JP4428866B2 - ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の製造法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P7/62—Carboxylic acid esters
Description
【技術分野】
【０００１】
本願発明はヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ(ＨＭＧ−ＣｏＡ)レダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般式(VI-a)
【化１】
（式中、Ｒ1は水素原子またはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物(VI-a)という］または一般式(VI-b)
【化２】
で表される、化合物(VI-a)のラクトン体［以下、化合物(VI-b)という］は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ−ゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を示すことが知られている［ザ・ジャーナル・オブ・アンチビオチクス(The Journal of Antibiotics, 29, 1346(1976)］。
【０００３】
微生物によって、一般式(V-a)
【化３】
（式中、Ｒ1は水素原子またはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物(V-a)という］または一般式(V-b)
【化４】
で表される、化合物(V-a)のラクトン体［以下、化合物(V-b)とういう］から化合物(VI-a)または化合物(VI-b)を生成する方法に関しては既に幾つかの報告がある。
【０００４】
即ち、特開昭５７―５０８９４には糸状菌を用いる方法が、特開平７―１８４６７０およびＷＯ９６／４０８６３には放線菌を用いる方法が、また特許第2672551号には遺伝子組換え放線菌を使用した方法が述べられている。しかし、よく知られているように糸状菌や放線菌は菌糸を伸ばして成長するため、発酵槽で増殖させると培養液の粘度が上昇する。このため培養液中の酸素が不足しやすく、また培養液が不均一になるため反応効率が低下しやすい。この酸素不足を解消し、培養液を均一に保つためには、発酵槽の撹拌速度を上げなければならないが、撹拌速度を上げると菌糸が剪断され、微生物の活性が低下しやすい[発酵工学の基礎、ｐ１６９〜１９０， P. F. Stansbury, A. Whitaker著、学会出版センター（１９８８）]。
【０００５】
さらに、上記放線菌および糸状菌はいずれも胞子を形成する能力を有する。胞子は菌体に比べはるかに飛散しやすい上、栄養細胞が容易に死滅するような条件下でも生存できる能力があるため、培養、精製工程での微生物汚染源となりやすい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明の目的は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を有する化合物の工業的に有利な製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、水酸化活性を有し、かつ胞子形成能を有さず菌糸状に生育しない微生物により化合物(V-a)または化合物(V-b)の水酸化を行うことができれば、胞子飛散による製造工程での微生物汚染や菌糸形成による培養液の不均一化にともなう反応効率の低下等の不都合を回避でき、工業的に有利であると考え、鋭意検討した結果、本願発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本願の発明は、以下（１）〜（９）に関する。
以下、特に断らない限り、一般式中でＲ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表す。
【０００９】
（１）一般式（I-a)
【化５】
で表される化合物［以下、化合物（I-a)という］または一般式（I-b)
【化６】
で表される、化合物(I-a)のラクトン体［以下、化合物(I-b)という］から、一般式(II-a)
【化７】
で表される化合物［以下、化合物(II-a)という］または一般式(II-b)
【化８】
で表される、化合物(II-a)のラクトン体［以下、化合物(II-b)という］を生成する活性を有し、かつ胞子形成能を有さず菌糸状に生育しない微生物、該微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用い、化合物(I-a)または化合物(I-b)を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に化合物(II-a)または化合物(II-b)を生成、蓄積させ、該水性媒体から化合物(II-a)または化合物(II-b)を採取することを特徴とする、化合物(II-a)または化合物(II-b)の製造法。
【００１０】
（２）化合物(I-a)が一般式(III-a)
【化９】
で表される化合物[以下化合物(III-a)という]であり、化合物(I-b)が一般式(III-b)
【化１０】
で表される化合物[以下、化合物(III-b)という]であり、化合物(II-a)が一般式(IV-a)
【化１１】
で表される化合物[以下、化合物(IV-a)という]であり、化合物(II-b)が一般式(IV-b)
【化１２】
で表される化合物[以下、化合物(IV-b)という]である、上記（１）の製造法。
【００１１】
（３）化合物(I-a)が一般式(V-a)
【化１３】
で表される化合物［以下、化合物(V-a)という］であり、化合物(I-b)が一般式(V-b)
【化１４】
で表される化合物［以下、化合物(V-b)という］であり、化合物(II-a)が一般式(VI-a)
【化１５】
で表される化合物［以下、化合物(VI-a)という］であり、化合物(II-b)が一般式(VI-b)
【化１６】
で表される化合物［以下、化合物(VI-b)という］である、上記（１）の製造法。
【００１２】
（４）化合物(I-a)が一般式(VII-a)
【化１７】
で表される化合物［以下、化合物(VII-a)という］であり、化合物(I-b)が一般式(VII-b)
【化１８】
で表される化合物［以下、化合物(VII-b)という］であり、化合物(II-a)が一般式(VIII-a)
【化１９】
で表される化合物［以下、化合物(VIII-a)という］であり、化合物(II-b)が一般式(VIII-b)
【化２０】
で表される化合物［以下、化合物(VIII-b)という］である、上記（１）の製造法。
【００１３】
（５）微生物の培養物の処理物が、培養菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物、該菌体の溶媒処理物等の菌体処理物、菌体の蛋白分画物、菌体および菌体処理物の固定化物から選ばれる処理物である、上記（１）の製造法。
【００１４】
（６）微生物が、Mycobacterium属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Rhodococcus属、Gordona属、Arthrobacter属、Micrococcus属、Cellulomonas属、およびSphingomonas属に属する微生物から選ばれる微生物である、上記（１）の製造法。
【００１５】
（７）微生物がMycobacterium phlei、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium thermoresistibile、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium parafortuitum、Mycobacterium gilvum、Rhodococcus globerulus、Rhodococcus equi、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、Rhodococcus rhodnii、Rhodococcus ruber、Rhodococcus coprophilus、Rhodococcus fascians、Gordona amarae、Gordona rubropertinctus、Gordona bronchialis、Gordona sputi、Gordona aichiensis、Gordona terrae、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium mycetoides、Corynebacterium variabilis、Corynebacterium ammoniagenes、Arthrobacter crystallopoietes、Arthrobacter duodecadis、Arthrobacter ramosus、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globiformis、Brevibacterium acetylicum、Brevibacterium linens、Brevibacterium incertum、Brevibacterium iodinum、Micrococcus luteus、Micrococcus roseus、Cellulomonas cellulans、Cellulomonas cartae、Sphingomonas paucimobilis、Sphingomonas adhaesiva、およびSphingomonas terraeから選ばれる微生物である、上記（１）の製造法。
【００１６】
（８）微生物がMycobacterium phlei JCM5865、Mycobacterium smegmatis JCM5866、Mycobacterium thermoresistibile JCM6362、Mycobacterium neoaurum JCM6365、Mycobacterium parafortuitum JCM6367、Mycobacterium gilvum JCM6395、Rhodococcus globerulus ATCC25714、Rhodococcus equi ATCC21387、Rhodococcus equi ATCC7005、Rhodococcus erythropolis ATCC4277、Rhodococcus rhodochrous ATCC21430、Rhodococcus rhodochrous ATCC13808、Rhodococcus rhodnii ATCC35071、Rhodococcus ruber JCM3205、Rhodococcus coprophilus ATCC29080、Rhodococcus fascians ATCC12974、Rhodococcus fascians ATCC35014、Gordona amarae ATCC27808、Gordona rubropertinctus IFM-33、Gordona rubropertinctus ATCC14352、Gordona bronchialis ATCC25592、Gordona sputi ATCC29627、Gordona aichiensis ATCC33611、Gordona terrae ATCC25594、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14020、Corynebacterium glutamicum ATCC19240、Corynebacterium mycetoides ATCC21134、Corynebacterium variabilis ATCC15753、Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872、Arthrobacter crystallopoietes ATCC15481、Arthrobacter duodecadis ATCC13347、Arthrobacter ramosus ATCC13727、Arthrobacter sulfureus ATCC19098、Arthrobacter aurescens ATCC13344、Arthrobacter citreus ATCC11624、Arthrobacter globiformis ATCC8010、Brevibacterium acetylicum ATCC953、Brevibacterium linens ATCC19391、Brevibacterium linens ATCC9172、Brevibacterium incertum ATCC8363、Brevibacterium iodinum IFO3558、Micrococcus luteus ATCC4698、Micrococcus roseus ATCC186、Cellulomonas cellulans ATCC15921、Cellulomonas cartae ATCC21681、Sphingomonas paucimobilis ATCC29837、Sphingomonas adhaesiva JCM7370、およびSphingomonas terrae IFO15098から選ばれる微生物である、上記（１）の製造法。
（９）微生物がGordona sp. ATCC19067である、上記（１）の製造法。
【００１７】
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本願発明を詳細に説明する。
本願発明で用いられる酵素源としては、上記化合物(I-a)または上記化合物(I-b)から、上記化合物(II-a)または上記化合物(II-b)を生成する活性を有し、かつ胞子形成能を有さず菌糸状に成育しない微生物、該微生物の培養物、該培養物の処理物があげられる。
【００１８】
アルキルとしては、直鎖または分岐状の、炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のアルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、これら各種分岐鎖異性体等があげられる。
アリールとしては、フェニル、ナフチル等があげられる。
【００１９】
置換アルキルにおける置換基としては、同一または異なって１〜３のハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アリール等があげられる
置換アリールにおける置換基としては、同一または異なって１〜３のハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ等があげられる。
アルコキシにおけるアルキル部分は上述のアルキルと同義である。
アルカリ金属とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウムの各元素を表す。
【００２０】
上記微生物としては、例えばMycobacterium属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Rhodococcus属、Gordona属、Arthrobacter属、Micrococcus属、Cellulomonas属、およびSphingomonas属から選ばれる微生物があげられる。
【００２１】
具体的には、Mycobacterium phlei、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium thermoresistibile、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium parafortuitum、Mycobacterium gilvum、Rhodococcus globerulus、Rhodococcus equi、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、Rhodococcus rhodnii、Rhodococcus ruber、Rhodococcus coprophilus、Rhodococcus fascians、Gordona amarae、Gordona rubropertinctus、Gordona bronchialis、Gordona sputi、Gordona
aichiensis、Gordona terrae、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium
mycetoides、Corynebacterium variabilis、Corynebacterium ammoniagenes、Arthrobacter crystallopoietes、Arthrobacter duodecadis、Arthrobacter ramosus、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globiformis、Brevibacterium acetylicum、Brevibacterium linens、Brevibacterium incertum、Brevibacterium iodinum、Micrococcus luteus、Micrococcus roseus、Cellulomonas cellulans、Cellulomonas cartae、Sphingomonas paucimobilis、Sphingomonas adhaesiva、およびSphingomonas terraeから選ばれる微生物があげられる。
【００２２】
さらに具体的には、Mycobacterium phlei JCM5865、Mycobacterium smegmatis
JCM5866、Mycobacterium thermoresistibile JCM6362、Mycobacterium neoaurum JCM6365、Mycobacterium parafortuitum JCM6367、Mycobacterium gilvum JCM6395、Rhodococcus globerulus ATCC25714、Rhodococcus equi ATCC21387、Rhodococcus equi ATCC7005、Rhodococcus erythropolis ATCC4277、Rhodococcus rhodochrous ATCC21430、Rhodococcus rhodochrous ATCC13808、Rhodococcus rhodnii ATCC35071、Rhodococcus ruber JCM3205、Rhodococcus coprophilus ATCC29080、Rhodococcus fascians ATCC12974、Rhodococcus fascians ATCC35014、Gordona amarae ATCC27808、Gordona rubropertinctus IFM-33、Gordona rubropertinctus ATCC14352、Gordona bronchialis ATCC25592、Gordona sputi ATCC29627、Gordona aichiensis ATCC33611、Gordona terrae ATCC25594、Gordona sp. ATCC19067、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14020、Corynebacterium glutamicum ATCC19240、Corynebacterium mycetoides ATCC21134、Corynebacterium variabilis ATCC15753、Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872、Arthrobacter crystallopoietes ATCC15481、Arthrobacter duodecadis ATCC13347、Arthrobacter ramosus ATCC13727、Arthrobacter sulfureus ATCC19098、Arthrobacter aurescens ATCC13344、Arthrobacter citreus ATCC11624、Arthrobacter globiformis ATCC8010、Brevibacterium acetylicum ATCC953、Brevibacterium linens ATCC19391、Brevibacterium linens ATCC9172、Brevibacterium incertum ATCC8363、Brevibacterium iodinum IFO3558、Micrococcus luteus ATCC4698、Micrococcus roseus ATCC186、Cellulomonas cellulans ATCC15921、Cellulomonas cartae ATCC21681、Sphingomonas paucimobilis ATCC29837、Sphingomonas adhaesiva JCM7370、Sphingomonas terrae IFO15098、およびGordona sp.ATCC19067等があげられる。
【００２３】
また、これらの微生物の継代培養体、突然変異体もしくは誘導体、遺伝子組換え技術により製造した組み換え体等も用いられる。
本願発明に用いられる微生物の培養に用いられる培地は、本願発明の微生物が資化することができる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本願発明の微生物の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられる。
【００２４】
培地中の炭素源の具体例としては、例えば、グルコース、フラクトース、グリセロール、マルトース、スターチ、サッカロース等の炭水化物、酢酸、クエン酸等の有機酸、糖蜜等があげられる。
窒素源の具体例としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆ミール、綿実かす、魚ミール、各種発酵菌体およびその消化物等があげられる。
【００２５】
無機物の具体例としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等があげられる。
また必要に応じてチアミン、ビオチン等のビタミン類、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸、アデニン、グアニン等の核酸関連物質を添加してもよい。
【００２６】
本願発明に用いられる微生物の培養は、振とう培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。通気撹拌培養の場合は、発泡を防ぐため消泡剤を適量添加するのが好ましい。培養は通常20〜50℃、好ましくは25〜40℃で、6〜120時間行う。培養中pHは5.0〜10.0、好ましくは6.0〜8.5に保持する。pH調整は無機酸或いは有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００２７】
このようにして得られる微生物の培養物の処理物としては、培養菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物、該菌体の溶媒処理物等の菌体処理物、菌体の蛋白分画物、菌体および菌体処理物の固定化物等があげられる。
【００２８】
化合物(I-a)または化合物(I-b)から化合物(II-a)または化合物(II-b)への変換方法は、微生物を培養する培地に予め化合物(I-a)または化合物(I-b)を添加する方法を用いてもよいし、培養中に化合物(I-a)または化合物(I-b)を添加する方法を用いてもよい。また、酵素源を化合物(I-a)または化合物(I-b)に水性媒体中で作用させる方法を用いてもよい。
化合物(I-a)または化合物(I-b)を微生物を培養する培地中に添加する場合、化合物(I-a)または化合物(I-b)は培地1mlあたり0.1〜10mg好ましくは0.2〜1mgを培養の初発または途中に添加する。化合物(I-a)または化合物(I-b)を添加する際、化合物(I-a)または化合物(I-b)をメチルアルコール、エチルアルコール等の溶媒に溶解して添加してもよい。
【００２９】
酵素源を、化合物(I-a)または化合物(I-b)に水性媒体中で作用させる方法を用いる場合、用いる酵素の量は、当該酵素源の比活性等により異なる。例えば、酵素源として微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を用いる場合は、酵素源を化合物(I-a)または化合物(I-b)の1mgあたり5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。反応は水性媒体中20〜50℃で行うことが好ましく、特に25〜40℃で行うことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、通常0.5〜150時間、好ましくは1〜72時間である。
【００３０】
水性媒体としては、水、リン酸緩衝液、HEPES(N-2ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸）緩衝液、トリス[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]塩酸緩衝液等の緩衝液があげられる。反応を阻害しなければ該緩衝液に有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒としては、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等があげられる。有機溶媒と水性媒体との混合液は、化合物(I-b)を用いる場合好ましく用いられる。
上記製造方法により、化合物(I-a)から化合物(II-a)または化合物(II-a)と化合物(II-b)の混合物を得ることができる。
【００３１】
また、同様に、化合物(I-b)から化合物(II-b)または化合物(II-a)と化合物(II-b)の混合物を得ることができる。
さらに、化合物(I-a)と化合物(I-b)の混合物から、化合物(II-a)と化合物(II-b)の混合物を得ることもできる。
【００３２】
化合物(I-b)および化合物(II-b)は下記に例示するラクトンの開環方法により、容易に化合物(I-a)および化合物(II-a)にそれぞれ変換することができる。また化合物(I-a)および化合物(II-a)は下記に例示するラクトンの生成方法により、容易に化合物(I-b)および化合物(II-b)にそれぞれ変換することができる。
【００３３】
ラクトンの開環方法としては、化合物(I-b)または化合物(II-b)を水性媒体に溶解し、酸またはアルカリを添加する方法があげられる。水性媒体としては、例えば水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等反応を阻害しない塩類を含む水溶液があげられる。該水溶液中には、反応を阻害しない濃度のメタノール、エタノール、酢酸エチル等の有機溶媒を含んでいてもよい。酸としては酢酸、塩酸、硫酸等の酸が挙げられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等があげられる。
【００３４】
ラクトンの生成方法としては、化合物(I-a)または化合物(II-a)を非水系の溶媒に溶解し、酸または塩基触媒を添加する方法があげられる。非水系の溶媒としては実質的に水を含まない有機溶媒で化合物(I-a)または化合物(II-a)を溶解できるものならばいかなるものでも用いることができる。
【００３５】
非水系の溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、酢酸エチル等があげられる。触媒としては、ラクトン化反応を触媒し、基質や反応産物にラクトン化以外の作用を及ぼさないものならば、どのようなものでも用いることができる。該触媒としては、例えば、トリフルオロ酢酸やパラトルエンスルホン酸等があげられる。反応温度は特に制限はないが、0〜100℃が好ましく、20〜80℃が特に好ましい。
【００３６】
反応終了後の上記溶液からの化合物(II-a)または化合物(II-b)の採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００３７】
本願発明により得られる化合物(II-a)または化合物(II-b)の確認または定量方法は、化合物(II-a)および／または化合物(II-b)を確認または定量できる方法であれば、いずれの方法でも用いられる。例えば、13C-NMRスペクトル、1H-NMRスペクトル、マススペクトル、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の方法により行うことができる。
【００３８】
本発明において、化合物(I-a)、化合物(I-b)、化合物(II-a)および化合物(II-b)の中には、光学異性体等の立体異性体が存在し得るものもあるが、本発明は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
【００３９】
化合物(I-a)としては、化合物(III-a)が好ましく、化合物(V-a)がより好ましく、化合物(VII-a)が特に好ましい。
化合物(I-b)としては、化合物(III-b)が好ましく、化合物(V-b)がより好ましく、化合物(VII-b)が特に好ましい。
化合物(II-a)としては、化合物(IV-a)が好ましく、化合物(VI-a)がより好ましく、化合物(VIII-a)が特に好ましい。
化合物(II-b)としては、化合物(IV-b)が好ましく、化合物(VI-b)がより好ましく、化合物(VIII-b)が特に好ましい。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
【実施例】
発明を実施するための最良の形態
実施例１
化合物(VII-b)(シグマ社製）100mgを9.5mlのメタノールに溶解した後、１mol/l水酸化ナトリウム0.5mlを加えて室温で1時間振盪した。得られた反応液を乾固し脱イオン水５mlを加えて溶解し１mol/l塩酸約0.1mlでpHを約6.5〜7.5に調整し、さらに脱イオン水4.9mlを加えることにより最終濃度が10mg/mlの化合物(VII-a)[一般式(VII-a)中Ｒ1がナトリウムである化合物]を10ml得た。
【００４１】
第１および２表に示した各種微生物をそれぞれ寒天培地[ペプトン（極東製薬工業製）1%、肉エキス（極東製薬工業製）0.7%、NaCl 0.3%、酵母エキス（日本製薬社製）0.2%、バクトアガー（ディフコ社製）2%、１mol/l水酸化ナトリウムでpH7.2に調整]に塗布し、第１および２表に表示した各温度で3日間培養した。寒天培地上に生育した菌株各々一白金耳をLB培地[バクトトリプトン（ディフコ社製）1%、バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）0.5%、１mol/l水酸化ナトリウムでpH7.2に調整]3mlを含む試験管に植菌し、第１および２表に示した各温度で24時間振盪培養した。培養後の培養液0.25mlをTB培地[バクトトリプトン（ディフコ社製）1.4%、バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）2.4%、KH2PO4 0.231%、K2HPO4 1.251%、１mol/l水酸化ナトリウムでpH 7.4に調整]5mlを含む試験管に植菌し、第１および２表に示した各温度で24時間振盪培養した。24時間後、上記で得られた化合物(VII-a)を終濃度が0.4mg/mlになるようにそれぞれの試験管に添加し、さらに48時間第１および２表に示した各温度で振盪して反応を行なった。
【００４２】
反応終了後、反応液を酢酸でpH3.5に調整した。この反応液0.5mlに酢酸エチル1mlを加え、1時間振盪した。振盪後、3000rpm、5分間の遠心分離によって反応液を２層に分け、上清の酢酸エチル層を回収し、遠心エバポレーターで溶媒を除去した後、残渣をメタノール0.5mlに溶解した。このメタノール溶液の一部を用いてHPLC分析[カラム；Inertsil ODS-2(5μm, 4x250mm, ジーエルサイエンス社製)、カラム温度；60℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝55：45：0.05、流速：0.9ml/分、検出波長：237nm]を行ない、化合物(VIII-a)[一般式(VIII-a)中Ｒ1はナトリウムである化合物]の検出、定量を行なった。結果を第１および第２表に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
実施例２
Mycobacterium gilvum JCM 6395株を実施例１と同様の寒天培地に塗布し、37℃で3日間培養し、寒天培地上に生育した菌株をLB培地3mlを含む試験管4本に植菌して、37℃で24時間振盪培養した。この培養液1.25mlを25mlのTB培地を含む300ml容三角フラスコ8本に各々植菌し、37℃で振盪培養した。24時間後に実施例１と同様に調整した化合物(VII-a)[一般式(VII-a)中Ｒ1はナトリウムである化合物]を終濃度が0.4mg/mlになるように添加し、37℃で48時間振盪した。反応終了後、培養液を3000rpm、4℃で10分間遠心分離し上清を分取した。この上清液のpHを酢酸で3.5に調整し、400mlの酢酸エチルを添加して30℃で1時間振盪した後静置し、上清を回収した。下層の水層に対して同じ操作を繰り返し、得られた酢酸エチル層を先の上清と合わせた。この酢酸エチル層に飽和食塩水100mlを添加して振盪後、上清を回収した。
【００４６】
次にこの上清に無水Na2SO4を5g添加して室温で15分間放置後、減圧により酢酸エチルを蒸発させ、乾固した。得られた残渣を脱イオン水５mlに溶解して水酸化ナトリウムでpHを9.0に調整し、50mlのHP-20カラム(25x100mm、三菱化学社製）に通塔した。カラムは150mlの脱イオン水で洗浄したあと、アセトン含量20%、30%、40%のアセトン水溶液100mlで段階的に溶出した。分取した画分は実施例１と同様のHPLC分析を行い、化合物(VIII-a)を含む画分を回収した。減圧下でこの画分からアセトンを除去し、１mol/l塩酸で溶液のpHを3.0に調整した。この溶液に360mlの酢酸エチルを添加して振盪し、静置後上清を回収した。この上清に飽和食塩水90mlを添加し振盪、静置後、上清を回収した。
【００４７】
次にこの上清に無水Na2SO4を4.5g添加して室温で15分間おいた後、減圧乾固した。得られた乾固物をジクロロメタンに溶解し、1%トリフルオロ酢酸を加えてラクトン化した。この反応物を分取用TLC[シリカゲル板；No.1.05744(200x200mm, 0.5mm厚)MERCK社製、展開溶媒；酢酸エチル、発色液；12.5%リンモリブデン酸・1%セリウム／10%硫酸溶液]を用いて分画し、化合物(VIII-b) 0.8mgが得られた。得られた化合物(VIII-b)のマススペクトルおよび1H-NMRスペクトル分析結果は以下の通りである。
【００４８】
マススペクトル
日本電子製JMS-HX/HX110A質量分析計を用い、マトリックスにm-ニトロベンジルアルコールを使用してポジティブモードで測定した。その結果、m/z 407に擬似分子イオンピーク([M+H]+）を与え、化合物(II-b)の構造および分子量(406)から期待される数値に一致した。
【００４９】
1 H-NMRスペクトル
日本電子製JNM-α400型スペクトロメータを用い、重クロロホルム中、内部標準にTMSを使用し400MHzで測定した。その結果を以下に示す。このスペクトルデータは化合物(VIII-b)の公知のデータ[三共研究所年報、37、147(1985)]と一致した。
δppm(CDCl3):6.01(1H, d,J=9.5Hz), 5.89(1H, dd,J=9.5, 5.9Hz), 5.58(1H, m), 5.41(1H, m), 4.60(1H, ddd,J=10.6, 7.3, 5.4, 2.8Hz), 4.40(1H, m), 4.38(1H, m), 2.74(1H, dd,J=13.1, 6.0, 4.8, 1.5Hz), 2.40(1H, m), 2.36(1H, m), 2.34(1H, m), 1.95(1H, dddd, J=14.4, 3.7, 2.9, 1.7Hz), 1.86(1H, dddd, J=12.5, 12.3, 7.3, 4.3Hz), 1.69(1H, m), 1.68(1H, m), 1.64(1H, m), 1.57(1H, m), 1.5〜1.4(2H, m), 1.43(1h, m), 1.30(1H, m), 1.12(3H, d, J=6.8Hz), 0.91(3H, d, J=7.1Hz), 0.89(3H, t, J=7.4Hz)
【００５０】
【産業上の利用可能性】
本願発明によりＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を有する化合物を効率よく製造することができる。
【０００１】
本願発明はヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ(ＨＭＧ−ＣｏＡ)レダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般式(VI-a)
【化１】
【化２】
【０００３】
微生物によって、一般式(V-a)
【化３】
【化４】
【０００４】
即ち、特開昭５７―５０８９４には糸状菌を用いる方法が、特開平７―１８４６７０およびＷＯ９６／４０８６３には放線菌を用いる方法が、また特許第2672551号には遺伝子組換え放線菌を使用した方法が述べられている。しかし、よく知られているように糸状菌や放線菌は菌糸を伸ばして成長するため、発酵槽で増殖させると培養液の粘度が上昇する。このため培養液中の酸素が不足しやすく、また培養液が不均一になるため反応効率が低下しやすい。この酸素不足を解消し、培養液を均一に保つためには、発酵槽の撹拌速度を上げなければならないが、撹拌速度を上げると菌糸が剪断され、微生物の活性が低下しやすい[発酵工学の基礎、ｐ１６９〜１９０， P. F. Stansbury, A. Whitaker著、学会出版センター（１９８８）]。
【０００５】
さらに、上記放線菌および糸状菌はいずれも胞子を形成する能力を有する。胞子は菌体に比べはるかに飛散しやすい上、栄養細胞が容易に死滅するような条件下でも生存できる能力があるため、培養、精製工程での微生物汚染源となりやすい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明の目的は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を有する化合物の工業的に有利な製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、水酸化活性を有し、かつ胞子形成能を有さず菌糸状に生育しない微生物により化合物(V-a)または化合物(V-b)の水酸化を行うことができれば、胞子飛散による製造工程での微生物汚染や菌糸形成による培養液の不均一化にともなう反応効率の低下等の不都合を回避でき、工業的に有利であると考え、鋭意検討した結果、本願発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本願の発明は、以下（１）〜（９）に関する。
以下、特に断らない限り、一般式中でＲ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ2は置換もしくは非置換のアルキルまたは置換もしくは非置換のアリールを表す。
【０００９】
（１）一般式（I-a)
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【００１０】
（２）化合物(I-a)が一般式(III-a)
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【００１１】
（３）化合物(I-a)が一般式(V-a)
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【００１２】
（４）化合物(I-a)が一般式(VII-a)
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【化２０】
【００１３】
（５）微生物の培養物の処理物が、培養菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物、該菌体の溶媒処理物等の菌体処理物、菌体の蛋白分画物、菌体および菌体処理物の固定化物から選ばれる処理物である、上記（１）の製造法。
【００１４】
（６）微生物が、Mycobacterium属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Rhodococcus属、Gordona属、Arthrobacter属、Micrococcus属、Cellulomonas属、およびSphingomonas属に属する微生物から選ばれる微生物である、上記（１）の製造法。
【００１５】
（７）微生物がMycobacterium phlei、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium thermoresistibile、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium parafortuitum、Mycobacterium gilvum、Rhodococcus globerulus、Rhodococcus equi、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、Rhodococcus rhodnii、Rhodococcus ruber、Rhodococcus coprophilus、Rhodococcus fascians、Gordona amarae、Gordona rubropertinctus、Gordona bronchialis、Gordona sputi、Gordona aichiensis、Gordona terrae、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium mycetoides、Corynebacterium variabilis、Corynebacterium ammoniagenes、Arthrobacter crystallopoietes、Arthrobacter duodecadis、Arthrobacter ramosus、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globiformis、Brevibacterium acetylicum、Brevibacterium linens、Brevibacterium incertum、Brevibacterium iodinum、Micrococcus luteus、Micrococcus roseus、Cellulomonas cellulans、Cellulomonas cartae、Sphingomonas paucimobilis、Sphingomonas adhaesiva、およびSphingomonas terraeから選ばれる微生物である、上記（１）の製造法。
【００１６】
（８）微生物がMycobacterium phlei JCM5865、Mycobacterium smegmatis JCM5866、Mycobacterium thermoresistibile JCM6362、Mycobacterium neoaurum JCM6365、Mycobacterium parafortuitum JCM6367、Mycobacterium gilvum JCM6395、Rhodococcus globerulus ATCC25714、Rhodococcus equi ATCC21387、Rhodococcus equi ATCC7005、Rhodococcus erythropolis ATCC4277、Rhodococcus rhodochrous ATCC21430、Rhodococcus rhodochrous ATCC13808、Rhodococcus rhodnii ATCC35071、Rhodococcus ruber JCM3205、Rhodococcus coprophilus ATCC29080、Rhodococcus fascians ATCC12974、Rhodococcus fascians ATCC35014、Gordona amarae ATCC27808、Gordona rubropertinctus IFM-33、Gordona rubropertinctus ATCC14352、Gordona bronchialis ATCC25592、Gordona sputi ATCC29627、Gordona aichiensis ATCC33611、Gordona terrae ATCC25594、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14020、Corynebacterium glutamicum ATCC19240、Corynebacterium mycetoides ATCC21134、Corynebacterium variabilis ATCC15753、Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872、Arthrobacter crystallopoietes ATCC15481、Arthrobacter duodecadis ATCC13347、Arthrobacter ramosus ATCC13727、Arthrobacter sulfureus ATCC19098、Arthrobacter aurescens ATCC13344、Arthrobacter citreus ATCC11624、Arthrobacter globiformis ATCC8010、Brevibacterium acetylicum ATCC953、Brevibacterium linens ATCC19391、Brevibacterium linens ATCC9172、Brevibacterium incertum ATCC8363、Brevibacterium iodinum IFO3558、Micrococcus luteus ATCC4698、Micrococcus roseus ATCC186、Cellulomonas cellulans ATCC15921、Cellulomonas cartae ATCC21681、Sphingomonas paucimobilis ATCC29837、Sphingomonas adhaesiva JCM7370、およびSphingomonas terrae IFO15098から選ばれる微生物である、上記（１）の製造法。
（９）微生物がGordona sp. ATCC19067である、上記（１）の製造法。
【００１７】
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本願発明を詳細に説明する。
本願発明で用いられる酵素源としては、上記化合物(I-a)または上記化合物(I-b)から、上記化合物(II-a)または上記化合物(II-b)を生成する活性を有し、かつ胞子形成能を有さず菌糸状に成育しない微生物、該微生物の培養物、該培養物の処理物があげられる。
【００１８】
アルキルとしては、直鎖または分岐状の、炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のアルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、これら各種分岐鎖異性体等があげられる。
アリールとしては、フェニル、ナフチル等があげられる。
【００１９】
置換アルキルにおける置換基としては、同一または異なって１〜３のハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アリール等があげられる
置換アリールにおける置換基としては、同一または異なって１〜３のハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ等があげられる。
アルコキシにおけるアルキル部分は上述のアルキルと同義である。
アルカリ金属とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウムの各元素を表す。
【００２０】
上記微生物としては、例えばMycobacterium属、Corynebacterium属、Brevibacterium属、Rhodococcus属、Gordona属、Arthrobacter属、Micrococcus属、Cellulomonas属、およびSphingomonas属から選ばれる微生物があげられる。
【００２１】
具体的には、Mycobacterium phlei、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium thermoresistibile、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium parafortuitum、Mycobacterium gilvum、Rhodococcus globerulus、Rhodococcus equi、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、Rhodococcus rhodnii、Rhodococcus ruber、Rhodococcus coprophilus、Rhodococcus fascians、Gordona amarae、Gordona rubropertinctus、Gordona bronchialis、Gordona sputi、Gordona
aichiensis、Gordona terrae、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium
mycetoides、Corynebacterium variabilis、Corynebacterium ammoniagenes、Arthrobacter crystallopoietes、Arthrobacter duodecadis、Arthrobacter ramosus、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globiformis、Brevibacterium acetylicum、Brevibacterium linens、Brevibacterium incertum、Brevibacterium iodinum、Micrococcus luteus、Micrococcus roseus、Cellulomonas cellulans、Cellulomonas cartae、Sphingomonas paucimobilis、Sphingomonas adhaesiva、およびSphingomonas terraeから選ばれる微生物があげられる。
【００２２】
さらに具体的には、Mycobacterium phlei JCM5865、Mycobacterium smegmatis
JCM5866、Mycobacterium thermoresistibile JCM6362、Mycobacterium neoaurum JCM6365、Mycobacterium parafortuitum JCM6367、Mycobacterium gilvum JCM6395、Rhodococcus globerulus ATCC25714、Rhodococcus equi ATCC21387、Rhodococcus equi ATCC7005、Rhodococcus erythropolis ATCC4277、Rhodococcus rhodochrous ATCC21430、Rhodococcus rhodochrous ATCC13808、Rhodococcus rhodnii ATCC35071、Rhodococcus ruber JCM3205、Rhodococcus coprophilus ATCC29080、Rhodococcus fascians ATCC12974、Rhodococcus fascians ATCC35014、Gordona amarae ATCC27808、Gordona rubropertinctus IFM-33、Gordona rubropertinctus ATCC14352、Gordona bronchialis ATCC25592、Gordona sputi ATCC29627、Gordona aichiensis ATCC33611、Gordona terrae ATCC25594、Gordona sp. ATCC19067、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14020、Corynebacterium glutamicum ATCC19240、Corynebacterium mycetoides ATCC21134、Corynebacterium variabilis ATCC15753、Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872、Arthrobacter crystallopoietes ATCC15481、Arthrobacter duodecadis ATCC13347、Arthrobacter ramosus ATCC13727、Arthrobacter sulfureus ATCC19098、Arthrobacter aurescens ATCC13344、Arthrobacter citreus ATCC11624、Arthrobacter globiformis ATCC8010、Brevibacterium acetylicum ATCC953、Brevibacterium linens ATCC19391、Brevibacterium linens ATCC9172、Brevibacterium incertum ATCC8363、Brevibacterium iodinum IFO3558、Micrococcus luteus ATCC4698、Micrococcus roseus ATCC186、Cellulomonas cellulans ATCC15921、Cellulomonas cartae ATCC21681、Sphingomonas paucimobilis ATCC29837、Sphingomonas adhaesiva JCM7370、Sphingomonas terrae IFO15098、およびGordona sp.ATCC19067等があげられる。
【００２３】
また、これらの微生物の継代培養体、突然変異体もしくは誘導体、遺伝子組換え技術により製造した組み換え体等も用いられる。
本願発明に用いられる微生物の培養に用いられる培地は、本願発明の微生物が資化することができる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本願発明の微生物の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられる。
【００２４】
培地中の炭素源の具体例としては、例えば、グルコース、フラクトース、グリセロール、マルトース、スターチ、サッカロース等の炭水化物、酢酸、クエン酸等の有機酸、糖蜜等があげられる。
窒素源の具体例としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆ミール、綿実かす、魚ミール、各種発酵菌体およびその消化物等があげられる。
【００２５】
無機物の具体例としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等があげられる。
また必要に応じてチアミン、ビオチン等のビタミン類、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸、アデニン、グアニン等の核酸関連物質を添加してもよい。
【００２６】
本願発明に用いられる微生物の培養は、振とう培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。通気撹拌培養の場合は、発泡を防ぐため消泡剤を適量添加するのが好ましい。培養は通常20〜50℃、好ましくは25〜40℃で、6〜120時間行う。培養中pHは5.0〜10.0、好ましくは6.0〜8.5に保持する。pH調整は無機酸或いは有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
【００２７】
このようにして得られる微生物の培養物の処理物としては、培養菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物、該菌体の溶媒処理物等の菌体処理物、菌体の蛋白分画物、菌体および菌体処理物の固定化物等があげられる。
【００２８】
化合物(I-a)または化合物(I-b)から化合物(II-a)または化合物(II-b)への変換方法は、微生物を培養する培地に予め化合物(I-a)または化合物(I-b)を添加する方法を用いてもよいし、培養中に化合物(I-a)または化合物(I-b)を添加する方法を用いてもよい。また、酵素源を化合物(I-a)または化合物(I-b)に水性媒体中で作用させる方法を用いてもよい。
化合物(I-a)または化合物(I-b)を微生物を培養する培地中に添加する場合、化合物(I-a)または化合物(I-b)は培地1mlあたり0.1〜10mg好ましくは0.2〜1mgを培養の初発または途中に添加する。化合物(I-a)または化合物(I-b)を添加する際、化合物(I-a)または化合物(I-b)をメチルアルコール、エチルアルコール等の溶媒に溶解して添加してもよい。
【００２９】
酵素源を、化合物(I-a)または化合物(I-b)に水性媒体中で作用させる方法を用いる場合、用いる酵素の量は、当該酵素源の比活性等により異なる。例えば、酵素源として微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を用いる場合は、酵素源を化合物(I-a)または化合物(I-b)の1mgあたり5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。反応は水性媒体中20〜50℃で行うことが好ましく、特に25〜40℃で行うことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、通常0.5〜150時間、好ましくは1〜72時間である。
【００３０】
水性媒体としては、水、リン酸緩衝液、HEPES(N-2ヒドロキシエチルピペラジン-N-エタンスルホン酸）緩衝液、トリス[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]塩酸緩衝液等の緩衝液があげられる。反応を阻害しなければ該緩衝液に有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒としては、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等があげられる。有機溶媒と水性媒体との混合液は、化合物(I-b)を用いる場合好ましく用いられる。
上記製造方法により、化合物(I-a)から化合物(II-a)または化合物(II-a)と化合物(II-b)の混合物を得ることができる。
【００３１】
また、同様に、化合物(I-b)から化合物(II-b)または化合物(II-a)と化合物(II-b)の混合物を得ることができる。
さらに、化合物(I-a)と化合物(I-b)の混合物から、化合物(II-a)と化合物(II-b)の混合物を得ることもできる。
【００３２】
化合物(I-b)および化合物(II-b)は下記に例示するラクトンの開環方法により、容易に化合物(I-a)および化合物(II-a)にそれぞれ変換することができる。また化合物(I-a)および化合物(II-a)は下記に例示するラクトンの生成方法により、容易に化合物(I-b)および化合物(II-b)にそれぞれ変換することができる。
【００３３】
ラクトンの開環方法としては、化合物(I-b)または化合物(II-b)を水性媒体に溶解し、酸またはアルカリを添加する方法があげられる。水性媒体としては、例えば水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等反応を阻害しない塩類を含む水溶液があげられる。該水溶液中には、反応を阻害しない濃度のメタノール、エタノール、酢酸エチル等の有機溶媒を含んでいてもよい。酸としては酢酸、塩酸、硫酸等の酸が挙げられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等があげられる。
【００３４】
ラクトンの生成方法としては、化合物(I-a)または化合物(II-a)を非水系の溶媒に溶解し、酸または塩基触媒を添加する方法があげられる。非水系の溶媒としては実質的に水を含まない有機溶媒で化合物(I-a)または化合物(II-a)を溶解できるものならばいかなるものでも用いることができる。
【００３５】
非水系の溶媒としては、例えば、ジクロロメタン、酢酸エチル等があげられる。触媒としては、ラクトン化反応を触媒し、基質や反応産物にラクトン化以外の作用を及ぼさないものならば、どのようなものでも用いることができる。該触媒としては、例えば、トリフルオロ酢酸やパラトルエンスルホン酸等があげられる。反応温度は特に制限はないが、0〜100℃が好ましく、20〜80℃が特に好ましい。
【００３６】
反応終了後の上記溶液からの化合物(II-a)または化合物(II-b)の採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００３７】
本願発明により得られる化合物(II-a)または化合物(II-b)の確認または定量方法は、化合物(II-a)および／または化合物(II-b)を確認または定量できる方法であれば、いずれの方法でも用いられる。例えば、13C-NMRスペクトル、1H-NMRスペクトル、マススペクトル、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)等の方法により行うことができる。
【００３８】
本発明において、化合物(I-a)、化合物(I-b)、化合物(II-a)および化合物(II-b)の中には、光学異性体等の立体異性体が存在し得るものもあるが、本発明は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
【００３９】
化合物(I-a)としては、化合物(III-a)が好ましく、化合物(V-a)がより好ましく、化合物(VII-a)が特に好ましい。
化合物(I-b)としては、化合物(III-b)が好ましく、化合物(V-b)がより好ましく、化合物(VII-b)が特に好ましい。
化合物(II-a)としては、化合物(IV-a)が好ましく、化合物(VI-a)がより好ましく、化合物(VIII-a)が特に好ましい。
化合物(II-b)としては、化合物(IV-b)が好ましく、化合物(VI-b)がより好ましく、化合物(VIII-b)が特に好ましい。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
【実施例】
発明を実施するための最良の形態
実施例１
化合物(VII-b)(シグマ社製）100mgを9.5mlのメタノールに溶解した後、１mol/l水酸化ナトリウム0.5mlを加えて室温で1時間振盪した。得られた反応液を乾固し脱イオン水５mlを加えて溶解し１mol/l塩酸約0.1mlでpHを約6.5〜7.5に調整し、さらに脱イオン水4.9mlを加えることにより最終濃度が10mg/mlの化合物(VII-a)[一般式(VII-a)中Ｒ1がナトリウムである化合物]を10ml得た。
【００４１】
第１および２表に示した各種微生物をそれぞれ寒天培地[ペプトン（極東製薬工業製）1%、肉エキス（極東製薬工業製）0.7%、NaCl 0.3%、酵母エキス（日本製薬社製）0.2%、バクトアガー（ディフコ社製）2%、１mol/l水酸化ナトリウムでpH7.2に調整]に塗布し、第１および２表に表示した各温度で3日間培養した。寒天培地上に生育した菌株各々一白金耳をLB培地[バクトトリプトン（ディフコ社製）1%、バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）0.5%、１mol/l水酸化ナトリウムでpH7.2に調整]3mlを含む試験管に植菌し、第１および２表に示した各温度で24時間振盪培養した。培養後の培養液0.25mlをTB培地[バクトトリプトン（ディフコ社製）1.4%、バクトイーストエキストラクト（ディフコ社製）2.4%、KH2PO4 0.231%、K2HPO4 1.251%、１mol/l水酸化ナトリウムでpH 7.4に調整]5mlを含む試験管に植菌し、第１および２表に示した各温度で24時間振盪培養した。24時間後、上記で得られた化合物(VII-a)を終濃度が0.4mg/mlになるようにそれぞれの試験管に添加し、さらに48時間第１および２表に示した各温度で振盪して反応を行なった。
【００４２】
反応終了後、反応液を酢酸でpH3.5に調整した。この反応液0.5mlに酢酸エチル1mlを加え、1時間振盪した。振盪後、3000rpm、5分間の遠心分離によって反応液を２層に分け、上清の酢酸エチル層を回収し、遠心エバポレーターで溶媒を除去した後、残渣をメタノール0.5mlに溶解した。このメタノール溶液の一部を用いてHPLC分析[カラム；Inertsil ODS-2(5μm, 4x250mm, ジーエルサイエンス社製)、カラム温度；60℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝55：45：0.05、流速：0.9ml/分、検出波長：237nm]を行ない、化合物(VIII-a)[一般式(VIII-a)中Ｒ1はナトリウムである化合物]の検出、定量を行なった。結果を第１および第２表に示す。
【００４３】
【表１】
【表２】
実施例２
Mycobacterium gilvum JCM 6395株を実施例１と同様の寒天培地に塗布し、37℃で3日間培養し、寒天培地上に生育した菌株をLB培地3mlを含む試験管4本に植菌して、37℃で24時間振盪培養した。この培養液1.25mlを25mlのTB培地を含む300ml容三角フラスコ8本に各々植菌し、37℃で振盪培養した。24時間後に実施例１と同様に調整した化合物(VII-a)[一般式(VII-a)中Ｒ1はナトリウムである化合物]を終濃度が0.4mg/mlになるように添加し、37℃で48時間振盪した。反応終了後、培養液を3000rpm、4℃で10分間遠心分離し上清を分取した。この上清液のpHを酢酸で3.5に調整し、400mlの酢酸エチルを添加して30℃で1時間振盪した後静置し、上清を回収した。下層の水層に対して同じ操作を繰り返し、得られた酢酸エチル層を先の上清と合わせた。この酢酸エチル層に飽和食塩水100mlを添加して振盪後、上清を回収した。
【００４６】
次にこの上清に無水Na2SO4を5g添加して室温で15分間放置後、減圧により酢酸エチルを蒸発させ、乾固した。得られた残渣を脱イオン水５mlに溶解して水酸化ナトリウムでpHを9.0に調整し、50mlのHP-20カラム(25x100mm、三菱化学社製）に通塔した。カラムは150mlの脱イオン水で洗浄したあと、アセトン含量20%、30%、40%のアセトン水溶液100mlで段階的に溶出した。分取した画分は実施例１と同様のHPLC分析を行い、化合物(VIII-a)を含む画分を回収した。減圧下でこの画分からアセトンを除去し、１mol/l塩酸で溶液のpHを3.0に調整した。この溶液に360mlの酢酸エチルを添加して振盪し、静置後上清を回収した。この上清に飽和食塩水90mlを添加し振盪、静置後、上清を回収した。
【００４７】
次にこの上清に無水Na2SO4を4.5g添加して室温で15分間おいた後、減圧乾固した。得られた乾固物をジクロロメタンに溶解し、1%トリフルオロ酢酸を加えてラクトン化した。この反応物を分取用TLC[シリカゲル板；No.1.05744(200x200mm, 0.5mm厚)MERCK社製、展開溶媒；酢酸エチル、発色液；12.5%リンモリブデン酸・1%セリウム／10%硫酸溶液]を用いて分画し、化合物(VIII-b) 0.8mgが得られた。得られた化合物(VIII-b)のマススペクトルおよび1H-NMRスペクトル分析結果は以下の通りである。
【００４８】
マススペクトル
日本電子製JMS-HX/HX110A質量分析計を用い、マトリックスにm-ニトロベンジルアルコールを使用してポジティブモードで測定した。その結果、m/z 407に擬似分子イオンピーク([M+H]+）を与え、化合物(II-b)の構造および分子量(406)から期待される数値に一致した。
【００４９】
1 H-NMRスペクトル
日本電子製JNM-α400型スペクトロメータを用い、重クロロホルム中、内部標準にTMSを使用し400MHzで測定した。その結果を以下に示す。このスペクトルデータは化合物(VIII-b)の公知のデータ[三共研究所年報、37、147(1985)]と一致した。
δppm(CDCl3):6.01(1H, d,J=9.5Hz), 5.89(1H, dd,J=9.5, 5.9Hz), 5.58(1H, m), 5.41(1H, m), 4.60(1H, ddd,J=10.6, 7.3, 5.4, 2.8Hz), 4.40(1H, m), 4.38(1H, m), 2.74(1H, dd,J=13.1, 6.0, 4.8, 1.5Hz), 2.40(1H, m), 2.36(1H, m), 2.34(1H, m), 1.95(1H, dddd, J=14.4, 3.7, 2.9, 1.7Hz), 1.86(1H, dddd, J=12.5, 12.3, 7.3, 4.3Hz), 1.69(1H, m), 1.68(1H, m), 1.64(1H, m), 1.57(1H, m), 1.5〜1.4(2H, m), 1.43(1h, m), 1.30(1H, m), 1.12(3H, d, J=6.8Hz), 0.91(3H, d, J=7.1Hz), 0.89(3H, t, J=7.4Hz)
【００５０】
【産業上の利用可能性】
本願発明によりＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を有する化合物を効率よく製造することができる。
Claims (8)
- 一般式(I-a)
- 化合物(I-a)が一般式(III-a)
- 化合物(I-a)が一般式(V-a)
- 化合物(I-a)が一般式(VII-a)
- 微生物の培養物の処理物が、培養菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物、該菌体の溶媒処理物等の菌体処理物、菌体の蛋白分画物、菌体および菌体処理物の固定化物から選ばれる処理物である、請求項１記載の製造法。
- 微生物がMycobacterium phlei、Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium thermoresistibile、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium parafortuitum、Mycobacterium gilvum、Rhodococcus globerulus、Rhodococcus equi、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、Rhodococcus rhodnii、Rhodococcus ruber、Rhodococcus coprophilus、Rhodococcus fascians、Gordona amarae、Gordona rubropertinctus、Gordona bronchialis、Gordona sputi、Gordona aichiensis、Gordona terrae、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium mycetoides、Corynebacterium variabilis、Corynebacterium ammoniagenes、Arthrobacter crystallopoietes、Arthrobacter duodecadis、Arthrobacter ramosus、Arthrobacter sulfureus、Arthrobacter aurescens、Arthrobacter citreus、Arthrobacter globiformis、Brevibacterium acetylicum、Brevibacterium linens、Brevibacterium incertum、Brevibacterium iodinum、Micrococcus luteus、Micrococcus roseus、Cellulomonas cellulans、Cellulomonas cartae、Sphingomonas paucimobilis、Sphingomonas adhaesiva、およびSphingomonas terraeから選ばれる微生物である、請求項１記載の製造法。
- 微生物がMycobacterium phlei JCM5865、Mycobacterium smegmatis JCM5866、Mycobacterium thermoresistibile JCM6362、Mycobacterium neoaurum JCM6365、Mycobacterium parafortuitum JCM6367、Mycobacterium gilvum JCM6395、Rhodococcus globerulus ATCC25714、Rhodococcus equi ATCC21387、Rhodococcus equi ATCC7005、Rhodococcus erythropolis ATCC4277、Rhodococcus rhodochrous ATCC21430、Rhodococcus rhodochrous ATCC13808、Rhodococcus rhodnii ATCC35071、Rhodococcus ruber JCM3205、Rhodococcus coprophilus ATCC29080、Rhodococcus fascians ATCC12974、Rhodococcus fascians ATCC35014、Gordona amarae ATCC27808、Gordona rubropertinctus IFM-33、Gordona rubropertinctus ATCC14352、Gordona bronchialis ATCC25592、Gordona sputi ATCC29627、Gordona aichiensis ATCC33611、Gordona terrae ATCC25594、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC14020、Corynebacterium glutamicum ATCC19240、Corynebacterium mycetoides ATCC21134、Corynebacterium variabilis ATCC15753、Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872、Arthrobacter crystallopoietes ATCC15481、Arthrobacter duodecadis ATCC13347、Arthrobacter ramosus ATCC13727、Arthrobacter sulfureus ATCC19098、Arthrobacter aurescens ATCC13344、Arthrobacter citreus ATCC11624、Arthrobacter globiformis ATCC8010、Brevibacterium acetylicum ATCC953、Brevibacterium linens ATCC19391、Brevibacterium linens ATCC9172、Brevibacterium incertum ATCC8363、Brevibacterium iodinum IFO3558、Micrococcus luteus ATCC4698、Micrococcus roseus ATCC186、Cellulomonas cellulans ATCC15921、Cellulomonas cartae ATCC21681、Sphingomonas paucimobilis ATCC29837、Sphingomonas adhaesiva JCM7370、およびSphingomonas terrae IFO15098から選ばれる微生物である、請求項１記載の製造法。
- 微生物がGordona sp. ATCC19067である、請求項１記載の製造法。
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