KR100815085B1 - Ｄ-세린의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성보다 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 변형된 미생물 세포, 전기 세포의 배양물 또는 그의 처리물을 DL-세린을 함유하는 배지 중에서 DL-세린에 접촉시켜 L-세린을 분해시키고, 잔존하는 D-세린을 전기 배지 중에서 수득하는 단계를 포함하는 D-세린의 제조방법 및 전기 제조방법에 관계되는 미생물에 관한 것이다. D-세린은 D-사이클로세린 등의 유용 의약품의 합성 중간체로서 유용한 화합물이다.
L-세린디아미나제, DL-세린, D-세린

Description

Ｄ-세린의 제조방법{PROCESS FOR PRODUCING D-SERINE}
본 발명은 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성보다 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 변형된 미생물 세포, 전기 세포의 배양물 또는 그의 처리물을 DL-세린을 함유하는 배지 중에서 DL-세린에 접촉시켜서 L-세린을 분해시키고, 잔존하는 D-세린을 전기 배지 중에서 수득하는 단계를 포함하는 D-세린의 제조방법 및 전기 제조방법에 관계되는 미생물에 관한 것이다. D-세린은 D-사이클로세린 등의 유용 의약품의 합성 중간체로서 유용한 화합물이다.
D-세린에 관해서는 이하의 제조방법이 알려져 있다:
(ⅰ) DL-히드록시메틸히단토인을 미생물에 의해 N-카바밀-D-세린으로 변환한 후, 가수분해하여 D-세린을 얻는 방법(참조: 특개소 제 61-152291호).
(ⅱ) DL-세린을 함유하는 배지 중에서 캔디다(Candida) 속, 토루로프시스(Torulopsis) 속, 크립토코카스(Cryptococcus) 속, 사카로마이코프시스(Saccharomycopsis) 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 에스케리키아(Escherichia) 속, 클렙시에라(Klebsiella) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 또는 세라티아(Serratia) 속에 속하는 L-세린을 자화하고 D-세린을 실질적으로 자화하지 않는 미생물을 배양하고, 배양액에서 D-세린을 단리하는 방법(참조: 특개소 제 64-2594호).
(ⅲ) 티로시나제 활성을 갖는 미생물을 DL-세린과 페놀을 함유하는 반응액에 작용시켜 L-세린을 L-티로신으로 변환하고, 잔존하는 D-세린을 수득하는 방법(참조: 특개소 제 5-91895호).
이러한 제조방법은 어느 것도 공업적인 D-세린 제조방법으로서 사용되기에는 문제점이 있다. (ⅰ)의 방법에서는 DL-히드록시메틸히단토인에서 N-카바밀-D-세린의 수율이 40%로 낮고, 촉매용으로 다량의 균체를 필요로 하는 점, (ⅱ)의 방법에서는 반응종료에서도 L-세린이 잔존하고 있어 결국 DL-세린의 분할을 요하는 점, (ⅲ)의 방법에서는 기질농도가 1%로 낮고, 유해한 페닐을 반응에 필요로 하는 점 등이 이러한 제조방법의 공업적 이용을 곤란하게 하고 있다.
대장균이 L-세린을 암모니아, 피루브산 및 물에 분해하는 L-세린디아미나제 활성을 갖고 있는 것은 알려져 있다(참조: J. Bacteriol., 171, 5095-5102(1989), Eur. J. Biochem., 212, 777-784(1993)). 그러나, 대장균에서 추출된 전기 효소는 반응시에 철이나 환원제의 첨가 등 복잡한 조건을 필요로 하는 것이 보고되어 있고(참조: J. Bacteriol., 162, 1270-1275(1985)), 전기 정제효소를 D-세린 제조방법에 사용하는 것은 실용적이지 않다.
또한, 대장균은 D-세린을 분해하는 D-세린디아미나제 활성도 갖고 있는 것이 알려져 있다(참조: J. Bacteriol., 121, 1092-1101(1975)). 따라서, 대장균을 사 용하여 L-세린디아미나제에 의해 DL-세린에서 생산된 D-세린은 전기 D-세린디아미나제에 의해 분해되어 버려 생산효율이 저하하였다.
이상, 종래의 공지된 방법에서는 DL-세린에서 D-세린을 효율적으로 생산하는 방법은 확립되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 공업적으로 유리한 D-세린의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명자는 대장균(Escherichia coli) DH 5α주에 비하여 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 변형된 대장균으로부터 L-세린디아미나제의 추출 또는 정제를 행하지 않고, 전기 균체 또는 균체 처리물을 DL-세린에 접촉시켜 의외로 D-세린을 거의 감소시키지 않고 신속하게 L-세린을 검출한계 이하까지 분해 할 수 있고, D-세린을 공업적으로 제조할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 이하 (1) 내지 (12)에 관한 것이다.
(1) 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성보다 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 변형된 미생물 세포, 전기 세포의 배양물 또는 그의 처리물을 DL-세린을 함유하는 배지 중에서 DL-세린에 접촉시켜 L-세린을 분해시키고, 잔존하는 D-세린을 전기 배지 중에서 수득하는 단계를 포함하는 D-세린의 제조방법.
(2) 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성보다 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 변형된 미생물을 DL-세린을 함유하는 배지에서 배양하고, L-세린을 분해시켜 전기 배양물에서 잔존하는 D-세린을 수득하는 단계를 포함하는 D-세린의 제조방법.
(3) 변형된 미생물이 L-세린디아미나제 활성을 갖는 미생물을 변이처리하여 수득되는 변이 미생물인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2)의 D-세린의 제조방법.
(4) 변형된 미생물이 L-세린디아미나제 유전자를 미생물에 삽입하여 수득되는 형질전환체인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2)의 D-세린의 제조방법.
(5) 변형된 미생물의 L-세린디아미나제 활성이 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성에 비해 2배 이상인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 D-세린의 제조방법.
(6) 변형된 미생물의 L-세린디아미나제 활성이 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성에 비해 5배 이상인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나의 D-세린의 제조방법.
(7) L-세린디아미나제 유전자가 대장균 유래의 sdaA 유전자 또는 sdaB 유전자인 것을 특징으로 하는 상기 (4)의 D-세린의 제조방법.
(8) 변형된 미생물이 대장균에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나의 D-세린의 제조방법.
(9) 변형된 미생물이 대장균(Escherichia coli) DH 5α/pHIB, 대장균(Escherichia coli) NM522/pHIA1, 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIA1, 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIA2, 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIB 및 대장균(Escherichia coli) ME5386/pHIA2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나의 D-세린의 제조방법.
(10) 변형된 미생물이 D-세린디아미나제 활성이 낮거나 활성을 갖지 않는 미생물인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나의 D-세린의 제조방법.
(11) 대장균(Escherichia coli)에 속하고, 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성보다 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 변형된 미생물.
(12) 미생물이 대장균(Escherichia coli) DH 5α/pHIB, 대장균(Escherichia coli) NM522/pHIA1, 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIA1, 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIA2, 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIB 및 대장균(Escherichia coli) ME5386/pHIA2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 상기 (11)의 미생물.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 대장균(Escherichia coli) DH 5α주에 비하여 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 변형된 미생물의 수득
본 발명에서 사용하고 있는 대장균(Escherichia coli) DH 5α주(동양방사 제, 이하 동일)에 비하여 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 변형된 미생물(이하, '변형된 미생물'로 약칭함)은 이하에 기술하는 방법에 의해 수득할 수 있다.
변형된 미생물(이하, '친주'라 함)은 L-세린디아미나제 활성을 갖는 미생물이거나, L-세린디아미나제 활성을 갖지 않는 미생물이거나 어느 것이어도 무관하다.
친주가 L-세린디아미나제 활성을 갖고 있는 경우는 이하에 기술하는 (1) 또는 (2)에 기재된 방법에 의해 변형된 미생물을 얻을 수 있다.
전기 친주가 L-세린디아미나제 활성을 갖고 있지 않은 경우에는 이하에 기술하는 (2)에 기재된 방법에 의해 변형된 미생물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법에서는 고수율로 D-세린을 제조할 수 있기 때문에, D-세린디아미나제에 의해 D-세린의 분해가 있었다고 해도 고수율로 D-세린을 제조할 수 있다.
따라서, 친주의 D-세린디아미나제 활성은 있거나 없거나 어느 것이어도 무관하다.
(1) 변이처리법에 의한 수득
변형된 미생물은 친주에 변이처리를 행하여 돌연변이를 생기게 하는 것에 의해 수득된 미생물(이하, '변이 미생물'이라 약칭함)에서 수득할 수 있다.
변이처리법은 통상 사용되고 있는 방법이면 어느 것이어도 무관하다. 예컨대, 변이처리제를 사용하는 방법, 자외선 조사법 등을 들 수 있다.
변이처리제를 사용하는 방법으로서는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)를 사용하는 방법(참조: 미생물 실험 매 뉴얼, 131페이지, 1986년, 강담사 사이언티픽사)가 바람직하게 사용되고 있다.
변이처리된 미생물을 하기에 기술한 방법으로 배양하고, N-세린디아미나제 활성이 대장균(Escherichia coli) DH 5α주보다 향상된 미생물을 선택하여 변형된 미생물을 수득할 수 있다.
N-세린디아미나제 활성은 적어도 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제보다 향상되어 있으면 좋고, 바람직하게는 2배 이상, 더욱 바람직하게는 5배 이상 향상시키는 것이 바람직하다.
N-세린디아미나제 활성의 측정은 [Meth. Enzymol., 17B, 346(1971)], [Meth. Enzymol., 17B, 351(1971)] 등에 기재되어 있는 방법에 따라 행할 수 있다. 또한, 간편한 방법으로서 하기에 기술한 방법을 들 수 있다.
즉, 변형된 미생물을 DL-세린과 접촉시킨 후에, 반응액 중에 잔존하는 L-세린의 양을 측정하고, 단위 시간 당 감소한 L-세린의 양을 산출하여 측정할 수 있다.
예컨대, 반응개시에서 반응 중의 임의의 시간까지 L-세린의 감소량 즉, 분해량을 측정하고, 수득된 분해량의 값을 반응 시간으로 나누어 단위 시간 당 L-세린의 분해량을 측정하고, 없어진 값을 L-세린디아미나제 활성으로 할 수 있다.
구체적으로는, 수득된 변이 미생물을 30℃에서 1일간 배양하여 수득된 배양액을 원심분리하여 균체를 수득한다. 배지는 전기 변이생물을 배양할 수 있는 배지이면 임의의 배지를 사용할 수 있다. 전기 균체를 50mmol/ℓ의 인산 완충액(pH 7.5)에 현탁하고, 원심분리하여 수득된 균체(습균체 중량 약 2g)을 반응에 사용한 다.
DL-세린을 50g/ℓ함유하는 인산 완충액(pH 7.5)에 수득된 균체를 현탁하고, 37℃에서 10시간 내지 22시간 반응시킨다. 반응 종료 후, D-세린 및 L-세린의 농도를 HPLC에 의해 측정하고, 완충액 중의 함량을 산정한다.
(2) 유전자 재조합에 의한 방법
이하에 기술하는 방법에서, L-세린디아미나제 유전자를 수득하고, 전기 유전자를 숙주세포에 도입하는 것에 의해 변형된 미생물을 얻을 수 있다.
(a) L-세린디아미나제 유전자의 수득
공지의 대장균(Escherichia coli)의 L-세린디아미나제 유전자 서열(참조: J. Bacteriol., 171, 5095-5102(1989), Eur. J. Biochem., 212, 777-784(1993))과 함께, L-세린디아미나제 유전자를 클로닝할 수 있다. 이하에, 대장균(Escherichia coli)의 L-세린디아미나제 유전자 sdaA, sdaB의 수득법을 차례로 설명하고 있지만, L-세린디아미나제 유전자의 수득원은 L-세린디아미나제 활성을 갖는 미생물이면 대장균에 한정되지 않는다.
예컨대, 이하의 방법에 의해 수득할 수 있다.
대장균, 예컨대 Escherichia coli W3110주를 대장균 배양에 알맞은 배지, 예컨대 LB 배지(박토트립톤(Difco사 제) 10g, 효모 엑기스(Difco사 제) 5g, NaCl 5g을 물 1ℓ에 넣고, pH 7.2로 조정한 배지)를 사용하고, 통상의 방법에 의해 배양한다. 배양 후, 배양물에서 원심분리에 의해 균체를 수득한다.
수득한 균체로부터 공지의 방법[예컨대, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001), 이하, '몰레큘러 클로닝 제 3판'이라고 함]에 따라 염색체 DNA를 단리한다.
[J. Bacteriol., 171, 5095-5102(1989)] 또는 [Eur. J. Biochem., 212, 777-784(1993)]에 기재된 L-세린디아미나제 유전자의 염기서열 정보를 이용하여 sdaA 유전자 또는 sdaB 유전자에 대응하는 염기서열을 함유하는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 DNA 합성기를 이용하여 합성한다.
수득된 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 염색체 DNA를 이용하여 PCR법으로 DNA 단편을 증폭한다. 전기 증폭 DNA 단편을 플라즈미드에 도입가능하게 하기 위하여 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머의 5'-말단에는 적절한 제한효소 부위, 예컨대 BamHI 등의 제한효소 부위를 부가시키는 것이 바람직하다.
전기 센스 프라이머와 안티센스 프라이머의 조합으로서는 예컨대, 서열 번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 2종류의 프라이머의 조합과 서열번호 1 및 3의 염기서열을 갖는 2종류의 프라이머의 조합(sdaA용), 서열 번호 4 및 5의 염기서열을 갖는 2종류의 프라이머의 조합(sdaB 용) 등을 들 수 있다.
염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머 TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2(보주조사 제) 또는 Expand TM High-Fidelity PCR System(Boehringer Mannheim사 제)를 사용하여 DNA THermal Cycler(Perkin Elmer Japan사 제)에서 PCR을 행한다.
PCR의 조건으로서, 2kb 이하의 DNA 단편을 증폭하는 경우에는 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초 내지 1분간, 72℃에서 2분간으로 이루어지는 반응공정을 1사이클로 하고, 2kb를 초과하는 DNA 단편을 증폭하는 경우에는 98℃에서 20초간, 68℃에서 3분간으로 이루어지는 반응공정을 1사이클로 하여, 각각 30사이클을 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건을 들 수 있다.
PCR에 의해 증폭된 DNA 단편과 대장균에서 복제가능한 벡터를 제한효소를 사용하여 상기 프라이머에서 부여한 제한효소 부위와 동일한 부위에서 절단한 후, 아가로스겔 전기영동, 슈크로스 밀도 구배 초원심 분리 등을 행하여 DNA 단편을 회수한다.
회수한 DNA 단편을 사용하여 통상의 방법, 예컨대 몰레큘러 클로닝 제 2판, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1~38, John Wiley & Sons(1987-1997): 이하, '커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지-서플멘트'로 칭함, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press(1995) 등에 기재된 방법에 의해 또는 시판되는 키트, 예컨대 cDNA 합성 및 플라즈미드 클로닝을 위한 수퍼스크립트 플라즈미드계(SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning)(Life Technologies사 제) 또는 ZAP-cDNA Synthesis Kit[Stratagene사 제]을 사용하여 클로닝 벡터를 제조하고, 제조한 클로닝벡터를 사용하여 대장균 예컨대, Escherichia coli DH5 α주(동양방사 제)를 형질전환한다.
대장균(Escherichia coli)을 형질전환하기 위한 클로닝 벡터로서는 대장균 K12주 중에서 자율복제할 수 있는 것이면 파지 벡터, 플라즈미드 벡터 등 어느 것 도 사용할 수 있다. 대장균 용의 발현벡터를 클로닝 벡터로서 사용해도 좋다. 구체적으로는 ZAP Express(참조: Stratagene사, Strategies, 5, 58(1992)), pBluescript II SK(+)(참조: Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)), (Lambda ZAP II(Stratagene사 제), λgt10, λgt11(참조: DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49(1985)), λTrip1Ex(Clontech사 제), λExCell(Pharmacia사 제), pT7T318U(Pharmacia사 제), pcD2(참조: Mol. Cell. Biol., 3, 280(1983)), pMW218(화광순약공업사 제), pUC118, pSTV28(보주조사 제), pEG400(참조: J. Bacteriol., 172, 2392(1990)), pHMV1520(MoBiTec사 제), pQE-30(QIAGEN사 제) 등을 들 수 있다.
수득된 형질전환주에서 목적하는 유전자를 함유하는 플라즈미드를 통상의 방법, 예컨대 몰레큘러 클로닝 제 3판, 커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지-서플멘트, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press(1995) 등에 기재된 방법에 의해 수득할 수 있다.
상기 방법에 의해 L-세린디아미나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 함유한 플리즈미드를 수득할 수 있다. 전기 플라즈미드로서는 예컨대, 실시예에 나타낸 pHIA1, pHIA2, pHIB를 들 수 있다.
동일한 방법으로 게놈의 DNA 염기서열이 공지된 생물에서 L-세린디아미나제 유전자를 수득할 수 있다. 또한, 게놈의 DNA 염기서열이 공지되지 않은 생물이어도 적당한 벡터를 사용하여 대장균을 숙주로서 염색체 DNA 라이브러리를 작성하여, 이 라이브러리의 각 주에 대하여 L-세린디아미나제 활성을 조사하는 것에 의해 L-세린디아미나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 함유한 플라즈미드를 수득할 수 있다.
(b) L-세린디아미나제 유전자의 발현방법
상기와 같이 하여 수득된 L-세린디아미나제를 암호화하는 DNA를 숙주세포 중에서 발현시키기 위해서, 우선 목적하는 L-세린디아미나제를 암호화하는 DNA를 제한효소류 또는 DNA 분해효소류로 절단하고, 암호화 영역을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편으로 한 후에, 전기 DNA 단편을 발현벡터 중의 프로모터 하류로 삽입하고, 이어서 전기 DNA를 삽입한 발현벡터를 발현벡터에 적당한 숙주세포 중에 도입한다.
숙주세포로서는 원핵생물, 효모, 동물세포, 곤충세포 등 목적하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 모두 이용할 수 있다.
발현벡터로서는 상기 숙주세포에서 독립복제가능하거나 염색체 중에 도입가능하고, 상기 목적하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다.
세균, 방선균 등의 원핵생물을 숙주세포로서 사용하는 경우 상기 DNA를 발현시키기 위한 발현벡터는 전기 원핵생물 중에서 독립복제 가능한 것과 동시에, 프로모터, 리보솜 결합서열, 상기 DNA 및 전사종결 서열로 구성된 재조합 벡터인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 좋다.
발현벡터로서는 예컨대, pBTrp2, pBTac1, pBTac2(모두 Boehringer Mannheim사 제), pKK233-2(Pharmacia사 제), pSE280(Invitrogen사 제), pGEMEX-1(Promega사 제), pQE-8(QIAGEN사 제), pQE-30(QIAGEN사 제), pKYP10(참조: 특개소 제 58-110600호), pKYP200(참조: Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)), pLSA1(참조: Agric. Biol. Chem., 53, 277(1989)), pGEL1(참조: Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 82, 4306(1985)), pBluescriptII SK+, pBluescriptII SK(-)(Stratagene사 제), pTrS30(FERM BP-5407), pTrS32(FERM BP-5408, pGEX(Pharmacia사 제), pET-3(Novagen사 제), pTerm2(참조: USP 제 4686191호, USP 제 4939094호, USP 제 5160735호), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pUC18(참조: Gene, 33, 103(1985)), pUC19(참조: Gene, 33, 103(1985)), pSTV28(보주조사 제), pSTV29(보주조사 제), pUC118(보주조사 제), pPA1(참조: 특개소 제 63-233798호), pEG400(참조: J. Bacteriol., 172, 2392(1990)), pQE-30(QIAGEN사 제), PHY300(보주사 제), pHW1520(MoBiTec사 제) 등을 예시할 수 있다.
프로모터로서는 숙주세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이어도 무관하다. 예컨대, trp프로모터(Ptrp), lac프로모터(Plac), PL프로모터, P R프로모터, PSE프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터, SP01프로모터, SP02프로모터, pen프로모터 등을 들 수 있다. 또한, Ptrp을 2개로 직렬시킨 프로모터(Ptrp×2), tac프로모터, letI프로모터, lacT프로모터와 같이 인위적으로 설계변형된 프로모터 등도 사용할 수 있다. 또한, 바실러스 속 세균 중에서 발현시키기 위한 xylA프로모터나 콜리네박테리움속 세균 중에서 발현시키기 위한 P54-1 프로모터 등도 사용할 수 있다.
리보솜 결합서열로서는 숙주세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 무관하지만, 샤인-달가노(Shing-Dalgarno) 서열과 개시코돈 사이를 적당한 거리(예컨대, 6 내지 18염기)로 조절한 플라즈미드를 사용하는 것이 바람직하다.
전사·번역을 효율적으로 행하기 위해서, L-세린디아미나제 활성을 갖는 단백질의 N-말단 또는 그의 일부를 결실한 단백질과 발현벡터를 암호화하는 단백질의 N-말단부분을 축합시킨 단백질을 발현시켜도 좋다.
목적하는 단백질의 발현에는 전사종결 서열이 반드시 필요한 것은 아니지만, 바람직하게는 구조 유전자 바로 아래의 전사 종결서열을 배치하는 것이 좋다.
숙주세포로는 에스케리키아(Escherichia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속, 세라티아(Serratia) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 알리시클로바실러스(Alicyclobacillus) 속, 아나바에나(Anabaena) 속, 아나시스티스(Anacystis) 속, 아트로박터(Arthrobacter) 속, 아조박터(Azobacter) 속, 크로마튬(Chromatium) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 메틸로박테리움(Methylobaterium) 속, 포르미디움(Phormidium) 속, 로도박터(Rhodobacter) 속, 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas) 속, 로도스피릴룸(Rhodospirillum) 속, 세네데스무스(Scenedesmus) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 시네코코커스(Synnechococcus) 속, 자이모모나스(Zymomonas) 속 등에 속하는 미생물을 들 수 있다.
예컨대, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Microbacterium ammoniaphilum, Serratia marcescens, Agrobacterium rhizogenes, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter nicotianae, Arthrobacter sulfureus, Arthrobacter ureafaciens, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Methylobacterium extorquens, Phormidium sp., Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces griseus, Zymomonas mobilis 등을 들 수 있다.
더욱 구체적으로는, Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene사 제), Escherichia coli XL2-Blue(Stratagene사 제), Escherichia coli DH1(몰레큘러 클로닝 제 2판, p505), Escherichia coli DH5α(동양방사 제), Escherichia coli MC1000[참조: Mol. Biol., 138, 179-207(1980)], Escherichia coli W1458(ATCC12345), Escherichia coli JM109(Stratagene사 제), Escherichia coli HB101(동양방사 제), Escherichia coli W3110(ATCC14948), Escherichia coli NM522(Stratagene사 제), Bacillus subtilis ATCC33712, Bacillus sp. FERM BP-6030, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium, saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14297, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Serratia marcescens, ATCC13880, Agrobacterium rhizogenes ATCC11325, Arthrobacter aurescens ATCC13344, Arthrobacter nicotianae ATCC15236, Arthorobacter sulfureus ATCC19098, Arthrobacter ureafaciens ATCC7562, Erwinia carotoyora ATCC15390, Erwinia herbicola ATCC21434, Methylobacterium extorquens DSM1337, Phormidium sp. ATCC29409, Rhodobacter sphaeroides ATCC21286, Rhodospirillum rubrum ATCC11170, Streptomyces aureofaciens ATCC10762, Streptomyces griseus ATCC10137, Zymomonas mobilis ATCC10988 등을 들 수 있다.
D-세린디아미나제 활성이 낮은 미생물 또는 D-세린디아미나제 활성을 결여한 미생물로는 예컨대, Escherichia coli ME5386주(국립유전원에서 입수가능)를 들 수 있다.
재조합 벡터의 숙주세포로의 도입방법으로는 숙주세포에 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것도 사용할 수 있다. 예컨대, 칼슘 이온을 사용하는 방법(참조: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110(1972)), 프로토플라스트법(참조: 특개소 제 63-248394호), 일렉트로포레이션법 또는 [Gene, 17, 107(1982)] 또는 [Molecular & General Genetics, 168, 111(1979)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
효모를 숙주세포로 사용하는 경우에는 발현벡터로서 예컨대, YEp13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 예시할 수 있다.
프로모터로서는 효모 중에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것도 무관하고, 예 컨대 PH05프로모터, PGK프로모터, GAP프로모터, ADH프로모터, gal 1프로모터, gal 10프로모터, 열충격 단백질 프로모터, MFa1 프로모터, CUP1 프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다.
숙주세포로서는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 트리코스포론(Trichosporon) 속, 슈와니오마이세스(Schwanniomyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 캔디다(Candida) 속 등에 속하는 미생물, 예컨대 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 플루란스(Trichosporon pullulans), 스와니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius), 캔디다 유틸리스(Candida utilis) 등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로서는 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것도 사용할 수 있고, 예컨대 일렉트로포레이션법(참조: Methods in Enzymol., 194, 182(1990)), 스페로플라스트법(참조: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929(1978)), 아세트산리튬법(참조: J. Bacteriol., 153, 163(1983)), [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929(1978)]에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.
동물세포를 숙주세포로 사용하는 경우에는 발현벡터로서 예컨대, pcDNAI, pcDM8(프나콘사 제), pAGE107(참조: 특개평 제3-22979호; Cytotechnology, 3, 133, (1990)), pAS3-3(참조: 특개평 제 2-227075호), pCDM8(참조: Nature, 329, 840, (1987)), pcDNAI/Amp(Invitrogen사 제), pREP4(Invitrogen사 제), pAGE103(참조: J. Biochem., 101, 1307(1987)), pAGE210 등을 예시할 수 있다.
프로모터로서는 동물세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것도 사용할 수 있고, 예컨대, 사이토메가로바이러스(인간 CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV 40의 초기 프로모터, 리트로바이러스의 프로모터, 메타로티오네이신프로모터, 열충격프로모터, SRα프로모터 등과 함께 사용해도 좋다.
숙주세포로서는 나말바 세포, HBT5637(참조: 특개소 제 63-000299호), COS1세포, COS7세포, CHO세포 등을 들 수 있다.
동물세포에 재조합 벡터를 도입하는 방법으로서는 동물세포에 DNA를 도입할 수 있는 방법이면 어느 것도 사용할 수 있고, 예컨대 일렉트로포레이션법(참조: Cytotechnology, 3, 133(1990)], 인산칼슘법(참조: 특개평 제2-227075), 리포펙션법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413(1987)), Virology, 52, 456(1973)에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 형질전환체의 수득 및 배양은 특개평 제 2-227075호 공보 또는 특개평 제 2-257891호 공보에 기재되어 있는 방법에 따라 행할 수 있다.
곤충세포를 숙주세포로 하여 사용하는 경우에는 예컨대, [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York(1992)], [커런트·프로토콜즈·인·몰레큘러·바이올로지-서플멘트, Bio/Technology, 6, 47(1988)] 등에 기재된 방법에 의해 단백질을 발현할 수 있다. 즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 배쿨로바이러스를 곤충세포에 동시도입하여 곤충 세포 배양 상청 중에서 재조합 바이러스를 수득한 후, 다시 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시켜 단백질을 발현시킬 수 있다.
전기 방법에 있어서, 사용되는 유전자 도입벡터로서는 예컨대, pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII(모두 Invitrogen사 제) 등을 들 수 있다.
배쿨로바이러스로서는 예컨대, 오토그래파 캘리포니아 뉴클리어 폴리히드로시스 바이러스(Autographa california nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.
곤충세포로서는 Spodopters frugiperda의 난소세포인 Sf 9, Sf 21(참조: Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)), Trichoplusia ni의 난소세포인 High5(Invitrogen사 제) 등을 이용할 수 있다.
재조합 바이러스를 조제하기 위한 곤충세포에 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 배큘로바이러스의 동시도입 방법으로서는 예컨대, 인산칼슘법(참조: 특개평 제2-227075호), 리포펙션법(참조: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413(1987)) 등을 들 수 있다.
유전자의 발현방법으로서는 직접발현 이외에 몰레큘러·클로닝 제 2판에 기재되어 있는 방법 등에 따라 분비생산, 축합 단백질 발현 등을 행할 수 있다.
효모, 동물세포 또는 곤충세포에 의해 발현시킨 경우에는 당 또는 당쇄가 부가된 단백질을 얻을 수 있다.
2. 변형된 미생물의 배양
상기 1에서 수득된 본 발명의 변형된 미생물을 배지에서 배양하는 방법은 숙주세포의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 본 발명의 변형된 미생물이 대장균 등의 원핵 미생물, 효모균 등의 진핵 미생물인 경우, 이들 미생물을 배양하는 배지는 전기 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면 천연 배지, 합성 배지 어느 것도 무관하다.
탄소원으로서는 각각의 변형된 미생물이 자화할 수 있는 것이면 좋고, 글루코즈, 프락토즈, 수쿠로즈, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류를 사용할 수 있다.
질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 각종 무기산이나 유기산의 암모늄염, 기타 함질소화합물 및 펩톤, 육질 엑기스, 효모 엑기스, 콘 스팁 리커, 카제인 가수분해물, 대두박, 대두박 가수분해물, 각종 발효균체 및 그의 소화물 등을 사용할 수 있다.
무기염으로서는 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산동, 탄산칼륨 등을 사용할 수 있다.
배양은 진탕배양 또는 심부통기교반배양 등의 호기적 조건하에서 행한다. 배양온도는 15 내지 50℃가 바람직하고, 배양시간은 통상 16시간 내지 7일간이다. 배양 중 pH는 3.0 내지 9.0으로 유지한다. pH의 조정은 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 좋다.
프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우에, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 좋다. 예컨대, lac 프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 등을, trp 프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우에는 인돌아크릴산(IAA) 등을, xylA 프로모터를 사용한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우에는 자일로스를 각각 배양에 첨가해도 좋다.
본 발명의 변형된 미생물이 동물세포인 경우, 전기 변형된 동물세포를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지(참조: The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), Eagle의 MEM 배지(참조: Science, 122, 501(1952)), DMEM 배지(참조: Virology, 8, 396(1959)), 199배지(참조: Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1(1950)) 또는 이 배지에 소의 태아혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6 내지 8, 30 내지 40℃, 5% CO2 존재 하 등의 조건에서 1 내지 7일간 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 좋다.
본 발명의 변형된 미생물이 곤충세포인 경우, 변형된 곤충세포를 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FM배지(PharMingen사 제), Sf-900II SFM 배지(GIBCO BRL사 제), ExCell400, ExCell405(모두 JRH Biosciences사 제), Grace's Insect Medium(참조: Grace, T.C.C., Nature, 195, 788(1962)) 등을 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6 내지 7, 25 내지 30℃ 등의 조건 하에서 1 내지 5일간 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가해도 좋다.
3. D-세린의 제조
DL-세린을 함유하는 배지 중에서 변형된 미생물을 DL-세린에 접촉시켜 L-세린을 분해시키고, 잔존한 D-세린을 전기 배지 중에서 수득하여 D-세린을 제조할 수 있다.
형질전환체 및 변이 미생물에서 L-세린디아미나제 활성증강 정도는 대장균(Escherichia coli) DH 5α주에 비해 증강될 필요가 있고, 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성보다 강할수록 좋지만, 바람직하게는 2배 이상, 더욱 바람직하게는 5배이상인 것이 바람직하다.
또한, D-세린디아미나제 활성이 낮거나 또는 전기 활성을 갖지 않는 주를 사 용하는 것에 의해 D-세린의 제조효율을 향상시킬 수 있다.
L-세린디아미나제 활성의 측정은 상기 1.(1)에 기술한 것과 같다.
이러한 미생물을 사용한 D-세린의 제조방법은 이하의 방법으로 행할 수 있다.
즉, 상기 방법으로 수득된 개량된 미생물 세포, 전기 세포의 배양물 또는 그들의 처리물(이하, '효소원'이라고 함)을 배지 중에서 DL-세린에 접촉시킨다.
세포 또는 전기 세포의 처리물로서는 세포의 건조물, 동결 건조물, 계면활성제 처리물, 효소 처리물, 초음파 처리물, 기계적 마쇄물, 용매 처리물 등의 세포 처리물, 배양물의 농축액, 과육물 등의 배양 처리물, 세포의 단백질 분획물, 세포 및 세포 처리물의 고정화물 또는 세포에서 수득된 정제효소 등을 들 수 있다.
변형된 미생물과 DL-세린의 접촉은 전기 변형된 미생물을 배양하는 배지에 미리 DL-세린을 첨가하는 방법을 사용해도 좋고, 배양 중에 DL-세린을 첨가하는 방법을 사용해도 좋다. 또한, 변형된 미생물을 배양하여 수득되는 효소원을 DL-세린을 함유하는 배지에 첨가해도 좋다.
변형된 미생물을 배양하는 배지 중에 DL-세린을 첨가하는 경우, DL-세린은 배지 1㎖ 당 1 내지 300mg, 바람직하게는 30 내지 100mg을 배양 개시 또는 도중에 첨가한다. 배양은 상기 (2)에 기술한 조건 하에서 행할 수 있다.
변형된 미생물에서 수득된 효소원과 DL-세린을 배지 중에서 접촉시키는 경우, 전기 효소원의 양은 해당 효소원의 비활성 등에 따라 다르다. 예컨대, 효소원으로서 전기 변형된 미생물 세포를 사용하는 경우, DL-세린 1mg당 습균체로서 5 내 지 1000mg, 바람직하게는 10 내지 400mg 첨가한다.
접촉반응은 20 내지 50℃에서 행하는 것이 바람직하고, 특히 25 내지 37℃에서 행하는 것이 바람직하다. 반응시간은 사용하는 효소원의 양 및 비활성 등에 따라 다르지만, 통상 2 내지 150시간, 바람직하게는 5 내지 60시간이다.
배지로서는 물 또는 수성배지, 유기용매 또는 물 또는 수성배지와 유기용매의 혼합액을 사용할 수 있다. 수성배지로서는 예컨대, 인산 완충액 HEPES(N-2-히드록시에틸피페라진-N-에탄술폰산)완충액, 트리스[트리스(히드록시메틸)아미노메탄]염산 완충액을 사용할 수 있다. 유기용매로서는 반응을 저해하지 않는 것이면 어느 것도 좋고, 예컨대, 아세톤, 아세트산에틸, 디메틸술폭시드, 크실렌, 메틸알콜, 에틸알콜, 부탄올 등을 사용할 수 있다.
DL-세린을 배지 중에 첨가하는 경우, DL-세린을 용해할 수 있는 물 또는 수성배지, 유기 매, 또는 물 또는 수성배지와 유기용매의 혼합액에 DL-세린을 용해하고, 배지 중에 첨가해도 좋고, 분말 또는 세립형태로 첨가해도 좋다.
반응배지에서 D-세린의 수득은 통상의 유기합성 화학에서 사용할 수 있는 방법, 예컨대 유기용매에서 추출, 결정화, 박층크로마토그래피, 고속액체크로마토그래피 등에 의해 행할 수 있다.
본 발명에 의해 수득된 D-세린의 확인 또는 정량방법은 D-세린을 확인 또는 정량할 수 있는 방법이면 어느 것도 사용할 수 있지만, 예컨대 13C-NMR 스펙트럼, 1H-NMR 스펙트럼, 매스 스펙트럼, 고속액체 크로마토그래피(HPLC) 등의 방법에 의해 행할 수 있다.
이하에서 본 발명의 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
1) L-세린디아미나제 유전자의 수득
대장균 W3110주 (ATCC14948)을 1백금이, 10㎖의 배지에 식균하고, 30℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양 후, 수득된 배양액에서 원심분리(3,000rpm, 10분간)에 의해 균체를 수득하였다. 전기 균체에서 통상(몰레큘러·클로닝 제 2판에 기재된 방법)에 따라 염색체 DNA를 단리정제하였다.
L-세린디아미나제를 암호화하는 유전자인 sdaA(참조: J. Bacteriol., 171, 5095-5102(1989))의 염기서열 정보를 기초로 센스 프라이머와 안티센스 프라이머의 조합인 서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 2종류의 프라이머, 염기서열 1 및 3의 염기서열을 갖는 2종류의 프라이머 및 sdaA와 동일하게 L-세린디아미나제를 암호화하는 유전자인 sdaB(참조: Eur. J. Biochem., 212, 777-784(1993))의 염기서열 정보를 기초로 서열번호 4 및 5의 염기서열을 갖는 2종류의 프라이머를 각각 DNA 합성기를 사용하여 합성하였다.
염색체 DNA을 주형으로서, 이러한 프라이머 pfu polymerase cloned(Stratagene사 제) 및 pfu polymerase 10 X Reaction Buffer(standard buffer)을 사용하여 DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer Japan사 제)에서 PCR을 행하였다.
PCR은 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초 내지 1분간, 72℃에서 2분간으로 이루어지는 반응공정을 1사이클로 하여 30사이클 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건하에서 행하였다. PCR에서 증폭된 DNA 단편은 모두 제한효소 HinⅢ와 제한효소 BamHI로 처리하였다. 처리 후 이러한 제한효소 처리 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동으로 처리하고, 각 제한효소로 처리된 DNA 단편을 수득하였다.
2) 재조합 DNA의 제조
암피실린 내성 유전자와 Trp 프로모터를 갖는 벡터 플라즈미드 pTrS30(FERM BP-5407에서 통상의 방법에 의해 추출)을 제한효소 HindⅢ 및 BamHI로 소화시킨 후, 아가로스 전기영동을 행하여 HindⅢ-BamHI처리 pTrS30 단편을 수득하였다.
상기에서 수득된 HindⅢ-BamHI처리 DNA 단편과 HindⅢ-BamHI처리 pTrS30 단편을 혼합한 후, 라이게이션 반응을 행하는 것에 의해 재조합 DNA를 수득하였다. 전기 재조합 DNA를 사용하여 대장균(Escherichia coli) DH 5α주(동양방사 제)를 통상의 방법에 따라 형질전환한 후, 전기 형질전환체를 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 LB 한천배지[박토트립톤(Difco사 제) 10g, 효모 엑기스(Difco사 제) 5g, NaCl 5g을 물 1리터에 넣고, pH 7.2로 조정하여 한천을 1.5%가 되도록 첨가한 배지]에 도포하여 30℃에서 1일간 배양하였다.
전기 배지상에서 생육한 형질전환체의 콜로니 수개씩을 암피실린 100㎍/㎖을 함유하는 LB 배지 10㎖에서 30℃로 1일간 배양하였다.
수득된 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하였고, 전기 균체로부터 통상의 방법에 의해 플라즈미드를 단리하였다.
HindⅢ-BamHI처리DNA 단편(서열번호 1 및 2의 염기서열을 갖는 2종류의 프라이머를 조합하여 PCR 증폭하여 수득되는 DNA 단편)과 HindⅢ-BamHI처리 pTrS30 단편을 연결하여 수득되는 플라즈미드를 pHIA1, HindⅢ-BamHI처리 DNA 단편(서열번호 1 및 3의 염기서열을 갖는 2종류의 프라이머를 조합하여 PCR 증폭하여 수득되는 DNA 단편)과 HindⅢ-BamHI처리 pTrS30 단편을 연결하여 수득되는 플라즈미드를 pHIA2, HindⅢ-BamHI처리 DNA 단편(서열번호 4 및 5의 염기서열을 갖는 2종류의 프라이머를 조합하여 PCR 증폭하여 수득되는 DNA 단편)과 HindⅢ-BamHI처리 pTrS30 단편을 연결하여 수득되는 플라즈미드를 pHIB1이라고 각각 명명하였다.
3) 형질전환체의 제조
이와 같이 하여 수득된 플라즈미드를 통상의 방법에 따라, 대장균(Escherichia coli) NM522(Stratagene사 제), 대장균(Escherichia coli) MM 294(ATCC33625) 및 D-세린디아미나제 활성을 결여한 대장균(Escherichia coli) ME5386주(국립유전원에서 입수)에 도입하였다.
이러한 균체 중, pHIA1을 보유하는 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIA1, pHIA2를 보유하는 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIA2 및 pHIB를 갖는 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIB는 부다페스트 조약에 따라 각각 FERM BP-7309, FERM BP-7310, FERM BP-7311로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센타: 일본국 305-8566 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1번지 1중앙 제 6(구: 공업기술원생명공학공업기술연구소: 일본국 305-8566 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1-3)에 2000년 9월 28일자로 기탁되었다.
실시예 2: L-세린디아미나제의 발현 및 D-세린의 제조
상기와 같이 하여 수득된 형질전환체 및 L-세린디아미나제 유전자를 함유하지 않는 플라즈미드 pTrS30을 갖는 대장균(Escherichia coli) DH 5α/pTrS30주를 암피실린 100㎍/㎖를 함유하는 LB 100㎖에서 30℃로 1일간 배양하였다. 수득된 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하고, 이것을 50mmol/ℓ의 인산 완충액(pH 7.5)에서 다시 현탁하고, 원심분리하여 수득되는 균체(습균체 중량 약 2g)을 반응에 사용하였다.
DL-세린을 50g/ℓ함유하는 인산 완충용액(pH 7.5)에서 상기의 균체를 현탁하고, 37℃에서 10시간 내지 22시간 반응을 행하였다.
반응 개시 후, 반응 중 및 반응종료 후에 반응액 중의 D-세린 및 L-세린의 농도를 HPLC에 의해 측정하였다.
HPLC의 조건은 아래와 같다:
컬럼: CRAWNPAK CR(+) (Daicel Chemical Industries, Ltd.)
이동층: 과염소산수용액(pH 1.0)
유속: 0.2㎖/분
컬럼 온도: 2℃
검출은 오르토프탈알데히드(OPA)를 사용한 포스트 컬럼 유도체화법(참조: J. Chromatogr., 33, 353-355(1973))을 사용하였다.
표 1에 결과를 나타내었다.
균체 플라스미드 반응시간 (1시간) L-세린총분해량(g/l) D-세린 농도(g/l) L-세린 농도(g/l) 상대활성
DH5α pTrS30 12 21 1.4 23.2 21.5 1.0
DH5α pHIB 12 21 19.8 24.9 0.0 14.1
NM522 PHIA1 11 21 21.6 23.7 0.0 16.8
ME5386 PHIA2 12 23.5 25.6 0.0 16.8
MM294 PHIA1 10 22 20.3 17.4
PHIA2 10 22 19.4 24.3 0.0 16.6
PHIB 10 22 8.5 7.3

반응개시 후, 10, 11 또는 12시간째의 반응액 중의 L-세린의 농도를 구하고, 반응을 개시한 때의 반응액 중 L-세린 농도와의 차이를 L-세린의 총분해량으로 나타내었다.
L-세린의 총 분해량을 반응 개시에서 시간(10, 11 또는 12)로 나눈 값을 L-세린디아미나제 활성으로 하고, 대장균(Escherichia coli) DH5α/pTrS30주의 L-세 린디아미나제 활성을 1.0으로 한 경우의 각 균체의 활성을 상대활성으로 하여 나타내었다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 대장균(Escherichia coli) ME5386/pHIA2주에 대해 반응개시 후 12시간 째, 대장균(Escherichia coli) DH5α/pHIB 주 및 대장균(Escherichia coli) NM522/pHIA1주에 대해 반응개시후 21시간 째, 대장균(Escherichia coli) NM294/pHIA2주에 대해 반응개시후 22시간 째의 L-세린 농도 및 D-세린 농도를 측정할 결과, 반응액 중의 L-세린 잔량은 0이고, D-세린만 잔존하였다.
본 발명에 의해 DL-세린으로부터 D-사이클로세린 등의 유용 의약품 합성 중간체 등으로 유용한 D-세린을 효과적으로 생산할 수 있다.
<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> PROCESS FOR PRODUCING D-SERINE <130> 11349WO1 <150> PCT/JP00/334751 <151> 2000-11-01 <160> 5 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 1 ccatcgataa gcttatgatt agtctattcg acatgtttaa gg 42 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 2 cgcggatcct ggggaatatt acagcagac 29 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 3 cgcggatcca gaagtattag tcacactgga c 31 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 4 cccaagctta tgattagcgt attcgatatt ttc 33 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 5 cgggatccat gagaaatcgg gaagaggc 28

Claims (12)

  1. 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성보다 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 L-세린디아미나제 유전자를 미생물에 도입하여 수득되는 미생물 세포, 전기 세포의 배양물 또는 그의 처리물을 DL-세린을 함유하는 배지 중에서 DL-세린에 접촉시켜 L-세린을 분해시키고, 잔존하는 D-세린을 전기 배지 중에서 수득하는 단계를 포함하는 D-세린의 제조방법.
  2. 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성보다 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 L-세린디아미나제 유전자를 미생물에 도입하여 수득되는 미생물을 DL-세린을 함유하는 배지 중에서 배양하여, 배지 중의 L-세린을 분해시키고, 배지 중에 잔존하는 D-세린을 수득하는 단계를 포함하는 D-세린의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    변형된 미생물의 L-세린디아미나제 활성은 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성에 비해 2배 이상인 것을 특징으로 하는
    D-세린의 제조방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    변형된 미생물의 L-세린디아미나제 활성은 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성에 비해 5배 이상인 것을 특징 으로 하는
    D-세린의 제조방법.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    L-세린디아미나제 유전자는 대장균 유래의 sdaA 유전자 또는 sdaB 유전자인 것을 특징으로 하는
    D-세린의 제조방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    변형된 미생물은 대장균에 속하는 미생물인 것을 특징으로 하는
    D-세린의 제조방법.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    L-세린디아미나제 유전자를 미생물에 도입하여 수득되는 미생물은 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIA1(FERM BP-7309), 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIA2(FERM BP-7310) 및 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIB(FERM BP-7311)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는
    D-세린의 제조방법.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    변형된 미생물은 D-세린디아미나제 활성이 낮거나 또는 활성을 갖지 않는 미생물인 것을 특징으로 하는
    D-세린의 제조방법.
  11. 대장균(Escherichia coli)에 속하고, 대장균(Escherichia coli) DH 5α주의 L-세린디아미나제 활성보다 높은 L-세린디아미나제 활성을 갖도록 L-세린디아미나제 유전자가 도입된 미생물.
  12. 제 11항에 있어서,
    미생물은 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIA1(FERM BP-7309), 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIA2(FERM BP-7310) 및 대장균(Escherichia coli) MM294/pHIB(FERM BP-7311)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는
    미생물.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2602320B1 (en) * 2004-10-13 2016-11-30 Mitsui Chemicals, Inc. DNA encoding novel enzyme having D-serine synthase activity, method of producing the enzyme and method of producing D-serine by using the same
JP5631534B2 (ja) 2005-11-29 2014-11-26 協和発酵バイオ株式会社 新規蛋白質および該蛋白質をコードするｄｎａ
CN101168513B (zh) * 2007-11-28 2012-06-27 上海化学试剂研究所 Dl-丝氨酸的制备方法
DE102010025124A1 (de) 2010-06-25 2011-12-29 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, Mikroorganismus, sowie Vektor
CN117736959B (zh) * 2024-01-26 2024-05-14 湖北大学 运动发酵单胞菌的工程菌株、制备方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998014602A2 (en) * 1996-09-30 1998-04-09 Nsc Technologies Llc Preparation of d-amino acids by direct fermentative means

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0591895A (ja) 1991-08-12 1993-04-16 Mitsubishi Petrochem Co Ltd Ｄ−セリンの製造法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998014602A2 (en) * 1996-09-30 1998-04-09 Nsc Technologies Llc Preparation of d-amino acids by direct fermentative means

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Bacteriology(1989) Vol.171.pp.5095-5102 *

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Publication number Publication date
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