CN101351551A

CN101351551A - 新型蛋白质和编码该蛋白质的dna

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Publication number: CN101351551A
Application number: CNA2006800496161A
Authority: CN
Inventors: 桥本信一; 米谷良之; 前田匡毅
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: Kyowa Hakko Bio Co Ltd
Priority date: 2005-11-29
Filing date: 2006-11-29
Publication date: 2009-01-21
Also published as: WO2007063866A1; JP5631534B2; JP2013176379A; JPWO2007063866A1; EP1956090A1; EP1956090A4; US8058037B2; US20100062486A1

Abstract

本发明提供使用具有SEQ ID NO.1－3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质(含有SEQ ID NO.4－6所示氨基酸序列的蛋白质除外)、以及编码具有SEQ ID NO.1－3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质的DNA(编码含有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA除外)的、抑制IMG－CoA还原酶、具有血清胆固醇降低作用的化合物的工业上有利的制备方法。

Description

新型蛋白质和编码该蛋白质的DNA

技术领域

本发明涉及具有生成下述化合物的活性的蛋白质，该化合物抑制羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原酶、具有血清胆固醇降低作用，还涉及编码该蛋白质的DNA、具有该DNA的转化体、以及使用该蛋白质或该转化体制备该化合物的方法。

背景技术

已知式(XI)所示化合物[以下称为化合物(VI-a)]中R¹为氢原子或碱金属的化合物，或者式(XII)所示的、化合物(VI-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(VI-b)]抑制HMG-CoA还原酶、显示降低血清胆固醇的作用等(非专利文献1)。

[化1]

式(XI)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)；

[化2]

式(XII)

关于通过微生物、由式(IX)所示的化合物[以下称为化合物(V-a)]或式(X)所示的、化合物(V-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(V-b)]生成化合物(VI-a)或化合物(VI-b)的方法已经有很多报道。

[化3]

式(IX)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)；

[化4]

式(X)

即，专利文献1中记述了使用丝状菌的方法，专利文献2和3中记述了使用放线菌的方法。但是，这些微生物是延伸菌丝进行生长，因此，在发酵罐中增殖，则培养液的粘度升高。容易发生氧不足，培养液不均匀，容易导致反应效率降低。为了消除该氧不足，使培养液保持均匀，必须提高发酵罐的搅拌速度，但如果提高搅拌速度则有可能发生菌丝断丝，容易使微生物的活性降低(非专利文献2)。

作为避免上述问题的方法，专利文献4中记述了使用枯草杆菌的方法，专利文献5中记述了使用不形成孢子且不形成菌丝的微生物的方法。但是任何方法都具有培养/反应需要较长时间或者相对于投入的原料化合物(V-a)或(V-b)的目标化合物(VI-a)或(VI-b)的收率低的问题，难以说是有利于工业化的制备方法。

作为解决这些问题的方法，人们考虑通过扩增催化由化合物(V-a)或(V-b)生成化合物(VI-a)或(VI-b)的反应的酶基因，使反应速度或收率提高的方法。催化该反应的酶基因已由本发明人从枯草杆菌中获得(专利文献6)。但是，基因的导入虽然可见生成活性增大的效果，但是在生成速度、收率方面仍未获得令人满意的工业化成绩。

非专利文献1：The Journal of Antibiotics，29，1346(1976)

非专利文献2：发酵工学的基础(醗酵工学の基礎)、169-190页，P.F.Stansbury，A.Whitaker著、学会出版センタ一(1988)]

专利文献1：日本特开昭57-50894号公报

专利文献2：日本特开平1-184670号公报

专利文献3：国际公开第96/40863号小册子

专利文献4：国际公开第99/07872号小册子

专利文献5：国际公开第00/43533号小册子

专利文献6：国际公开第00/44886号小册子

发明内容

本发明的目的在于提供具有活性的蛋白质，该活性是生成抑制HMG-CoA还原酶、具有血清胆固醇降低作用的化合物的活性；还提供编码该蛋白质的DNA、具有该DNA的转化体、以及使用该蛋白质或该转化体该化合物的有利于工业化的制备方法。

本发明涉及下述(1)-(22)：

(1)蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列。但是含有SEQ ID NO.4-6所示氨基酸序列的蛋白质除外。

(2)DNA，该DNA编码具有SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质。但是，编码含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA除外。

(3)DNA，该DNA具有SEQ ID NO.7所示碱基序列。

(4)重组体DNA，该重组体DNA含有上述(2)或(3)的DNA。

(5)转化体，该转化体是将上述(4)的重组体DNA导入到宿主细胞中得到的。

(6)上述(5)的转化体，其中，宿主细胞是属于埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、曲霉属(Aspergillus)或青霉属(Penicillium)的微生物。

(7)上述(5)的转化体，其中，宿主细胞是属于大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、土曲霉(Aspergillusterreus)、桔青霉(Penicillium citrinum)的微生物。

(8)化合物(II-a)或化合物(II-b)的制备方法，其特征在于：使上述(1)或(2)的蛋白质与式(I)所示的化合物[以下称为化合物(I-a)]或式(II)所示的、化合物(I-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(I-b)]接触，

[化5]

式(I)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)；

[化6]

式(II)

(式中，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)

生成式(III)所示的化合物[以下称为化合物(II-a)]或式(IV)所示的、化合物(II-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(II-b)]，

[化7]

式(III)

[化8]

式(IV)

(式中，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)

收集化合物(II-a)或(II-b)。

(9)化合物(II-a)或化合物(II-b)的制备方法，其特征在于：在水性介质中，使上述(5)-(7)中任一项的转化体的培养物或该培养物的处理物与化合物(I-a)或(I-b)接触，使化合物(II-a)或化合物(II-b)在该介质中生成并蓄积，由该介质中收集化合物(II-a)或化合物(II-b)。

(10)上述(8)或(9)的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(V)所示的化合物[以下称为化合物(III-a)]：

[化9]

式(V)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)，

化合物(I-b)是式(VI)所示的化合物[以下称为化合物(III-b)]：

[化10]

式(VI)

(式中，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)，

化合物(II-a)是式(VII)所示的化合物[以下称为化合物(IV-a)]：

[化11]

式(VII)

化合物(II-b)是式(VIII)所示的化合物[以下称为化合物(IV-b)]：

[化12]

式(VIII)

(式中，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)。

(11)上述(8)或(9)的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(IX)所示的化合物[以下称为化合物(V-a)]：

[化13]

式(IX)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，

化合物(I-b)是式(X)所示的化合物[以下称为化合物(V-b)]：

[化14]

式(X)

化合物(II-a)是式(XI)所示的化合物[以下称为化合物(VI-a)]：

[化15]

式(XI)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，

化合物(II-b)是式(XII)所示的化合物[以下称为化合物(IV-b)]：

[化16]

式(XII)

(12)上述(8)或(9)的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(XIII)所示的化合物[以下称为化合物(VII-a)]：

[化17]

式(XIII)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，

化合物(I-b)是式(XIV)所示化合物[以下称为化合物(VII-b)]：

[化18]

式(XIV)

化合物(II-a)是式(XV)所示的化合物[以下称为化合物(VIII-a)]：

[化19]

式(XV)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，

化合物(II-b)是式(XVI)所示的化合物[以下称为化合物(VIII-b)]：

[化20]

式(XVI)

(13)上述(8)或(9)的制备方法，其中，化合物(II-b)是由化合物(II-a)形成内酯得到的化合物(II-b)。

(14)上述(8)或(9)的制备方法，其中，化合物(II-a)是使化合物(II-b)的内酯开环得到的化合物(II-a)。

(15)上述(10)的制备方法，其中，化合物(III-b)是由化合物(III-a)形成内酯得到的化合物(III-b)。

(16)上述(10)的制备方法，其中，化合物(IV-a)是使化合物(IV-b)的内酯开环得到的化合物(IV-a)。

(17)上述(11)的制备方法，其中，化合物(V-b)是由化合物(V-a)形成内酯得到的化合物(V-b)。

(18)上述(11)的制备方法，其中，化合物(VI-a)是使化合物(VI-b)的内酯开环得到的化合物(VI-a)。

(19)上述(12)的制备方法，其中，化合物(VII-b)是由化合物(VII-a)形成内酯得到的化合物(VII-b)。

(20)上述(12)的制备方法，其中，化合物(VIII-a)是使化合物(VIII-b)的内酯开环得到的化合物(VIII-a)。

(21)上述(9)-(12)中任一项的制备方法，其中，转化体培养物的处理物是培养物的浓缩物、培养物的干燥物、培养物的冻干物、由培养物得到的菌体，选自该菌体的干燥物、该菌体的冻干物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎物、该菌体的溶剂处理物的菌体处理物，菌体的蛋白分级产物，以及选自菌体和菌体处理物的固定化物的处理物。

(22)蛋白质的制备方法，其特征在于：将上述(5)-(7)中任一项的转化体在培养基中培养，使上述(1)的蛋白质在培养物中生成并蓄积，由该培养物中收集该蛋白质。

根据本发明，可以高效、工业化制备抑制HMG-CoA还原酶、具有血清胆固醇降低作用的化合物。

附图说明

图1是表示pSC6的制备步骤的图。

图2是表示pSYN2-39上的yjiB基因的变异位置和限制酶切位点的图。箭头表示yjiB基因区，粗线表示变异位置。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

1.本发明的蛋白质

本发明的蛋白质是除了包含SEQ ID NO.4-6所示氨基酸序列的蛋白质之外的、具有SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明的蛋白质也包含下述蛋白质：包含在SEQ ID NO.1-3所示的任一氨基酸序列中，Xaa所示的氨基酸以外的1～50个，优选1～20个，更优选1～15个，进一步优选1～10个，特别优选1～5个，更特别优选1～3个氨基酸残基置换、缺失或附加得到的氨基酸序列，且具有将上式(I)(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)所示的化合物[以下称为化合物(I-a)]、或上式(II)(式中，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)所示的、化合物(I-a)的闭环内酯体(以下称为化合物(I-b))转化为式(III)(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)所示化合物[以下称为化合物(II-a)]、或式(IV)(式中，R²表示取代或无取代的碱或芳基)所示的、化合物(II-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(II-b)]的活性。

2.本发明的DNA

本发明的DNA可列举除了编码含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA之外的、编码具有SEQ ID NO.1-3所示氨基酸序列的蛋白质的DNA，以及具有SEQ ID NO.7所示碱基序列的DNA。

不过，含有SEQ ID NO.8和9所示碱基序列的DNA可以排除在本发明的DNA之外。

3.本发明的DNA的制备方法

通过公知的化学合成方法合成编码具有SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质的DNA，可以制备本发明的DNA。DNA的合成可以使用市售的DNA合成装置(例如PE、BioSystems公司制造的ABI-381A等)。也可以分成几个部分合成，以取代一次性地合成全长，将各片段依次连接组合，来制备本发明的DNA。

合成含有SEQ ID NO.9所示碱基序列的DNA之后，通过公知的方法向该DNA导入变异，由此也可以制备本发明的DNA。或者是利用限制酶等将上述得到的各变异部位进行组合，也可以制备本发明的DNA。

具体来说，可通过以下方法制备本发明的DNA。DNA的操作、大肠杆菌的转化、由大肠杆菌回收质粒等可按照常规方法、例如Molecularcloning，A laboratory manual，Third Edition，Cold Harbor Laboratory Press(2001)(以下简称为分子克隆第3版)、Current Protocols in MolecularBiology，Supplement 1-38，John Wiley & Sons(1987-1997)、DNACloning 1：Core Techniques，A Practical Approach，Second Edition，OxfordUniversity Press(1995)等中记载的方法、或者使用市售试剂盒等进行。

首先合成将SEQ ID NO.9的碱基序列分割而成的部分序列。为了使后面的连接操作容易进行，优选以突出位点的形式导入与该部分序列互补的碱基序列，或者适当加入限制酶切位点。该部分序列例如可以是具有SEQ ID NO.10-33所示碱基序列的DNA。如图1所示，该部分序列可以分成末端具有限制酶切位点的5个链段(block)。

将该部分序列的各链段进行互补的部分序列的退火，用预先设定的限制酶切断末端，然后与适当的载体连接，转化大肠杆菌、例如大肠杆菌DH5α(购自东洋纺社)。

作为载体，只要是可在大肠杆菌中自主复制即可，没有特别限定，具体可列举：pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research，17，9494(1989)]、Lambda ZAPII[ストラタジ一ン公司制备]、λgt10、λgt11[DNACloning A Practical Approch，1，49(1985)]、pT7T313U(ファルマシア社制)、pcD2[H.Okayama and P.Berg；Mol.Cell.Biol.，3，280(1983)]、pMW218(和光纯药制)、pUC118、pUC119、pSTV28、pSTV29(宝酒造社制)、pEG400[J.Bac.，172，2392(1990)]、pHMV1520(MoBiTec社制)、pQE-30(QIAGEN社制)等。

由所得转化体回收目标质粒，用适当的限制酶切断后，通过琼脂糖凝胶电泳等分离链段部分的DNA片段。

将这些DNA片段连接，可以制备具有SEQ ID NO.9所示碱基序列的DNA片段。如果将3个以上的链段一次性连接较为困难时，可以通过将连续的链段依次附加的方法(图1)制备目标片段。

通过向该片段中导入变异，可以制备具有SEQ ID NO.7所示碱基序列的DNA片段。导入变异的方法有：易错PCR法、使用羟氨的方法、使UV等变异剂与具有该DNA片段的细胞作用的方法等。

例如，采用易错PCR法时，以整合了具有SEQ ID NO.9所示碱基序列的DNA片段的质粒作为模板，以SEQ ID NO.34和35作为引物，在锰(Mn)盐浓度比通常高的反应液中进行PCR反应。Mn盐浓度可以使用0.1mmol/L-1mmol/L左右的浓度。

4.本发明的蛋白质的制备方法

本发明的蛋白质可通过将上述3的方法中制备的本发明的DNA在宿主细胞中表达来制备。

为了使该DNA在宿主细胞中表达，首先将作为目标的该DNA用限制酶或DNA分解酶等制成含有编码区的适当长度的DNA片段，然后插入到表达载体的启动子下游，接着将该表达载体导入到适合表达载体的宿主细胞中。

宿主细胞只要是细菌、酵母、丝状菌、动物细胞、植物细胞等可表达目标基因的细胞，则可以使用任何细胞。

作为表达载体，使用可以在上述宿主细胞中自主复制或者是整合到染色体DNA中，在可转录上述目标DNA的位置含有启动子的表达载体。

使用细菌等原核生物作为宿主细胞时，用于使该DNA表达的表达载体优选是可在该细胞中自主复制、同时由启动子、核糖体结合序列、该DNA和转录终止序列构成的重组载体。也可以含有控制启动子的基因。

表达载体可列举：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由ベ一リンガ一マンハイム社制)、pKK233-2(ファルマシア社制)、pGEX(ファルマシア社制)、pSE280(インビトロジエン社制)、pGEME X-1(プロメガ社制)、pQE-8(キアゲン社制)、pET-3(ノバジエン社制)、pKYP10(日本特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Bio.Chem，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，82，4306(1985)]、pBluescriptII SK+(ストラタジエン社制)、pBluescript IISK(-)(ストラタジエン社制)、pTrS30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERMBP-5407)制]、pTrS32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制]、pUC 19[Gene，33，103(1985)]、pSTV28(タカラバイオ社制)、pUC118(タカラバイオ社制)、pPA1(日本特开昭63-233798)、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pHW1520(MoBiTec社制)、pCS299P(WO 00/63388)等。

启动子只要是可在宿主细胞中发挥功能即可，可以使用任何启动子。例如可以使用trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、P_L启动子、P_R启动子、P_SE启动子等来自大肠杆菌或噬菌体等的启动子，SPO1启动子，SPO2启动子，penP启动子等。还可以使用将Ptrp两个串联的启动子(Ptrp×2)，tac启动子、lacT7启动子、letI启动子这样的进行了人工设计改变的启动子等。并且，为了在芽孢杆菌属细菌中表达，可以使用xylA启动子，或为了在棒状杆菌属细菌中表达，可使用P54-6启动子等。

优选使用将作为核糖体结合序列的SD(Shine-Dalgarno)序列和起始密码子之间调节为适当距离(例如6-18个碱基)的质粒。

本发明的重组体DNA中，本发明的DNA的表达不一定需要转录终止序列，但优选在结构基因的紧下游配置转录终止序列。

用作宿主细胞的原核生物，可列举：属于埃希氏菌属、棒状杆菌属、短杆菌(Brevibacterium)属、芽孢杆菌属、微杆菌(Microbacterium)属、沙雷氏菌(Serratia)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)属、鱼腥藻(Anabaena)属、组囊蓝细菌(Anacystis)属、节杆菌(Arthrobacter)属、固氮杆菌(Azobacter)属、着色菌(Chromatium)属、欧文氏菌(Erwinia)属、甲基杆菌(Methylobacterium)属、席蓝细菌(Phormidium)属、红细菌(Rhodobacter)属、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)属、红细菌(Rhodospirillum)属、斜生栅藻(Scenedesmun)属、链霉菌属、聚球藻(Synnecoccus)属或发酵单胞菌(Zymomonas)属等的微生物，优选属于埃希氏菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属等的微生物。

该微生物的具体例子例如可列举：大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、大肠杆菌MP347、大肠杆菌NM522、枯草芽孢杆菌ATCC33712、巨大芽孢杆菌、芽孢杆菌属细菌FERMBP-6030(Bacillus sp.FERM BP-6030)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammmoniagenes)、Brevibacterium immariophilum ATCC 14068、解糖短杆菌ATCC14066(Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066)、黄色短杆菌ATCC14067(Brevibacterium flavum ATCC14067)、乳发酵短杆菌ATCC13869(Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869)、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14297、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870(Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870)、产氨棒杆菌ATCC6872(Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872)、产氨棒杆菌ATCC21264、嗜氨微杆菌ATCC15354(Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354)、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、假单胞菌细菌D-0110(Pseudomonas sp.D-0110)、放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、悬钩子土壤杆菌(Agrobacterium rubi)、柱孢鱼腥蓝细菌(Anabaena cylindrica)、桶形鱼腥蓝细菌(Anabaena doliolum)、水华鱼腥蓝细菌(Anabaena flos-aquae)、金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)、柠檬节杆菌(Arthrobacter citreus)、球形节杆菌(Arthrobacter globformis)、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、迈索尔节杆菌(Arthrobacter mysorens)、烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)、原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacterprotophormiae)、玫瑰色石蜡节杆菌(Arthrobacter roseoparaffinus)、硫磺节杆菌(Arthrobacter sulfureus)、产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)、(Chromatium buderi)、微温着色菌(Chromatium tepidum)、酒色着色菌(Chromatium vinosum)、沃氏着色菌(Chromatium warmingii)、Chromatiumfluviatile、噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)、胡萝卜软腐欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)、菠萝欧文氏杆菌(Erwinia ananas)、草生欧文氏杆菌(Erwinia herbicola)、Erwinia punctata、Erwinia terreus、罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、席藻属细菌ATCC29409(Phormidium sp.ATCC29409)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)、球形红细菌(Rhodobactersphaeroides)、生芽红细菌(Rhodopseudomonas blastica)、海红菌(Rhodopseudomonas marina)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、需盐红螺菌(Rhodospirillum salexigens)、盐场红螺菌(Rhodospirillum salinarum)、产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、生金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)、金色链霉菌(Streptomyces aureus)、杀真菌链霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)、橄榄灰链霉菌(Streptomyces olivogriseus)、枝链霉菌(Streptomyces rameus)、田无链霉菌(Streptomyces tanashiensis)、酒红链霉菌(Streptomyces vinaceus)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等。

重组载体的导入方法只要是向上述宿主细胞中导入DNA的方法均可使用，例如有使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，69，2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394)、电穿孔法或Gene，17，107(1982)或Molecular & General Genetics，168，111(1979)中记载的方法等。

使用酵母作为宿主细胞时，表达载体例如有YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。

启动子只要是可在酵母中发挥功能的即可，例如有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热休克蛋白启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。

酵母有：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺氏酵母(Schwanniomycesalluvius)等。

重组载体的导入方法只要是可以向酵母中导入DNA的方法均可使用，例如有电穿孔法[Methods.Enzymol.，194，182(1990)]、原生质球法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)]、乙酸锂法[J.Bacteriol.，153，163(1983)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)]记载的方法等。

使用动物细胞作为宿主细胞时，表达载体例如有：pcDNAI、pcDM8(フナコシ社销售)、pAGE107[日本特开平3-22979；Cytotechnology，3.，133，(1990)]、pAS3-3(日本特开平2-227075)、pCDM8[Nature，329，840，(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen社制)、pREP4(Invitrogen社制)、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987)]、pAGE210等。

启动子只要是可在动物细胞中发挥功能即可，均可使用，例如有：巨细胞病毒(人CMV)的IE(立即早期)基因的启动子、SV40的早期启动子、反转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子等。还可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。

宿主细胞有：那马瓦细胞(Namalwa cell)、HBT5637(日本特开昭63-299)、COS1细胞、COS7细胞、CHO细胞等。

向动物细胞中导入重组载体的方法可以使用可向动物细胞中导入DNA的任何方法，例如可采用电穿孔法[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平2-227075)、脂转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413(1987)、Virology，52，456(1973)]中记载的方法等。转化体的获得和培养可按照日本特开平2-227075号公报和日本特开平2-257891号公报所记载的方法进行。

表达方法除了使本发明的蛋白质直接表达的方法之外，还可按照分子克隆第3版所记载的方法，以分泌型蛋白或融合型蛋白的形式表达。

通过酵母、动物细胞表达时，可以获得加成有糖或糖链的蛋白质。

将保有整合了本发明的DNA的上述重组体DNA的转化体在培养基中培养，使本发明的蛋白质在培养物中生成并蓄积，由该培养物中收集该蛋白质，由此可以制备本发明的蛋白质。

将该转化体在培养基中培养的方法可以按照宿主细胞培养中所使用的通常的方法进行。

该转化体为以原核生物、或酵母等微生物作为宿主细胞的转化体时，培养这些微生物的培养基只要含有该微生物可以同化的碳源、氮源、无机盐类等，且可高效地进行转化体的培养即可，可以是天然培养基、合成培养基的任一种。

碳源只要是各微生物可以同化的均可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它们的糖蜜，淀粉或淀粉水解产物等碳水化合物，乙酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类。

氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等各种无机酸或有机酸的铵盐，其它含氮化合物，以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕和豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化物等。

无机物可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。

培养在振荡培养或深度通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度可以是15-50℃，培养时间通常为16小时-7天。培养中的pH保持在3.0-9.0。pH的调节可以使用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。

培养中还可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉素或四环素等抗生素。

对用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导物。例如，对于用使用lac启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)等；对用使用trp启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸(IAA)等；对于用使用xylA启动子的表达载体转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加木糖。

对于以动物细胞作为宿主细胞得到的转化体进行培养时，培养基可使用通常所使用的RPMI1640培养基[The Journal of the AmericanMedical Association，199，519(1967)]、Eagle的MEM培养基[Science，122，501(1952)]、DMEM培养基[Virology，8，396(1959)]、199培养基[Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950)]或这些培养基中添加胎牛血清等所得的培养基等。

培养通常在pH 6-8、30-40℃、5％CO₂存在下等条件下进行1-7天。

培养中还可以根据需要添加卡那霉素、青霉素等抗生素。

由培养物中分离纯化本发明的蛋白质时，可以采用通常的酶的分离、纯化方法。

例如，本发明的蛋白质以在细胞内溶解的状态表达时，可以在培养结束后通过离心分离回收细胞，悬浮于水系缓冲液中，然后通过超声波破碎机、弗氏细胞压碎机、マントンガウリン匀浆器、Dyno-mill等进行细胞破碎，获得无细胞的提取液。将该无细胞提取液离心分离获得上清，由该上清将常规酶的分离纯化方法，即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、有机溶剂沉淀法、二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、使用DIAION HPA-75(三菱化学社制)等树脂的阴离子交换色谱法、使用S-琼脂糖FF(ファルマシア社制)等树脂的阳离子交换色谱法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、层析聚焦法、等电位电泳等电泳法等方法单独或组合使用，可获得纯化的标准品。

该蛋白质在细胞内形成不溶物表达时，同样地回收细胞后进行破碎，进行离心，按照通常的方法，从所得沉淀组分中回收该蛋白质，然后通过蛋白质改性剂使该蛋白质的不溶物可溶。将该溶解液稀释为不含有蛋白质改性剂、或者蛋白质改性剂的浓度不会导致蛋白质改性程度的稀溶液，或者进行透析，使该蛋白质形成正常的立体结构，然后通过与上述同样的分离纯化法获得纯化标准品。

本发明的蛋白质或其糖修饰物等衍生物分泌到细胞外时，可以在培养上清中回收该蛋白质或其糖链加成物等衍生物。即，通过与上述同样的离心等方法对该培养物进行处理，由此可获得可溶性组分，通过使用与上述同样的分离纯化法，可以从该可溶性组分中获得纯化标准品。

上述获得的蛋白质例如有：具有SEQ ID NO.1-3所示氨基酸序列的蛋白质。通过上述方法表达的蛋白质还可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等化学合成方法制备。另外，也可以利用桑和贸易(美国Advanced chem Tech制造)、パ一キンエルマ一ジヤパン(美国Perkin-Elmer公司制造)、ファルマシアバイオテク(瑞典PharmaciaBiotech公司制造)、アロカ(美国Protein Technology Instrument制造)、クラボウ(美国Synthecell-Vega公司制)、日本パ一セプテイブ·リミテツド(美国PerSeptive公司制造)、岛津制作所等的肽合成仪进行合成。

5.化合物(II-a)或化合物(II-b)的制备方法

在介质中，将按照上述4的方法培养得到的细胞、该细胞的培养物、该培养物的处理物或纯化的本发明的蛋白质等与化合物(I-a)或化合物(I-b)接触，在该介质中生成并蓄积化合物II-a或化合物II-b，从该介质中收集化合物(II-a)或化合物(II-b)，由此可制备化合物(II-a)或化合物(II-b)。

本发明的细胞培养物的处理物有：培养物的浓缩物、培养物的干燥物、培养物的冻干物，将培养物离心等得到的菌体，该菌体的干燥物、该菌体的冻干物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的溶剂处理物和该细胞的固定化物等保持细胞形态的处理物，该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎物等粗酶提取物、以及来自该细胞的蛋白质分级物和酶的固定化物等的粗纯化酶等。

介质可以使用水、水性介质或有机溶剂，或者是水或水性介质与有机溶剂的混合液。水性介质例如可使用磷酸缓冲液、HEPES(N-2-羟基乙基哌嗪-N-乙磺酸)缓冲液、三[三(羟甲基)氨基甲烷]盐酸缓冲液等缓冲液。有机溶剂只要不阻碍反应即可，例如可使用丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。水或水性介质与有机溶剂的混合液例如在使用化合物(I-b)时优选使用。水性介质有：培养本发明的细胞的培养液、以及培养得到的培养液。

将化合物(I-a)或化合物(I-b)添加到介质中时，可以将化合物(I-a)或化合物(I-b)溶解于可溶解化合物(I-a)或化合物(I-b)的水、水性介质或有机溶剂、或者水或水性介质与有机溶剂的混合液中，然后添加到介质中。有机溶剂只要不阻碍反应即可，例如可使用丙酮、乙酸乙酯、二甲基亚砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇等。

使用培养本发明的细胞的培养液作为介质时，在培养开始前可以预先将化合物(I-a)或化合物(I-b)添加到培养液中，也可以在培养中或培养结束后将化合物(I-a)或化合物(I-b)添加到培养液中。

将化合物(I-a)或化合物(I-b)添加到培养液中时，化合物(I-a)或化合物(I-b)可以在培养的起始或中途、每1ml培养基中添加0.1-10mg、优选0.2-1mg。化合物(I-a)或化合物(I-b)优选溶解于水或甲醇、乙醇等有机溶剂中之后再添加到培养液中。

在制备本发明的化合物(II-a)或化合物(II-b)的方法中，所使用的酶源的量根据其比活性等而不同，例如使用细胞的培养物或其处理物作为酶源时，1mg化合物(I-a)或化合物(I-b)中添加湿重量5-1000mg、优选10-400mg。反应优选在20-50℃下进行，特别优选在25-37℃下进行。反应时间根据所使用的酶源的量和比活性等而不同，通常为2-150小时，优选6-120小时。

化合物(I-b)或化合物(II-b)可通过下述所列举的内酯的开环方法，分别容易地转化成化合物(I-a)和化合物(II-a)。化合物(I-b)或化合物(II-b)还可以通过下述所列举的内酯的生成方法分别容易地转化成化合物(I-b)和化合物(II-b)。

内酯的开环方法有：将化合物(I-b)或化合物(II-b)溶解于水性介质中，添加酸或碱进行开环的方法。水性介质例如有水、磷酸缓冲液、Tris缓冲液等含有不阻碍反应的盐类的水溶液。该水溶液中可以含有不阻碍反应的浓度的甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂。酸有乙酸、盐酸、硫酸等酸，碱有氢氧化钠、氢氧化钾、氨等。

内酯的生成方法有：将化合物(I-a)或化合物(II-a)溶解于非水系的溶剂中，添加酸或碱催化剂，形成内酯的方法。非水系的溶剂只要是用实质上不含有水的有机溶剂可溶解化合物(I-a)或化合物(II-a)的溶剂均可使用。溶剂例如有二氯甲烷、乙酸乙酯等。催化剂只要是催化内酯化反应、对底物或反应产物没有内酯化以外的作用即可，可以使用任何催化剂。该催化剂有三氟乙酸或对甲苯磺酸等。反应温度没有特别限定，优选0-100℃，特别优选20-80℃。

从介质中收集化合物(II-a)和(II-a)可以通过常规的有机合成化学中所使用的方法、例如有机溶剂的提取、结晶、薄层层析、高效液相色谱等进行。

本发明的方法所制备的化合物(II)的确认或定量方法只要是可对化合物化合物(II)、优选(II-a)和/或(II-b)进行确认或定量的方法即可，可以使用任何方法，例如可以通过¹³C-NMR谱、¹H-NMR谱、质谱、高效液相色谱(HPLC)等方法进行。

6.本发明中的化合物各基团的定义

在式(I)-(IX)、(XI)、(XIII)和(XV)所示化合物的各基团中，烷基是直链或支链的碳原子数为1-10、优选为1-6的烷基，例如有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、异己基、庚基、4，4-二甲基戊基、辛基、2，2，4-三甲基戊基、壬基、癸基、上述的各种支链异构体等。

芳基有苯基、萘基等。

取代烷基中的取代基可以相同或不同，可列举1-3个的卤素、羟基、氨基、烷氧基、芳基等。

取代芳基中的取代基可以相同或不同，可列举1-3个的卤素、羟基、氨基、烷基、烷氧基等。

卤素有氟、氯、溴和碘。

烷氧基中的烷基部分与上述烷基定义相同。

取代烷基中的芳基与上述芳基定义相同。

取代芳基中的烷基与上述烷基定义相同。

碱金属表示锂、钠、钾、铷、铯、钫各元素。

以下给出本发明的参考例和实施例，但本发明并不受这些实施例的限定。

参考例载体质粒的制备

以含有来自产氨棒杆菌的启动子区的质粒pFM54-6(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，674-679，2000)作为模板，以含有SEQ ID NO.36所示碱基序列的DNA、和含有SEQ ID NO.37所示碱基序列的DNA作为引物进行PCR，扩增含有启动子区的0.7kb DNA片段。将该片段用EcoRV和BamHI消化，然后插入到市售的大肠杆菌载体pTZ18R(Protein Engineering，1，67-74，1986)的HincII-BamHI区，得到质粒pRI107。将该质粒用PstI和BamHI消化，将所得的约0.7kb的PstI-BamHI DNA片段导入到pCS299P(WO00/63388)的Sse8387I-BamHI区，得到pRI109。

实施例1

反应底物的制备

将100mg化合物(VII-b)(シグマ公司制)溶解于9.5ml甲醇中，然后加入0.5ml 1mol/L氢氧化钠，在室温下振荡1小时。将所得反应液干燥固化，加入5ml去离子水进行溶解，然后使用约0.1ml的1mol/L盐酸，将pH调节至约pH 6.5-7.5，再加入4.9ml去离子水，得到10ml终浓度为10mg/ml的化合物(VII-a)[式(XIII)中，R¹为钠的化合物]。

实施例2

pRIyjiB和pSYN2-39的获得

以pWyjiB(WO00/44886以及对应的US7049111、EP1148122)为模板，使用含有SEQ ID NO.38所示碱基序列的DNA和含有SEQ ID NO.39所示碱基序列的DNA作为引物对，进行PCR。

PCR是在96℃下保温1分钟，然后将含有95℃30秒、50℃45秒、72℃3分钟的步骤进行25次，然后在72℃下保温10分钟进行。通过该PCR，可以得到约1.4kb的扩增DNA片段。将该DNA片段用SalI和BamHI切断，然后与同样用SalI和BamHI切断的pRI109连接。

使用电穿孔法，将连接的重组体DNA导入到大肠杆菌DH5α中。从大肠杆菌中分离所得质粒，通过电穿孔法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032株中。如下测定10株所得转化体的各株的由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的转化活性。

即，将各株接种于装入了3ml含有100μg/ml卡那霉素的KM102培养基(2％普通肉汤、0.5％酵母提取物)的试管中，在30℃下培养过夜。将所得培养物中的0.5mL添加到装入了5ml含有100μg/ml卡那霉素的LMC培养基[3％葡萄糖、0.1％NH₄Cl、0.1％KH₂PO₄、0.3％K₂HPO₄、0.01％MgSO₄·7H₂O、0.05％酵母提取物、1％玉米浆、2mg/L FeSO₄、2mg/LMnSO₄、50μg/L生物素、0.05mg/L硫胺素(pH 7.2)]的试管中，在30℃下振荡培养5小时，然后添加实施例1中制备的化合物(VII-a)，使终浓度为500mg/L，再在30℃下振荡培养6小时。

将所得培养物中的0.5ml转移至1.5ml离心管中，以15,000rpm离心2分钟，分离菌体。将所得上清部分用甲醇稀释至5-20倍，以15,000rpm离心2分钟，然后将一部分进行HPLC分析[柱：Inertsil ODS-2(5μm，4×250mm，ジ一エルサイエンス社制)、柱温：60℃、流动相：乙腈∶水∶磷酸＝55∶45∶0.05，流速：0.9ml/分钟，检测波长：237nm]，对化合物(VIII-a)(式(XV)中，R¹为钠的化合物)进行定量。选择转化活性最高的株[化合物(VIII-a)的生成量为56mg/L，转化率16％]，将该株命名为ATCC13032/pRIyjiB。

根据由该株提取的质粒pRIyjiB，进一步使SD序列与起始密码子的距离最佳化，制备将yjiB基因的N末端一侧第2、3、4和7密码子变更为适合谷氨酸棒杆菌的密码子的表达质粒。

接着，以pRIyjiB为模板，使用含有SEQ ID NO.40和39所示碱基序列的DNA作为引物对进行PCR。PCR是在96℃下保温1分钟，然后将95℃30秒、50℃45秒、72℃3分钟的步骤进行25次，然后在72℃下保温10分钟进行。通过该PCR得到约1.4kb的扩增DNA片段。

将该DNA片段用XhoI和BamHI切断后，与用SalI和BamHI切断的pRI109连接，得到重组体DNA。用电穿孔法将该重组体DNA导入到大肠杆菌DH5α中，获得转化体。从该转化体中分离质粒，使用电穿孔法导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032株中。

将30株所得转化体与上述同样地培养，测定由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的转化活性，选择转化活性最高的株[化合物(VIII-a)的生成量80mg/L，转化率28％]，将该株所保持的质粒命名为pSYN2-39，将该株命名为ATCC13032/pSYN2-39。

实施例3

使用限制酶进行的变异位点的分离

在确定实施例2所得的pRIyjiB和pSYN2-39的yjiB基因的编码区的碱基序列时，与公知的yjiB基因的碱基序列相比，表明分别有2个碱基、8个碱基不同。这些变异表示在表1中。以下碱基的位置是分别将yjiB基因的翻译起始密码子ATG的A、氨基酸残基的位置是将yjiB基因所编码的蛋白质的N末端的Met(SEQ ID NO.4所示氨基酸序列中的第1号Met)作为1。

[表1]

表1

研究这些变异对于转化活性的影响。

首先，将与pSYN2-39相同结构的无变异型的yjiB基因插入到pRI109中，制备质粒。以枯草芽孢杆菌168株的染色体DNA(WO00/44886)为模板，使用含有SEQ ID NO.38和39所示碱基序列的DNA作为引物对，进行PCR。PCR是在96℃下保温1分钟，然后将含有95℃30秒、50℃45秒、72℃3分钟的步骤进行25次，之后在72℃下保温10分钟进行。通过该PCR，得到了约1.2kb的扩增DNA片段。

将该DNA片段与pT7blue(Novagen社制)连接，将得到的重组体DNA用电穿孔法导入到大肠杆菌DH5α中。由所得转化体中提取质粒，确定质粒yjiB基因的编码区的碱基序列，确认没有变异。

将该质粒用SalI和BamHI切断，将所得的含有yjiB的约1.2kb的DNA片段与用SalI和BamHI切断的pRI109和pBluescript II SK+连接，获得重组体DNA，分别命名为pN9和pN9SK。

将pN9SK的ClaI-BamHI部分替换为pRIyjiB的相应部分，得到pN5SK，还将pN5SK的SalI-BamHI片段导入到pRI109中，制备pN5。

接着，以pSYN2-39为模板，使用含有SEQ ID NO.40和39所示碱基序列的DNA作为引物对，进行PCR，扩增yjiB区域。将所得的1.2kb的DNA片段与pT-Blue(Novagen社制)连接，获得重组体DNA。确定该重组体DNA的碱基序列，确认保持了pSYN2-39所具有的变异，然后将该重组体DNA的SalI-BamHI片段与pRI109和pBluescriptII SK+连接，获得重组体DNA，分别命名为pN1和pN1SK。

通过将pN1SK、pN5SK和pN9SK的ClaI-BamHI片段或EcoRI-BamHI片段分别交换，可得到命名为pN1C9SK、pN9C1SK、pN1E9SK和pN9E1SK的质粒，再将这些质粒的含有yjiB部分的SalI-BamHI片段导入到pRI109中，获得命名为pN1C9、pN9C1、pN1C5、pN1E9和pN9E1的质粒。

将pN1、pN5以及pN9的DraI-BamHI区域与pN1SK、pN5SK、pN9SK的对应区域置换，获得命名为pN1D9、pN1D5、pN9D1和pN5D9的质粒。再将pN1C9和pN1C5的DraI-BamHI区与pN1交换，得到命名为pN1C9D1和pN1C5D1的质粒。

还将pN1C9SK和pN1C5SK的EcoRI-BamHI片段与pN1置换，得到了命名为pN1C9E1SK和pN1C5E1的质粒，再将这些质粒的含有yjiB部分的SalI-BamHI片段导入到pRI109中，获得命名为pN1C9E1和pN1C5E1的质粒。

存在于与上述质粒所具有的yjiB基因对应部分的变异点和限制酶切位点的位置关系如图2所示。

上述得到的pN1、pN5、pN9、pN1C9、pN1C5、pN1E9、pN1D9、pN1D5、pN9C1、pN9E1、pN9D1、pN5D9、pN1C9D1、pN1C5D1、pN1C5E1和pN1C9E1通过电穿孔法可分别导入到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中。将所得转化体按照与实施例2同样的方法培养，测定由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的转化活性。

结果如表2所示。

[表2]

表2

变异点：表中的○表示具有上段所示的氨基酸残基的变异，-表示不具有。

消耗化合物(VII-a)：从500mg/L添加量中减去反应终止时的残留化合物(VII-a)所得的值。

转化率：生成化合物(VIII-a)的量比消耗化合物(VII-a)的量

如表2所示，8个变异具有使yjiB基因产物导致的由化合物(VII-a)转化为(VIII-a)的转换反应的转化率和转化速度改变的效果，变异效果具有叠加性。

例如，与野生型yjiB(pN9)相比，具有Q11P变异的pN1C9显示高转化率，由此可知该变异具有提高转化率的效果。另一方面，pN5具有V104A和F232L变异，与pN9相比，化合物(VIII-a)的生成量多，由此可知具有提高转化速度的效果。结合具有这些变异的pN1C5同时兼具高转化率和转化速度两性质。

作为另一个例子，将pN1C9与pN1E9相比，则转化速度、转化率稍微降低，可以认为在pN1E9中所含的N83S和V104A两者或其中一方是有害变异。只具有V104A变异的pN5D9与野生型相比，转化率稍微降低，但转化速度提高。因此，可以推定N83S是有害或者是无效变异。事实上，从pN1中只除去该变异得到的pN1C5E1显示与pN1同等的成绩。

实施例4

pSYN2-39cod的制备

如下，将相当于pSYN2-39的yjiB基因的编码区的密码子改变为适合在棒状杆菌中表达的密码子。

首先，使用DNA合成仪合成SEQ ID NO.10-33所示的序列。

接着，将含有SEQ ID NO.10-13所示碱基序列的DNA退火，将所得约200bp的DNA片段用SalI和HindIII消化，然后导入到市售的大肠杆菌载体pUC119的SalI-HindIII位点，获得pSC1。再将含有SEQ ID NO.14-19所示碱基序列的DNA退火，将所得约280bp的DNA片段用SphI和HindIII进行消化，然后插入到pSC1的SphI-HindIII位点，获得pSC2。

接着，将含有SEQ ID NO.20-23所示碱基序列的DNA退火，将所得约200bp的DNA片段用SalI和BamHI消化，然后导入到pUC119的SalI-BamHI位点，获得pSC3。再将含有SEQ ID NO.24-27所示碱基序列的DNA退火，将所得约200bp的DNA片段用SalI和EcoRV进行消化，然后插入到pSC3的SalI-EcoRV位点，获得pSC4。再将含有SEQ ID NO.28-33所示碱基序列的DNA退火，将所得约200bp的DNA片段用SalI和Eco81I消化，然后导入到pSC4的SalI-Eco81I位点，获得pSC5。

最后，将pSC2用SalI和BglII进行消化，然后将所得约490bp的DNA片段导入到pSC5的SalI-BglII位点，由此制备在pUC119的SalI-BamHI位点具有约1.2kb的插入序列的质粒pSC6。pSC6的制备过程如图1所示。

将pSC6用BamHI和SalI消化，然后取约1.2kb的DNA片段，与用BamHI和SalI消化的pRI109连接，获得pSYN2-39cod。

通过电穿孔法(WO 00/44886)，将pSYN2-39cod导入到产氨棒杆菌ATCC21264株中。

将所得转化株命名为产氨棒杆菌ATCC21264/pSYN2-39cod，如下测定由VII-a转换为化合物(VIII-a)的转化活性。

即，将产氨棒杆菌ATCC21264/pSYN2-39cod接种于加入了3ml含有100μg/ml卡那霉素的ASB培养基[5％葡萄糖、0.5％(NH₄)₂SO₄、0.1％KH₂PO₄、0.1％K₂HPO₄、0.1％MgSO₄·7H₂O、1％酵母提取物、1％聚胨、0.1％尿素、20mg/L FeSO₄、40mg/L MnSO₄、10mg/L ZnSO₄、2mg/LCuSO₄、20mg/L L-半胱氨酸盐酸盐、15mg/Lβ丙氨酸、100mg/L生物素、15mg/L硫胺素、100mg/L腺嘌呤、100mg/L鸟嘌呤(pH 7.2)]的试管中，在30℃下振荡培养过夜。将所得培养物中的0.2ml添加到加入了1.8ml含有100μg/L卡那霉素的APB培养基[4％葡萄糖、0.35％(NH₄)₂SO₄、0.43％KH₂PO₄、1.45％K₂HPO₄、0.4％MgSO₄·7H₂O、2％玉米浆、10mg/LFeSO₄、4mg/L MnSO₄、20mg/L ZnSO₄、0.5mg/L CuSO₄、20mg/L L-半胱氨酸盐酸盐、10mg/L泛酸钙、60μg/L生物素、15mg/L硫胺素、90mg/L腺嘌呤、90mg/L鸟嘌呤(pH 7.2)]的试管中，在30℃下振荡培养5小时，然后添加实施例1制备的化合物(VII-b)，使终浓度为500mg/L，再在30℃下振荡培养20小时。与实施例2同样地测定所得培养液中的化合物(VIII-a)和(VII-a)(表3)。化

[表3]

表3

转化率：生成化合物(VIII-a)的量比消耗化合物(VII-a)的量

实施例5

第一代变异型基因的制备

为了提高由产氨棒杆菌ATCC21264/pSYN2-39cod的由化合物(VII-a)转化为化合物(VII-a)的转换率，通过易错PCR法向相当于pSYN2-39cod中的yjiB基因的基因编码区导入变异。

即，以pSC6为模板，使用SEQ ID NO.41和42所示碱基序列作为引物对，在含有0.3mmol/L MnCl₂的反应液中进行PCR。PCR是在96℃下保温1分钟，然后将含有95℃30秒、58℃30秒、72℃2分钟的步骤进行25次，然后在72℃下保温10分钟进行。通过该PCR，获得了向约1.2kb DNA的部分随机导入变异的DNA片段。

将该DNA片段用SalI和BamHI切断后，与用SalI和BamHI切断的pSYN2-39cod的载体部分连接，制备重组体DNA，使用电穿孔法将该重组体DNA导入到大肠杆菌DH10B中。

用96孔滴定板(タイタ一プレ一ト)、在LB培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl)中分别培养所得转化株的集落，然后将培养物混合，用碱法提取质粒。将保有该随机变异基因的质粒通过电穿孔法导入到产氨棒杆菌ATCC21264株中，制备具有导入了随机变异的基因的重组株文库。

将上述文库的各株通过实施例4的方法培养，测定由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的转化活性。将数千株用于反应实验，选择显示高转化活性的4株。将各株所具有的质粒命名为pEP77、pEP129、pEP139和pEP268。这4株的实验结果如上表3所示。

如表3所示，与保有pSYN2-39cod的株相比，转化速度、转化率大幅提高。

分别分离pEP77、pEP129、pEP139和pEP268，确定yjiB基因相当部分的编码区的碱基序列。各质粒相对于pSYN2-39cod具有表4所示的变异。

[表4]

表4

如表4所示，pEP77、pEP129、pEP139和pEP268所具有的变异包含有利于由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的转化效率提高的变异。

实施例6

第二代变异型基因的制备

为了获得具有更高转化效率的变异型pSYN2-39cod，将pEP77、pEP129、pEP139和pEP268所具有的变异进行组合。

将pEP77用SalI和BamHI消化，获得约1.2kb的DNA片段。将其与用SalI和BamHI消化的大肠杆菌的载体pHSG299(タカラバイオ公司制)连接，转化大肠杆菌DH5α，由此制备重组体DNA。

按照同样的顺序，将pEP129、pEP139和pEP268中的约1.2kb的SalI和BamHI消化DNA片段分别插入到pHSG299的SalI-BamHI位点，分别制备p129、p139和p268。

将p268用EcoRV和BamHI消化得到约3.7kb的DNA片段；将p139用EcoRV和BamHI消化得到约0.2kb的DNA片段，将它们连接，制备重组体DNA，使用该重组体DNA转化大肠杆菌DH5α，由此制备p268上的约0.2kb的EcoRV-BamHI区域被来自p139的EcoRV-BamHI区置换的p268a。

按照同样的步骤，将p268a的约0.05kb的NcoI-HpaI区用来自p139的约0.05kb的NcoI-HpaI区置换，制备p346；将p268a的约0.5kb的BglII-EcoRV区用来自p77的约0.5kb的BglII-EcoRV区置换，制备p509；将p268a的约0.5kb的BglII-EcoRV区用来自p139的约0.5kb的BglII-EcoRV区置换，制备p709；将p268a的约1.4kb的Cfr10I-Cfr10I(一方存在于载体一侧)区用来自p129的约1.4kb的Cfr10I-Cfr10I区置换，制备p849。

将上述取得的p346、p509、p709和p849分别用SalI和BamHI消化，获得约1.2kb的SalI-BamHI DNA片段，与用SalI和BamHI消化的pRI109连接，制备重组体DNA，然后使用该重组体DNA转化大肠杆菌DH5α，由此制备pES346、pES509、pES709和pES849。

将上述质粒通过电穿孔法导入到产氨棒杆菌ATCC21264株中，获得转化株。将各转化株用实施例2的方法培养，测定由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的转化活性(表3)。

如表3所示，任何株均比保有第一代变异型基因的转化株显示高转化率，表明通过变异的组合可以进一步提高转化效率。

实施例7

第三代变异基因的制备

由实施例3的结果显示，将由pSYN2-39cod所具有的约1.2kb的SalI-BamHI片段所编码的、催化由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的酶的第83号丝氨酸残基置换为天冬酰胺，可能可以提高转化效率。因此，向实施例6制备的质粒中进一步导入该置换变异。

以pES346为模板，以含有SEQ ID NO.43和44所示碱基序列的DNA作为引物，进行PCR。PCR是在96℃保温1分钟之后，将含有96℃1分钟、58℃1分钟、72℃1分钟的步骤进行25个循环，然后在72℃下保温10分钟进行。

将该PCR所得的约330bp的扩增DNA片段用SalI-HpaI消化，与pES346所对应的SalI-HpaI部分置换，制备pES78-1。pES78-1中，催化由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的酶的第83号丝氨酸残基变换为天冬酰胺，除此之外与pES346相同。

同样，制备pES849-1，该pES849-1是将催化由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的酶的第83号丝氨酸残基变换为天冬酰胺。

再将pES503的约0.3kb的SalI-HpaI区用来自pES78-1的约0.3kb的SalI-HpaI区置换，制备pES503-1。

通过电穿孔法，分别将pES78-1、pES849-1和pES503-1导入到产氨棒杆菌ATCC21264株中，获得转化株。将各转化株按照实施例2的方法培养，测定由化合物(VII-a)转化为化合物(VIII-a)的转化活性。结果如上表3所示。

如表3所示，将第83号丝氨酸置换为天冬酰胺的酶、以及将pES78-1和pES849-1所具有的变异进行组合得到的酶使由化合物(VII-a)转换为化合物(VIII-a)的转化效率提高。

由以上结果表明，通过改变yjiB基因，可以使由化合物(VII-a)转换为(VIII-a)的转化速度、转化效率提高，带来这样性质变化的变异具有叠加的效果。因此，推断具有上述各变异的任意组合的酶也具有优异的转化速度或/和转化效率。

产业实用性

通过使用本发明的蛋白质，可以工业化有利地制备抑制HMG-CoA还原酶、具有血清胆固醇降低作用的化合物。

序列表自由文本

SEQ ID NO.1-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.2-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.3-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.5-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.6-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.7-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.8-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.9-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.10-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.11-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.12-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.13-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.14-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.15-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.16-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.17-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.18-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.19-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.20-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.21-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.22-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.23-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.24-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.25-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.26-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.27-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.28-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.29-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.30-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.31-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.32-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.33-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.34-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.35-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.36-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.37-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.38-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.39-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.40-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.41-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.42-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.43-人工序列的说明：合成DNA

SEQ ID NO.44-人工序列的说明：合成DNA

序列表

<110>KYOWA HAKKO KOGYO CO.，LTD.

<120>新型蛋白质和编码该蛋白质的DNA

<130>1831

<150>JP2005-344312

<151>2005-11-29

<160>44

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

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<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>未确定(UNSURE)

<222>(11)..(11)

<223>Xaa表示选自Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(14)..(14)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(16)..(16)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(17)..(17)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(18)..(18)

<223>Xaa表示选自Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(35)..(35)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(83)..(83)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(104)..(104)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(123)..(123)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(132)..(132)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(135)..(135)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(143)..(143)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(154)..(154)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(187)..(187)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(232)..(232)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(253)..(253)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

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<221>未确定

<222>(284)..(284)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

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<221>未确定

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Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

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<221>未确定

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Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(343)..(343)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<220>

<221>未确定

<222>(357)..(357)

Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val的任意氨基酸

<400>1

Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Xaa Arg Ala Xaa Leu Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser

20 25 30

Met Arg Xaa Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gln Val Trp

35 40 45

Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu

50 55 60

Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Xaa Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val

85 90 95

Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Xaa Met Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile

100 105 110

Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Xaa Gln Gly Arg Ser Glu

115 120 125

Phe Asp Leu Xaa His Asp Xaa Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile Xaa Ile

130 135 140

Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala Xaa Met Glu Gln Phe Lys Ala

145 150 155 160

Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala

165 170 175

Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Xaa Glu Glu Glu Leu Ala

180 185 190

Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln

195 200 205

Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu

210 215 220

Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Xaa Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly

225 230 235 240

Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Xaa Ser Ile Leu

245 250 255

Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met

260 265 270

Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Xaa Pro Ala Pro Val

275 280 285

Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile

290 295 300

Lys Xaa Gly Asp Xaa Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp

305 310 315 320

Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro

325 330 335

Asn Pro His Ile Ala Phe Xaa His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala

340 345 350

Pro Leu Ala Arg Xaa Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser

355 360 365

Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser

370 375 380

Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

385 390 395

<210>2

<211>396

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>未确定

<222>(11)..(11)

<223>Xaa表示Gln或Pro

<220>

<221>未确定

<222>(14)..(14)

<223>Xaa表示Leu或Pro

<220>

<221>未确定

<222>(16)..(16)

<223>Xaa表示Asn，Ala，Val，Ile或Leu

<220>

<221>未确定

<222>(17)..(17)

<223>Xaa表示Gly，Ala，Val，Ile或Leu

<220>

<221>未确定

<222>(18)..(18)

<223>Xaa表示Lys，Arg或His

<220>

<221>未确定

<222>(35)..(35)

<223>Xaa表示Lys，Met，Ala，Ser，Gly或Thr

<220>

<221>未确定

<222>(83)..(83)

<223>Xaa表示Asn，Ser，Thr或Ala

<220>

<221>未确定

<222>(104)..(104)

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<220>

<221>未确定

<222>(123)..(123)

<223>Xaa表示Phe，Ala，Val，Leu或Ile

<220>

<221>未确定

<222>(132)..(132)

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<220>

<221>未确定

<222>(135)..(135)

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<221>未确定

<222>(143)..(143)

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<221>未确定

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<220>

<221>未确定

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<220>

<221>未确定

<222>(253)..(253)

<223>Xaa表示Tyr，Phe或Trp

<220>

<221>未确定

<222>(284)..(284)

<223>Xaa表示Ala，Thr或Ser

<220>

<221>未确定

<222>(306)..(306)

<223>Xaa表示Glu，Met，Gly，Ala，Thr或Ser

<220>

<221>未确定

<222>(309)..(309)

<223>Xaa表示Met，Thr，Ala，Val，Leu或Ile

<220>

<221>未确定

<222>(343)..(343)

<223>Xaa表示Gly，Ala，Val，Leu或Ile

<220>

<221>未确定

<222>(357)..(357)

<223>Xaa表示Leu或Pro

<400>2

Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Xaa Arg Ala Xaa Leu Xaa

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Xaa Xaa Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser

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<213>人工序列

<220>

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<222>(11)..(11)

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<222>(14)..(14)

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<221>未确定

<222>(16)..(16)

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<221>未确定

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Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala

165 170 175

Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Xaa Glu Glu Glu Leu Ala

180 185 190

Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln

195 200 205

Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu

210 215 220

Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Xaa Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly

225 230 235 240

Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Xaa Ser Ile Leu

245 250 255

Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met

260 265 270

Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Xaa Pro Ala Pro Val

275 280 285

Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile

290 295 300

Lys Xaa Gly Asp Xaa Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp

305 310 315 320

Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro

325 330 335

Asn Pro His Ile Ala Phe Xaa His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala

340 345 350

Pro Leu Ala Arg Xaa Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser

355 360 365

Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser

370 375 380

Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

385 390 395

<210>4

<211>396

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400>4

Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Leu Asn

1 5 10 15

Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser

20 25 30

Met Arg Lys Asp Ala Pro Val ser Phe Asn Glu Glu Asn Gln Val Trp

35 40 45

Ser Val Phe Leu Try Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu

50 55 60

Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val

85 90 95

Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Val Met Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile

100 105 110

Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu

115 120 125

Phe Asp Leu Val His ASp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile

130 135 140

Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gln Phe Lys Ala

145 150 155 160

Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala

165 170 175

Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala

180 185 190

Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln

195 200 205

Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu

210 215 220

Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Phe Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly

225 230 235 240

Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Tyr Ser Ile Leu

245 250 255

Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met

260 265 270

Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val

275 280 285

Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile

290 295 300

Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp

305 310 315 320

Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro

325 330 335

Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala

340 345 350

Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser

355 360 365

Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser

370 375 380

Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

385 390 395

<210>5

<211>396

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Leu Asn

1 5 10 15

Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser

20 25 30

Met Arg Lys Asp Ala Pro Val ser Phe Asn Glu Glu Asn Gln Val Trp

35 40 45

Ser Val Phe Leu Try Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu

50 55 60

Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val

85 90 95

Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala Met Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile

100 105 110

Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu

115 120 125

Phe Asp Leu Val His ASp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile

130 135 140

Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gln Phe Lys Ala

145 150 155 160

Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala

165 170 175

Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala

180 185 190

Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln

195 200 205

Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu

210 215 220

Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly

225 230 235 240

Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Tyr Ser Ile Leu

245 250 255

Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met

260 265 270

Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val

275 280 285

Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile

290 295 300

Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp

305 310 315 320

Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro

325 330 335

Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala

340 345 350

Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser

355 360 365

Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser

370 375 380

Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

385 390 395

<210>6

<211>396

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Leu Asn

1 5 10 15

Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser

20 25 30

Met Arg Lys Asp Ala Pro Val ser Phe Asn Glu Glu Asn Gln Val Trp

35 40 45

Ser Val Phe Leu Try Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu

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Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser

65 70 75 80

Ile Ile Ser Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val

85 90 95

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100 105 110

Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu

115 120 125

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Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala

165 170 175

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180 185 190

Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln

195 200 205

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210 215 220

Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly

225 230 235 240

Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Phe Ser Ile Leu

245 250 255

Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met

260 265 270

Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val

275 280 285

Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile

290 295 300

Lys Glu Gly Asp Thr Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp

305 310 315 320

Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro

325 330 335

Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala

340 345 350

Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser

355 360 365

Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser

370 375 380

Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

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<210>7

<211>396

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atgaacgttc tgaaccgccg ccaggcactg cmgcgcgcac ygctcawcgk cargaacaag 60

caggatgcat accatccatt tccatggtac gaatccatgc gcawggatgc accagtttcc 120

tttgatgaag aaaaccaggt ttggagcgtt tttctttacg atgatgtcaa gaaggttgtt 180

ggcgataagg agctgttttc ctcctgcatg ccacagcaga ccagctctat tggaaactcc 240

atcattarca tggacccacc aaagcatacc aagatccgtt ccgtcgttaa caaggcattt 300

actccgcgcg ytatgaagca gtgggaacca cgcattcagg aaatcaccga tgaactgatt 360

cagaagyttc agggccgcag tgagtttgac cttgktcacg attwttccta cccacttcca 420

gttattgkta tctctgagct gctgggagtt ccttccgcac rtatggaaca gtttaaggca 480

tggtctgatc ttctggtctc caccccaaag gataagtccg aagaagctga aaaggcattt 540

ctggaagaac gcgataagtr cgaggaagaa ctggcagcat tttttgcagg catcatcgaa 600

gaaaagcgca acaagccgga acaggatatt atttctattc tggttgaagc agaagaaacc 660

ggcgagaagc tgtccggtga agagctgatt ccgttktgca ccctgctgct ggttgcagga 720

aacgaaacca ctaccaacct gatttccaac gcaatgtwca gcatcctgga aaccccaggc 780

gtttacgagg aactgcgcag ccatcctgaa ctgatgcctc aggcagttga ggaagccctg 840

cgtttccgcr caccagcacc agttctgcgc cgcatcgcaa agcgcgatac cgagatcggc 900

ggccacctga ttaaggragg tgatayggtt ctggcatttg ttgcatccgc aaaccgtgat 960

gaagcaaagt ttgaccgccc acacatgttt gatatccgcc gccatccaaa cccacatatt 1020

gcatttgscc acggcatcca tttttgcctt ggcgcaccac ttgcacgtcy tgaagcaaac 1080

atcgcactga cctctctgat ttctgctttt cctcatatgg agtgcgtctc catcactcca 1140

attgaaaact ccgttatcta cggactgaag agcttccgtg ttaagatg 1188

<210>8

<211>396

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

atg aac gtt ctg aac cgc cgc cag gca ctg cag cgc gca ctg ctc aac 48

Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Gln Arg Ala Leu Leu Asn

1 5 10 15

ggc aag aac aag cag gat gca tac cat cca ttt cca tgg tac gaa tcc 96

Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser

20 25 30

atg cgc aag gat gca cca gtt tcc ttt gat gaa gaa aac cag gtt tgg 144

Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gln Val Trp

35 40 45

agc gtt ttt ctt tac gat gat gtc aag aag gtt gtt ggc gat aag gag 192

Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu

50 55 60

ctg ttt tcc tcc tgc atg cca cag cag acc agc tct att gga aac tcc 240

Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser

65 70 75 80

atc att aac atg gac cca cca aag cat acc aag atc cgt tcc gtc gtt 288

Ile Ile Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val

85 90 95

aac aag gca ttt act ccg cgc gct atg aag cag tgg gaa cca cgc att 336

Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala Met Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile

100 105 110

cag gaa atc acc gat gaa ctg att cag aag ttt cag ggc cgc agt gag 384

Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu

115 120 125

ttt gac ctt gtt cac gat ttt tcc tac cca ctt cca gtt att gtt atc 432

Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile

130 135 140

tct gag ctg ctg gga gtt cct tcc gca cat atg gaa cag ttt aag gca 480

Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gln Phe Lys Ala

145 150 155 160

tgg tct gat ctt ctg gtc tcc acc cca aag gat aag tcc gaa gaa gct 528

Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala

165 170 175

gaa aag gca ttt ctg gaa gaa cgc gat aag tgc gag gaa gaa ctg gca 576

Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala

180 185 190

gca ttt ttt gca ggc atc atc gaa gaa aag cgc aac aag ccg gaa cag 624

Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln

195 200 205

gat att att tct att ctg gtt gaa gca gaa gaa acc ggc gag aag ctg 672

Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu

210 215 220

tcc ggt gaa gag ctg att ccg ttg tgc acc ctg ctg ctg gtt gca gga 720

Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly

225 230 235 240

aac gaa acc act acc aac ctg att tcc aac gca atg tac agc atc ctg 768

Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Tyr Ser Ile Leu

245 250 255

gaa acc cca ggc gtt tac gag gaa ctg cgc agc cat cct gaa ctg atg 816

Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met

260 265 270

cct cag gca gtt gag gaa gcc ctg cgt ttc cgc gca cca gca cca gtt 864

Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val

275 280 285

ctg cgc cgc atc gca aag cgc gat acc gag atc ggc ggc cac ctg att 912

Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile

290 295 300

aag gaa ggt gat atg gtt ctg gca ttt gtt gca tcc gca aac cgt gat 960

Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp

305 310 315 320

gaa gca aag ttt gac cgc cca cac atg ttt gat atc cgc cgc cat cca 1008

Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro

325 330 335

aac cca cat att gca ttt ggc cac ggc atc cat ttt tgc ctt ggc gca 1056

Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala

340 345 350

cca ctt gca cgt ctt gaa gca aac atc gca ctg acc tct ctg att tct 1104

Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser

355 360 365

gct ttt cct cat atg gag tgc gtc tcc atc act cca att gaa aac tcc 1152

Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser

370 375 380

gtt atc tac gga ctg aag agc ttc cgt gtt aag atg 1188

Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

385 390 395

<210>9

<211>396

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

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Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gln Ala Leu Pro Arg Ala Leu Leu Asn

1 5 10 15

ggc aag aac aag cag gat gca tac cat cca ttt cca tgg tac gaa tcc 96

Gly Lys Asn Lys Gln Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser

20 25 30

atg cgc aag gat gca cca gtt tcc ttt gat gaa gaa aac cag gtt tgg 144

Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gln Val Trp

35 40 45

agc gtt ttt ctt tac gat gat gtc aag aag gtt gtt ggc gat aag gag 192

Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu

50 55 60

ctg ttt tcc tcc tgc atg cca cag cag acc agc tct att gga aac tcc 240

Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gln Gln Thr Ser Ser Ile Gly Asn Ser

65 70 75 80

atc att agc atg gac cca cca aag cat acc aag atc cgt tcc gtc gtt 288

Ile Ile Ser Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys Ile Arg Ser Val Val

85 90 95

aac aag gca ttt act ccg cgc gct atg aag cag tgg gaa cca cgc att 336

Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala Met Lys Gln Trp Glu Pro Arg Ile

100 105 110

cag gaa atc acc gat gaa ctg att cag aag ttt cag ggc cgc agt gag 384

Gln Glu Ile Thr Asp Glu Leu Ile Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ser Glu

115 120 125

ttt gac ctt gtt cac gat tat tcc tac cca ctt cca gtt att gtt atc 432

Phe Asp Leu Val His Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Pro Val Ile Val Ile

130 135 140

tct gag ctg ctg gga gtt cct tcc gca cat atg gaa cag ttt aag gca 480

Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gln Phe Lys Ala

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tgg tct gat ctt ctg gtc tcc acc cca aag gat aag tcc gaa gaa gct 528

Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala

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180 185 190

gca ttt ttt gca ggc atc atc gaa gaa aag cgc aac aag ccg gaa cag 624

Ala Phe Phe Ala Gly Ile Ile Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gln

195 200 205

gat att att tct att ctg gtt gaa gca gaa gaa acc ggc gag aag ctg 672

Asp Ile Ile Ser Ile Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu

210 215 220

tcc ggt gaa gag ctg att ccg ttg tgc acc ctg ctg ctg gtt gca gga 720

Ser Gly Glu Glu Leu Ile Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly

225 230 235 240

aac gaa acc act acc aac ctg att tcc aac gca atg ttc agc atc ctg 768

Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu Ile Ser Asn Ala Met Phe Ser Ile Leu

245 250 255

gaa acc cca ggc gtt tac gag gaa ctg cgc agc cat cct gaa ctg atg 816

Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met

260 265 270

cct cag gca gtt gag gaa gcc ctg cgt ttc cgc gca cca gca cca gtt 864

Pro Gln Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val

275 280 285

ctg cgc cgc atc gca aag cgc gat acc gag atc ggc ggc cac ctg att 912

Leu Arg Arg Ile Ala Lys Arg Asp Thr Glu Ile Gly Gly His Leu Ile

290 295 300

aag gaa ggt gat acg gtt ctg gca ttt gtt gca tcc gca aac cgt gat 960

Lys Glu Gly Asp Thr Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp

305 310 315 320

gaa gca aag ttt gac cgc cca cac atg ttt gat atc cgc cgc cat cca 1008

Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp Ile Arg Arg His Pro

325 330 335

aac cca cat att gca ttt ggc cac ggc atc cat ttt tgc ctt ggc gca 1056

Asn Pro His Ile Ala Phe Gly His Gly Ile His Phe Cys Leu Gly Ala

340 345 350

cca ctt gca cgt ctt gaa gca aac atc gca ctg acc tct ctg att tct 1104

Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn Ile Ala Leu Thr Ser Leu Ile Ser

355 360 365

gct ttt cct cat atg gag tgc gtc tcc atc act cca att gaa aac tcc 1152

Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser Ile Thr Pro Ile Glu Asn Ser

370 375 380

gtt atc tac gga ctg aag agc ttc cgt gtt aag atg 1188

Val Ile Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

385 390 395

<210>10

<211>138

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

acgcgtcgac taatatgaac gttctgaacc gccgccaggc actgccacgc gcactgctca 60

acggcaagaa caagcaggat gcataccatc catttccatg gtacgaatcc atgcgcaagg 120

atgcaccagt ttcctttg 138

<210>11

<211>104

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

atgaagaaaa ccaggtttgg agcgtttttc tttacgatga tgtcaagaag gttgttggcg 60

ataaggagct gttttcctcc tgcatgccac agcagaagct tggg 104

<210>12

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

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<210>13

<211>148

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

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<210>14

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

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aagcatacca agatccgttc cgtcgttaac aaggcattta ctccgcgcgc tatgaagcag 120

<210>15

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

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<210>16

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

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<210>17

<211>60

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

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<210>18

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

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<210>19

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

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cagctcagag ataacaataa ctggaagtgg gtaggaataa tcgtgaacaa ggtcaaactc 120

<210>20

<211>130

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

acgcgtcgac taatgatatc cgccgccatc caaacccaca tattgcattt ggccacggca 60

tccatttttg ccttggcgca ccacttgcac gtcttgaagc aaacattgca ctgacctctc 120

tgatttctgc 130

<210>21

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

ttttcctcat atggagtgcg tctccatcac tccaatcgaa aactccgtta tctacggact 60

gaagagcttc cgtgttaaga tgtaaggatc cggg 94

<210>22

<211>94

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

agacgtgcaa gtggtgcgcc aaggcaaaaa tggatgccgt ggccaaatgc aatatgtggg 60

tttggatggc ggcggatatc attagtcgac gcgt 94

<210>23

<211>130

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

cccggatcct tacatcttaa cacggaagct cttcagtccg tagataacgg agttttcgat 60

tggagtgatg gagacgcact ccatatgagg aaaagcagaa atcagagagg tcagtgcaat 120

gtttgcttca 130

<210>24

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

acgcgtcgac atgccctcag gcagttgagg aagccctgcg tttccgcgca ccagcaccag 60

ttctgcgccg catcgcaaag cgcgataccg agatcggcgg ccacctgatt aaggaaggtg 120

<210>25

<211>77

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

atacggttct ggcatttgtt gcatccgcaa accgtgatga agcaaagttt gaccgcccac 60

acatgtttga tatccgc 77

<210>26

<211>77

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

tgcgatgcgg cgcagaactg gtgctggtgc gcggaaacgc agggcttcct caactgcctg 60

agggcatgtc gacgcgt 77

<210>27

<211>120

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

gcggatatca aacatgtgtg ggcggtcaaa ctttgcttca tcacggtttg cggatgcaac 60

aaatgccaga accgtatcac cttccttaat caggtggccg ccgatctcgg tatcgcgctt 120

<210>28

<211>130

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

acgcgtcgac cagatcttct ggtctccacc ccaaaggata agtccgaaga agctgaaaag 60

gcatttctgg aagaacgcga taagtgcgag gaagaactgg cagcattttt tgcaggcatc 120

atcgaagaaa 130

<210>29

<211>130

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

agcgcaacaa gccggaacag gatattattt ctattctggt tgaagcagaa gaaaccggcg 60

agaagctgtc cggtgaagag ctgattccgt tgtgcaccct gctgctggtt gcaggaaacg 120

aaaccactac 130

<210>30

<211>93

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

caacctgatt tccaacgcaa tgttcagcat cctggaaacc ccaggcgttt acgaggaact 60

gcgcagccat cctgaactga tgcctcaggc agt 93

<210>31

<211>93

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

ttcctcgcac ttatcgcgtt cttccagaaa tgccttttca gcttcttcgg acttatcctt 60

tggggtggag accagaagat ctggtcgacg cgt 93

<210>32

<211>130

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

acaacggaat cagctcttca ccggacagct tctcgccggt ttcttctgct tcaaccagaa 60

tagaaataat atcctgttcc ggcttgttgc gcttttcttc gatgatgcct gcaaaaaatg 120

ctgccagttc 130

<210>33

<211>130

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

actgcctgag gcatcagttc aggatggctg cgcagttcct cgtaaacgcc tggggtttcc 60

aggatgctga acattgcgtt ggaaatcagg ttggtagtgg tttcgtttcc tgcaaccagc 120

agcagggtgc 130

<210>34

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

acgccgcgac gcgtcgacta atatgaacgt tctgaacc 38

<210>35

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

gcgacgcgcg ggatccttac atcttaacac ggaagctc 38

<210>36

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>36

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210>37

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>37

tagtggatcc atagtcgact aatccctta 29

<210>38

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>38

agcggtcgac aatgaatgtg ttaaaccgc 29

<210>39

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>39

acgcggatcc ttacattttc acacggaag 29

<210>40

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<400>40

tcgcctcgag tcgaggaggt cgactaatat gaacgttctg aaccgccgtc aagccttgca 60

gcgagcg 67

<210>41

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>41

acgccgcgac gcgtcgacta atatgaacgt tctgaacc 38

<210>42

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>42

gcgacgcgcg ggatccttac atcttaacac ggaagctc 38

<210>43

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>43

cagctggaag agcaactgg 19

<210>44

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>44

ggtatgcttt ggtgggtcca tgttaatgat ggag 34

Claims

1.蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列，但是含有SEQ ID NO.4-6所示氨基酸序列的蛋白质除外。

2.DNA，该DNA编码具有SEQ ID NO.1-3中任一项所示氨基酸序列的蛋白质，但是，编码含SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白质的DNA除外。

3.DNA，该DNA具有SEQ ID NO.7所示碱基序列。

4.重组体DNA，该重组体DNA含有上述(2)或(3)的DNA。

5.转化体，该转化体是将上述(4)的重组体DNA导入到宿主细胞中得到的。

6.权利要求5的转化体，其中，宿主细胞是属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、链霉菌属、曲霉属或青霉属的微生物。

7.权利要求5的转化体，其中，宿主细胞是属于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌、浅青紫链霉菌、土曲霉、桔青霉的微生物。

8.化合物(II-a)或化合物(II-b)的制备方法，其特征在于：使权利要求1或2的蛋白质与式(I)所示的化合物[以下称为化合物(I-a)]或式(II)所示的、化合物(I-a)的闭环内酯体[以下称为化合物(I-b)]接触，

[化21]

式(I)

[化22]

式(II)

(式中，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)

[化23]

式(III)

[化24]

式(IV)

(式中，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)收集化合物(II-a)或(II-b)。

9.化合物(II-a)或化合物(II-b)的制备方法，其特征在于：在水性介质中，使权利要求5-7中任一项的转化体的培养物或该培养物的处理物与化合物(I-a)或(I-b)接触，使化合物(II-a)或化合物(II-b)在该介质中生成并蓄积，由该介质收集化合物(II-a)或化合物(II-b)。

10.权利要求8或9的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(V)所示的化合物[以下称为化合物(III-a)]：

[化25]

式(V)

化合物(I-b)是式(VI)所示的化合物[以下称为化合物(III-b)]：

[化26]

式(VI)

(式中，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)，化合物(II-a)是式(VII)所示的化合物[以下称为化合物(IV-a)]：

[化27]

式(VII)

化合物(II-b)是式(VIII)所示的化合物[以下称为化合物(IV-b)]：

[化28]

式(VIII)

(式中，R²表示取代或无取代的烷基或芳基)。

11、权利要求8或9的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(IX)所示的化合物[以下称为化合物(V-a)]：

[化29]

式(IX)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，化合物(I-b)是式(X)所示的化合物[以下称为化合物(V-b)]：

[化30]

式(X)

化合物(II-a)是式(XI)所示的化合物[以下称为化合物(VI-a)]：

[化31]

式(XI)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，化合物(II-b)是式(XII)所示的化合物[以下称为化合物(IV-b)]：

[化32]

式(XII)

12、权利要求8或9的制备方法，其中，化合物(I-a)是式(XIII)所示的化合物[以下称为化合物(VII-a)]：

[化33]

式(XIII)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，化合物(I-b)是式(XIV)所示化合物[以下称为化合物(VII-b)]：

[化34]

式(XIV)

化合物(II-a)是式(XV)所示的化合物[以下称为化合物(VIII-a)]：

[化35]

式(XV)

(式中，R¹表示氢原子、取代或无取代的烷基或碱金属)，化合物(II-b)是式(XVI)所示的化合物[以下称为化合物(VIII-b)]：

[化36]

式(XVU)

13.权利要求8或9的制备方法，其中，化合物(II-b)是由化合物(II-a)形成内酯得到的化合物(II-b)。

14.权利要求8或9的制备方法，其中，化合物(II-a)是使化合物(II-b)的内酯开环得到的化合物(II-a)。

15.权利要求10的制备方法，其中，化合物(III-b)是由化合物(III-a)形成内酯得到的化合物(III-b)。

16.权利要求10的制备方法，其中，化合物(IV-a)是使化合物(IV-b)的内酯开环得到的化合物(IV-a)。

17.权利要求11的制备方法，其中，化合物(V-b)是由化合物(V-a)形成内酯得到的化合物(V-b)。

18.权利要求11的制备方法，其中，化合物(IV-a)是使化合物(VI-b)的内酯开环得到的化合物(IV-a)。

19.权利要求12的制备方法，其中，化合物(VII-b)是由化合物(VII-a)形成内酯得到的化合物(VII-b)。

20.权利要求12的制备方法，其中，化合物(VIII-a)是使化合物(VIII-b)的内酯开环得到的化合物(VIII-a)。

21.权利要求9-12中任一项的制备方法，其中，转化体培养物的处理物是培养物的浓缩物、培养物的干燥物、培养物的冻干物、由培养物得到的菌体，选自该菌体的干燥物、该菌体的冻干物、该菌体的表面活性剂处理物、该菌体的酶处理物、该菌体的超声波处理物、该菌体的机械磨碎物、该菌体的溶剂处理物的菌体处理物，菌体的蛋白分级产物，以及选自菌体和菌体处理物的固定化物的处理物。

22.蛋白质的制备方法，其特征在于：将权利要求5-7中任一项的转化体在培养基中培养，使权利要求1的蛋白质在培养物中生成并蓄积，由该培养物中收集该蛋白质。