinal.
[0006] Surpreendentemente, é possível identificar atualmente retinol desidrogenases (RDHs) específicas que têm capacidade de converter retinal em retinol com uma conversão total de pelo menos cerca de 90 % para a geração de retinol.
[0007] Em particular, a presente invenção é direcionada às RDHs, de preferência, RDHs fúngicas que são heterólogas expressadas em uma célula hospedeira adequada, como uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, uma célula hospedeira fúngica, com a atividade de redução de retinal em retinol com uma conversão total para a produção de retinol de pelo menos cerca de 90 8%, de preferência, 92, 95, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % com base na quantidade total de retinoides produzida pela dita célula hospedeira, isto é, uma quantidade de retinol de pelo menos cerca de 90 % em comparação com a quantidade de retinal presente na dita mistura de retinoide produzida pela célula hospedeira.
[0008] A invenção consiste em um aspecto direcionado, de preferência, a uma célula hospedeira produtora de carotenoide, em particular, a uma célula hospedeira produtora de retinoide, compreendendo tal RDH como definido no presente documento, a dita célula hospedeira que produz uma mistura de retinal compreendendo tanto retinol quanto retinal, em que a porcentagem de retinol é de pelo menos cerca de 90 %, de preferência, 92, 95, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % com base na quantidade de total de retinoides (compreendendo retinal/retinol) na mistura de retinol.
[0009] os termos “retinal redutase”, “retinol desidrogenase”, “enzima que tem atividade de redução de retinal” ou “RDH” são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem às enzimas[EC 1.1.1.105) que têm capacidade de catalisar a conversão de retinal em retinol e também a reação reversa que leva ao retinal, a última atividade deve ser reduzida em cerca de 10 % ou menos de acordo com a presente invenção.
[0010] Os termos “conversão”, “oxidação”, “redução” em conjunto com catálise enzimática de retinol são usados de modo intercambiável no presente documento e se referem à ação de RDH como definido no presente documento.
[0011] Como usado no presente documento, o termo "célula hospedeira fúngica" inclui particularmente levedura como célula hospedeira, como, por exemplo, Yarrowia ou Saccharomyces.
[0012] As RDHs como definido no presente documento que levam à conversão total de cerca de pelo menos 90 % para a produção de retinol a partir de catálise enzimática de retinal são, de preferência, introduzidas em uma célula hospedeira adequada, isto é, expressas como enzimas heterólogas, ou podem ser expressas como enzimas endógenas.
De preferência, as enzimas como descrito no presente documento são expressas como enzimas heterólogas.
[0013] Para o propósito da presente invenção, qualquer enzima redutora de retinal que resulta em um aumento de pelo menos cerca de 18 %, como, por exemplo, pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 % para a formação de retinol pode ser usado em um processo como definido no presente documento, tal aumento sendo calculado na formação de retinol com o uso de RDHs endógenas presentes na célula hospedeira produtora de carotenoide adequada, particularmente, célula hospedeira fúngicas, como, por exemplo, cepas de Yarrowia ou Saccharomyces.
[0014] AS RDHs com atividade para a formação de retinol, isto é, reação de redução de retinal, como definido no presente documento, podem ser obtidas a partir de qualquer fonte, como, por exemplo, plantas, animais, incluindo seres humanos, algas, fungos, incluindo levedura e bactérias.
[0015] Em uma modalidade, o polipeptídeo que tem atividade de RDH como definido no presente documento, isto é, com uma conversão total de pelo menos 90 % para o retinol, é obtenível a partir de fungos, em particular, Dikarya ou Mycoromycetes, incluindo, mas não se limita aos fungos selecionados a partir de Ascomycota ou Mucorales, de preferência, é obtido a partir de Fusarium ou Mucor, com mais preferência, isolado a partir de F. fujikuroi ou M. circinelloides, como um polipeptídeo com pelo menos 60 &%, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % ou até 100% de identidade com F. fujikuroi F£LRDH12 (sequência de polipeptídeos derivada de EXK27040) ou M. circinelloides MCRDH12 (sequência de polipeptídeos derivada de EPB85547.1), por exemplo, olipeptídeos com o menos 60 %, como, exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade com um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, incluindo um polipeptídeo codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO:2.
[0016] Nas modalidades adicionais, o polipeptídeo que tem atividade de RDH como definido no presente documento, isto é, com uma conversão total de pelo menos 90 % para retinol, é obtenível a partir de animais incluindo seres humanos, de preferência, obtido a partir de rato ou ser humano, como HsRDH12 humano (sequência de polipeptídeos derivada de NP 689656.2) ou RnRDH12 de rato (sequência de polipeptídeos derivada de NP 001101507.1), por exemplo, polipeptídeos com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% ou até 100 % de identidade com um polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:5 ou 6.
[0017] Em uma modalidade, a célula hospedeira como descrita no presente documento tem capacidade de conversão de retinal com uma conversão total de pelo menos cerca de 90 %, de preferência, 92, 95, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % para a produção de retinol. De preferência, tal conversão é obtida a partir de uma mistura de retinal compreendendo uma porcentagem de pelo menos cerca 61 % como trans-retinal, como, por exemplo, cerca de 61 a 90 &% na trans-isoforma, que é produzida na célula hospedeira. A retinal pode ser obtido através da conversão de betacaroteno em retinal, catalisado pelas respectivas oxidases de betacaroteno (BCO), como, por exemplo, de preferência, o BCO de Drosophila melanogaster, DmNinaB ou um polipeptídeo com pelo menos
60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade com um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:3. De preferência, a mistura de retinal a ser convertida em retinol pela ação da RDH como definido no presente documento compreende pelo menos 61- 65 % de trans-retinal, como, por exemplo, cerca de 61 a 90 %& na trans-isoforma, entretanto, a atividade/conversão das RDHs de acordo com a presente invenção é independente da porcentagem de trans- e cis-retinal.
[0018] Assim, em uma modalidade, a invenção é direcionada a uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, compreendendo (1) uma betacaroteno oxidase (BCO), estereosseletiva, isto é, uma BCO trans-específica, a catalisação da conversão de betacaroteno em uma mistura de cis- e trans-retinal com uma porcentagem de pelo menos 61 % de trans-retinal na mistura de retinal; e (2) uma RDH como definido no presente documento que catalisa a conversão de retinal, por exemplo, uma mistura de retinal com uma porcentagem de pelo menos 61 % de trans-retinal com base na quantidade total de retinal na mistura, em retinol com uma conversão total de pelo menos cerca de 90 % em retinol.
[0019] Exemplos de tais BCOs como definido no presente documento podem ser obtidas a partir de qualquer fonte, como, por exemplo, planta, animal, bactérias, fungos, algas. As BCOs estereosseletivas particularmente úteis obtidas a partir de fungos, em particular, Dikarya, incluindo, mas não se limita aos fungos selecionados a partir de Ascomycota ou Basidiomycota, de preferência, obtidos a partir de Fusarium ou Ustilago, com mais preferência,
isolados a partir de F. fujikuroi ou U. maydis, como, por exemplo, FíCarX (sequência de polipeptídeos derivada de AJ854252), UmMCCOl (sequência de polipeptídeos derivada de EAK81726). Adicionalmente, as BCOs estereosseletivas particularmente úteis são obtidas a partir de insetos, em particular, Diptera, de preferência, obtidos a partir de Drosophila, com mais preferência, a partir de D. melanogaster, como, por exemplo, DmNinaB ou DmMBCO (sequência de polipeptídeos derivada de NP 650307.2). Adicionalmente, as BCOs estereosseletivas particularmente úteis são obtidas a partir de plantas, em particular, Angiospermas, de preferência, obtidos a partir de Crocus, com mais preferência, a partir de C. sativus, como, por exemplo, CsZCO (sequência de polipeptídeos derivada de Q84K96.1). Adicionalmente, as BCOsS estereosseletivas particularmente úteis são obtidas a partir de eucariotas, em particular, peixes, de preferência, obtidos a partir de Danio ou Ictalurus, com mais preferência, a partir de D. rerio ou II. punctatus, como, por exemplo, DrBCOl (sequência de polipeptídeos derivada de Q90WH4), IpBCO (sequência de polipeptídeos derivada de XP 017333634).
[0020] Em um aspecto preferencial da invenção, uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, compreende (1) uma BCO estereosseletiva a partir de Drosophila, como D. melanogaster, de preferência, um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:3, e (2) RDH que tem atividade para a geração de retinol como definido no presente documento que é selecionado a partir de fungos, como Fusarium, de preferência, a partir de F. fujikuroi, com mais preferência,
FÍRDH12 (SEQ ID NO:1).
[0021] As modificações a fim de ter a célula hospedeira como definido no presente documento produzem mais cópias de genes e/ou proteínas, como, por exemplo, BCOs ou RDHs trans-seletivos com a seletividade para a formação de retinol como definido no presente documento, podem incluir o uso de promotores fortes, melhoradores de transcrição e/ou tradução adequados, ou a introdução de uma ou mais cópias de gene na célula hospedeira produtora de carotenoide, levando ao acúmulo aumentado das respectivas enzimas em um determinado tempo. O elemento versado sabe quais técnicas usar na dependência da célula hospedeira. O aumento ou redução de expressão de gene pode ser medido por vários métodos, como, por exemplo, tecnologia Northern, Southern ou Western blot como conhecido na técnica.
[0022] A geração de uma mutação em ácidos nucleicos ou aminoácidos, isto é, mutagênese, pode ser realizada de formas diferentes, como, por exemplo, por mutagênese aleatória ou lateral, danos físicos provocados por agentes, como, por exemplo, radiação, tratamento químico ou inserção de elemento genético. O elemento versado sabe como introduzir mutações.
[0023] Assim, a presente invenção é direcionada a uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como descrito no presente documento compreendendo um vetor de expressão de ou um polinucleotídeo que codifica RDHs como descrito no presente documento — que foi integrado no DNA cromossomal do hospedeiro. Tal célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, que compreende um polinucleotídeo heterólogo em um vetor de expressão e ou integrado no DNA cromossomal que codifica RDHs como descrito no presente documento é denominada de uma célula hospedeira recombinante. A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, pode conter uma ou mais cópias de um gene que codifica as RDHs como definido no presente documento, como, por exemplo, polinucleotídeos que codifica polipeptídeos com pelo menos cerca de 60 % de identidade com um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1, levando à superexpressão de tais genes que codificam as RDHs como definido no presente documento. O aumento de expressão de gene pode ser medido por vários métodos, como, por exemplo, tecnologia Northern, Southern ou Western blot como conhecido na técnica.
[0024] Com base nas sequências como revelado no presente documento e da preferência para redução de retinal para retinol com uma conversão total de pelo menos cerca de 90 %, pode-se ainda deduzir facilmente os polipeptídeos que codificam genes que têm atividade de redução de retinal como definido no presente documento, o que poderia ser usado para a conversão de retinal em retinol, em particular, em que a porcentagem de trans-retinal na mistura de retinal a ser convertida é de pelo menos cerca de 61 %, como, por exemplo, pelo menos cerca de 61 a 90 8% de trans-retinal presente na mistura de retinal. Assim, a presente invenção é direcionada para um método para identificação de enzimas redutoras de retinal inovadoras, em que um polipeptídeo com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 % ou até 100% de identidade com FF. fujikuroi RDH12 (SEQ ID NO:1) é usado como sondado em um processo de triagem para novas enzimas redutoras de retinal com preferência para produção de retinol na conversão total de pelo menos cerca de 90 %. Qualquer polipeptídeo que tem atividade de RDH pode ser usado para produção de retinol a partir de retinal como descrito no presente documento, desde que a ação redutora resulte em pelo menos cerca de 90 % de retinol em comparação com a quantidade de retinal na mistura de reação. Assim, uma RDH adequada a ser usada para um processo de acordo com a presente invenção inclui uma enzima que tem capacidade de produzir cerca de 10 % ou menos de retinal, como, por exemplo, com base na quantidade total de retinoides obtida a partir da conversão de retinol em retinal (reação reversa).
[0025] A presente invenção é direcionada particularmente para o uso de tais enzimas redutoras de retinal inovadoras em um processo para produção de retinol, em que a produção de retinal pela ação da dita RDH como definido no presente documento foi reduzida ou abolida e em que a produção de retinol foi aumentada, levando a uma razão entre retinol e retinal na mistura de retinol de pelo menos cerca de 9:1. O processo pode ser realizado com uma célula hospedeira produtora de carotenoide adequada que expressa a dita RDH, de preferência, em que os genes que codificam os ditas RDHs são heterólogos expressados, isto é, introduzidos nas ditas células hospedeiras. o retinol pode ser convertido adicionalmente em vitamina A pela ação de mecanismos adequados (conhecidos).
[0026] Uma atividade reduzida ou abolida para uma conversão de retinol em retinal como usado no presente documento significa que a atividade para a produção de retinal é diminuída em relação à atividade enzimática para a produção de retinol. Como usado no presente documento, a redução ou abolição da atividade para a conversão de retinol em retinal, isto é, aprimoramento da razão de produto para a redução de retinal em retinol significa uma razão de produto entre retinol e retinal na mistura de retinoides que é de pelo menos cerca de 9:1, como, por exemplo, 9,1:1, 9,2:1, 9,5:1, 9,8:1 ou até 10:1, cujas razões de produto são alcançadas com as RDHs específicas como definido no presente documento.
[0027] Uma redução ou abolição da quantidade de retinal na mistura de retinol significa uma limitação em cerca de % ou menos de retinal na mistura de retinol com base na quantidade total de retinoides produzida através de ação enzimática da RDH como definido no presente documento.
[0028] O uso de um enzima redutora de retinal como definido no presente documento leva a um aumento de pelo menos cerca de 18 % na conversão total, como, por exemplo, pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80% em comparação a uma célula hospedeira não modificada que carrega (apenas) as RDHs endógenas, a célula hospedeira fúngica, como por exemplo, Yarrowia ou Saccharomyces sem nenhuma modificação genética em relação à redução de retinal, isto é, expressão dos homólogos de RDH fúngicos endógenos presentes na célula hospedeira.
[0029] Como usado no presente documento, o termo “pelo menos cerca de 90 %” em relação à produção de retinol, em particular, em relação À produção de retinol a partir de conversão de retinal com o uso de uma RDH como definido no presente documento, significa que pelo menos cerca de 90 %,
como, por exemplo, 92, 95, 98 % ou até 100 % do retinal é convertido em retinol. O termo “cerca de 10 % ou menos” em relação à produção de retinal, em particular, em relação à produção de retinal a partir de conversão de retinol com o uso de uma RDH definida no presente documento, significa que cerca de 10 % ou menos, como, por exemplo, 8, 7, 5, 2 ou até 0 % do retinol produzido é convertido de volta em retinal. Todos esses números têm como base a quantidade de retinal e retinol na mistura de retinoide presente em uma célula hospedeira produtora de carotenoide adequada como definido no presente documento.
[0030] Os termos "identidade de sequência", "% de identidade" ou "homologia de sequência" são usados de modo intercambiável no presente documento. Para o propósito desta invenção, é definido aqui que, para determinar a porcentagem de homologia de sequência ou identidade de sequência de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para fins de comparação ideal. De modo a otimizar o alinhamento entre as duas sequências, podem ser introduzidas lacunas em qualquer uma das duas sequências que são comparadas. Esse alinhamento pode ser realizado ao longo de todo o comprimento das sequências a serem comparadas. Alternativamente, o alinhamento pode ser executado em um comprimento mais curto, por exemplo, em cerca de 20, cerca de 50, cerca de 100 ou mais ácidos nucleicos/bases ou aminoácidos. A identidade de sequência é o percentual de correspondências idênticas entre as duas sequências sobre a região alinhada relatada. A identidade de sequência em porcentagem entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada com o uso do algoritmo Needleman e Wunsch para o alinhamento de duas sequências (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Ambas as sequências de aminoácidos e sequências nucleotídicas podem ser alinhadas pelo algoritmo. O algoritmo de Needleman- Wunsch foi implementado no programa de computador NEEDLE. Para o propósito da presente invenção, foi usado o programa NEEDLE do pacote EMBOSS (versão 2.8.0 ou superior, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, Longden and Bleasby, Trends in Genetics 16, (6) pp 276277, http://emboss.bioinformatics.nl/). É usado EBLOSUM62 para as sequências de proteínas para a matriz de substituição. Para a sequência de nucleotídeos, é usado EDNAFULL. Os parâmetros opcionais usados são uma penalidade de abertura de lacunas de 10 e penalidade de extensão de lacuna de 0,5. A pessoa versada observará que todos esses parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a identidade de porcentagem geral de duas sequências não é significativamente alterada ao usar diferentes algoritmos.
[0031] Após o alinhamento pelo programa NEEDLE como descrito acima, a porcentagem de identidade de sequência entre uma sequência de consulta e uma sequência da invenção é calculada como a seguir: número de posições correspondentes no alinhamento que mostra um aminoácido idêntico ou um nucleotídeo idêntico em ambas as sequências dividido pelo comprimento total do alinhamento após a subtração do número total de vãos no alinhamento. A identidade como definido no presente documento pode ser obtida a partir de NEEDLE através do uso da opção NOBRIEF e é etiquetada na saída do programa como "identidade mais longa". Se ambas as sequências de aminoácidos que são comparadas não diferirem em que qualquer um dos seus aminoácidos, as mesmas são idênticas ou têm 100 8% de identidade. Em relação às enzimas originadas a partir de plantas como definido no presente documento, o elemento versado na técnica sabe que enzimas derivadas de planta podem conter um sinal de direcionamento de cloroplasto deve ser clivado através de enzimas específicas, como, por exemplo, enzimas de processamento de cloroplasto (CPEs).
[0032] Dependendo da célula hospedeira, os polinucleotídeos como definido no presente documento podem ser otimizados para expressão na respectiva célula hospedeira. O elemento versado sabe como gerar tais polinucleotídeos modificados. Entende-se que os polinucleotídeos como definido no presente documento abrange também tais moléculas de ácido nucleico otimizadas por hospedeiro desde que os mesmos expressem o polipeptídeo com as respectivas atividades como definido no presente documento.
[0033] Assim, em uma modalidade, a presente invenção é direcionada para uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, compreendendo —“polinucleotídeos que codificam DHs como definido no presente documento que são otimizados para expressão na dita célula hospedeira, sem nenhuma impacto no crescimento de padrão de expressão da célula hospedeira ou das enzimas. Particularmente, uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, é selecionada a partir de Yarrowia, como Yarrowia lipolytica, em que os polinucleotídeos que codificam as RDHs como definido no presente documento são selecionados a partir de polinucleotídeos com pelo menos 60 %, como, por exemplo, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 % ou até 100 % de identidade com as SEQ ID NOs:2, 5, 6 ou 7.
[0034] As RDHs como definido no presente documento abrange também enzimas que carregam substituição (ou substituições) de aminoácido que não alteram atividade enzimática, isto é, que mostra as mesmas propriedades em relação à enzima do tipo selvagem e catalisa a conversão de retinal em retinol, em particular, com uma conversão total de pelo menos cerca de 90 % para a produção de retinol. Tais mutações são denominadas também “mutações silenciosas”, que não alteram a atividade (enzimática) das enzimas como descrito no presente documento.
[0035] Uma molécula de ácido nucleico de acordo coma invenção pode compreender apenas uma porção ou um fragmento da sequência de ácido nucleico fornecida pela presente invenção, como, por exemplo, sequências de polinucleotídeo ou de acordo com as SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 6 ou 7, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento que pode codificar uma porção de uma RDH como definido no presente documento. A sequência de nucleotídeos determinada a partir da clonagem do gene de RDH permite a geração de sondas e iniciadores projetados para uso na identificação e/ou clonagem de outros homólogos a partir de outras espécies. A sonda/iniciador compreende tipicamente oligonucleotídeos substancialmente purificados que compreendem tipicamente uma região de sequência de nucleotídeos que hibridiza, de preferência, sob condições altamente rigorosas a pelo menos cerca de 12 ou 15, de preferência, a cerca de 18 ou 20, com mais preferência, a cerca de 22 ou 25, ainda com mais preferência, a cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou 75 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência de nucleotídeos de acordo com as SEQ ID NOs: 2, 4, 5, 6 ou 7 ou um fragmento ou derivado do mesmo.
[0036] Um exemplo não limitante preferencial de tais condições de hibridização em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 ºC, seguida por uma ou mais lavagens em lx SSC, 0,1 % de SDS a 50 ºC, de preferência, a 55 ºC, com mais preferência, a 60 ºC em ainda com mais preferência, a 65 “ºC.
[0037] As condições altamente rigorosas incluem, por exemplo, incubação de 2 h a 4 dias a 42 ºC com o uso de uma sonda de DNA etiquetada com digoxigenina (DIG) (preparada através do uso de um sistema de etiquetagem de DIG; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemanha) em uma solução, como solução DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) com ou sem 100 ug/ml de DNA de esperma de salmão, ou uma solução que compreende 50 8% de formamida, 5x SSC (NaCl a 150 mM, citrato de trissódio a 15 mM), 0,02 % de dodecil sulfato de sódio, 0,1 % de N-lauroilsarcosina, e 2 % de reagente de bloqueio (Roche Diagnostics GmbH), seguido por lavagem dos filtros duas vezes por 5 a 15 minutos em 2x SSC e 0,1 % de SDS à temperatura ambiente e, então, lavagem de duas vezes por 15-30 minutos em 0,5x SSC e 0,1 % de SDS ou 0,1x de SSC e 0,1 % de SDS a 65-68 “C.
[0038] A expressão das enzimas/polinucleotídeos que codificam uma das RDHs específicas como definido no presente documento pode ser alcançada em qualquer sistema hospedeiro, incluindo (micro)organismos, que é adequado para produção de carotenoides/retinoides e que permite expressão dos ácidos nucleicos que codificam uma das enzimas como revelado no presente documento, incluindo equivalentes funcionais ou derivados como descrito no presente documento.
Exemplos de (micro) organismos hospedeiros produtores de carotenoide/retinoide são bactérias, algas, fungos, incluindo leveduras, células vegetais ou animais.
As bactérias preferenciais são essas dos gêneros Escherichia, como, por exemplo, Escherichia coli, Streptomyces, Pantoea (Erwinia), Bacillus, Flavobacterium, Synechococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Mixococcus, Brevibacterium, Bradyrhizobium, Gordonia, Dietzia, Muricauda, Sphingomonas, Synochocystis, Paracoccus, como, por exemplo, Paracoccus zeaxanthinifaciens.
Os microrganismos eucarióticos, em particular, fungos que incluem levedura, são selecionados a partir de Saccharomyces, como Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, como Aspergillus niger, Pichia, como Pichia pastoris, Hansenula, como Hansenula polymorpha, Phycomyces, como Phycomyces blakesleanus, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia, Blakeslea, como, por exemplo, Blakeslea trispora ou Yarrowia, como Yarrowia lipolytica.
É particularmente preferencial a expressão em uma célula hospedeira fúngica, como, por exemplo, Yarrowia ou Saccharomyces, ou a expressão em Escherichia, com mais preferência, a expressão em JYarrowia lipolytica Ou
Saccharomyces cerevisiae.
[0039] Em relação à presente invenção, entende-se que os organismos, como, por exemplo, microrganismos, fungos, algas ou plantas, incluem também sinônimos ou basônimos de tais espécies que têm as mesmas propriedades fisiológicas, como definido pelo Código Internacional de Nomenclatura de Procariotas ou pelo Código Internacional de Nomenclatura para algas, fungos e plantas (Código de Melbourne).
[0040] Como usado no presente documento, uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, é uma célula hospedeira, em que os respectivos polipeptídeos são expressos e ativos in vivo que levam à produção de carotenoides, por exemplo, betacaroteno. Os genes e métodos para gerar célula hospedeira produtora de carotenoide são conhecidos na técnica, consulte, por exemplo, o documento WO2006102342. Dependendo do carotenoide a ser produzido, genes diferentes podem ser envolvidos.
[0041] Como usado no presente documento, uma célula hospedeira produtora de retinoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, é uma célula hospedeira em que os polipeptídeos são expressos e ativos in vivo, que levam à produção de retinoides, por exemplo, vitamina A e seus precursores, através da conversão enzimática de betacaroteno através de retinal e retinol. Esses polipeptídeos incluem as RDHs como definido no presente documento. Os genes da trajetória de vitamina A e métodos para gerar célula hospedeira produtora de retinoides são conhecidos na técnica. De preferência, o betacaroteno é convertido em retinal através da ação de enzimas oxidantes de betacaroteno, o retinal é convertido adicionalmente em retinol através da ação de RDHs como definido no presente documento, e o retinol é convertido em acetato de retinol através de ação de enzimas acetil-transferase, como, por exemplo, ATFl. O acetato de retinol pode ser o retinoide de escolha que é isolado a partir da célula hospedeira.
[0042] A presente invenção é direcionada para um processo para produção de retinol, em particular, com uma conversão total de pelo menos 90 %, através da redução de retinal pela ação de uma RDH como descrito no presente documento, em que a quantidade de retinal na mistura de retinol produzida é cerca de 10 8% ou menos, em que as enzimas redutoras de retinal são, de preferência, heterólogas expressadas em uma célula hospedeira adequada sob condições adequadas como descrito no presente documento. O retinol produzido pode ser isolado e purificado adicionalmente a partir do meio e/ou célula hospedeira. Em uma modalidade adicional, o retinol pode ser usado como precursor em um processo de múltiplas etapas que leva à vitamina A. A vitamina A pode ser isolada e purificado opcional e adicionalmente a partir do meio e/ou célula hospedeira como conhecido na técnica.
[0043] Assim, a presente invenção é direcionada para um processo para diminuir a porcentagem de retinal em uma mistura de retinol, ou para aumentar a porcentagem de retinol em uma mistura de retinol, em que o retinol é gerado através de contato de uma das RDHs como definido no presente documento com retinal, resultando em uma mistura de retinol/retinal com uma porcentagem de pelo menos cerca de 90 % de retinol ou cerca de 35 % ou menos de retinal.
Particularmente, o dito processo que compreende (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica uma das RDHs como definido no presente documento em uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como definido no presente documento, (b) clivar enzimaticamente o retinal em retinol através da ação da dita RDH expressada em que a porcentagem de retinol é pelo menos 90 % com base na quantidade total de retinal e retinol na mistura de retinol, e, opcionalmente, (3) converter retinol, de preferência trans- retinol, em vitamina A sob condições adequadas conhecidas pelo elemento versado.
[0044] A célula hospedeira, isto é, microrganismo, algas, fungos, célula animal ou vegetal, que tem capacidade de expressar os genes produtores de betacaroteno, os genes de RDH como definido no presente documento, opcionalmente, os genes que codificam enzimas que oxigenam betacaroteno e/ou, opcionalmente, genes adicionais exigidos para biossíntese de vitamina A, podem ser cultivados em um meio aquoso suplementado com nutrientes apropriados sob condições aeróbicas ou anaeróbicas e como conhecido pelo elemento versado para células hospedeiras diferentes. Opcionalmente, tal cultivo é na presença de proteínas e/ou cofatores envolvidos na transferência de elétrons, como definido no presente documento. o cultivo/crescimento da célula hospedeira pode ser conduzido na batelada, batelada alimentada, modo semicontínuo ou contínuo. Dependendo da célula hospedeira, de preferência, a produção de retinoides, como, por exemplo, a vitamina A e precursores, como retinal, retinol, podem variar, como é conhecido pelo elemento versado. O cultivo e o isolamento de betacaroteno e célula hospedeira produtora de retinoides selecionada a partir de Yarrowia como descrito, por exemplo, no documento WO2008042338. Em relação à produção de retinoides nas células hospedeiras selecionadas a partir de E. coli, métodos são descritos em, por exemplo, Jang et al, Microbial Cell Factories, 10:95 (2011). os métodos específicos para produção de betacaroteno e retinoides em células hospedeiras de levedura, como, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, são revelados, por exemplo, no documento WO2014096992.
[0045] Como usado no presente documento, o termo "atividade específica" ou "atividade" em relação às enzimas significa sua atividade catalítica, isto é, sua habilidade de catalisar a formação de um produto a partir de um determinado substrato. A atividade específica define a quantidade de substrato consumida e/ou produto produzido em um determinado período de tempo e por quantidade definida de proteína em uma temperatura definida. Tipicamente, a atividade específica é expressa em umol de substrato consumido ou em produto formado por min por mg de proteína. Tipicamente, umol/min é abreviado por U (= unidade). Portanto, as definições de unidade para atividade específica de umol/min/(mg de proteína) ou U/(mg de proteína) são usadas de modo intercambiável ao longo desse documento. Uma enzima é ativa, se realizar sua atividade catalítica in vivo, isto é, na célula hospedeira como definido no presente documento ou em um sistema na presença de um substrato adequado. O elemento versado sabe como medir atividade enzimática, em particular, atividade de
RDHs como definido no presente documento. Os métodos analíticos para avaliar a capacidade de uma RDH adequada como definido no presente documento para produção de retinol a partir de conversão de retinal são conhecidos na técnica, como, por exemplo, descrito no Exemplo 4 do documento WO2014096992. Em suma, titulações de produtos, como retinol, trans-retinal, cis-retinal, betacaroteno e similares podem ser medidas por HPLC.
[0046] Os retinoides como usado no presente documento incluem produtos de clivagem de betacaroteno conhecidos também como apocarotenoides, incluindo, mas não se limita ao retinal, ácido retinólico, retinol, metóxido retinóico, acetato de retinila, ésteres de retinila, 4-ceto-retinoides, 3 hidroxi-retinoides ou combinações dos mesmos. Uma mistura que compreende retinal e retinol é chamada de “mistura de retinol” no presente documento, em que a porcentagem de “pelo menos cerca de 90 %” em relação ao retinol ou “cerca de 10 % ou menos” em relação ao retinal se refere à razão de retinol para retinal em tal mistura de retinol. A biossíntese de retinoides é descrita, por exemplo, no documento WO2008042338.
[0047] O retinal como usado no presente documento é conhecido sob o nome de IUPAC (2E,4E,6E,8E)-3,7-Dimetil-9- (2,6, 6-trimetilciclo-hexen-l1-il)nona-2,4,6,8-tetraenal. É chamado de modo intercambiável no presente documento de retinaldeído ou aldeído de vitamina A inclui tanto isoformas cis- quanto trans-isoformas, como, por exemplo, l1-cis retinal, 1l13-cis retinal, trans-retinal e todos os trans retinal.
[0048] O termo “carotenoides” como usado no presente documento é bem conhecido na técnica. Inclui 40 polienos de isoprenoide conjugado com e longos que são formados na natureza pela ligação de duas moléculas de pirofosfato de geranilgeranila de 20 carbonos. Esses incluem, mas não se limitam a fitoeno, licopeno e caroteno, como, por exemplo, betacaroteno, que pode ser oxidado na posição 4-ceto ou na posição 3-hidróxi para render cantaxantina, zeaxantina ou astaxantina. A biossíntese de carotenoides é descrita, por exemplo, no documento WO2006102342.
[0049] A vitamina A como usado no presente documento pode ser qualquer forma química de vitamina A encontrada em soluções aquosas, como, por exemplo, não dissociada, na sua forma ácida livre ou dissociada como um ânion. O termo como usado no presente documento inclui todos os precursores ou intermediários na trajetória de vitamina A biotecnológica. Isso inclui também o acetato de vitamina A.
[0050] Em particular, a presente invenção apresenta as presentes modalidades: - Uma célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, compreendendo uma retinol desidrogenase [EC 1.1.1.105], a dita célula hospedeira que produz uma mistura de retinol compreendendo retinal e retinol, em que a porcentagem de retinol é de pelo menos cerca de 90 %, de preferência, 92, 95, 97, 98, 99 ou mesmo 100 % em comparação com a quantidade de retinal presente na dita mistura de retinol.
- A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como acima e definido no presente documento, em que o retinal a ser reduzido através da ação do retinol desidrogenase compreende uma mistura de trans-retinal e cis-retinal, em que a porcentagem de trans-retinal na dita mistura de retinal está na faixa de pelo menos cerca de 61 a 98 %, de preferência, pelo menos cerca de 61 a 95%, com mais preferência, pelo menos cerca de 61 a 90 %.
- A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como acima e definido no presente documento, compreendendo uma retinol desidrogenase heteróloga.
- A célula hospedeira produtora de carotenoide como acima e definido no presente documento, em que a célula hospedeira é selecionada a partir de plantas, fungos, algas ou microrganismos, de preferência, selecionada a partir de fungos incluindo levedura, com mais preferência, a partir de Saccharomyces, Aspergillus, Pichia, Hansenula, Phycomyces, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia, Blakeslea ou Yarrowia, ainda com mais preferência, a partir de Yarrowia lipolytica ou Saccharomyces cerevisiae.
- A célula hospedeira produtora de carotenoide como acima e definido no presente documento, em que a célula hospedeira é selecionada a partir de plantas, fungos, algas ou microrganismos, de preferência, selecionada a partir de Escherichia, Streptomyces, Pantoea, Bacillus, Flavobacterium, Synechococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Mixococcus, Brevibacterium, Bradyrhizobium, Gordonia, Dietzia, Muricauda, Sphingomonas, Synochocystis ou Paracoccus.
- A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como acima e definido no presente documento, em que a retinol desidrogenase é selecionada a partir de fungos, de preferência, Fusarium, com mais preferência, Fusarium fujikuroi, com máxima preferência, selecionada a partir do grupo F. fujikuroi RDHl12, particularmente, a partir de um polipeptídeo com pelo menos 60 % de identidade com um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1l ou sequências codificadas por um polinucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO:2.
- A célula hospedeira produtora de carotenoide como acima e definido no presente documento, em que o retinol é convertido adicionalmente em vitamina A.
- A célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, como acima e definido no presente documento, compreendendo adicionalmente uma enzima oxidante de betacaroteno trans- seletiva selecionada a partir de Drosophila que catalisa a conversão de betacarotenoto em uma mistura de retinal, em que a mistura compreende pelo menos cerca de 61 %, de preferência, 65, 68, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou até 100 % de retinal na trans-isoforma com base na quantidade total de retinal na mistura, com mais preferência, selecionada a partir de uma sequência com pelo menos 60 % de identidade com um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:3.
- Um processo para produção de uma mistura de retinol compreendendo retinol e retinal através de atividade enzimática de uma retinol desidrogenase [EC 1.1.1.105], que compreende o contato de retinal com a dita retinol desidrogenase, em que a razão de retinol para retinal na mistura de retinol é de pelo menos cerca de 9:1.
- Um processo para diminuir a quantidade de retinal em uma mistura de retinol produzida a partir de ação enzimática de retinol desidrogenase, o dito processo compreendendo o contato de retinal com um retinol desidrogenase como definido no presente documento, em que a quantidade de retinal na mistura de retinol resultante da dita ação enzimática está na faixa de cerca de 10 % ou menos em comparação a uma quantidade de retinol.
- Um processo para aumentar uma quantidade de retinol em uma mistura de retinol produzido a partir de ação enzimática de retinol desidrogenase, o dito processo compreendendo o contato de retinal com um retinol desidrogenase como definido no presente documento, em que a quantidade de retinol na mistura de retinol resultante da dita ação enzimática está na faixa de pelo menos cerca de 90 % em comparação a uma quantidade de retinol.
- Um processo de acordo com o supracitado e definido no presente documento com o uso da célula hospedeira produtora de carotenoide, particularmente, célula hospedeira fúngica, compreendendo uma retinol desidrogenase [EC 1.1.1.105]), a dita célula hospedeira que produz uma mistura de retinol compreendendo retinal e retinol, em que a porcentagem de retinol é de pelo menos cerca de 90 %, de preferência, 92, 95, 97, 98, 99 ou mesmo 100 3% em comparação a uma quantidade de retinal presente na dita mistura de retinol.
- Um processo para produção de vitamina A que compreende as etapas de: (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica uma retinol desidrogenase [EC 1.1.1.105] como definido no presente documento em uma célula hospedeira produtora de caroteno adequada, particularmente, célula hospedeira fúngica, (b) converter enzimaticamente retinal em uma mistura de retinol compreendendo retinol e retinal em uma razão de pelo menos cerca de 9:1, (c) converter retinol em vitamina A sob condições de cultivo adequadas.
- Uso de uma retinol desidrogenase [EC 1.1.1.105] como acima e definido no presente documento para produção de uma mistura de retinol compreendendo retinol e retinal em uma razão de 9:1, em que a retinol desidrogenase é heteróloga expressa em uma célula hospedeira produtora de carotenoide adequada, particularmente, célula hospedeira fúngica.
[0051] Os exemplos a seguir são apenas ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da invenção de forma alguma. Os conteúdos de todas as referências, pedidos de patente, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido são incorporados a título de referência pelo presente documento, em particular, o documento WO2006102342, WO2008042338 ou WO2014096992.
Exemplos Exemplo 1: Métodos Gerais, cepas e plasmídeos
[0052] Todos os procedimentos de biologia molecular básica e manipulação de DNA descritos no presente documento são, em geral, realizados de acordo com Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Nova Iorque (1989) ou Ausubel et al. (eds). Current Protocols in Molecular Biology. Wiley:
Nova Iorque (1998).
[0053] Ensaio de placa de agitação. Tipicamente, 800 ul de Extrato de levedura a 0,075 %, peptona a 0,25 % (0,25X YP) são inoculados com 10 pl de Yarrowia crescido recentemente e sobreposto com 200 ul de fonte de carbono de óleo mineral Drakeol 5 a 5% de óleo de milho no óleo mineral e/ou 5% em glicose em fase aquosa. os transformantes foram cultivados em placas de 24 poços (Multitron, 30 eC, 800 RPM) em meio YPD com dodecano a 20 % durante 4 dias. A fração de óleo mineral foi removida dos poços de placa de agitação e analisada por HPLC em uma coluna de fase normal, com um detector de matriz de fotodiodo.
[0054] Transformação de DNA. As cepas são transformadas através de crescimento durante a noite no meio de placa de YPD de 50 pl de células são raspadas a partir de uma placa e transformadas através de incubação em 500 pl com 1 ug de DNA de transformação, tipicamente, DNA linear para transformação integrativa, PEG 3550MW a 40 8%, acetato de lítio a 100 mM, Ditiotreitol a 50 mM, Tris-Cl a 5 mM com pH 8,0, EDTA a 0,5mM por 60 minutos a 40 C e semeadas diretamente para o meio seletivo ou no caso de seleção de marcador antibiótico dominante, as células são crescidas em meio líquido de YPD por 4 horas a 30 “C antes de semear no meio seletivo.
[0055] Biologia molecular de DNA. Os genes foram sintetizados com as extremidades NheIl e MluIl no vetor pUC57. Tipicamente, os genes foram subclonados nos vetores MB5082 "URA3', MB6157 HygR e MB8327 NatR para seleção de marcador em transformações de Yarrowia lipolytica, como no documento
WO2016172282. Para a inserção de gene limpa através da junção de extremidade não homóloga aleatório do gene e do marcador HindIII/XbaI (MB5082) ou PvuIlI (MB6157 e MB8327), purificados respectivamente através de eletroforese em gel e coluna de purificação em gel Qiagen.
[0056] Lista de plasmídeos. As sequências de plasmídeo, cepas, nucleotídeos e aminoácidos a serem usadas são listadas na Tabela 1, 2 e a listagem de sequências. As sequências de nucleotídeos ID NOs:2, 4, 5, 6 e 7 são otimizadas por códon para expressão em Yarrowia.
[0057] Tabela 1: lista de plasmídeos usada para construção das cepas que carregam os genes de RDH heteróloga. As sequências ID NOs se referem aos insertos. Para mais detalhes, consulte texto.
plasmídeo de MB Principal | Inserto | SEQ ID NO: :
[0058] Tabela 2: lista de cepas de Yarrowia usada para produção de retinoides que carregam os genes de RDH heteróloga. Para mais detalhes, consulte texto.
Cepa de Descrição Primeiramente ee ps APP 7788 Cepa de caroteno documento Fo Ea
Cepa de Descrição Primeiramente
FT EE 15710 ML7788 transformado com MB7311 documento
FE EL 17544 ML15710 curado de URA3Z por FOA aqui PF MEEESA= 17767 ML17544 transformado com MB6072 |aqui DMBCO-URA3 e MB6732 SLbATF1-HygR e curado de marcadores 17978 ML17968 transformado com MB8200 |aqui FÍRDH-URA3 e curado de marcadores
[0059] Método de retinol de fase normal. Uma bomba binária Waters 1525 fixa a um amostrador automático 717 foi usada para injetar amostras. Foi usado um Phenomenex Luna de Sílica 3 p (2), 150 x 4,6 mm com um kit de coluna de proteção de sílica de segurança para resolver retinoides. A fase móvel consiste em 1000ml de hexano, 30ml de isopropanol e 0,lml de ácido acético para compostos relacionados à astaxantina, ou 1000 ml de hexano, 60 ml de isopropanol e O0,lml de ácido acético para compostos relacionados à zeaxantina. A taxa de fluxo para cada um é 0,6 ml por minuto. A temperatura de coluna é ambiente. O volume de injeção é 20 nl. O detector é um detector de matriz de fotodiodo que coleta de 210 a 600 nm. Os analitos foram detectados de acordo com a Tabela 3.
[0060] Tabela 3: lista de analitos que usam o método de retinol de fase normal. Para mais detalhes, consulte texto.
Intermediários Tempo de retenção Lambda máx.
l1-cis-di-hidro- 7,1 293 acetato de 3,5 326 Eme PE
[0061] Preparação de amostra. As amostras foram preparadas “através de vários métodos dependendo das condições. Para amostras de caldo inteiro ou caldo lavado, o caldo foi colocado em um tubo de PrecellysO pesado e a fase móvel foi adicionada, as amostras foram processadas em um homogeneizador Precellys& (Bertin Corp, Rockville, MD, EUA) na configuração mais alta 3X de acordo com as direções de fabricação. No caldo lavado, as amostras foram centrifugadas em um tubo de 1,7 ml em uma microcentrífuga a 10000 rpm por 1 minuto, o caldo decantado, 1 ml de água adicionado peletizado e decantado e levado ao volume original em que a mistura foi peletizada novamente e levada a uma quantidade apropriada de fase móvel e processada através de batidas de esferas de PrecellysO. Para a análise de fração de óleo mineral, a amostra foi centrifugada a 4000 RPM por 10 minutos e o óleo foi decantado do topo através de pipeta de deslocamento positiva (Eppendorf, Hauppauge, NY, EUA) e diluída na fase móvel através de vórtice e medida para concentração de retinoide por análise de HPLC.
[0062] Condições de fermentação. As fermentações foram idênticas às condições previamente descritas com o uso de sobreposição de óleo mineral e tanque agitado que foi alimentado com óleo de milho em um reator de bancada com 0,5 l1 a 5 l1 de volume total (consulte o documento WO2016172282). Em geral, os mesmos resultados foram observados com um tanque agitado com batelada alimentada com uma produtividade aumentada que demonstra a utilidade do sistema para a produção de retinoides. Exemplo 2: Produção de retinoides em Yarrowia lipolytica
[0063] Tipicamente, a cepa de betacaroteno ML17767 foi transformada com fragmentos de HinDIII/XbaIl purificados derivados de plasmídeos que contém ligante de fragmentos de gene de retinol desidrogenase (RDH) para um promotor URA3. Seis a oito isolados foram examinados em relação a uma diminuição no retinol: razão de retinal em um ensaio de placa de agitação e isolados bem-sucedidos foram executados em um reator de tanque agitado com batelada alimentada por oito dias, o que mostrou uma ordem de aumento de magnitude na produtividade do processo que indica uma utilidade na produção em larga escala. Os melhores resultados foram obtidos com o homólogo Fusarium RDH12 apenas com 2 % ou retinal residual mantido após 8 dias de incubação em frasco de agitação como descrito acima. O isolado derivado a partir da sequência Fusarium demonstrou uma redução de retinol aumentada como indicado na tabela a seguir. Exemplo 3: Produção de retinoides em Saccharomyces cerevisiae
[0064] Tipicamente, uma cepa de betacaroteno é transformada com genes heterólogos que codificam enzimas, como geranilgeranil sintase, fitoeno sintase, licopeno sintase, licopeno ciclase, construída que está produzindo betacaroteno de acordo com métodos padrão como conhecidos na técnica (como, por exemplo, como descrito no documento US20160130628 ou MWO2009126890). Adicionalmente, quando transformado com betacaroteno, o retinal de genes de oxidase pode ser produzido. Adicionalmente, quando transformado com retinol desidrogenase, então, o retinol pode ser produzido. Com essa abordagem, resultados similares em relação de especificidade para produtividade para retinol são obtidos. Exemplo 4: Produção de retinol a partir de betacaroteno
[0065] Além das únicas modificações descritas nos Exemplos 2, 3 e 4, uma cepa foi construída carregando os heterólogos em conjunto com a FtRDHI2 heteróloga. A fermentação e a análise dos retinoides foi feita como descrita anteriormente.
[0066] Para expressão de BCO heteróloga de Drosophila melanogaster DmNinaB (DmMBCOl; SEQ ID NO:3), uma cepa de betacaroteno ML17544 foi transformada com fragmento de DNA linear purificado através de clivagem de endonucleotídeo de restrição mediada por HindII e XbaI de betacaroteno oxidase (BCO) contendo fragmentos otimizados para códon ligados a uma marcador nutricional URA3. A transformação de DNA foi derivada a partir de gene de BCO de Drosophila NinaB MB6702,
pela qual as sequências otimizadas por códon (SEQ ID NO:4) foram usadas. Então, o gene foi crescido ao examinar 6-8 isolados em uma análise de placa de agitação, os isolados que realizam bem foram executados em uma reação de tanque com batelada alimentada por 8-10 dias. A detecção de cis- e trans-retinal foi feita através de HPLC com o uso de parâmetros padrão como descrito no documento WO2014096992, mas calibrada com padrões purificados para os analitos de retinoide. A quantidade de trans-retinal na mistura de retinal heteróloga que expressa a BCO de Drosophila melanogaster (SEQ ID NO:3) resultou em 61 3% de trans- retinal com base na quantidade total de retinal (não mostrada).
[0067] A presença de FtRDH1I2 heteróloga reduziu uma quantidade de retinal detectada no analito de 20 % a 4 &%, que é uma boa indicação para atividade de redução de retinal específica do Fusarium RDH12 (consulte Ex. 2), ainda com uma porcentagem de trans-retinol na faixa de pelo menos 61 %.

Claims (13)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula hospedeira produtora de carotenoide caracterizada por compreender uma retinol desidrogenase [EC
1.1.1.105], de preferência, uma retinol desidrogenase heteróloga, a dita célula hospedeira que produz uma mistura de retinoide compreendendo retinal e retinol, em que a porcentagem de retinol é de pelo menos cerca de 90 %, de preferência, 92, 95, 97, 98, 99 ou mesmo 100 3% em comparação com a quantidade de retinal presente na dita mistura de retinoide.
2. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o retinal a ser reduzido através de ação da retinol desidrogenase compreende uma mistura de trans-retinal e cis-retinal, em que a porcentagem de trans-retinal na dita mistura de retinal está na faixa de pelo menos cerca 61 a 98 %, de preferência, pelo menos cerca de 61 a 95 8%, com mais preferência, pelo menos cerca de 61 a 90 %.
3. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 Ou 2, caracterizada pelo fato de que a retinol desidrogenase é selecionada a partir de fungos, de preferência, Fusarium, com mais preferência, a retinol desidrogenase é uma retinol desidrogenase de Fusarium fujikuroi (FtRDH).
4, Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a FLRDH é selecionada a partir de um polipeptídeo com pelo menos cerca de 60 % de identidade com um polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:1.
5. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada a partir de plantas, fungos, algas ou microrganismos, como selecionado a partir do grupo que consiste em Escherichia, Streptomyces, Pantoea, Bacillus, Flavobacterium, Synechococcus, Lactobacillus, Corynebacterium, Micrococcus, Mixococcus, Brevibacterium, Bradyrhizobium, Gordonia, Dietzia, Muricauda, Sphingomonas, Synochocystis, Paracoccus, Saccharomyces, Aspergillus, Pichia, Hansenula, Phycomyces, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia e Blakeslea, de preferência, selecionada a partir de fungos incluindo levedura, com mais preferência, selecionadas a partir do grupo que consiste em Saccharomyces, Aspergillus, Pichia, Hansenula, Phycomyces, Mucor, Rhodotorula, Sporobolomyces, Xanthophyllomyces, Phaffia, Blakeslea e Yarrowia, com mais preferência, a partir de Yarrowia lipolytica ou Saccharomyces cerevisiae.
6. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o retinol é convertido adicionalmente em vitamina A.
7. Célula hospedeira produtora de carotenoide, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a o, caracterizada por compreender adicionalmente uma enzima oxidante de betacaroteno estereosseletiva selecionada a partir de Drosophila que catalisa a conversão de betacaroteno em uma mistura de retinal, em que a mistura compreende pelo menos cerca 61 %, de preferência 68, 70, 75,
80, 85, 90, 95, 98 ou até 100% de retinal na trans- isoforma com base na quantidade total de retinal na mistura, com mais preferência, selecionada a partir de uma sequência com pelo menos 60 % de identidade com uma polipeptídeo de acordo com a SEQ ID NO:3.
8. Processo para produção de uma mistura de retinoide caracterizado por compreender retinol e retinal através de uma atividade enzimática de uma retinol desidrogenase [EC
1.1.1.105]), compreendendo o contato de retinal com a dita retinol desidrogenase, em que a razão de retinol para retinal na mistura de retinoide é de pelo menos cerca de 9:1.
9. Processo para diminuir a quantidade de retinal em uma mistura de retinoide produzida a partir de ação enzimática de retinol desidrogenase, sendo o dito processo caracterizado por compreender o contato de retinal com uma retinol desidrogenase, em que a quantidade de retinal na mistura de retinoide resultante a partir da dita ação enzimática está na faixa de cerca de 10% ou menos em comparação com à quantidade de retinol.
10. Processo para diminuir a quantidade de retinol em uma mistura de retinoide produzida a partir de ação enzimática de retinol desidrogenase, sendo o dito processo caracterizado por compreender o contato de retinal com uma retinol desidrogenase, em que a quantidade de retinol na mistura de retinoide resultante a partir da dita ação enzimática está na faixa de pelo menos cerca de 90 % em comparação com a quantidade de retinol.
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado por usar a célula hospedeira produtora de carotenoide conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
12. Processo para produção de vitamina A caracterizado por compreender as etapas de: (a) introduzir uma molécula de ácido nucleico que codifica uma retinol desidrogenase [EC 1.1.1.105] em uma célula hospedeira produtora de caroteno adequada, (b) converter enzimaticamente retinal em uma mistura de retinol compreendendo retinol e retinal em uma razão de pelo menos cerca de 9:1, (c) converter retinol em vitamina A sob condições de cultivo adequadas.
13. Uso caracterizado por ser de uma célula hospedeira produtora de carotenoide conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores 1 a 7 para produção de uma mistura de retinol compreendendo retinol e retinal em uma razão de 9:1.
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