CZ293836B6 - Způsob výroby @@aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny působením expandázy na penicilin G - Google Patents

Abstract

Celkový způsob přípravy a izolace @@aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny }@@ADCAB pomocí enzymatického působení na rozšíření kruhu penicilinu G použitím Penicillium chrysogenum transformantní linie exprimující expandázuŕ

Description

Předložený vynález se týká biosyntetického způsobu přípravy a izolace 7- aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny (7-ADCA).

Dosavadní stav techniky:

β-Laktamová antibiotika tvoří nejdůležitější skupinu antibiotických sloučenin, s dlouhou historií klinického používání. V této skupině jsou prominentní peniciliny a cefalosporiny. Tyto sloučeniny se přirozeně produkují vláknitou houbou Penicillium chrydogenum, respe. Acemonium chrysogenum.

V důsledku zlepšených postupů klasických kmenů se v posledním desetiletí úroveň výroby antibiotik v Penicillium chrydogenum, a Acemonium chrysogenum dramaticky zvýšila. Se vzrůstajícími znalostmi biosyntetických postupů vedoucích k penicilinům a cefalosporinům, a nástupem rekombinantních DNA technologií, se staly dostupnými nové nástroje pro zdokonalení výroby kmenů a pro derivatizaci sloučenin in vivo.

Bylo identifikováno mnoho enzymů obsažených v β-laktamových biosyntézách, a byly klonovány jejich odpovídající geny, jak lze nalézt v Ingolia a Queener, Med. Res. Rev. 9 (1989), 245264 (biosyntetický postup a enzymy), a Aharonowitz, Cohen, a Martin, Ann. Rev. Microbiol. 46 (1992), 461-495 (genové klonování).

Prvními dvěma kroky v biosyntéze penicilinu v P chrysogenum je kondenzace tří aminokyselin L-5-animo-5-karboxypentanové kyseliny (L-aminoadipové kyseliny) (A), L-cysteinu (C) a L-valinu (V), na tripeptid LLD-ACV, následovaná cyklizací thoto tripeptidu za vzniku izopenicilinu N. Tato sloučenina obsahuje typickou β -laktamovou strukturu.

Třetí krok zahrnuje výměnu hydrofilního bočního řetězce L-5-animo-5-karboxypentanové kyseliny hydrofobním bočním řetězcem působením enzymu acyltransferázy (AT). Enzymatická výměnná reakce zprostředkovaná AT nastává uvnitř celulámí organely, mikrotělíska, a je popsána v EP-A-0448180.

Cefalosporiny jsou mnohem dražší než peniciliny. Jedním důvodem je to, že některé cefalosporiny (např. cefalesin) jsou vyrobeny z penicilinů řadou chemických konverzí. Jiným důvodem je to, že doposud mohly být fermentovány pouze cefalosporiny s D-5-amino-5-karboxypentanoylovým bočním řetězcem. Cefalosporin C, z tohoto hlediska doposud nejdůležitější výchozí materiál, je velice rozpustný ve vodě při jakémkoliv pH, tudíž předpokládá dlouhé a drahé izolační postupy použitím těžkopádné a finančně nákladné kolonové technologie. Tímto způsobem získaný cefalosporin C se musí přeměnit na terapeuticky používané cefalosporiny řadou chemických a enzymatických konverzí.

Postupy běžně používané v průmyslu při přípravě meziproduktu 7-ADCA zahrnují komplex chemických stupňů vedoucích k rozšíření a derivatizaci penicilinu G. Jeden z nezbytných chemických stupňů při výrobě 7-ADCA zahrnuje expanzi 5-členné kruhové struktury penicilinu na 6-člennou kruhovou strukturu cefalosporinu (viz např. US 4 003 894). Tento komplex chemických postupuje rovněž finančně náročný a nebezpečný pro okolí.

Proto existuj velká potřeba nahradit tyto chemické postupy enzymatickými reakcemi, jako jsou enzymatické katalýzy, přednostně během fermentace. Klíčem k nahražení chemického

-1 CZ 293836 B6 expanzního způsobu biologickým postupem je centrální enzym v cefalosporinové biosyntetické dráze, syntetáza deacetoxycefalosporinu C, nebo expandáza.

Bylo nalezeno, že enzym expandáza z bakterie Streptomyces clavuligerus provádí in vitro. v některých případech rozšíření pěnicilinového kruhu (Baldwin a kol, Tetrahedron 43(13) 3009 (1987). V Cantwell a kol. (Current Genetics, 17, 213-221 (1990) je popsána exprese S. clavuligerus expandázy vP. chrysogenum. Exprese expandázy neměla za následek vytvoření cefalosporinů ve fermentaci, jak se předpokládá v publikacích. Pouze tehdy, když se zabuduje do P. chrysogenum společně s izopenicilinem N gen epimerázy S. clavuligerus, předpokládá se konverze penicilinové kruhové struktury penicilinu N (jeho přirozeného substrátu) na cefalosporinovou kruhovou strukturu desacetoxycefalosporinu C (jeho přirozený produkt), jak je popsáno v Cantwell a kol., Proč. R. Soc. Lond. B. 248 (1992), 283-289. Enzym expandáza byl velice dobře charakterizován (EP-A-O366354) biochemicky i funkčně, jako má jeho odpovídající gen. Obě fyzikální mapy cefE genu (EP-A-0341892), DNA sekvence a transformační studie v P. chrysogenum s cefE byly popsány.

Jiným zdrojem kruhového expanzního enzymu je bakterie Nocardia lactamdurans (dříve Streptomycs lactamdurans). Biochemické vlastnosti enzymu s DNA sekvence genu byly popsány (Cortes a kol, J. Gen. Microbiol. 133 (1987). 3165-314; resp. Coque a kol., Mol. Gen. Genet. 236 (1993), 453-458).

Jelikož expandáza katalyzuje rozšíření 5-členného thiazolidinového kruhu penicilinu N na 6-členný dihydrothiazinový kruh deacetoxycefalosporinu C, bude tento enzym samozřejmě logickým kandidátem pro náhradu kroků rozšiřování kruhu v chemickém postupu. Překvapivě pracuje enzym na meziproduktu penicilinu N cefalosporinové biosyntetické cesty, ale nikoliv na snadně dostupných levných penicilinech, jak se produkuje P, chrysogenum. včetně penicilinu G . Penicilín N je komerčně nedostupný a dokonce když expanduje, nemůže být jeho D-aminoadipylový boční řetězec snadno odstraněn penicilinovými acylázami.

Nedávno bylo zjištěno, že enzym expandáza je schopný expandování penicilinů s konkrétními bočními řetězci na odpovídající 7-ADCA deriváty. V EP-A-268343 je popsán in vitro postup rozšíření penicilinu se 3-karboxyfenylacetylovým nebo adipoylovým bočním řetězcem použitím syntetázy deacetoxycefalosporinu C. Tento znak expandázy byl využit v technologii, jak je popsána vEP-A-0532341, EP-A-0540210, W095/014149. V těchto popisech jsou běžné chemické konverze penicilinu G na 7-ADCA nahraženy in vivo konverzí určitých derivátů 6-aminopenicilanové kyseliny (6-APA) v rekombinantních Penicillim chrysogenum liniích obsahujících gen expandázu.

Konkrétněji, EP-A-0532341 uvádí in vivo použití enzymu expandázy v P. chrysogenum v kombinaci s 5-karboxypentanoylovým bočním řetězcem jako vstupní surovinou, která je substrátem pro enzym acyltransferázu v P. chrysogenum. To vede k vytvoření 5-karboxypentynoyl-6-APA, která je přeměněna enzymem expandázou zavedenou do P. chrysogenum řetězce za vytvoření 5-karboxypentanoyl-7-ADCA. Konečně, odstranění 5-karboxypentanoylového bočního řetězce je doporučeno, za vzniku 7-ADCA jako konečného produktu.

Ve W095/04149 je uvedeno, že 3-karboxymethylthiopropionová kyselina a 3,3—thiodipropionová kyselina byly nalezeny jako substráty pro expandázu, za vzniku 2-(karboxyethylthio) acetyl- a 3-(karboxymethylthio) - propionyI-7-ADCA.

Postup podle předloženého vynálezu však poskytuje více výhod, vzhledem k vysoké pen G syntézové kapacitě penicilín produkujících kmenů a mnohem výhodnějšímu postupu extrakce fenylacetyl-7-ADCA-kyseliny. Rovněž fenylacetylový boční řetězec penicilinu je mnohem přístupnější enzymatickému štěpení penicilinovými G amidázami produkovanými řadou typů mikroorganismů s výtěžkem 6-APA, například separázou G, jak je popsáno v EP-A-0453047.

-2CZ 293836 B6

Různé publikace uváděly, že expandáza neakceptuje penicilín G jako substrát pro expanzi (Baldwin & Abraham (1988), Natural Produkt Reports, 5 (2), p. 129-145; Maeda a kol. (1955),

Enzyme and Microbial Technology, 17, 231-234; Crawford a kol. (1995), Bio/technology, 13, p.

58-61; Wu/Kuang Yeh a kol, v 50. letech Penicillin Application (vyd. Kleinkauf a Von Dohren),

209 (1991), viz konkrétně tabulku 3 A).

Avšak nyní bylo překvapivě zjištěno, že penicilín G produkující P. chrysogenum transformovaný expandázu kódujícím genem je schopný produkovat fenylacetyldesacetoxycefalosporanovou kyselinu.

Podstata vynálezu:

Předložený vynález poskytuje způsob přípravy a izolace 7-aminodesacetyxycefalosporanové 15 kyseliny (7-ADCA):

a) transformováním Penicillium chrysogenum kmene expandázovým genem, při transkripční a translační regulaci houbových signálů exprese;

b) fermentací uvedených kmenů v kultivačním prostředí a přidáním kyseliny fenyloctové nebo její soli nebo esteru do uvedeného kultivačního média za získání penicilinu G , který je expandován, aby vytvořil fenylacetyl-7-ADCA;

c) izolováním fynylacetyl-7-ADCA z fermentační živné půdy;

d) deacylací fenylacetyl-7-ADCA; a

e) izolován krystalické 7-ADCA.

Výhodně je stupněm (e) filtrace.

Výhodně je fenylacetal-7-ADCA-izolována z fermentační živné půdy extrahováním filtrátu živné půdy organickým rozpouštědlem nemísitelným s vodou při pH nižším než asi 4,5 a zpětným extrahováním toho samého vodou při pH mezi 4 a 10.

Navíc, vektor rekombinantní DNA obsahující DNA kódující expandázu, funkčně vázanou na transkripční a translační řídící prvky houbového genu, například Aspergillus nidulans gpdA gen a Aspergillus niger glcA gen a hostitelské buňky transformované tím samým, jsou poskytnuty.

Podrobný popis vynálezu

Předložený vynález se týká použití funkčních genových konstruktů v P. chrysogenum pro in vivo rozšíření kruhové struktury penicilinu G za vzniku derivátu klíčového meziproduktu v cefalo45 sporinové biosyntéze, 7-aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny, nebo 7-ADCA. Tento derivát má takové chemické složení, že umožňuje účinnou extrakci rozpouštědlem, a tím poskytuje ekonomicky atraktivní izolační postup.

Transformace P, chrysogenum může být v podstatě dosaženo různými způsoby podání DNA, 50 jako je PEG-Ca zprostředkovaný absorpcí protoplastu, elektroporaci nebo technikami ostřelování částicemi, a výběrem transformantů. Viz například Van den Hondel en Punt, Gene Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi, v : Applied Molecular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennet, vyd.), Cambridge University Press (1991). Byla popsána aplikace dominantních a nedominantních selekčních markérů (Van den Hondel, supra). (P. chrysogenum

-3CZ 293836 B6 odvozený) tak heterologního (ne- P. chrysogenum odvozený) původu (Gouka a kol, J. Biotecho. 20(1991), 189-200).

Použití různých transformačních selekčních markérů, homologních nebo heterologních, za přítomnosti nebo absence vektorových sekvencí, fyzikálně vázaných nebo nevázaných na ne-selektivní DNA, při výběru transformantů, jsou dobře známy.

Reakce rozšiřování kruhu je zprostředkovaná zabudováním enzymu expandázy a tímto způsobem exprimováním v P. chrysogenum. například v linii Panlabs P14-B10, DS 18541 (uložené v DBS pod přijímacím číslem 455.95). Je jasné, že v případě rozšiřování kruhu se reakce provádí v jejich mutantách, podmínky prostředí musí být přizpůsobeny pro vytvoření účinného růstu.

Gen cefE je vložen pod transkripční a translační kontrolou houbových (jejich vlákny nebo nikoliv) genových kontrolních elementů, přednostně odvozených od genu Y P. chrysogenum, β tubulin genu, Aspergillus nidulans gpdA genu, enbo Aspergillus niger glcA genu.

Souhrnně se v předloženém vynálezu uvádí, jak může být aktivita expandázy enzymu zabudovaného do P. chrysogenum věnována in vivo do rozšíření kruhu penicilinu G.

Podle předloženého vynálezu je β -laktamový meziprodukt fenylacetyl-7-ADCA produkován v P. chrysogenum přidáním kyseliny fenyloctové nebo její soli nebo esteru do média. Vhodnými solemi jsou například sodné nebo draselné sole. 7-ADCA se z prostředí účinně izoluje jednoduchou extrakcí rozpouštědlem, například následujícím způsobem:

Živná půda se zfiltruje a k filtrátu se přidá organické rozpouštědlo nemísitelné s vodou. Nastaví se pH tak, aby se z vodné vrstvy extrahoval cefalosporin. Rozmezí pH má být nižší než 4,5; přednostně mezi 4 a 1, výhodněji mezi 2 a 1. Tímto způsobem se cefalosporin vyděluje z mnoha jiných nečistot přítomných ve fermantační půdě. Přednostně se používá malý objem organického rozpouštědla, a získá se koncentrovaný roztok cefalosporinu, čímž se dosáhne snížení objemových průtokových rychlostí. Druhou možností je extrakce celé živé půdy při pH 4 nebo nižší. Přednostně se živná půda extrahuje mezi pH 1 a 4 organickým rozpouštědlem nemísitelným s vodou.

Může se použít jakékoliv rozpouštědlo, které nenarušuje molekulu cefalosporinu. Vhodnými rozpouštědly například jsou butylacetát, ethylacetát, methylizobutylketon, alkoholy jako butanol, atd. Výhodně se použije butylacetát.

Potom je cefalosporin zpětně extrahován vodou při pH mezi 4 a 10, výhodně mezi 6 a 9. Opět se konečný objem drasticky sníží. Izolace se může provádět při teplotách mezi 0 a 50 °C, a výhodně při teplotách okolí.

Takto získaný vodný roztok cefalosporinu se zpracovává s vhodným enzymem, aby se odstranil fenylacetylový boční řetězec a získal se požadovaná 7-ADCA. Vhodným enzymem pro totéž je acyláza penicilinu G Jak je popsána v EP-A-0453047, označovaná také penicilinová amidáza.

Výhodně se používá imobilizovaný enzym, aby bylo možné použít enzym opakovaně. Metodika přípravy těchto částic a imobilizace enzymů byla široce popsána v EP-A-0222462. pH vodného roztoku má hodnotu například pH 4 až pH 9, při němž je degradační reakce cefalosporinu minimální, a požadovaná konverze s enzymem je optimální. Proto se enzym přidává do vodného roztoku cefalosporinu při udržování pH na příslušné hodnotě například přidáváním anorganické báze, jako je roztok hydroxidu draselného, nebo použitím kationtové výměnné pryskyřice. Když je reakce ukončena, imobilizovaný enzym se odstraní filtrací. Jinou možností je aplikace imobilizovaného enzymu v pevném nebo fluidním loži kolony, nebo použitím enzymu v roztoku a odstraňováním produktů membránovou filtrací. Následně se reakční směs okyselí za přítomnosti organického rozpouštědla nemísitelného s vodou.

-4CZ 293836 B6

Po nastavení pH na asi 0,1 až asi 1,5 se vrstva oddělí a pH vodné vrstvy se nastaví ne pH 2 až 5. Krystalická 7-ADCA se potom odfiltruje.

Deacylace se rovněž může provádět chemicky, jak je známo ze stavu techniky, například přes vytvoření iminochloridového bočního řetězce, přidáním chloridu fosforečného při teplotě nižší než 10 °C, a potom izobutanolu při teplotách okolí nebo nižších.

Následující příklady jsou předloženy pro ilustraci a nikoliv pro omezení rozsahu.

Příklady provedení vynálezu:

Příklad 1

Fermentační výroba fenyiacetyl-7-ADCA

P. chrysogenum linie Panlabs P14-P10, uložená v CBS pod číslem 455,95, se použije jako hostitelská linie pro konstrukty expresivní kazety expandázy.

Použitá expresivní kazeta obsahující gen expandázu pod IPNS genem P. chrysogenum transkripčními a translačními regulačními signály je popsána v Crawford a kol. (supra). Podmínky transformace a kultivace jsou popsány v Crawford a kol. (supra). Transformanty jsou purifikovány a analyzovány pro expresi enzymu expandázy testováním jejich kapacity pro výrobu adipoyl-7-ADCA, jak je popsáno Crawfordem a kol. (supra).

Adipoyl-7-ADCA produkující transformanty, jako například P, chrysogenum linie PC 100, uložená sATCC pod číslem 74182, jsou inokulovány při 2, 106 konidií/ml do očkovaného prostředí sestávajícího z (g/1): glukózy, 30; Pharmamedia (jedlá semena bavlníku), 10; nasáklé kukuřičné pevné hmoty, 20; (NH4)₂SO₄, 20; CaCO₃ 5; KH₂PO₄, 0,5; laktózy, 10; kvasinkového extraktu, 10 při pH před sterilizací 5, 6.

Zárodečná kultura (20 ml ve 250 ml Erlemeyerově baňce uzavřené bavlněnou zátkou) se inkubuje při 25 °C při 220 ot/min. Po 48 hodinách se použije 1 ml na inokulaci 15 ml produkčního prostředí sestávajícího z (g/1): KH₂PC>4 0,5; K₂SO₄ 5; (NA4ESO4, 17,5; laktóza, 140; Pharmamedia, 20; CaCO₃ 10; sádlo, 10 při pH před sterilizací 6,6.

Po inokulaci zárodečnou kulturou se 0,15 až 0,75 ml 10% roztoku kyseliny fenyloctové, nastavené pomocí KOH na pH 7,0, přidá do fermentace.

Produkční kultura se inokuluje při 25 °C při 220 ot/min. po 168 hodin ve 250 ml Erlemeyerově baňce uzavřené mléčným filtrem. Odpařovaná voda se doplňuje každý další den.

Na konci fermentační výroby se mycelium odebere odstředěním nebo filtrací a penicilín G a fenylacetyl-7-ADCA se analyzují HPLC.

Příklad 2

Analýza výroby fenylacetyl-7-ADCA

Fermentační produkty z transformovaných Penicillim linií se analyzují vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC). HPLC systém sestává z následujících spektrálních komponent: PÍ500 systém uvolňování rozpouštědla, AS 1000 vstřikovací zařízení, UV1000 detektor

-5CZ 293836 B6 proměnné vlnové délky (nastaven na 214 nm) a ISM 100 integrátor nebo podobný Stacionární fází je Chrompack Chromspher C18 kolona. Mobilní fáze sestává ze 75% fosfátového pufru pH 2,6 a 25% acetonitrilu. Produkty se stanoví srovnáním se standardní křivkou fenylacetyl-7ADCA a penicilinu G . Totožnost fenylacetyl-7—ADCA se stanoví 600 MHz NMR deutere5 chloroformového roztoku získaného kyselou extrakcí kultivačního filtrátu. Resonance fenylacetyl-7-ADCA v kyselinovém extraktu dokazuje shodu s resonancí syntetického vzorku.

Claims (4)

1. Způsob přípravy a izolace 7-aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny (7-ADCA), 15 vyznačující se tím, že se

a) transformuje kmen Penicillim chrysogenum expandázovým genem při transkripční a translační regulaci signálů houbové exprese;

20 b) uvedený kmen se fermentuje v kultivačním prostředí a do uvedeného kultivačního prostředí se přidá kyselina fenyloctová nebo její sůl nebo ester vhodná pro získání penicilinu G , který se expanduje do formy fenylacetyl-7-ADCA;

c) fenylacetyl-7-ADCA se izoluje z fermentační živné půdy;

d) deacyluje se fenylacetyl-7-ADCA; a

e) izoluje se krystalická 7-ADCA.

30

2. Způsob podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že stupeň (e) je filtrace.

3. Způsob podle některého z předchozích nároků, vyznačující se tím, že stupněm (c) je filtrace a filtrát živné půdy se extrahuje organickým rozpouštědlem nemísitelným s vodou při pH mezi 4 a 10.

4. Způsob podle některého z předchozích nároků, vyznačující se tím, že gen expandázy se odvodí ze Streptomvces clavuligerus nebo Nocardia lactamdurans.