WO2007063866A1

WO2007063866A1 - 新規蛋白質および該蛋白質をコードするｄｎａ

Info

Publication number: WO2007063866A1
Application number: PCT/JP2006/323757
Authority: WO
Inventors: Shin-Ichi Hashimoto; Yoshiyuki Yonetani; Masaki Maeda
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 2005-11-29
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2007-06-07
Also published as: JP5631534B2; JP2013176379A; JPWO2007063866A1; CN101351551A; EP1956090A1; EP1956090A4; US8058037B2; US20100062486A1

Abstract

　本発明によれば、配列番号１～３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質（ただし、配列番号４～６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）、および配列番号１～３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ（ただし、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを除く）を用いた、HMG-CoAレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物の工業的に有利な製造法を提供される。

Description

新規蛋白質および該蛋白質をコードする DNA

技術分野

[0001] 本願発明は、ヒドロキシメチルダルタリル CoA(HMG- CoA)レダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物を生成する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする DNA、該 DNAを有する形質転換体、および該蛋白質または該形質転換体を用いた該化合物の製造法に関する。

背景技術

[0002] 式（XI)

[0003] [化 1]

[0004] (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物 [以下、化合物 (VI- a)という]のうち、 R¹が水素原子もしくはアルカリ金属である化合物、または式 (XII)

[0005] [化 2]

で表される、化合物 (VI- a)の閉鎖ラタトン体 [以下、化合物 (VI-b)という]は、 HMG- CoAレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を示すことが知られている (非特許文献 1)。

微生物によって、式 (IX) [0007] [化 3]

式（IX)

[0008] (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す) で表される化合物 [以下、化合物 (V-a) t 、う]または式 (X)

[0009] [化 4]

式 (X)

[0010] で表される、化合物 (V-a)の閉鎖ラタトン体 [以下、化合物 (V-b)という]から化合物（ VI-a)または化合物 (VI-b)を生成する方法に関しては既に幾つかの報告がある。即ち、特許文献 1には糸状菌を用いる方法が、特許文献 2および 3には放線菌を用 V、る方法が述べられて、る。し力しこれらの微生物は菌糸を伸ばして成長するため、発酵槽で増殖させると培養液の粘度が上昇する。このため酸素が不足しやすぐ培養液が不均一になるため反応効率の低下を招きやすい。この酸素不足を解消し、培養液を均一に保っためには、発酵槽の攪拌速度を上げなければならないが、攪拌速度を上げると菌糸がせん断され、微生物の活性が低下しやすい (非特許文献 2)。

[0011] こうした問題点を回避する方法として特許文献 4には枯草菌を用いる方法が、特許文献 5には胞子を形成せずかつ菌糸を形成しない微生物を用いる方法が述べられている。しかし、いずれの方法も培養'反応に長時間を要する点や投入した原料化合物 (V-a)または (V-b)に対する目的化合物 (VI- a)または (VI-b)の収率が低いといった問題点を有し、工業的に有利な製法とは言い難いものであった。

[0012] これらの問題点を解決する手法として、化合物 (V-a)または (V-b)力も化合物 (VI- a) または (VI-b)を生成する反応を触媒する酵素遺伝子を増幅することによって反応速度や収率を向上させる方法が考えられる。該反応を触媒する酵素遺伝子は、既に本発明者らによって枯菌草から取得されている (特許文献 6)。しかしながら遺伝子の導入によって生成活性の増大効果は認められたものの、生成速度や収率の点で工業的に満足できる成績は得られて、なかった。

非特許文献 1：ザ ·ジャーナル ·ォブ ·アンチピオチクス (The Journal of Antibiotics) , 2 9, 1346(1976)

非特許文献 2 :醱酵工学の基礎， P169-190, P.F.Stansbury, A.Whitaker著、学会出版センター (1988)]

特許文献 1：特開昭 57-50894号公報

特許文献 2：特開平 7-184670号公報

特許文献 3：国際公開第 96/40863号パンフレット

特許文献 4 :国際公開第 99/07872号パンフレット

特許文献 5：国際公開第 00/43533号パンフレット

特許文献 6：国際公開第 00/44886号パンフレット

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0013] 本願発明の目的は、 HMG- CoAレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物を生成する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする DNA、該 DNAを有する形質転換体、および該蛋白質または該形質転換体を用いた該化合物の工業的に有利な製造法を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0014] 本願発明は、以下 (1)〜(22)に関する。

(1)配列番号 1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。ただし、配列番号 4〜6で表されるアミノ酸配列力なる蛋白質を除く。

(2)配列番号 1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAoただし、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力もなる蛋白質をコードする DNA を除く。

(3)配列番号 7で表される塩基配列を有する DNA。 (4)上記（2)または（3)の DNAを含む糸且換え体 DNA。

(5)上記 (4)の組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。

(o 王糸田胞 ) Escherichiafe、 Bacillus 、し orvne Dactenum属、 Streptomvces属、 As 属または MdUi l属に属する微生物である、上記（5)の形質転換体。、 Π 王糸田胞ゝ Escherichia coli、 Bacillus subtilis、 Bacillus megatenum、 Corvnebacte rium glutamicum、 Corvnebacterium ammoniagenes. Streptomvces lividans、 Aspergill us ter固、または Penicillium dHimimに属する微生物である、上記（5)の形質転換体。

(8)上記（1)または（2)の蛋白質を式 (I)

[0015] [化 5]

[0016] (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物（I-a) t 、う]または式 (II)

[0017] [化 6]

式（II)

[0018] (式中、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される、化合物 (I- a)の閉鎖ラタトン体 [以下、化合物 (I-b)という]と接触させて、式 (III)

[0019] [化 7] 式（III)

[0020] (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物（Π-a) t 、う]または式 (IV)

[0021] [化 8]

式 (IV)

[0022] (式中、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される、化合物 (Il-a)の閉鎖ラタトン体 [以下、化合物 (Π-b)という]を生成させ、化合物 (Il-a)または (Π-b)を採取することを特徴とする化合物 (Il-a)または化合物 (Π-b)の製造方法。

(9)上記（5)〜（7)の、ずれか 1つの形質転換体の培養物または該培養物の処理物と、化合物 (I-a)または (I-b)とを、水性媒体中で接触させ、該媒体中に化合物 (Il-a) または化合物 (Π-b)を生成蓄積させ、該媒体中から化合物 (Il-a)または化合物 (Il-b )を採取することを特徴とする化合物 (Il-a)または化合物 (Π-b)の製造方法。

(10) 化合物 (I-a)が式 (V)

[0023] [化 9]

式 (V)

[0024] (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下化合物（ΠΙ-a) t 、う]であり、化合物（I-b)が式 (VI)

[0025] [化 10]

式 (VI)

[0026] (式中、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物（ΠΙ-b)という]であり、化合物（Π-a)が式 (VII)

[0027] [化 11]

[0028] (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物（IV-a) t\、う]であり、化合物（Π-b)が式 (VIII)

[0029] [化 12]

[0030] (式中、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物 (IV-b)という]である、上記 (8)または（9)の製造法。

(11)化合物 (ト a)が式 (IX) [0031] [化 13]

式（IX)

[0032] (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す) で表される化合物 [以下、化合物 (V-a)という]であり、化合物 (I-b)が式 (X)

[0033] [化 14]

式 (X)

[0034] で表される化合物 [以下、化合物 (V-b)という]であり、化合物 (Iト a)が式 (XI)

[0035] [化 15]

式 (XI)

[0036] (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す) で表される化合物 [以下、化合物 (VI - a)という]であり、化合物（Π-b)が式 (XII)

[0037] [化 16]

式 (XII)

[0038] で表される化合物 [以下、化合物 (VI-b)という]である、上記（8)または（9)の製造法

式（XIII)

[0040] (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物 [以下、化合物 (Vll-a)という]であり、化合物（I-b)が式 (XIV)

[0041] [化 18]

式（XIV)

[0042] で表される化合物 [以下、化合物 (VII-b)という]であり、化合物（Il-a)が式 (XV) [0043] [化 19]

式 (XV)

[0044] (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す) で表される化合物 [以下、化合物 (Vlll-a)という]であり、化合物（Π-b)が式 (XVI)

[0045] [化 20] 式（XVI)

で表される化合物 [以下、化合物 (VIII-b)という]である、上記（8)または（9)の製造法。

(13)化合物 (Π-b)が化合物 (Il-a)よりラタトンを形成させて得られたィ匕合物 (Il-b)である、上記（8)または（9)の製造法。

(14)化合物 (Il-a)が化合物 (Π-b)のラタトンを開環させて得られた化合物 (Il-a)である、上記（8)または（9)の製造法。

(15)化合物 (ΠΙ-b)が化合物 (ΠΙ-a)よりラタトンを形成させて得られたィ匕合物 (ΠΙ-b)である、上記（10)の製造法。

(16)化合物 (IV-a)が化合物 (IV-b)のラタトンを開環させて得られたィ匕合物 (IV-a)である、上記（10)の製造法。

(17)化合物 (V-b)が化合物 (V-a)よりラタトンを形成させて得られたィ匕合物 (V-b)である、上記（11)の製造法。

(18)化合物 (VI- a)が化合物 (VI-b)のラタトンを開環させて得られたィ匕合物 (VI- a)である、上記（11)の製造法。

(19)化合物 (VII-b)が化合物 (Vn-a)よりラタトンを形成させて得られた化合物 (VII-b) である、上記（12)の製造法。

(20)化合物 (VIII-a)が化合物 (VIII-b)のラタトンを開環させて得られたィ匕合物 (VIII-a) である、上記（12)の製造法。

(21)形質転換体の培養物の処理物が培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍結乾燥物、培養物から得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物、該菌体の溶媒処理物から選ばれる菌体処理物、菌体の蛋白分画物、並びに菌体および菌体処理物の固定ィ匕物力も選ばれる処理物である、上記（ 9)〜（12)の、ずれか 1項に記載の製造法。

(22)上記（5)〜（7)のいずれか 1つの形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記（1)の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、該蛋白質の製造法。

発明の効果

[0047] 本発明により、 HMG- CoAレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物を効率よぐ工業的に製造することができる。

図面の簡単な説明

[0048] [図 1]図 1は pSC6の製造過程を示す図である。

[図 2]図 2は、 pSYN2-39上の yjiB遺伝子中の変異箇所と制限酵素サイトを示す図である。矢印は yjiB遺伝子領域を、太線は変異位置をそれぞれ示す。

発明を実施するための最良の形態

[0049] 以下、本願発明を詳細に説明する。

1.本発明の蛋白質

本発明の蛋白質は、配列番号 4〜6で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除ぐ配列番号 1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質である。

また、配列番号 1〜3で表されるいずれかのアミノ酸配列において、 Xaaで表されるアミノ酸以外の 1以上、 50以下、好ましくは 1以上、 20以下、より好ましくは 1以上、 15 以下、さらに好ましくは 1以上、 10以下、特に好ましくは 1以上、 5以下、特に好ましくは 1以上、 3以下のアミノ酸残基が置換、欠失または付加したアミノ酸配列からなり、かつ上記式 (I) (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物 (ト a)という]または上記式 (II) (式中、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される、化合物（I-a)の閉鎖ラタトン体 [以下、化合物 (卜 b)という]を、式 (III) (式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物 (Il-a)という]または式 (IV) (式中、 R²は置換もしくは非置換のアルカリまたはァリールを表す)で表される、化合物（Il-a)の閉鎖ラタトン体 [以下、化合物 (π-b) t ヽぅ]に変換する活性を有する蛋白質も本発明の蛋白質に含まれる。

2.本発明の DNA

本発明の DNAとしては、配列番号 4で表されるアミノ酸配列力なる蛋白質をコードする DNAを除ぐ配列番号 1〜3で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNA、および配列番号 7で表される塩基配列を有する DNAをあげることができる。

[0050] ただし、配列番号 8および 9で表される塩基配列からなる DNAは本発明の DNAから除かれてもよい。

3.本発明の DN Aの製造法

公知の化学合成法により配列番号 1〜3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DNAを合成することにより、本願発明の DNAを製造することができる。 DNAの合成は市販の DNAの合成装置（例えば PE BioSystems社製の A BI-381Aなど）を用いて行うことができる。一度に全長を合成する代わりに、幾つかの部分に分けて合成し、各断片を順次つなぎ合わせることによつても本発明の DNAを製造することができる。

[0051] また、配列番号 9で表される塩基配列力もなる DNAを、つたん合成したのち、該 D NAに公知の方法で変異を導入することによつても本発明の DNAを製造することができる。もしくは、そのようにして得られた各々の変異部位を、制限酵素などを利用して組み合わせることによつても本発明の DNAを製造することができる。

具体的には以下の方法により本発明の DNAを製造することができる。なお DNA操作、大腸菌の形質転換、大腸菌からのプラスミド回収等は、常法、例えば Molecular c loning, A laboratory manual, Third Edition, Cola Harbor Laooratory Press (200l ( 以下、モレキュラ^ ~·クロー-ング第 3版と略す)、 Current Protocols in Molecular Biol ogy, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)、 DNA Cloning 1: Core Tec hniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等【こ記載された方法、あるいは市販のキットなどを用いて行うことができる。

[0052] まず配列番号 9記載の塩基配列を分割した部分配列を合成する。好ましくは後の連結操作を容易にするために、該部分配列に相補的な塩基配列を突出部位として導入する、または制限酵素部位を適宜加える。該部分配列としては、例えば配列番号 10〜33で表される塩基配列を有する DNAをあげることができる。該部分配列は、図 1に示すように、制限酵素サイトを末端に持つ 5つのブロックにわけることができる。

[0053] 該部分配列をブロックごとに相補的な部分配列をァニールさせ、あら力じめ設定しておいた制限酵素で末端を切断したのち適当なベクターに連結し大腸菌、例えば E. coH DH5 a (東洋紡社より購入)を形質転換する。

ベクターとしては大腸菌で自律複製可能であれば特に制限はないが、具体的には、 pBluescript II SK (+) [Nucleic Acid Research, 17, 9494 (1989)]、 Lambda ZAP II (ストラタジーン社製)、 λ gtl0、 λ gtll [DNA Cloning A Practical Approch, 1, 49 (1985)] 、 pT7T313U (フアルマシア社製)、 pcD2 [H.Okayama and P. Berg; Mol. Cell. Biol, 3, 280 (1983)]、 pMW218 (和光純薬社製)、 pUC118、 pUC119、 pSTV28、 pSTV29 (宝酒造社製)、 pEG400 [J. Bac, Γ72, 2392 (1990)]、 pHMV1520 (MoBiTec社製)]、 pQE- 3 0 (QIAGEN社製)等をあげることができる。

[0054] 得られた形質転換体より、目的とするプラスミドを回収し、適当な制限酵素で切断後、ァガロースゲル電気泳動などでブロック部分の DNA断片を分離する。

これらの DNA断片を連結して、配列番号 9で表される塩基配列を有する DNA断片を製造することができる。いちどに 3つ以上のブロックを連結するのが困難な場合は、連続するブロックを順次付加する方法 (図 1)で目的とする断片を製造することができる。

[0055] この断片に変異を導入することによって配列番号 7で表される塩基配列を有する D NA断片を製造することができる。変異を導入する方法としては、エラーブローン PC R法、ヒドロキシルァミンを用いる方法、該 DNA断片を有する細胞に UV等の変異剤を作用させる方法などをあげることができる。

例えばエラーブローン PCR法を用いる場合には、配列番号 9で表される塩基配列を有する DNA断片を組み込んだプラスミドを铸型とし、配列番号 34および 35をブライマ一とし、通常よりマンガン (Mn)塩濃度を高めた反応液中で PCR反応を行う。 Mn 塩濃度としては 0.1mmol/lから lmmol/1程度の濃度を用いることができる。 4.本発明の蛋白質の製造法

本発明の蛋白質は、上記 3の方法で製造された本発明の DNAを宿主細胞中で発現させること〖こより、製造することができる。

[0056] 該 DNAを宿主細胞中で発現させるためには、まず、目的とする該 DNAを、制限酵素または DNA分解酵素などで、コーディング領域を含む適当な長さの DNA断片とした後に、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、次いで該発現ベクターを、発現ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。

宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、動物細胞、植物細胞など目的とする遺伝子を発現できる細胞であれば、、ずれの細胞も用いることができる。

[0057] 発現ベクターとしては、上記宿主細胞にぉ、て自立複製可能または染色体 DNA 中への組込みが可能で、上記目的とする DNAを転写できる位置にプロモーターを含有して!/、るものが用いられる。

細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、該 DNAを発現させるための発現ベクターは該細胞中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該 DNAおよび転写終結配列により構成された組換えベクターであることが望ま、。プロモーターを制御する遺伝子が含まれて!/、てもよ、。

[0058] 発現ベクターとしては、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれもベーリンガーマンハイム社製）、 pKK233-2 (フアルマシア社製）、 pGEX (フアルマシア社製）、 pSE280 (インビトロジェン社製）、 pGEMEX-Ι (プロメガ社製）、 pQE-8 (キアゲン社製）、 pET- 3 (ノバジェン社製）、 pKYP10 (特開昭 58- 110600)、 pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (19 84)]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci., U SA, 82, 4306 (1985)〕、 pBluescriptll SK+ (ストラタジーン社製）、 pBluescript II SK (-) ( ストラタジーン社製）、 pTrS30〔大腸菌 JM109/pTrS30(FERM BP- 5407)より調製〕、 pTr S32〔大腸菌 JM109/pTrS32(FERM BP- 5408)より調製〕、 pUC19〔Gene, 33, 103 (1985 )〕、 pSTV28(タカラバィォ社製)、 pUC118 (タカラバィォ社製）、 pPAl (特開昭 63- 2337 98) pEG400D.Bacteriol., 172, 2392 (1990)]、 pHW1520 (MoBiTec社製）、 pCS299P(W 0 00/63388)等を例示することができる。

[0059] プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、 imプロモーター（Pim)、プロモーター（Pk^)、 Pプロモーター、

L pプロモ

R

一ター、 P プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、 SP01

SE

プロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーター等をあげることができる。また IEを 2つ直列させたプロモーター（Pimx2)、 ^プロモーター、 k£T7プロモーター、 let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる

。さらに Bacillus属細菌中で発現させるための xvlAプロモーターや Corvnebacterium 属細菌中で発現させるための P54-6プロモーターなども用いることができる。

[0060] リボソーム結合配列であるシャインーダルガノ（Shine-Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ま、。本発明の組換え体 DNAにお、ては、本発明の DNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではな、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。

宿主細胞として用いられる原核生物としては、 Escherichia属、 Corvnebacterium属、 Brevibacterium¾、 Bacillus践、 Microbacterium Serratia践、 Pseudomonas Agro bacterium Alicvclobacillus属、 Anabaenaj¾. Anacvstis属、 Arthrobacter属、 Azoba cter属、し hromatium属、 Erwinia属、 Methylobacterium¾、 Phormidium属、 Rhodobact g£属、 Rhodopseudomonas属、 RhodospirnlumJfe. Scenedesmun属、 Streptomvces属、 S vnnecoccus属または Zvmomonas属等に属する微牛.物をあげるこができ、好ましくは、 Escherichia^. Corvnebacterium腐、 Brevibacterium属 ¾た【 3~B acillus属【こする微生物等をあげることができる。

[0061] 該微生物の具体例として、例えば、 Escherichia coli XLト Blue、 Escherichia coli XL 2- Blue、 Escherichiacoli DH1、 Escherichia coli DH5 、 Escherichia coli MC1000、 Es chericnia coli KY3276、 Escherichia coli W1485、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W3110、 Escherichia coli NY49 、 Escherichia coli MP347、 Escherichia coli NM522、 Bacillus subtilis ATCC33712、 B acillus megaterium. Bacillus sp. FERM BP- 6030、 Bacillus amvloliquefacines, Breviba cterium ammmoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC 14068、 Brevibacteriu m saccharolyticum ATCC14066、 Brevibacterium flavum ATCC 140b Brevibacteriu m lactofermentum ATCC13869、 Corvnebacterium glutamicum ATCC13032、 Corvne bacterium glutamicum ATCC14297、 Corvnebacterium acetoacidophilum ATCC1387 0、 Corvnebacterium ammoniagenes ATCC6872、 Corvnebacterium ammoniagenes AT CC21264、 Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、 Serratia ficaria, Serratia fo nticola、 Serratia liquefaciens. Serratia marcescens. Pseudomonas sp. D- 0110、 Agrob acterium radiobacter、 Agrobacterium rhizogenes^ Agrobacterium rubi、 Anabaena cvli ndrica、 Anabaena doliolum、 Anabaena flos-aquae. Arthrobacter aurescens. Arthroba cter citreus、 Arthrobacter globformis、 Arthrobacter hvdrocarboglutamicus、 Arthroba cter mvsorens Arthrobacter nicotianae. Arthrobacter paraffineus. Arthrobacter pro tophormiae, Arthrobacter roseoOaraffinus、 Arthrobacter sulfur eus, Arthrobacter ure afaciens, Chromatium buderi、 Chromatium tepidum, Chromatium vinosum, Chromati um warmingii、 Chromatium fluviatile、 Erwinia uredovora, Erwinia carotovora, Erwinia ananas, Erwinia herbicola、 Erwinia punctata, Erwinia terreus, Methvlobacterium rh odesianum、 Methvlobacterium extorauens, Phormidium sp. ATCC29409、 Rhodobact er capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas blastica、 Rhodopseudo monas marina、 Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum、 Rhodospirillum salexigens, Rhodospirillum salinarum, StreOtomvces ambofaciens, StreOtomvces aur eofaciens ゝ Streptomvces aureus, Streptomvces fungicidicus, Streptomvces griseoch romogenes, Streptomvces griseus, StreOtomvces lividans、 Streptomvces olivogriseus 、 Streptomvces rameus. Streptomvces tanashiensis、 Streptomvces vinaceusおよび Zv momonas mobilis等をあげることができる

[0062] 組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭 63- 248394)、エレクト口ポレーシヨン法または Gene, J7, 107 (1982)や Molecular & General Genetics, 168, 11 1 (1979)に記載の方法等をあげることができる。

[0063] 酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 (ATC C37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を例示することがでさる。

プロモーターとしては、酵母中で機能するものであればいかなるものでもよぐ例えば、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 gal 1プロモーター、 gal 10プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、 MF a 1プ口モーター、 cuPlプロモーター等のプロモーターをあげることができる。

[0064] 酵母としては、サッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomvces cerevisae )、シゾサッカロセス ·ホンぺ (, Schizosaccharomvces pombe)、クリュイベロセス ·フクチス (Kluwerom vces lactis)、トリコスポロン'プノレランス (Trichosporon pullulans)、シュヮ-ォミセス'ァノレピウス (Schwanniomvces alluvius)等をあげることができる。

組換えベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であれば、ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods. Enzymol., 194, 182 (1990〕、スフエロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチゥム法〔J. BacterioL, 153, 163(1983)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)] 記載の方法等をあげることができる。

[0065] 動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAI 、 pcDM8 (フナコシ社より市販）、 pAGE107〔特開平 3- 22979 ; Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕、 pAS3- 3 (特開平 2- 227075)、 pCDM8〔Nature, 329, 840, (1987)〕、 pcDNAI/ Amp (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 ( 1987)〕、 pAGE210等を例示することができる。

[0066] プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウィルス（ヒト CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプロモ一ター、 SV40の初期プロモーター、レトロゥイノレスのプロモーター、メタ口チォネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーター等をあげることができる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。

[0067] 宿主細胞としては、ナマルバ細胞、 HBT5637(特開昭 63— 299)、 COS1細胞、 COS7 細胞、 CHO細胞等をあげることができる。

動物細胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞に DNAを導入できるヽかなる方法も用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法〔Cytotechnology, 3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平 2— 227075)、リボフヱクシヨン法〔Proc.Natl. Acad.Sci.,USA, 84, 7413(1987)、 virology, 52, 456 (1973)]に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平 2-227075号公報あるいは特開平 2-257891号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。

[0068] 発現方法としては、本発明の蛋白質をそのまま発現させる方法以外に、モレキユラ一'クローユング第 3版に記載されている方法等に準じて、分泌型蛋白質または融合蛋白質として発現させることができる。

酵母、動物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。

[0069] 本発明の DNAを組み込んだ上記組換え体 DNAを保有する形質転換体を培地に培養し、本発明の蛋白質を培養物中に生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、本発明の蛋白質を製造することができる。

該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。

[0070] 該形質転換体が原核生物、または酵母等の微生物を宿主細胞とする形質転換体である場合、これら微生物を培養する培地は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。

炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよぐグルコース、フラタトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類が用、られる。

[0071] 窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ- ゥム、リン酸アンモ-ゥム等の各種無機酸や有機酸のアンモ-ゥム塩、その他含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカ一、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等が用いられる。

無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。

[0072] 培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は 15〜50°Cがよぐ培養時間は、通常 16時間〜 7日間である。培養中 pHは、 3.0-9.0 に保持する。 pHの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシゥム、アンモニアなどを用いて行う。

また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添カロしてちょい。

[0073] プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、 k£プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル j8— D—チォガラタトピラノシド（IPTG)等を、 1mプロモーターを用 V、た発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸 (I AA)等を、 xylAプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する時にはキシロースを、それぞれ培地に添カ卩してもよい。

[0074] 動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されている RPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 1 99, 519 (1967)〕、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952)〕、 DMEM培地〔Virolog y, 8, 396 (1959)〕、 199培地 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 7 3, 1(1950)]またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。

[0075] 培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。

2

また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添カロしてちよい。

培養物力本発明の蛋白質を単離、精製するには、通常の酵素の単離、精製法を用いればよい。

[0076] 例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジェチルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA-75 (三菱化学社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose FF (フアルマシァ社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、プチルセファロース、フエ-ルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いることにより、精製標品を得ることができる。

[0077] また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まない、または蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、もしくは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。

[0078] 本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。

[0079] このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号 1〜3で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をあげることができる。また、上記方法により発現させた蛋白質を、 Fmoc法 (フルォレ-ルメチルォキシカルボ-ル法)、 tBoc法 (t-ブチルォキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、桑和貿易 (米国 Ad vanced chemTech社製)、パーキンエルマ一ジャパン (米国 Perkin- Elmer社製)、フアルマシアバイオテク (スゥユーデン Pharmacia Biotech社製)、ァロカ (米国 Protein Technol ogy Instrument社製)、クラボウ (米国 SyntheceU- Vega社製)、日本パーセプティブ'リミテッド (米国 PerS印 tive社製)、島津製作所等のペプチド合成機を利用し合成することちでさる。

5.化合物 (Il-a)または化合物 (Il-b)の製造法

上記 4の方法に準じて培養して得られる細胞、該細胞の培養物、該培養物の処理物、または精製された本発明の蛋白質等とィ匕合物 (I-a)または化合物 (I-b)とを媒体中で接触させ、該媒体中に化合物 Π-aまたは化合物 Π-bを生成、蓄積させ、該媒体から化合物（Π-a)または化合物（Π-b)を採取することにより化合物（Il-a)または化合物（Π-b)を製造することができる。

[0080] 本発明の細胞の培養物の処理物としては、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍結乾燥物、培養物を遠心分離等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の溶媒処理物および該細胞の固定ィ匕物などの細胞の形態を保持している処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物などの粗酵素抽出物、並びに該細胞力の蛋白質分画物および酵素の固定ィ匕物などの粗精製酵素などをあげることができる。

[0081] 媒体としては、水、水性媒体もしくは有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、 HEPES (N-2- ヒドロキシェチルピペラジン- N-エタンスルホン酸）緩衝液、トリス [トリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン]塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよぐ例えば、アセトン、酢酸ェチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液は、例えば化合物 (I-b)を用いる場合好ましく用いられる。また水性媒体としては、本発明の細胞を培養する培養液、および培養して得られる培養液ちあげることができる。

[0082] 化合物（I-a)または化合物（I-b)を媒体に添加する場合、化合物（I-a)または化合物 (I-b)を溶解することのできる水、水性媒体もしくは有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液に化合物 (I-a)または化合物 (I-b)を溶解し、媒体に添加することができる。有機溶媒としては、反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸ェチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。

[0083] 本発明の細胞を培養する培養液を媒体として用いる場合、培養開始前にあらかじめ化合物（I-a)または化合物（I-b)を培養液に添加してもよ!/ヽし、培養中または培養終了後に化合物（ト a)または化合物（I-b)を培養液に添加してもよ!/、。

化合物 G_a)または化合物（I-b)を培養液中に添加する場合、化合物（I-a)または化合物（I-b)は培地 lmlあたり 0.1〜10mg、好ましくは 0.2〜lmgを培養の初発または途中に添加する。化合物（I-a)または化合物（I-b)は、水またはメタノール、エタノール等の有機溶媒に溶解した後、培養液中に添加することが望ましい。

[0084] 本発明の化合物 (Il-a)または化合物 (Π-b)を製造する方法にお!、て、用いられる酵素源の量は、その比活性等により異なるが、例えば、酵素源として細胞の培養物もしくはその処理物を用いる場合は、 lmgの化合物（ト a)または化合物（H))あたり、湿重量として 5〜1000mg、好ましくは 10〜400mg添カ卩する。反応は 20〜50°Cで行なうことが好ましぐ特に 25°C〜37°Cで行なうことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なる力通常 2〜150時間、好ましくは 6〜120時間である。

[0085] 化合物（I-b)および化合物（Π-b)は下記に例示するラタトンの開環方法により、容易に化合物 (I-a)および化合物 (Il-a)にそれぞれ変換することができる。また化合物（ I-b)および化合物（Π-b)は下記に例示するラタトンの生成方法により容易に化合物（I -b)および化合物（Π-b)にそれぞれ変換することができる。

ラタトンの開環方法としては、化合物（I-b)または化合物（Π-b)を水性媒体に溶解し、酸またはアルカリを添加し開環する方法があげられる。水性媒体としては、例えば水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液など反応を阻害しない塩類を含む水溶液があげられる。該水溶液中には、反応を阻害しない濃度のメタノール、エタノール、酢酸ェチルなどの有機溶媒を含んでいてもよい。酸としては酢酸、塩酸、硫酸などの酸があげられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、アンモニアなどがあげられる

[0086] ラタトンの生成方法としては、化合物（I-a)または化合物（Il-a)を非水系の溶媒に溶解し、酸または塩基触媒を添加しラタトンを形成させる方法があげられる。非水系の溶媒としては実質的に水を含まな!/、有機溶媒で化合物 (I-a)または化合物 (Il-a)を溶解できるものならばいかなるものでも用いることができる。溶媒として例えばジクロロメタン、酢酸ェチル、などがあげられる。触媒としては、ラタトン化反応を触媒し、基質や反応産物にラタトンィ匕以外の作用を及ぼさないものならば、どのようなものでも使用できる。該触媒としては、トリフルォロ酢酸やパラトルエンスルホン酸などがあげられる

。反応温度は特に制限はないが、 0〜100°Cが好ましぐ 20〜80°Cが特に好ましい。

[0087] 媒体中からの化合物（Il-a)および (Il-b)の採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。

本発明の方法で製造される化合物 (Π)の確認または定量方法は、化合物化合物 (I I)、好ましくは（Π-a)および/または（Π-b)を確認または定量できる方法であれば、ヽずれの方法でも用いられる力例えば、 ¹³C- NMR ^ベクトル、 NMR ^ベクトル、マススペクトル、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)等の方法により行うことができる。 6.本発明における化合物の各基の定義

式（I)〜（IX)、（XI)、（XIII)および (XV)で表される化合物の各基において、アルキルとしては、直鎖または分岐状の、炭素数 1〜10、好ましくは 1〜6のアルキルであり、例えばメチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec ブチル、 tert—ブチノレ、ペンチノレ、ネオペンチル、へキシル、イソへキシル、ヘプチル、 4, 4 ジメチルペンチル、ォクチル、 2, 2, 4 トリメチルペンチル、ノニル、デシル、これら各種分岐鎖異性体等があげられる。

[0088] ァリールとしては、フエ-ル、ナフチル等があげられる。

置換アルキルにおける置換基としては、同一または異なって 1〜3のハロゲン、ヒド口キシ、アミ入アルコキシ、ァリール等があげられる。

置換ァリールにおける置換基としては、同一または異なって 1〜3のハロゲン、ヒドロキシ、アミ入アルキル、アルコキシ等があげられる。

[0089] ハロゲンとしては、フルォロ、クロ口、ブロモおよびョードがあげられる。

アルコキシにおけるアルキル部分は上述のアルキルと同義である。

置換アルキルにおけるァリール基は上述のァリールと同義である。

置換ァリールにおけるアルキル基は上述のアルキルと同義である。アルカリ金属とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウムの各元素を表す。

[0090] 以下に本発明の参考例および実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

参考例ベクタープラスミドの作製

Corvnebacterium ammoniagenes由来のプロモーター領城を含むプラスミド DFM54- 6 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679, 2000)を铸型とし、配列番号 36で表される塩基配列力なる DNA、および配列番号 37で表される塩基配列からなる DNAをプライマーとして PCRを行、、プロモーター領域を含む 0.7kbの DNA断片を増幅した。この断片を EmRVおよび EamHlで消化した後、市販の大腸菌ベクター pTZl8R (P rotein Engineering, 1, 67-74, 1986)の ΗίηςΙΙ- EamHI領域に挿入しプラスミド pRI107を得た。このプラスミドを Egilおよび EamHIで消化し、得られた約 0.7kbの I_E IHID NA断片を pCS299P(WO00/63388)の 2^83871- EamHI領域に導入して pRI109を得た実施例 1

[0091] 反応基質の調製

lOOmgの化合物（VII-b) (シグマ社製）を 9.5mlのメタノールに溶解した後、 0.5mlの 1 mol/1水酸ィ匕ナトリウムを加えて室温で 1時間振盪した。得られた反応液を乾固し、 5m 1の脱イオン水をカ卩えて溶解した後、約 0.1mlの lmol/1塩酸を用いて pHを約 pH6.5〜7. 5に調整し、さらに 4.9mlの脱イオン水をカ卩えることにより最終濃度が lOmg/mlの化合物 (VII-a) [式 (XIII)中、 R¹がナトリウムである化合物]を 10ml得た。

実施例 2

[0092] pRIyjiBと pSYN2- 39の取得

pWyjiB(WO 00/44886および対応する US7049111、 EP1148122)を铸型し、配列番号 38で表される塩基配列力もなる DNAおよび配列番号 39で表される塩基配列からなる DNAをプライマーセットに用いて PCRを行った。

PCRは、 96°Cで 1分間保温した後、 95°Cで 30秒間、 50°Cで 45秒間、 72°Cで 3分間からなる工程を 25回行い、その後 72°Cで 10分間保温する条件で行った。該 PCRにより、約 1.4kbの増幅 DNA断片を得た。該 DNA断片を lと S lHIで切断後、同じく l と ^ lHIで切断した pRI109と連結した。

[0093] 連結した組換え体 DNAを、エレクト口ポレーシヨン法を用いて大腸菌 DH5 aに導入した。得られたプラスミドを大腸菌から単離し、 C. glutamicum ATCC13032株にエレクトロポレーシヨン法で導入した。得られた形質転換体 10株の各株の化合物 (Vll-a)から化合物 (Vlll-a)への転換活性を以下のようにして測定した。

すなわち、各株をカナマイシン 100 g/mLを含む KM102培地（普通ブイヨン 2%,酵母エキス 0.5%) 3mL入りの試験管に植菌し、 30°Cで終夜培養した。得られた培養物のうち 0.5 mLをカナマイシン 100 g/mLを含む LMC培地 [グルコース 3%, NH C1 0.1%

4

, KH PO 0.1%, K HPO 0.3%, MgSO · 7Η Ο 0.01%,酵母エキス 0.05%,コーンスティ

2 4 2 4 4 2

一プリカ一 1%, FeSO 2mg/L, MnSO 2mg/L,ビォチン 50 μ g/L,チアミン 0.5mg/L (

4 4

pH7.2)]5 mL入りの試験管に添加し、 30°Cで 5時間振とう培養したのち、実施例 1で調製した化合物 (Vll-a)を終濃度 500mg/Lになるよう添加して、更に 30°Cで 6時間振とう口しプ。

[0094] 得られた培養物のうち 0.5mlを 1.5mlチューブに移し、 15,000rpmで 2分間遠心分離して菌体を分離した。得られた上清部分をメタノールで 5〜20倍に希釈し、 15,000rpmで 2分間遠心分離した後、その一部を HPLC分析 [カラム； Inertsil ODS- 2(5 μ m, 4x250 mm,ジーエルサイエンス社製)、カラム温度； 60°C、移動相；ァセトニトリル:水：リン酸 = 55 : 45 : 0.05、流速； 0.9ml/分、検出波長； 237nm]に供し、化合物（Vlll-a) (式（XV) 中、 R¹はナトリウムである化合物）の定量を行った。最も転換活性が高い株 [ィ匕合物（ VIII-a)の生成量 56mg/l、転換率 16%]を選択し、該株を ATCC13032/pRIyjiBと名づけた。

[0095] 該株カも抽出したプラスミド pRIyjiBをもとにさらに SD配列と開始コドンの距離を最適化し、 yjiB遺伝子の N末端側の 2、 3、 4および 7番目のコドンを glutamicumに谪合したコドンに変更した発現プラスミドを作製した。

次に、 pRIyjiBを铸型にし、配列番号 40および 39で表される塩基配列からなる DN Aをプライマーセットに用いて PCRを行った。 PCRは、 96°Cで 1分間保温した後、 95 °Cで 30秒間、 50°Cで 45秒間、 72°Cで 3分間の工程を 25回行い、その後 72°Cで 10分間保温する条件で行った。該 PCRにより、約 1.4kbの増幅 DNA断片を得た。

[0096] 該 DNA断片を 20 lと S lHIで切断後、 lと ^ lHIで切断した pRI109と連結して組換え体 DNAを得た。該組換え体 DNAを、エレクト口ポレーシヨン法を用いて大腸菌 DH5 aに導入して形質転換体を取得した。該形質転換体からプラスミドを単離し、 C. glutamicum ATCC13032株にエレクト口ポレーシヨン法を用いて導入した。

得られた形質転換体 30株を上記と同様に培養し、化合物 (Vn-a)から化合物 (VIII- a)への転換活性を測定し、最も転換活性が高い株 [ィ匕合物 (Vlll-a)の生成量 80mg/ 1、転換率 28%]を選択し、該株が保持するプラスミドを pSYN2- 39、該株を ATCC13032 /pSYN2-39と名づけた。

実施例 3

[0097] 制限酵素を用いた変異点の分離

実施例 2で得られた pRIyjiBと pSYN2-39の yjiB遺伝子のコーディング領域の塩基配列を決定したところ、公知の yjiB遺伝子の塩基配列に比べそれぞれ 2塩基、 8塩基が異なっていることが判明した。これらの変異を表 1に示す。なお、以下塩基の位置は yj iB遺伝子の翻訳開始コドン ATGの Aを、アミノ酸残基の位置は yjiB遺伝子がコードする蛋白質の N末端の Met (配列番号 4で表されるアミノ酸配列中の 1番目 Met)を、それぞれ 1として表示する。

[0098] [表 1]

表 1

これらの変異が転換活性に及ぼす影響を調べた。

まず、 pSYN2-39と同じ構造で無変異型の yjiB遺伝子を pRI109に挿入したプラスミドを作製した。 Bacillussubtilis 168株の染色体 DNA(WO 00/44886)を铸型とし、配列番号 38および 39で表される塩基配列力もなる DNAをプライマーセットに用いて PC Rを行った。 PCRは、 96°Cで 1分間保温した後、 95°Cで 30秒間、 50°Cで 45秒間、 72°C で 3分間からなる工程を 25回行い、その後 72°Cで 10分間保温する条件で行った。該 PCRにより、約 1.2kbの増幅 DNA断片を得た。

[0100] 該 DNA断片を pT7Blue(Novagen社製)と連結して得られた組換え体 DNAを、エレタトロポレーシヨン法を用いて大腸菌 DH5 aに導入した。得られた形質転換からブラスミドを抽出し、 yjiB遺伝子のコーディング領域の塩基配列を決定し、変異のないことを確認した。

該プラスミドを lと EamHIで切断して得られた yjiBを含む約 1.2kbの DNA断片を、 S allと E IHIで切断した pRI109および pBluescriptll SK+に連結して組換え体 DNAを取得し、それぞれ pN9および pN9SKと命名した。

[0101] pN9SKの Oal-EamHI部分を pRIyjiBの相当部分と入れ替えることで pN5SKを、また p N5SKの I- EamHI断片を pRI109に導入して pN5を作製した。

次に、 pSYN2-39を铸型にし、配列番号 40および 39で表される塩基配列からなる D NAをプライマーセットとして用いて、 PCRを行い、 yjiB領域を増幅した。得られた 1.2k bの DNA断片を pT- Blue(Novagen社製)に連結して組換え体 DNAを取得した。該組換え体 DNAの塩基配列を決定し pSYN2-39が有する変異を保持していることを確認した後、該組換え体 DNAの I- EamHI断片を pRI109および pBluescriptll SK+に連結して組換え体 DNAを取得し、それぞれ pNlおよび pNlSKと命名した。

[0102] 次に、 pNlSK、 pN5SKおよび pN9SKの ^ lHI断片または Ee^RI- ^ lHI断片をそれぞれ交換することにより、 pNlC9SK、 pN9ClSK、 pNlE9SKおよび pN9ElSKと命名したプラスミドを取得し、さらにこれらのプラスミドの yjiB部分を含む I-^ lHI断片を PRI109に導入することにより pNlC9、 pN9Cl、 pNlC5、 ρΝ1Ε9および ρΝ9Ε1と命名したプラスミドを取得した。

また ρΝ1、 pN5および pN9の ^I- S lHI領域を pNlSK、 pN5SK、 pN9SKの相当領域と置換することで pNlD9、 pNlD5、 pN9Dlおよび pN5D9と命名したプラスミドを取得した。さらに pNlC9および pNlC5の Dral- BamHI領域を pNlと交換することにより pNlC9 D 1および pNlC5D 1と命名したプラスミドを取得した。

[0103] また pNlC9SKおよび pNlC5SKの EmRI-S lHI断片を pNlと置換することにより pNl

C9E1SKおよび pNlC5Elと命名したプラスミドを取得し、さらに、これらのプラスミドの yj iB部分を含む Ι-β ΐΗΙ断片を pRI109に導入することで pNlC9Elおよび pNlC5Elと命名したプラスミドを取得した。

上記したプラスミドが有する yjiB遺伝子相当部分に存在する変異点と制限酵素部位の位置関係を図 2に示す。

[0104] 上記で得られた pNl、 pN5、 pN9、 pNlC9、 pNlC5、 ρΝ1Ε9、 pNlD9、 pNlD5、 pN9Cl

、 pN9El、 pN9Dl、 pN5D9、 pNlC9Dl、 pNlC5Dl、 pNlC5Elおよび pNlC9Elをエレクトロポレーシヨン法によってそれぞれ C. glutamicum ATCC13032に導人した得られた形質転換体を実施例 2と同様の方法で培養し、化合物 (Vll-a)から化合物 (Vin-a) への転換活性を測定した。

結果を表 2に示す。

[0105] [表 2]

表 2

変異点：表中の〇は上段に示したアミノ酸残基の変異を持つことを、一は持たないことを示す。

消費化合物（VI I - a〉：反応終了時の残存化合物（V I I -a) を添加量 500mg/lから差し引いた値。

転換率：消費化合物（Vl l -a) 量に対する生成化合物（VI I I- a) 量表 2に示すとおり、 8つの変異は yjiB遺伝子産物による化合物 (VII-a)から (VIII-a) の転換反応の転換率および転換速度を変化させる効果のあること、変異の効果は相加性があることがわ力つた。

例えば野生型 yjiB(pN9)に比べ Q11P変異を持つ pNlC9は高い転換率を示すのでこの変異は転換率向上効果を持つことがわかる。一方 _PN5は V104Aと F232L変異をもち、 pN9に比べ化合物 (VIII-a)の生成量が多、ことから転換速度向上効果を持つことがわかる。これらの変異を併せ持つ pNlC5は高ヽ転換率と転換速度の両者の性質を併せ持つている。 [0107] 別の例として pNlC9と ρΝ1Ε9を比べると転換速度、転換率ともやや低下しているので PN1E9に含まれる N83Sと V104Aの両方またはどちらかは有害な変異であると考えられる。一方 V104A変異のみをもつ pN5D9は野生型に比べ転換率はやや低下するものの転換速度が向上している。従って N83Sは有害もしくは無効変異と推定される。事実 pNlからこの変異のみを除いた PN1C5E1は pNlと同等の成績を示した。

実施例 4

[0108] pSYN2-39codの作製

以下のようにして PSYN2-39の yjiB遺伝子に相当するコーディング領域のコドンをコリネバタテリゥム中での発現に適したコドンに改変した。

まず DNA合成機を用いて、配列番号 10〜33で示す配列を合成した。次に配列番号 10〜13で表される塩基配列力もなる DNAをァニールさせて得られた約 200bpの DNA断片を lと Hindmで消化した後、市販の大腸菌ベクター pUCl 19 の I—Hindlll部位に導入し、 pSClを取得した。さらに配列番号 14〜19で表される塩基配列からなる DNAをァニールさせて得られた約 280bpの DNA断片を ilと dmで消化した後、 psc 1の I— ttodin部位に挿入し pSC2を取得した。

[0109] 次に配列番号 20〜23で表される塩基配列力なる DNA合成をァニールさせて得られた約 200bpの DNA断片を lと S lHIで消化後、 11 19の2^1—^111"[1部に導入した pSC3を取得した。さらに配列番号 24〜27で表される塩基配列力もなる DNA をァニールさせて得られた約 200bpの DNA断片を lと E^RVで消化した後、 pSC3 の I— EmRV部位に導入した pSC4を取得した。さらに配列番号 28〜33で表される塩基配列からなる DNAをァニールさせて得られた約 200bpの DNA断片を lと E^8 IIで消化した後、 pSC4の I— Em81I部位に導入し PSC5を取得した。

[0110] 最後に pSC2を lと Πで消化した後、得られた約 490bpの DNA断片を pSC5の I— II部位に導入することにより PUC119の I—E IHI部位に約 1.2kbの挿入配列を持つプラスミド PSC6を作製した。 pSC6作製の過程を図 1に示した。

pSC6を E IHIと lで消化した後、約 1.2kbの DNA断片を分取し、 EamHIと lで消化した pRI 109に連結し、 pSYN2-39codを取得した。

[0111] pSYN2- 39codをエレクト口ポレーシヨン法 (WO 00/44886)によって CorvDebacterium ammoniagenes ATCC21264株に導入した。

得られた开質転^ を ammoniagenes ATCC21264/pSYN2- 39codと命名し、 VII -aから化合物 (Vlll-a)への転換活性を以下のようにして測定した。

すなわち、 C. ammoniagenes ATCC21264/pSYN2- 39codをカナマイシン 100 μ g/mL を含む 3mLの ASB培地 [グルコース 5%, (NH ) SO 0.5%, KH PO 0.1%, K HPO 0.1%,

4 2 4 2 4 2 4

MgSO · 7Η Ο 0.1%,酵母エキス 1%,ポリペプトン 1%,尿素 0.1%, FeSO 20mg/L, MnS

4 2 4

O 40mg/L, ZnSO lOmg/L, CuSO 2mg/L, L-システィン塩酸塩 20mg/L, βァラ-

4 4 4

ン 15mg/L,ビォチン 100mg/L,チアミン 15mg/L,アデ-ン 100mg/L,グァニン lOOmg/ L (pH7.2)]が入った試験管に植菌し、 30°Cで一晩振とう培養した。得られた培養物のうち 0.2 mLをカナマイシン 100 μ g/mLを含む 1.8mLの APB培地 [グルコース 4%, (NH )

4 2

SO 0.35%, KH PO 0.43%, K HPO 1.45%, MgSO · 7Η O 0.4%,コーンスティープリカ

4 2 4 2 4 4 2

一 2%, FeSO 10mg/L, MnSO 4mg/L, ZnSO 20mg/L, CuSO 0.5mg/L, L-システィ

4 4 4 4

ン塩酸塩 20mg/L,パントテン酸カルシウム 10mg/L,ピオチン 60 μ g/L,チアミン 15mg /L,アデニン 90mg/L,グァニン 90mg/L (pH7.2)]が入った試験管に添カ卩し、 30°Cで 5 時間振とう培養した後、実施例 1で調製した化合物 (Vll-b)を終濃度 500mg/Lになるよう添加して、更に 30°Cで 20時間振とう培養した。得られた培養液中の化合物 (Vlll-a )および (Vn-a)を実施例 2と同様に測定した (表 3)。

[表 3]

表 3

変異点

プラスミド消費化合物生成化合物転換率

(VII-a) (VIII-a) (%) (mg/1) (rag/1)

pSYN2-39cod P L14 - - - - - - - - - - - - - - - 290.3 54.3 18.6

PEP77 〇 o N16I _ 〇 — 〇〇一 o — 〇 —— 〇 445.5 188.9 42.4 PEP129 〇 o _ G7V1 o - - - - 478.1 257.5 53.9 PEPI39 K18R o - 380.3 179.9 47.3 PEP268 - _ 〇一 o K35M 〇 o o _ 431.1 130.2 30.2

PES346 - - 〇 S38N 〇一〇 o〇〇 _

PES509 - — 〇 _ 〇 23 F1L 〇一 - 〇一〇 _

PES709 - — 〇一 o V321G o - - - - 〇 - PES849 o o 〇3 V14G 〇 - 〇〇〇一

PES78-1 - - 〇 —— Δ —— 〇一 H5R14 〇 0 0 〇一

PES849-1 O O Δ —— 〇〇 C817Y- 〇〇〇一

PES503-1 - - 〇 —— 厶 ——〇〇 - 〇 A28T4 o〇一

変異点：表中の〇は上段に示したアミノ酸残 E306G基の変異を持つことを、一は持たないことを、厶は新たに PCRで導入した変異を G343A持つことを示す。

消費化合物 (VII- a) ：反応終了時の残存化合物（V L357PII-a) を添加量 500mg/lから差し引いた値。

転換率：消費化合物（VII-a) 暈に対する生成化合物（VIII a) 量実施例 5

[0113] 第一世代変異型遺伝子の作製

C. ammoniagenes ATCC21264/pSYN2-39codの化合物（Vll-a)から化合物（Vlll-a) への転換率を向上させるため、エラープローン PCR法で pSYN2-39cod中の yjiB遺伝子に相当する遺伝子のコーデイング領域に変異を導入した。

即ち、 pSC6を铸型にし、配列番号 41および 42で表される塩基配列をプライマーセットに用いて 0.3mmol/lの MnClを含む反応液中で PCRを行った。 PCRは、 96°Cで 1 分間保温した後、 95°Cで 30秒間、 58°Cで 30秒間、 72°Cで 2分間力なる工程を 25回行い、その後 72°Cで 10分間保温する条件で行った。該 PCRにより、約 1.2kbの DNA 部分にランダムに変異が導入された DNA断片を取得した。

[0114] 該 DNA断片を lと EamHIで切断後、 lと EamHIで切断した pSYN2-39codのべクター部分と連結して組換え体 DNAを作製し、該組換え体 DNAをエレクト口ポレーシヨン法を用いて大腸菌 DH10Bに導入した。

得られた形質転換株のコロニーを、 96穴タイタープレートを用いて LB培地 (バタトトリプトン 1%,酵母エキス 0.5%, NaCl 1%)中でそれぞれ培養した後、培養物を混合し、アルカリ法にてプラスミドを抽出した。このランダム変異遺伝子を保有するプラスミドを C. ammoniagenes ATCC21264株にエレクト口ポレーシヨン法によって導入し、ランダム変異が導入された遺伝子を有する組換え株ライブラリーを作製した。

[0115] 上記ライブラリーの各株を実施例 4に記載した方法で培養し、化合物 (Vll-a)から化合物 (vm-_a)への転換活性を測定した。数千株を反応試験に供し、高い転換活性を示す 4株を選択した。それぞれの株の有するプラスミドを pEP77、 pEP129、 pEP139および PEP268と名づけた。これら 4株の試験結果を上記表 3に示した。

表 3に示すとおり、 pSYN2-39cod保有株に比べ、大幅に転換速度、転換率が向上していた。

[0116] pEP77、 pEP129、 pEP139および pEP268をそれぞれ単離し、 yjiB遺伝子相当部分のコーディング領域の塩基配列を決定した。各プラスミドは pSYN2-39codに対して表 4 に示すような変異を有して、た。

[0117] [表 4]

表 4

表 4に示すとおり、 pEP77、 pEP129、 pEP139および pEP268が有する変異には、化合物 (Vll-a)から化合物 (Vlll-a)への転換効率向上に有利にはたらく変異が含まれることが明らかになった。

実施例 6

[0119] 第二世代変異型遺伝子の作製

より高い転換効率をもつ変異型 PSYN2- 39codを得るため、 pEP77、 pEP129、 pEP139 および PEP268の有する変異を組み合わせた。

pEP77を lと EamHiで消化し、約 1.2kbの DNA断片を取得した。これを Iと E IH

Iで消化した大腸菌のベクター pHSG299 (タカラバィォ社製）と連結し、大腸菌 DH5 a を形質転換することによって、組換え体 DNAを作製した。

[0120] 同様の手順で、 pEP129、 pEP139および pEP268中の約 1.2kbの I- BamHI消化 DN

A断片を、それぞれ pHSG299の I-EamHIサイトに挿入し、 pl29、 pl39および p268をそれぞれ作製した。

p268を E^RVと EamHIで消化して得られた約 3.7kbの DNA断片と、 pl39を E^RVと ^ lHIで消化して得られた約 0.2kbの DNA断片とを連結して組換え体 DNAを作製し、該組換え体 DNAを用いて大腸菌 DH5 aを形質転換することによって、 p268上の約 0.2kbの E^RV-^ iHI領域が pl39由来の EmRV-^ lHI領域で置換された p268a を作製した。

[0121] 同様の手順で p268aの約 0.05kbの^ I-t I領域を pl39由来の約 0.05kbの

l領域で置換して P346を、 p268aの約 0.5kbの H-E£2RV領域を p77由来の約 0.5kb の H-E£2RV領域で置換して p509を、 p268aの約 0.5kbの H-E^RV領域を pl39 由来の約 0.5kbの H-E^RV領域で置換して p709を、 p268aの約 1.4kbの ££：101-££： 101(片方はベクター側に存在)領域を pl29由来の約 1.4kbの £fi;10I-£fi:10I領域で置換して p849を作成した。

[0122] 上記で取得した p346、 p509、 p709および p849を、それぞれ Iおよび E lHIで消化し、約 1.2kbの I-EamHIDNA断片を取得し、 lと EamHIで消化した pRI109と連結して組換え体 DNAを作製した後、該組換え体 DNAを用いて大腸菌 DH5 aを形質転換することによって、 pES346、 pES509、 pES709および pES849を作製した。

上記プラスミドを ammoniagenes ATCC21264株にエレクト口ポレーシヨン法によつて導入し、形質転換株を取得した。各形質転換株を実施例 2に記載した方法で培養し、化合物 (Vll-a)から化合物 (Vlll-a)への転換活性を測定した (表 3)。

[0123] 表 3に示すとおり、いずれの株も第一世代変異型遺伝子を保有する形質転換株より高い転換率を示したことから、変異の組み合わせによって転換効率をさらに向上させることが可能であることが明らかになった。

実施例 7

[0124] 第三世代変異型遺伝子の作製

実施例 3の結果から、 pSYN2-39codが有する約 1.2kbの I-EamHI断片にコードされる化合物 (Vll-a)から化合物 (Vlll-a)への転換を触媒する酵素の 83番目のセリン残基をァスパラギンに置換することで転換効率が向上する可能性が示唆されている。そこで実施例 6で作製したプラスミドにさらに該置換変異を導入した。

[0125] pES346を铸型とし、配列番号 43および 44で表される塩基配列力なる DNAをプライマ一として PCRを行った。 PCRは、 96°Cで 1分間保温した後、 96°Cで 1分間、 58°C で 1分間、 72°Cで 1分間力もなる工程を 25サイクル行い、その後 72°Cで 10分間保温する条件で行った。

該 PCRで得られた約 330bpの増幅 DNA断片を lと £ Iで消化し、 pES346の対応する部分と置換することで PES78-1を作製した。 pES78-lは化合物 (Vll-a) から化合物 (Vlll-a)への転換を触媒する酵素の 83番目のセリン残基がァスパラギンに変わって、る以外は pES346と同じである。

[0126] 同様にして pES849力も化合物 (VII-a)から化合物 (VIII-a)への転換を触媒する酵素の 83番目のセリン残基がァスパラギンに変わっている pES849-lを作成した。

さらに PES503の約 0.3kbの HdMl領域を PES78-1由来の約 0.3kbの HdMl領域で置換した PES503-1も作製した。

PES78- 1、 pES849- 1および pES503- 1を、それぞれ C. ammoniagenes ATCC21264 株にエレクト口ポレーシヨン法によって導入し、形質転換株を取得した。各形質転換株を実施例 2に記載した方法で培養し、化合物 (Vll-a)から化合物 (Vlll-a)への転換活性を測定した。結果は上記表 3に示した。

[0127] 表 3に示すとおり、 83番目のセリンをァスパラギンに置換した酵素、および pES78-l と PES849-1が有する変異を組み合わせた酵素の化合物 (VII-a)から化合物 (VIII-a) への転換効率が向上している。

以上の結果から、 yjiB遺伝子を改変することで化合物 (Vll-a)から (Vlll-a)への転換速度、転換効率を向上させることができること、こうした性質の変化をもたらす変異は相加的な効果を有することが明らかになった。したがって、上記した各変異の任意の組み合わせを有する酵素もまた、優れた転換速度または Zおよび転換効率を有すると予想できる。

産業上の利用可能性

[0128] 本願発明の蛋白質を用いることにより、 HMG-CoAレダクターゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用を有する化合物を工業的に有利に製造することができる。配列表フリ' —テキスト

[0129] 配列番号 1 -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 2 -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 3 -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 5 -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 6 -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 7 -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 8 -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 9 -人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 10 人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 11 人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 12 人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 13 人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 14 人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 15 人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 16 人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 17 人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 18 人工配列の説明：合成 DNA

配列番号 19 人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 20- -人工配列の説明合成 DNA 配列番号 21 - -人工配列の説明合成 DNA 配列番号 22- -人工配列の説明合成 DNA 配列番号 23 - -人工配列の説明合成 DNA 配列番号 24- -人工配列の説明合成 DNA 配列番号 25 - -人工配列の説明合成 DNA 配列番号 26 - -人工配列の説明合成 DNA 配列番号 27- -人工配列の説明合成 DNA 配列番号 28- -人工配列の説明 .合成 DNA 配列番号 29 - -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 30- -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 31 - -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 32- -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 33 - -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 34 -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 35 -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 36 -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 37 -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 38 -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 39 -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 40 -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 41 -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 42 -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 43 -人工配列の説明：合成 DNA 配列番号 44 -人工配列の説明：合成 DNA

Claims

請求の範囲

[1] 配列番号 1 3の、ずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質。ただし、配列番号 4 6で表されるアミノ酸配列力なる蛋白質を除く。

[2] 配列番号 1 3のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする DN

A。ただし、配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNAを除

<o

[3] 配列番号 7で表される塩基配列を有する DNA

[4] 請求項 2または 3記載の DNAを含む組換え体 DNA

[5] 請求項 4記載の組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。

[り」 Ti糸田]^力 Escherichia属、 Bacillus i¾ C orvnebactenum腐、 Streptomvces腐、 Asper gfc属または EgnkiUi l属に属する微生物である、請求項 5記載の形質転換体。

[7] ィ ΤΪ細胞力 ^Escherichia coli Bacillus subtilis Bacillus megaterium Corvnebacteriu m glutamicum Corvnebacterium ammoniagenes. Streptomvces lividans. Aspergillus ter または Penidllium citrinumに属する微生物である、請求項 5記載の形質転換体。

[8] 請求項 1または 2に記載の蛋白質を式 (I)

[化 21]

式 (I)

(式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物（I-a) t 、う]または式 (II)

[化 22]

(式中、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される、化合物 (I- a)の閉鎖ラタトン体 [以下、化合物 (I-b)という]と接触させて、式 (III)

[化 23]

R^ooc-y^

式（I II)

(式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、 R ²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物（Π-a) t 、う]または式 (IV)

[化 24]

(式中、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される、化合物 (Il-a)の閉鎖ラタトン体 [以下、化合物 (Π-b)という]を生成させ、化合物 (Il-a)または (Π-b)を採取することを特徴とする化合物 (Il-a)または化合物 (Π-b)の製造方法。請求項 5〜7のいずれか 1項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物と、化合物 (I-a)または (I-b)とを、水性媒体中で接触させ、該媒体中に化合物 (II- a)または化合物 (Π-b)を生成蓄積させ、該媒体中から化合物 (Il-a)または化合物 (II -b)を採取することを特徴とする化合物（Π-a)または化合物（Π-b)の製造方法。

[10] 化合物 (I-a)が式 (V)

[化 25] ood™ 式 (V)

(式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下化合物（ΠΙ-a) t\、う]であり、化合物（I-b)が式 (VI)

[化 26]

式 (VI)

(式中、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物（ΠΙ-b)という]であり、化合物（Il-a)が式 (VII)

[化 27]

式（VI I)

(式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、 R 2は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物（IV-a)とレ、う]であり、化合物（Π-b)が式 (VIII) [化 28]

式（VI I I)

(式中、 R²は置換もしくは非置換のアルキルまたはァリールを表す)で表される化合物 [以下、化合物 (IV-b)という]である、請求項 8または 9記載の製造法。

[11] 化合物 (I-a)が式 (IX)

[化 29]

式（IX)

(式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す) で表される化合物 [以下、化合物 (V-a)という]であり、化合物 (I-b)が式 (X)

[化 30]

式 (X)

で表される化合物 [以下、化合物 (V-b)という]であり、化合物 (Il-a)が式 (XI)

[化 31] 式 (XI)

(式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物 [以下、化合物 (VI-a)という]であり、化合物（Π-b)が式 (XII) [化 32]

式（XII)

で表される化合物 [以下、化合物 (VI-b)という]である、請求項 8または 9記載の製造法。

[12] 化合物（I-a)が式 (XIII)

[化 33]

式（XIII)

(式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す) で表される化合物 [以下、化合物 (Vll-a)という]であり、化合物 (I-b)が式 (XIV) [化 34]

式（XIV)

で表される化合物 [以下、化合物 (VII-b)という]であり、化合物（Il-a)が式 (XV) [化 35]

(式中、 R¹は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す) で表される化合物 [以下、化合物 (Vlll-a)という]であり、化合物（Π-b)が式 (XVI) [化 36]

で表される化合物 [以下、化合物 (VIII-b)という]である、請求項 8または 9記載の製造法。

化合物 (Π-b)が化合物 (Il-a)よりラタトンを形成させて得られたィ匕合物 (Π-b)である、請求項 8または 9記載の製造法。

化合物 (Il-a)が化合物 (Π-b)のラタトンを開環させて得られたィ匕合物 (Il-a)である、請求項 8または 9記載の製造法。

化合物 (Ill-b)が化合物 (ΠΙ-a)よりラタトンを形成させて得られたィ匕合物 (ΠΙ-b)である、請求項 10記載の製造法。

化合物 (IV-a)が化合物 (IV-b)のラタトンを開環させて得られたィ匕合物 (IV-a)である、請求項 10記載の製造法。

化合物 (V-b)が化合物 (V-a)よりラタトンを形成させて得られたィ匕合物 (V-b)である、請求項 11記載の製造法。

化合物 (VI- a)が化合物 (VI-b)のラタトンを開環させて得られたィ匕合物 (VI-a)である、請求項 11記載の製造法。

[19] 化合物 (VII-b)が化合物 (Vn-a)よりラタトンを形成させて得られた化合物 (VII-b)である、請求項 12記載の製造法。

[20] 化合物 (VIII-a)が化合物 (VIII-b)のラタトンを開環させて得られた化合物 (VIII-a)である、請求項 12記載の製造法。

[21] 形質転換体の培養物の処理物が培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物の凍結乾燥物、培養物から得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕物、該菌体の溶媒処理物から選ばれる菌体処理物、菌体の蛋白分画物、並びに菌体および菌体処理物の固定ィ匕物力も選ばれる処理物である、請求項 9〜 12いずれか 1項に記載の製造法。

[22] 請求項 5〜7のいずれかに記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項 1 に記載の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、該蛋白質の製造法。