CZ20012622A3

CZ20012622A3 - Proces přípravy inhibitorů HMG-CoA reduktázy

Info

Publication number: CZ20012622A3
Application number: CZ20012622A
Authority: CZ
Inventors: Shin-Ichi Hashimoto; Yoshiyuki Yonetani; Akio Ozaki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd.
Priority date: 1999-01-20
Filing date: 2000-01-20
Publication date: 2002-01-16
Also published as: DE60034547T8; CA2358927A1; HUP0105000A3; EP1146126A1; WO2000043533A1; CN1240844C; KR100633867B1; JP4428866B2; CN1344328A; EP1146126B1; EP1146126A4; AU3074300A; ATE360703T1; US6946270B1; IL144405A0; KR20020002375A; HUP0105000A2; DE60034547D1; HK1040419A1; DE60034547T2

Description

Oblast techniky ' ·

Předkládaný vynález se týká oblasti přípravy sloučeniny, která inhibuje hydroxymetylglutaryl CoA (HMG-CoA) reduktázu a má účinek na snížení sérového cholesterolu. ·

Dosavadní stav techniky

Sloučenina reprezentovaná vzorcem (iv-a) (odtud referována jako sloučenina (IV-a)):

HO

kde R¹ představuje vodíkový atom nebo alkalický kov,,nebo’laktonovou formu sloučeniny (Vl-a)- reprezentovanou vzorcem (Vi-b) (odtud referována jako sloučenina (IV-b)):

je známa, že inhibuje HMG-CoA reduktázu a vykazuje účinek na snížení sérového cholesterolu a podobně (The Journal of Antibiotics, 29, 1346 (1976)) .

·’ · ·' ' · - · • '· ' · * · · · · · - · · · 4 •·· »·· ---99 · ·· 9 1

Existuje několik zpráv týkajících se způsobu přípravy sloučeniny (Vl-a) nebo sloučeniny (Vl-b) zě sloučeiiiny reprezentované vzorcem

kde R¹ představuje vodíkový atom nebo< alkalický kov, nebo laktonovou formu sloučeniny (V-a) reprezentovanou vzorcem '(V-b) (odtud referována jako sloučenina jv-b))^::'í -

(V-b) za použití mikroorganismu. . ,· >·· ·.’-···.

‘i

Patentová přihláška Japanese Patent Application Laid-Open (kokai) č. 57-50894 popisuje specificky způsob, který využívá vláknité houby; patentová přihláška Japanese Patent Application Laid-Open (kokai) č. 7-184670 i International Publication WQ 96/40863 popisují způsob, který využívá Aktinomycety; a. japonský' patent Japanese Patént č. 2672551 popisuje způsob, který-využívá rekombinantních Aktinomycet. Jak je -však dobře, známo, protože vláknité ’ houby ;.a -Aktinomycety rostou- ve vláknité formě prodlužováním mycélia, dochází ke zvyšování viskozity kultury ve fermentoru. To často způsobuje úbytek kyslíku v kultuře, a protože se kultury stávají heterogenními, snižuje se účinnost reakce. Aby se vyřešil tento' úbytek kyslíku a · kultura se

9 9 • 9 9 · · ·· 9 9·· • · · · · · • · · · · • · · 9 9 9 •· 999 99 9 udržela homogenní měl by být zvýšen stupeň promíchávání fermentoru, ale zvýšením stupně promíchávání je mycélium sestříháno a aktivita mikroorganismů se snižuje (Basic Fermentation Engineering (Hakko Kogaku no Kiso) str. 169-190, P.F. Stansbury,' A. Whitaker, Japan Scientific Press (1988)). ' ;

Výše zmíněné Aktinomycety a vláknité houby mají navíc schopnost sporulace. Protože spory mají tendenci se rozptýlit mnohem snadněji než buňky a mají schopnost přežívat dokonce- za podmínek, kde vegetativní buňky snadno hynou, mají .tyto spory tendenci stát se zdrojem mikrobiální kontaminace v kultivačních a purifikačních postupech. ^:4. · , ·

Popis vynálezu ?, '

Cílem předkládaného vynálezu je. poskytnout průmyslově výhodný způsob přípravy sloučeniny, která inhibuje HMG-CoA reduktázu a má účinek na snížení hladiny sérového cholesterolu a podobně.

Předkladatelé tohoto vynálezu zvažovali·, že pokud by byla provedena hydroxylace sloučeniny (V-a) nebo sloučeniny (V-b) - pomočí mikroorganismu majícího hydrdxylační aktivitu, nemajícího schopnost sporulace a nevytvářejícího mycélium, mohlo by být zabráněno • . I nevýhodám, jako jsou například- '.účinnost reakce v důsledku mikrobiální kontaminace způsobené /uvolněním spor během procesu přípravy, nebo v důsledku heterogenity kultury způsobené tvorbou mycélia, a že tento způsob by byl průmyslově výhodný. Intenzivními studiemi namířenými k tomuto cíly ‘ dosáhli vynálezci předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález se tedy týká následujících bodů (1) až (9).

Od této chvíle představuje R¹.-vodíkový atom, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, nebo 'alkalický kov, a R² představuje substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, _ nebo substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, pokud není jinak specifikováno.

Proces přípravy sloučeniny (ΙΙ-a) nebo sloučenin (Il-b), kde jako enzymový zdroj je použit mikroorganismus mající aktivitu produkovat sloučeninu (II—a) nebo sloučeninu (ΙΙ-b) ze sloučeniny (I-a) nebo ze sloučeniny (I-b) bez schopnosti sporulace a nevytvářejícím mycelium, kultura řečeného mikroorganismu, nebo upravený produkt řečené kultury, a postup zahrnuje: umožnění sloučenině (I-a) nebo sloučenině (I-b) existovat ve vodném .médiu; umožnění sloučenině '(IIa) nebo sloučenině (ΙΙ-b) být produkována a akumulována v řečeném vodném médiu; a stažení sloučenin (Il-a) nebo (ΙΙ-b) z řečeného vodného média, a kde sloučenina (I-a) je sloučeninou reprezentovanou vzorcem (I-a) (odtud referovaná jako sloučenina (I-á)):

vzorcem (I-b) (odtud referovaná jako sloučenina (I-b)):

sloučenina (Il-a) je sloučenina reprezentovaná vzorcem (ΙΙ-a) (odtud referovaná jako sloučenina (ÍI-a)j: ,· .

i > · · · · · · • · · · ,· • · ·· · sloučenina Ul· b) je .láktonová forma sloučeniny (Il-a) reprezentované

b)):

2) Postup podle bodu 1) uvedeného výše, kde sloučenina (I-a) je sloučeninou reprezentovanou vzorcem (III-a! (odtud referovaná jako sloučenina*(ill-a)1:

Sloučenina (I-b) je sloučenina reprezentovaná vzorcem (ΙΙΙ-b) (odtud j referovaná jako sloučenina (III,-b)): ·

(ΠΙ-b)

Sloučenina (ΙΙ-a) je sloučenina reprezentovaná vzorcem (IV-a), (odtud referovaná jako sloučenina (IV-a)): -* · ,

A/; 'i > ··;

-'j .·

Ά 'A

sloučenina (ΓΙ-b) je sloučenina reprezentované vzorcem (IV-b) (odtud referovaná jako sloučenina (IV-b)): _

Ov-b)

-i

3) Postup podle bodu 1) uvedeného výše, kde j ' ' i* ' .· .

sloučenina (I-a) je sloučeninou reprezentovanou vzorcem (V-a) (odtud referovaná jako sloučenina (V-a));: · '

R^!OOC . >HO

(V-a)’ sloučenina (I-b) je sloučenina reprezentovaná vzorcem (V-b) (odtud referovaná jako sloučenina (V-bj ) *

.. ' '‘8.

-i ·'· '·'·« 9 , 99

-'•-.S · **,, ,· ' . · .· • · ? · - · 9

9 ’ 9 « · • · · · · ·· · 99

(V-b) sloučenina (ΙΙ-a) je sloučenina reprezentovaná vzorcem (Vl-a) (odtud • . '-ii: ' '* referovaná jako sloučenina (Vl-a)) :. '·'· ‘ <

'.jí?

- ' · ··.· · *·.;» ’ · ,s‘ .

sloučenina (II.-b) je sloučenina reprezentované vzorcem (VI-b) (odtud, ··' ' 8 ’ ' ,^l ' referovaná jako sloučenina (V3-b) ) : ί <· · ·

(Vl-b) sloučenina (I-a) je sloučeninou, reprezentovanou vzorcem (VlI-a) (odtud referovaná jako sloučenina (VlI-a)):

.. .j«·

• tt · 4. · » .· < · * ' ·	• · '	···' φ'·'.'	···· •	··	tt-
· ’·	• •	>t •	♦ 9
• ·	•	•	•	•		. 9
• ·	• · ·		• ·	7*		··	.99 9

sloučenina (I-b) je sloučenina réprezentovaná vzorcem (VlI-b) .(odtud referovaná jako sloučenina (VlI-b)): ; ; . · . ' Ί

‘-f · sloučenina (Il-a) je sloučenina ’ reprezentovaná vzorcem; (Vlll-a) ... í (odtud referovaná jako sloučenina·^:(VIII-a)) : ‘

a - i -7 .

* ř· ' ' ' / sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina 'reprezentované vzorcem (VlII-b) , (odtud referovaná jako sloučenina (VÍIl-b)):

♦1 ¹ 5 :

· · . · ♦ ♦ ·· • · · • · · • · · • · · · ·

5) Postup podle bodu 1) uvedeného výše, kde upravený produkt kultury mikroorganismu je upravený produkt vybraný z kultivovaných buněk, upravených produktů, jako jsou například 'vysušené buňky, lyofilizované buňky, buňky zpracované surfaktantem, buňky zpracované enzymem, buňky zpracované .„ultrasonikací/,; buňky zpracované mechanickým mletím, buňky j zpracované', rozpouštědlem, proteinová frakce buňky; a imobilizoyané produkty buněk nebo zpřacovaných buněk. u - . - ' ' · .

6) Postup podle bodu 1) .uvedeného výše, kde mikroorganismus je V'-' Λ - .

vybrán z mikroorganismů patřících . do rodu; Mycobacterium;, Corynebacterium, Brevibacterium,· Rhodococus, Gordona, Arthrobacter, Micrococus, Celulomonas a Sphingomonas.

„.X

7) Postup podle bodu lj uvedeného’ výše, mikroorganismus vybraný z Mycobacterium kde mikroorganismus je phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium thermoresistibile, Mycobacterium ' neoaurum, Mycobacterium parafortuitum, Mycobacterium gilvum, globerulus, Rhodococus equi, Rhodococus erythropolis, rhodochrous, Rhodococus rhodnii, Rhodococus ruber,

Rhodococus fascians, ' Gordona amarae, coprofilus,

Rhodocočús

Rhodococus

Gordona rubropertinctus, Gordona bronchialis, Gordona sputi, Gordona aichiensis, Gordona térrae, Corynebacterium mycetoides, j Corynebacterium ammoniagenéš,

Arthrobacter sulfureus,

Corynebacterium glutamičum,·

Corynebacterium variabilis,

Arthrobacter crystalopoites, duodecadis'/ Arthrobacter rámosus, Arthrobacter

Arthrobacter ' aurescens, ’ Arthrobacter , citreus, Arthrobacter globiformis, Brevibacterium acetylicum, -Brevibacterium linens, Brevibacterium incertum/’Brevibacterium iodinum, Micřococus • · · ·

10	· · · · · • · · ' · ·	·· ···« • · · • · ·	·♦ · · ' « · · · • · «
	• · · • · · · ·	• · · ·· ·	' · · · • · « · ·

luteus, Micrococus roseus, Celulomonas. célúlans, Celulomonas cartae,

Sphingomonas paucinomibilis; Sphingomonaš adhaesiva a Sphingomonas terrae. ' _ř

8) Postup podle bodu 1) uvedeného výše, kde mikroorganismus je mikroorganismus vybraný z Mycobacterium phlei JCM5865/ Mycobacterium smegmatis JCM5866, .Mycobacterium thermoresistibile JCM6362, Mycobacterium neoaurum .JCM6365, Mycobacterium parafortuitum JCM6367, Mycobacterium gilvum JCM6395, Rhodococus globerulus ATCC25714, Rhodococus equi ATCC21387, Rhodococus equi ATCC7005, Rhodococus erythropolis ATCC4277, Rhodococus rhodochrous ATCC21430, Rhodococus rhodochrous ATCC13808, Rhodococus řhodhií. ATCC35071, Rhodococus ruber JCM3205, Rhodococus coprofilus ÁTCC29080, Rhodococus fascians ATCC12974, Rhodococus fascians ATCČ35014, Gordona ámarae ATCC27808, Gordona rubropertinctus IFM-33, Gordona rubropertinctus ATCC14352, Gordona bronchialis ATČC25592, . Gordona šputi ATCC29627, Gordona' aichiensis ATCC33611, Gordona terrae ATCC25594, Corynebacterium ; f glutamicum ATCC19240, Corynebacterium mycetoides ATCC21134, Corynebacterium variabilis ATCC15753, Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872, Arthrobacter crystalopoites ATGČ15481, Arthrobacter duodecačis ATCC13347, Arthrobacter* rámosus ATCC13727, Arthrobacter sulfuřeus ATCC19098, Arthrobacter áurescens ATCC13344, Arthrobacter citreus ATCC11624, Arthrobacter gióbiformis ATCC80.10, Brevibacterium acetylicum ATCC953, Brevibacterium linens ATCC19391, Brevibacterium incértum ATCC8363, Brevibacterium iodinum'IFO3558, Micrococus luteus ATCC4698, Micrococus roseus ATCC186). Celulomonas celulans ATCC15921, Celulomonas cartae AŤCC21681,· Sphingomonas paucinomibilis ATCC29837, Sphingomonas adhaesiva JCM7370 a Sphingomonas terrae ATCC15098.

9) Postup podle bodu 1) uvedeného výše, kde mikroorganismus je Gordona sp. ATCC19067. * ₈ Předkládaný vynález je popsán detailněji níže.

Příklady zdroje enzymu používaného v předkládaném vynálezu zahrnují: mikroorganismus, který má aktivitu produkovat, výše uvedenou sloučeninu (ΙΙ-a) nebo výše uvedenou sloučeninu (ΙΙ-b) z výše ’»·· · ·-· »·>·.» »»,!.» η · ·· * * « · * ·· t ··»····· ·»· ··· ··· ·· ··· ·· » ·· »·· uvedených sloučenin (I-a) nebo výše uvedené sloučeniny (I-b), bez schopnosti sporulace a bez tvorby mycélia; kulturu řečeného mikroorganismu; nebo zpracovaný produkt řečené kultury. · ;

Alkyl je lineární nebo větvený alkyl obsahující 1 až 10 uhlíkových atomů, přednostně 1 až 6 uhlíkových atomů, jako jsou metyl, etyl) i propyl, izopropyl, butyl, izobutyl, sec-butyl, -tert-butyl,- pentýl, neopentyl, hexyl, izohexyl, heptyl, 4,4-dimetylpentýl, oktyl, 2,24trimetylpentyl, nonyl, decyl, a jejich různé izomery s větveným řetězcem.

Příklady arylu zahrnují fenyl a naftyl.

Substituentem substituovaného alkylu mohou být 1 až 3 identické nebo odlišné skupiny, a- jejich příkladyizhrnují halogeny, hydroxy, amino, * alkyl a alkoxy substituenty; ý ¹ ’ ' i

Alkylová skupina a alkoxy má stejnou definici jako alkyl zmíněný výše. . ,. - - ’ . · . \

Alkalické kovy představují prvky lithium, sodík, draslík, rubidium, cesium nebo francium. ‘

Příklady výše uvedeného ' mikroorganismu zahrnují mikroorganismy vybrané z rodu Mycobacterium, -Corynebacterium, .Brevibacterium, ^!Rhodococus, Gordona, Arthrobacter, Micrococus, Celulomonas a Sphingomonas. /..·- i

Specifické příklady zahrnují mikroorganismy vybrané z Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, .{Mycobacterium thermoresistibile, Mycobacterium neoaurum, Mycobacterium parafórtuitum, Mycobacterium gilvum, Rhodococus globerulus, ‘ Rhodococus ' j equi,.· Rhodococus erythropolis, Rhodococus rhodochřous, Rhodococus rhodnii, Rhodococus ruber, Rhodococus coprofilus, Rhodococus ’ fascians, Gordona amaráe, * Gordona rubropertinctus, ‘Gordona břonchialis, - Gordona sputi, Gordona i aichiensis, Gordona terrae, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium mycetoides, .'Corynebacterium variabilis,

Corynebacterium ammoniagenes, - Arthrobactěr ·- crystalopoites, Arthrobacter duodecadis, Arthrobactěr . ramosus, Arthrobactěr < sulfureus, Arthrobacter auřescens, Arthrobacter citreus,·.' ^!Arthrobacter globiformiš, Brevibacterium acetylicum,- -Brevibacterium· linens, Brevibacterium incertum, ;Brevibacterium iodinum, Micrococus luteus, Micrococus roseus, Celulomonaš celulans, Celulomonas cartae,· Sphingomonas paucinomibilis, Sphingómóhas adhaesiva a Sphingomonas terrae.

Specifičtěji příklady zahrnují Mycobacterium. phlei JCM5865, Mycobacterium smegmatis JCM5866, 5Mycobacterium thermoresistibile ''

JCM6362, Mycobacterium neoaurum JCM6365, Mycobacterium párafortuitum JCM6367, Mycobacterium gilvum JCM6395, ' Rhodococus globerulus ;

ATCC25714, Rhodococus equi ATCC21387, Rhodococus equi ATCC7005, ’ *

Rhodococus erythropolis ATCC4277,'Rhodococus rhodochrous ATCC21430, Rhodococus rhodochrous ATCC13808, ;; Rhodococus rhodnii ATCC35071, Rhodococus ruber JCM3205, Rhodococus coprófilus ATCC29080, Rhodococus fascians ATCC12974, ••Rhodococus fascians ATCC35014,'

- t

Gordona amarae ATCC27808, Gordona rubropértinctus IÉM-33, Gordona,. \ rubropértinctus ATCC14352, Gordona j. bronchialis ATCC25592, Gordona sputi ATCC29627, Gordona , aichiensis ’ ATCC33611, Gordona terrae ⁵

ATCC25594, Corynebacterium ‘glutamicum ATCC19240, Corynebacterium mycetoides ATCC21134, Corynebacterium variabilis ATCC15753, ‘

... , i,

Corynebacterium ammoniagenes ⁴ ATCC6872, Arthrobacter crystalopoites ATCC15481, Arthrobacter duodecadis ATCC13347, Arthrobacter ramosus t

Z. ' ' ''

ATCC13727, Arthrobacter sulfureus' ATCC19098, Arthrobacter auřescens ATCC13344, Arthrobacter citreus ATCC11624, Arthrobacter globiformiš ATCC8010, Brevibacterium acetylicum ATCC953, Brevibacterium linens' , ATCC19391, Brevibacterium incertum ATCC8363, Brevibacterium iodinum , IFO3558, Micrococus luteus . ATCC4698, Micrococus roseus ATCC186, i Celulomonas celulans ATČC15921, Celulomonas cartae. ATCC21681,' Sphingomonas paucinomibilis ATCC29837, Sphingomonas adhaesiva,, JCM7370 a Sphingomonas terrae ATCC15098 a Gordona sp. ATCC19067. ‘

Navíc může být použita také subkultura, mutant, derivát nebo rekombinant připravený- rekombinantní' DNA technikou z jakéhokoli’ , z těchto mikroorganismů.

• · »<©·· • · *

« · • a « ta ··«· ₉ ! <· · · ·· • * * · · • · a « · 4 • · · · · · ·♦ * >· ♦*·

Jako médium používané pro kultivaci mikroorganismu používaného v předkládaném vynálezu mohou být použita přirozená i syntetická média, pokud obsahují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, anorganické soli a podobně, které mohou být asimilovány mikroorgaríismem' předkládaného vynálezu, a v kterých může: být mikroorganismus předkládaného vynálezu účinně kultivován.

Specifické příklady zdroje uhlíku v médiu zahrnují sacharidy, jako jsou například glukóza, fruktóza, glycerol, maltóža, škrob, a sacharóza, a organické kyseliny,' jako' jsou například kyselina octová a kyselina citrónová a melasa. ' ··

Specifické příklady zdroje dusíku v médiu zahrnují amoniak, amoniové* soli různých typů anorganických kyselin a organických kyselin, jako jsou například chlorid amonný, síran amonný, octan amonný, dusičnan amonný, fosforečnan amonný; .'pepton, masový extrakt, kukuřičný extrakt, hydrolyzát kaseínu, sójový extrakt, bavlníkový extrakt, rybí extrakt, různé typy fermentovaných mikrobiálních buněk a jejich extrakt. . · · .V

Specifické příklady anorganických sloučenin zahrnují dihydrogenfosforečnan - draselný, hýdrogenfosforečnan dvojdraselný, fosforečnan horečnatý, síran _z hořečňatý, chlorid sodný, síran železnatý, síran horečnatý, síran měďnatý a uhličitan vápenatý. *

Je-li to vyžadováno, mohou být přidány vitaminy, jako jsou například thiamin a biotin, aminokyseliny, jako jsou například kyselina glutamová a kyselina aspartová,. látky příbuzné nukleovým kyselinám, jako jsou například adenin a guanin.

Kultivace mikrorganismu používaného v předkládaném vynálezu je přednostně prováděna za aerobních podmínek, jako například kultivace s protřepáváním, kultivace s provzdušňováním, a podobně. Je-li prováděna kultivace s provzdušňováním, je preferováno přidat příslušné množství látky zabraňující pěnění. Kultivace je prováděna obvykle při teplotě 20 až 50°C, přednostně při teplotě 25 až 40°C, po

14	4 4·· 4 ,·'· · 4· • 4	44 4444 • · 4 • 4 4	44 O • · 4 4 '4 4 4
	4 4 4 4 4 4 4 4	• · 4 4 4 4 -	4 4 4 • · 4 4 4

dobu 6 až 120 hodin. Během kultivace je pH udržováno, na hodnotě.5,0 až 10,0, přednostně 6,0 až 8,5. Kontrola- pH je -prováděna za použití anorganických nebo organických kyselin, alkalického roztoku, močoviny, uhličitanu vápenatého, amoniaku, atd. - Příklady upraveného produktu takto získaného ., kultivovaného mikroorganismu zahrnují kultivované buňky, upravený produkt, jako jsou například vysušené buňky, lyofilizované- buňky, buňky zpracované surfaktantem, buňky zpracované enzymem, buňky zpracované ultrasonikací, buňky-zpracované mechanickým mletím, buňky zpračované rozpouštědlem, proteinová, frakce buněk; a imobilizovaný produkt buněk nebo zpracovaných buněk. Způsoby konverze sloučeniny (I-a). .nebo sloučeniny (I-b) na sloučeninu (ΙΙ-a) nebo sloučeninu (ΙΙ-b) mohou být způsobem,' při kterém se přidá sloučenina (I-a). nebo/sloučenina -(I-b) do média, v kterém mají být mikroorganismy kultivovány. Dále může být ..také použit způsob umožňující enzymovému· zdroji účingk rta sloučeninu (Iaj nebo na sloučeninu (I-b) ve vodném médiu. V případě, kdy je sloučenina (I-a) nebo sloučenina (I-b) přidána do' média, v kterém má být mikroorganismus kultivován, je do 1 ml média přidáno ná začátku nebo uprostřed kultivace 0,1 mg, až 10 mg, přednostně 0,2 mg až b mg sloučeniny'.(I-a) nebo sloučeniny (I-b).. Je-li přidávána sloučenina (I-a) nebo sloučenina (I-b), může být přidávána po svém rozpuštění., v rozpouštědle, jako jsou například metylalkohol nebo etylalkohol.· u'.V případě způsobu umožňujícího účinek enzymového zdroje na sloučeninu (I-a) nebo sloučeninu- (i-b) ve vodném médiu závisí množství enzymu, které má být použito na specifické aktivitě enzymového zdroje. Napříkladi je-li použita kultura mikroorganismů nebo upravený produkt kultury jako enzymový zdroj, je na 1 mg sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny'’ (I-b) přidáno 5- až 1000 mg, přednostně 10 až 400 mg enzymového zdroje. Reakce je prováděna ve vodném médiu, přednostně při·- teplotě 20 až 50°C, a obzvláště přednostně při teplotě 25 až 40°C. Reakční doba závisí na množství i

•15 specifické aktivitě, atd. enzymového zdroje, který má být použit, ale je obvykle 0,5 až 150 hodin, přednostně í až 72 hodin. . Příklady vodného média zahrnují vodu nebo pufry, jako jsou fosfátový pufr, pufry HEPES (A-2 hydroxyetyÍpiperazin-N-etansulfonát) a Tris' (tris (hydroxymetyl) amift.ometan) ’ hydrochlorid) .* K výše. uvedeným pufrům může být přidáno rozpouštědlo, pokud neinhibuje reakci. Příklady organického rozpouštědla zahrnují ' aceton, etylacetát, dimetylsulfoxid, xylen, metylalkohol, etylalkohol a .butanol. Je-li použita sloučenina . (1-b), je přednostně použita směs organického rozpouštědla a vodného média.

Podle výše uvedeného způsobu může být ze sloučeniny. .(I-a) 'získána sloučenina (Il-a) nebo směs sloučeniny Jll-a) a sloučeniny' (II-b) ..... '

Podobně může být ze sloučeniny. .(I-b). získána sloučenina (II-b). nebo směs sloučeniny (ΙΙ-a) a sloučeniny (II-b). ' ·

Navíc může být zesměsi sloučeniny (I-a) a sloučeniny (I-b) získána směs sloučeniny (ΪΙ-a) a sloučeniny (II-b).

Sloučenina (I-b) a sloučenina (II-b) mohou být snadno přeměněny na sloučeninu (I-á) a respektive « sloučeninu (ΙΙ-a) otevřením laktonového kruhu, jak je.uvedeno; níže. - ’

Příklady otevření laktonového kruhu zahrnují způsob, který se Sestává z rozpuštění sloučeniny · (í-b) „nebo sloučeniny (II-b) ve vodném médiu a z přidání kyseliny nebo louhu. Příklady vodného média zahrnují vodu a vodný roztok obsahující soli, které neinhibují reakci, jako jsou například fosfátový . pufr, Tris pufr a podobně. Výše uvedený vodný roztok může · obsahovat organické rozpouštědlo, jako například metanol, etanol, etylacetát a podobně, v koncentrací,, která neinhibuje reakci. Příklady kyseliny zahrnují „kyselinu octovou, kyselinu chlorovodíkovou a kyselinu sírovou, á příklady louhu zahrnují hydroxid sodný, hydroxid draselný a amoniak.

V'* ''*···· · ······ .·· ·

.. 16 ^Γ · · ··· „!!!

.. ·········· • · · · · · · · · * ····· ····· ·-· ···

Příklady způsobu přípravy laktonu zahrnují způsob, který se sestává ' z rozpuštění ''sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (ΙΙ-a) v nevodném rozpouštědlu a z přidání kyseliny nebo louhu. Pokud je nevodným rozpouštědlem organické rozpouštědlo, které neobsahuje významné množství vody a je schopné rozpustit sloučeninu (I-a) nebo sloučeninu (Tl-a), může být použit jakýkoli typ nevodného rozpouštědla.

Příklady nevodných rozpouštědel zahrnuji dichlormetan a etylacetát. ··' Jako katalyzátor může- být použit jakýkoli katalyzátor, pokud í katalyzuje laktonizaci a nevykazuje jiný účinek než je laktonizace i sustrátu nebo reakčního produktu. Příklady výše uvedeného katalyzátoru zahrnují kyselinu trifúoróoctovou a p-toluensulf onovou. Reakčni teplota není významně omezena, ale přednostně v rozmezí‘0 až ’ 100°C a ještě přednostněji 20 áž 80°C. - - ,

Po ukončení reakce může být sloučenina (ΙΙ-a) nebo sloučenina (Il-b) získána z výše uvedeného roztoku běžnými způsoby používanými na poli organické syntetické chemie, jako jsou například extrakce ; organickými rozpouštědly, ' krystalizace, tenkovrstevná chromatografie, vysoko účinná kapalinová chromatografie, atd.

í

Jako způsob pro detekci a „kvantifikaci sloučeniny (ΙΙ-a) nebo ’ sloučeniny(ΙΙ-b) získaných pomocí ’ předkládaného vynálezu může být použit jakýkoli způsob, pokud může být provedena detekce nebo kvantifikace sloučeniny (ΙΙ-a) a/nebo sloučeniny (Il-b). Příklady těchto způsobů zahrnují ¹³C-NMR 'spektroskopii, ¹H-NMR spektroskopii, hmotovou spektroskopii, vysoko účinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) , atd. . ,

Pro sloučeninu (I-a), sloučeninu (I-b), sloučeninu (ΙΙ-a) a sloučeninu {II—b) mohou existovat stereoizomery, jako jsou například optické izomery. Předkládaný vynález pokrývá všechny možné izomery a jejich směsi zahrnujících tyto stereoizomery.

I.

i

- i ·’♦':· · · · · ·-♦♦· ·’ • · · .: · ' * ♦, . · · • · · · · · • · 9 ' 9 9 \ 9 9 • · · · · · • Λ · · · · · <

Jako sloučenina (I-a) je sloučenina· (III-a) přednostní’, sloučenina (V-a) je přednostnější, a < sloučenina (VlI-a) je obzvláště •f: ' ' přednostní. ...-···

Jako sloučenina (1-b) je sloučenina (ΙΙΙ-b) přednostní, sloučenina (V-b) je přednostnější,'· a . sloučenina (VlI-b) , · je obzvláště přednostní. - ' ' .

Jako sloučenina (Il-a) · je sloučenina.. (IV-a) .přednostní, sloučenina,.' ’ (Vl-a) je přednostnější, a sloučenina (VlII-a) ’ je obzvláště. í ' přednostní. ’ sloučenina(IV-b) přednostní, sloučenina

‘.á /' Sloučenina (Vlll-b) je · obzvláště..

jy i¹. .< · - ·...

Jako sloučenina (ΙΙ-b) je (Vl-b) je přednostnější, přednostní.

Příklady předkládaného vynálezu 'jsou’ popsány· níže;, ale. předkládaný·’ · ΐ vynález není omezen na tyto příklady.: / - i : ·, ’ , ’

Příklady provedení vynálezu ,

Přiklad l 1. í··,,. -'.·< '<. · '

100 mg sloučeniny (VlI-b) (výrobce’ společnost.Sigma) bylo rozpuštěno _ v 9,5 ml metanolu a bylo při dáno 0,5 mi 1 mol/1 hydroxidu sodného. j .· ^: 'úir· ,. i 1 f řSměs byla promíchávána při. pokojové'Teplotě při pokojové teplotě; po ' u i dobu 1 hodiny. Získaný reakční roztok* bylvysušen tak, .. aby byla / L získána pevná forma, která · byla rozpuštěna přidáním¹ '5 . ml· ' - ..

deionizované vody s následnou uplavou-pH na zhruba 6/5 až 7,5 (pomočí \ } · , ;

zhruba .0,1 ml kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 1 mol/1., “Poté . : ’ bylo·'db/ směsi. přidáno 4,9 ml·. deionizováné vody, aby bylo získáno 1-0 ml sloučeniny. (VIT-a), jejíž finální .koncentrace byla 10 mg/ml i , (sloučenina, kde ve vzorci (VlI-a) je R^: sodík). ‘ · -..8

Různé typy mikroorganismů uvedených: v Tabulkách 1 a 2 byly nezávisle umístěny na agarové médium (1% pepton (výrobce společnost -Kyokuťo Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.)·, 0,7% masový extrakt (výrobce společnost Kyokuto Pharmaceutical’·-Indúšťrial Co., Ltd.), 0,3% Naď, 'i 0,2% kvasničný autolyzát (výrobce společnost Nihon; Pharmaceutical’ ^: • ' t. *·-·./- i

18' • ·♦ • · ♦ ·

Co., Ltd.), 2% bactoagar (výrobce společnost Difco), pH upraveno na

7,2 pomocí hydroxidu sodného o koncentraci .1» mol/1), poté · . . í kultivovány po dobu 3 dnů při každé teplotě uvedené v Tabulce 1 a ' v Tabulce 2. Inokulační kličkou byl každý z kmenů, které rostly na agarovém médiu, inokulóván do zkumavky obsahující 3 ml LB média (1% bacto trypton (vyráběný - společností Difco), 0,5% bacto kvasničný autolyzát (vyráběný společností Difco) š pH upraveným na 7,2 pomocí hydroxidu sodného o koncentraci 1 mol/1). Tato kultura byla poté ; vystavena kultivaci za protřepávání po dobu 24 hodin při každé ' teplotě uvedené v Tabulce 1 a v Tabulce 2. Po kultivaci bylo 0,25 ml ; kultury inokulováno do zkumavek obsahujících 5. ml TB média (1,4% ’ bacto trypton (vyráběný společností Difco), 2,4% bacto kvasničný autolyzát (vyráběný společností Difco) , 0,231% KH₂PO₄ s pH upraveným na 7,4 pomocí hydroxidu sodného ó. koncentraci 1 mol/1). Zkumavky ’ byly poté vystaveny kultivaci za protřepávání po dobu 24 hodin při 'j· každé teplotě uvedené v Tabulce 1 a v’Tabulce 2. Po 24 hodinách byla * přidána do každé zkumavky' výše. získaná sloučenina (VlI-a) ve finální koncentraci 0,4 mg/ml a poté bylá,provedena reakce za protřepávání při každé teplotě uvedené v .Tabulce 1 a v. Tabulce 2 po dobu 48 hodin. . ; (

Po ukončení reakce bylo pH reakčního, roztoku- upraveno na 3,5 pomocí , kyseliny octové. K 0,5 ml’ tohoto reakčního roztoku byl přidán 1 ml ·} · ' etylacetátu s následným přotřépáváním po dobu 1 hodiny. Po protřepávání byl reakční roztok oddělen do 2 vrstev centrifugaci při : 3000 otáčkách za minutu po dobu 5¹ minut a poté byla stažena horní ětylacetátová vrstva. Rozpouštědlo bylo odstraněno centrifugačním ' ' * · · odpařováním reziduum bylo rozpuštěno .v 0,5 ml metanolu. Za použití části tohoto metanolového roztoku byla provedena HPLC analýza (Kolona: Inertsil ODS-2 (5 - um, ;4x250 mm, vyráběná firmou GL Science), teplota kolony: 60°C, mobilní fáze: acetonitril: voda: kyselina fosforečná = 55:45:0,05, · průtok: 0,9 ml/min, detekční vlnová délka: 237 nm) za účelem .detekce a kvantifikace' sloučeniny ' (VlII-a) (sloučenina kde ve vzorci (VlII-a) je R¹ sodík). Výsledky jsou uvedeny v Tabulkách 1 a 2.' • · ··· ·

Tabulka 1

Kmen		Sloučenina (VlII-a) mg/1	Kultivační teplota (°C)
Mycobacterium phlei	JCM 5865	,. 1,6	37
Mycobacterium smegmatis.	JCM 5866	0,4	37
Mycobacterium thermoresistible	JCM . 6362	9,1 '	37
Mycobacterium neoaurum	JCM 6365	3,7	37
Mycobacterium parafortuitum	JCM 6367	7,4	37
Mycobacterium gilvum	JCM 6395'	9,6 .	37
Rhodococus globerulus	ATCC 25714	4,9	28
Rhodococus equi	ATCC21387	2,5	30
Rhodococus erythropolis	. ATCC4277 .	1,4	30
Rhodococus rhodochrous	ATCC21430	' 4,9	30
Rhodococus equi	ATCC7005	1,4	30
Rhodococus rhodochrous	ATCC13808 :f	4,7	28
Rhodococus rhodnii	ATCC35071 1 „	0,4	28
Rhodococus ruber	JCM‘3205 ·.	0,6	28
Rhodococus coprophilus	ATCC29080 ' -	5,6	28
Rhodococus fascians	ATCC2974	1,3	28
Rhodococus fascians	ATCC35014	5,2	30
Gordona amarae	ATCC27808	1,2 .	30
Gordona rubropertinctus	IFM-33 .	2,5	30
Gordona bronchialis	ATCC25592	0,9	28
Gordona rubropertinctus	. ATCC14352	0,7	28
Gordona sputi	ATCC29627	0,3	28
Gordona aichiensis	ATCC33611	0, 6	28
Gordona sp.	ATCC19067 .	4,0	30
Gordona terrae	ATCC25594	0, 3	28

. 20

Tabulka 2

Kmen		Sloučenina (VlII-a) mg/1	Kultivační teplota (°C)
Corynebacterium glutamicum	ATCC13032	1,1	30
Corynebacterium glutamicum.	ATCC14020	0,7	3.0
Corynebacterium glutamicum	ATCC19240	1,0	30
Corynebacterium mycetoides	ATCC2134	0,3	30
Corynebacterium variabilis	ATCC15753	1,7	30 .
Corynebacterium amoniágehes	,·, ATCC6872	0,6	30
Arthrobacter crystalopoites	'· ATCC15481	0,5	30
Arthrobacter duodecadis	ATCC13347	0,7	30
Arthrobacter ramosus·	• -ATCC13727	2,2	30
Arthrobacter sulfureus'	ATCC19098	1,1	30
Arthrobacter aurescens	ATCC13344	.1,3.	30
Arthrobacter citreus	ATCC11624	1,2	30
Arthrobacter globi-formis -	•ATCC8010	0,3	30
Brevibacterium acetylicum	ATCC953	0,4	30
Brevibacterium linens	, ATCC19391	0,5	30 ,
Brevibacterium linens	ATCC9172	0, 6	30
Brevibacterium incertum	ATCC8363	0, 5	30
Brevibacterium iodinum	•IFO3558 '	- . 0,8	30
Micrococus luteus	ATCC4698 '	.0,5	30
Micrococus roseus	, ATCC186	0,4	30
Celulomonas celulans	ATCC15921	0,7	30
Celulomonas cartae	ATCC21681	0,7 -	30
Sphingomonas paucimobilis-	ATCC29837	3,4	30
Sphingomonas adhaesiva	JCM7370	2,7	37
Sphingomonas terrae	ATCC15098	.3,1	30

Příklad 2

Mycobcterium gilvum, kmen JCM 6395, byl naočkován na stejné agarové médium jako v Příkladu 1 a kultivace probíhala při teplotě 37°C po dobu 3 dnů. Kmen, který rostl na agařovém médiu byl inokulován do 4 zkumavek, kde každá obsahovala 3 ml- LB média s následnou kultivací za protřepávání při teplotě ,37°O po dobu 24 hodin. 1,25 ml každé z kultur bylo inokulováno do .8 ‘ 300-ml Erlenmeyerových nádob obsahujících 25 ml TB média s následnou kultivací za protřepávání při teplotě 37°C. Po 24 hodinách bylá sloučenina (VlI-a) připravena jako v Příkladu 1 (sloučenina, kde vs vzorci (VlI-a) je R¹ sodík, byla přidána ve finální koncentraci 0,4 mg/ml a směs byla promíchávána při teplotě 37°C po dobu, 48 hodin) .' Po ukončení reakce byla kultura centrifugována při 3000/otáčkách za minutu při teplotě 4°C po dobu 10 minut, aby mohl být stažen supernatant. PH tohoto supernatantu bylo upraveno na 3,5 pomocí kyseliny octové. Po přidání 400 ml etylacetátu byla směs promíchávána při teplotě¹ 30°C po dobu 1 hodiny. Po usazení byl stažen supernatant. Stejná operace byla opakována se spodní vodnou vrstvou, poté byla získaná etylacetáťová • · · ·· vrstva zkombinována s výše zmíněným supernatantem. Po přidání 100 ml nasyceného solného roztoku k této etylacetátové vrstvě byla směs promíchávána a byl stažen supernatant.

Dále bylo k tomuto supernatantu 5 g bezvodého Na₂SO₄ a směs byla ponechána při pokojové teplotě pó dobu 15 minut.· Poté byl etylacetáť odpařen pod sníženým tlakem, takže směs byla převedena do pevné formy. Získané reziduum bylo rozpuštěno v 5 ml deionizované vody a pH bylo upraveno na hodnotu 9,0 pomocí hydroxidu sodného s následným přečištěním roztoku přes 50 ml kolonu HP-20 (25x100 mm, výrobce společnost Mitsubishi- Chemical Corp. j . Po promytí kolony 150 ml' deionizované vody byla provedena kroková eluce po 100 ml acetonového roztoku, kde každý obsahoval 20%, 30% a 40% acetonu. Sbírané frakce byly vystaveny stejné HPLC analýze, jako v Příkladu 1, čímž došlo k získání frakce obsahující sloučeninu (VlI-a). Z této frakce byl odstraněn acetonitril pod sníženým tlakem, poté bylo pH roztoku upraveno na hodnotu 3,0 pomocí kyseliny chlorovodíkové o koncentraci 1 mol/1. Po přidání 360 ml etylacetátu k tomuto roztoku byla směs promíchána. Po odstátí byl stažen supernatant. Po 'přidání 90 ml nasyceného solného roztoku^ k,tomuto supernatantu byla směs promíchána, ponechána odstát a byl stažen supernatant.

Následně bylo přidáno 4,5 g bezvodého -Na₂SO₄ k tomuto supernatantu, směs byla ponechána při pokojově, teplotě po dobu 15 minut s následným odpařením o sucha pod sníženým tlakem. Získané vysušené reziduum bylo rozpuštěno v dichlormetanu a laktonizováno přidáním.1% kyseliny trifuorooctové. Tento reakční produkt byl frakcionován pomocí preparativní TLC (deska Siiiča gel: No -1,05744 (200 x 200 mm, tloušťka: 0,5 mm, výrobce společnost Merck), vyvíjecí rozpouštědlo: etylacetát, barvící roztok: 12,5% kyselina fosfomolybdenová-1% cerium/10% roztok kyseliny sírové), čímž došlo k získání 0,8 mg sloučeniny (VIII-b). Výsledky hmotové spektrometrie a ¹H-NMR spektrálních analýz získané sloučeniny jsou následující.

Hmotové spektrum

Za použití JMS-HX/HX110A hmotového spektrometru (výrobce společnost NIHON DENSHI Ltd.) bylo provedeno měření v pozitivním módu za pomoci i

··. ····

t m-n.i trobenzyl alkoholu jako matrice. Výsledkem bylo' získáni pseudointového vrcholu ((M+H)⁺) při m/z 407 a hodnota skutečného měření odpovídala hodnotě očekávané ze struktury a molekulové váhy (406) sloučeniny (Il-b) ... ·. /

Ή-NMR spektrum ' ’ ·

Za použití JNM-a400 spektrometru (výrobce společnost ,Νί.ΗΟΝ DENSHILtd.) bylo provedeno měření při .4 00 Mhz v deutero ; chloroformu, za použití TMS jako vnitřního standardu. Výsledky, -jsou uvedeny níže.· Spektrální data se shodovala se známými daty týkajícími se sloučeniny (VlII-b) (Sankyo Research Laboratories‘Annuál Report, 37, 147 (1985) . ’

δ ppm (CDCL₃) :	6, 01	(1H,	d, J	.= 9,5 Hz) , 5,89 (1H, dd, J. = 9, 5, 5,9
Hz), 5,5.8 (1H,	m) ,	5,41	(1Ή, '	m) , 4,6.0 (1H, .ddd, J = 10,6, 7,3, 5,4,
2,8 Hz), 4,40	(1H,	m) ,	4,38	(lH,‘mj; 2/74 (1H, dd,J_t= .13,1,.6/0,
4,8, 1,5 Hz) ,	2,40	(1H,	m) ,	2,36 (1H, m), 2,34 (1H, ‘m), í, 95 · (1H,

dddd, J = 14,4, 3,7, 2, 9, ,1, 7 Hž), . 1/86 ' (1H, dddd, J =12,5, 12,3, 7,3, 4,3 Hz), 1,69 (1H, m) , ’ 1,68' (1H, cm) , 1, 64 (1H, · m) , 1,57 (1H,

m), 1,5-1,4 (2H, m) , 1,43 (1H, m) , ' 1,30 (1H, m) , 1,12 (3H, ;d, J =

6,8 Hz), 0,91 (3H, d, J = 7,1 hzj , 0,.89 (3H, >t, J=7,4 Hz).

Průmyslová použitelnost ' . '

Podle předkládaného vynálezu se. stává možným vyrábět, sloučeninu, která inhibuje HMG-CoA reduktázu ' a* má účinek na snížení hladiny sérového cholesterolu. /

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1 , kde R¹ představuje vodíkový atom, substituovaný, nebo nesubstituovaný '' alkyl, nebo alkalický kov, a R² představuje substituovaný nébo . nesubstituovaný alkyl, nebo substituovaný nebo nesubstituovaný aryl;. _s

Sloučenina referovaná (I-b) je sloučenina reprezentovaná vzorcem jako sloučenina (ΙΙΊ-b)) : y. ' ' '. (iII-b)., (odtud ‘ í • ’ 5 1 .4 . J***Ή' r'.....- ' R²\) f (ΠΙ-b) i 8* . ► · . * i i kde R² má stejnou definici jako je'popsáno výše; Sloučenina (ΙΙ-a) je sloučenina reprezentovaná vzorcem referovaná jako sloučenina (IV-a)): (IV-a) (odtud ;

kde R¹ a R² mají stejnou definici jako je popsáno výše; a

9· ·

9 · ·· • · · ····

I - · ·.·*’ » «’ · .

sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina reprezentované vzorcem_; (IV-bj. (odtud referovaná jako sloučenina (IV-b)): ' ⁵ t'i . '

OV-b) kde R² má stejnou definici jako je pópsáno výše; _ ‘

1. Proces přípravy sloučeniny (Il-a) nebo sloučeniny (II-b), kde jako enzymový zdroj je použit mikroorganismus majícím aktivitú produkovat sloučeninu (Il-a) ·nebo sloučeninu (II-b) ze sloučeniny bez schopnosti sporulace a řečeného mikroorganismů, nebo - t a postup zahrnuje: umožnění (I-a) nebo ze sloučeniny (I-b) nevytvářejícím mycelium, kultura upravený produkt řečené kultury, sloučenině (I-a) nebo sloučenině (I-b) existovat ve vodném médiu; umožnění sloučenině (ΙΙ-a) nebo sloučenině (II—b) být produkována a akumumulována v řečeném vodném médiu; a sbírání sloučenin (Il-a) nebo (II-b) ' z řečeného vodného média, a kde sloučenina (I-a) je sloučeninou reprezentovanou vzorcem (I-a) (odtud referovaná jako sloučenina (I-a)): , kde R¹ představuje vodíkový atom, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, nebo alkalický kov, a R²· představuje substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, nebo substituovaný nebo nesubstituovaný aryl; . ('i Λ/'—'ii ’ ' · '

Sloučenina (I-b) je laktonová forma sloučeniny (I-a) reprezentovaná vzorcem (I-b) (odtud referovaná jako'sloučenina (I-b)):

i··.' í . V ϊ

kde R² má stejnou definici jako je popsáno výše;

sloučenina (ΙΙ-a) je sloučenina reprezentovaná vzorcem (ΙΙ-a) (odtud referovaná jako sloučenina (ΙΙ-a)): / kde R¹ a R² mají stejnou definici jako je popsáno výše; a ' sloučenina (II- b) je laktonová forma sloučeniny (II—a.) reprezentované vzorcem (ΙΙ-b) (odtud referovaná jako sloučenina (líbí) : ., 1 .

^Ί t kde R² má stejnou definici jako'je popsáno výše;

2) Postup podle patentového .nároku>1,. kde ' ,* sloučenina (I-a) je sloučeninou· /reprezentovanou vzorcem' (III-a)’ - ' ·* _v (odtud referovaná jako sloučenina (III-a)):

I

3) Postup podle patentového nároku 1, kde ' sloučenina (I-a) je sloučeninou reprezentovanou vzorcem (V-a) (odtud referovaná jako sloučenina (V-a) ) : · . ý ·· - álkyl, nebo alkalický kov; ý: , i ^; _s sloučenina (I-b) je sloučenina ' reprezentovaná vzorcem (V-b) (odtud' referovaná jako sloučenina·(V-b)): .

i1 ϊ V

ř/, •v ’ ' * - '7·· m 7'”.. • · ·· - - ·· • • 1 . ·:♦ • · ·^Α ' 9 · .« - - · . • 9 • · • ‘ '· .·* .. · · ·· · • * • i ·' β • ·> · ·' • · • . · 9 i · · 9' - · · ' ·♦ • · ·

sloučenina (II—a) je sloučenina reprezentovaná vzorcem (Vl-a) (odtud referovaná jako sloučenina (VI—a)):

(Vl-a) kde R¹ má stejnou definici jako je popsáno výše; a · sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina reprezentované vzorcem ' (VI-b) (odtud referovaná jako sloučenina (Viřte·)): · ' ý.

(VELa)

• 4 « 4 4.4 444 4 44 4 4 4 • · 4 4 4 4 4 • • • · 4 4 4 • 4 • 4 4 4 4 4 • 4 «44 4· 4 ·· 4 4

kde R¹ představuje vodíkový atom, ' substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl, nebo alkalický kov;

sloučenina (I-b) je sloučenina reprezentovaná vzorcem (VlI-b) (odtud referovaná jako sloučenina (VlI-b)): - sloučenina (ΙΙ-aj je sloučenina reprezentovaná (odtud referovaná jako sloučenina (VlII-a)):

vzorcem (VlII-a) kde R¹ má stejnou definici jako je popsáno výše; a sloučenina (II-b) je sloučepina ‘reprezentované' vzorcem (VlII-b)

• · · · • •' _v·' 9 9 • • · 9*9 9 • 9' ’· 9 9» ' 9 9 9 • 9 9 .9 • 9 9 9 • 9 • 9 « 9 9 9 9 9« • 99 99 » „ 9« 9 9 9

- í i

5) Postup podle patentového nároku 1, kde upravený produkt kultury mikroorganismu je upravený produkt vybraný z kultivovaných buněk, upravených produkt, jako jsou například vysušené buňky, lyofilizované buňky, buňky zpracované surfaktantem, buňky zpracované enzymem, buňky zpracované ultrasonikací, buňky zpracované mechanickým mletím, buňky zpracované rozpouštědlem, proteinová frakce buňky; a zmobilizované produkty buněk nebo zpracovaných buněk.

6) Postup podle patentového nároku 1, kde mikroorganismus je vybrán z mikroorganismů patřících do -rodu; Mycobacterium, -Corynebacterium, Brevibacterium, Rhodococus, Gordona, *' Arthrobacťer, Micrococus, Celulomonas a Sphingomonas. . ‘

7) Postup podle patentového nároku 1, kde .'mikroorganismus je mikroorganismus vybraný z Mycobacterium .phlei, - Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium thermoresistibile, Mycobacterium neoaurum,· Mycobacterium parafortuitum, Mycobacterium gilviim,» . Rhodococus globerulus,

Rhodococus, equi, ' Rhodococus erythropolis, Rhodococus rhodnii, Rhodococus ruber, rhodochrous, coprofilus,

Rhodococus Rhodococus fascians, Gordona, amarae, Gordona bronchialis, Gordona · sputr, Gordona terrae, · Corynebacterium glutamicum,' ^! Corynebacterium variabilis,

Arthrobacter . crystalopoites, .Arthrobacter ramosus, Arthrobacter ‘aurescens, Arthrobacťer citreus.

Rhodococus řubropertinctus, Gordona aichiensis, Gordona

Corynebacterium mycetoides,.

Corynebacterium ammoniagehes

Arthrobacter duodecadis, sulfureus, Arthrobacter

Arthrobacter globiformis, -Brevibacterium acetylicum,¹ Brevibacterium linens, Brevibacterium incertum, Brevibacterium iodinum, Micrococus luteus, Micrococus roseus, Celulomonas¹ celulans, Celulomonas cartae, Sphingomonas paucinomibilis,. Sphingomonas adhaesiva a Sphingomonas terrae.

8) Postup podle patentového - nároku 1, kde mikroorganismus’ je mikroorganismus vybraný z Mycobacterium phlei JCM5865,⁴ Mycobacterium smegmatis JCM5866, Mycobacterium thermoresistibile JCM6362, Mycobacterium neoaurum JCM6365, Mycobacterium parafortuitum JCM6367, • til <» ·*4»

Myčobactěrium gilvum JCM6395, Rhodococus globerulus Rhodococus equi ATCC21387, Rhodococus equi ATCC7005, erythropolis ATCC4277, Rhodococus rhodochrous ATCC21430, Rhodococus rhodochrous ATCC13808, Rhodococus rhodnii ATCC35071, Rhodococus ruber JCM3205, Rhodococus coprofilus ATCC29080, Rhodococus fascians ATCC12974, Rhodococus fascians ATCC35014, Gordona amarae ATCC27808, Gordona rubropertinctus IFM-33, Gordona rubropertinctus ATCC14352,’ Gordona bronchiaiis ATCC25592, Gordona sputi ATCC29627, Gordona aichiensis ATCC33611, Gordona terrae ATCC25594, Corynebacterium glutamicum ATCC19240, Corynebacterium mycetoides ATCC21134',

Corynebacterium variabilis ATCC15753, Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872, Arthrobacter crystálopoites ATCČ15481, Arthrobacter duodecadis ATCC13347, Arthrobacter rámosus ATCC13727, Arthrobacter sulfureus ATCC19098, Arthrobacter aurescens' ATCC13344, Arthrobacter citreus ATCC11624, Arthrobacter globiformis ATCC8010, Brevibacterium acetylicum ATCC953, Brevibacterium linens ATCC19391, Brevibacterium incertum ATCC8363, Brevibacterium iódinum IFO3558, Miórococus luteus ATCC4698, Micrococus roseus ATCC186, Celulomonas celulans ATCC15921, Celulomonas cartae ATCC21681, Sphingomonas paucinomibilis ATCC29837, Sphingomonas adhaesiva JCM7370 a Sphingomonas terrae ATCC15098.

ATCC25714,

Rhodococus

9) Postup podle patentového nároku 1, kde mikroorganismus je Gordona sp. ATCC19067. ' ^: