JP2005052007A - アミダーゼ様酵素をコードする遺伝子及び当該遺伝子によってコードされる遺伝子産物 - Google Patents
アミダーゼ様酵素をコードする遺伝子及び当該遺伝子によってコードされる遺伝子産物 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】汎用的にアミド結合を加水分解、合成し得るアミダーゼ様酵素の提供、及び当該酵素の大量生産方法を提供することにある。
【解決手段】以下の(a)又は(ｂ)のDNAからなる遺伝子。(a)ストレプトミセス由来の特定な塩基配列からなることを特徴とするDNA。(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ様酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【選択図】 なし
【解決手段】以下の(a)又は(ｂ)のDNAからなる遺伝子。(a)ストレプトミセス由来の特定な塩基配列からなることを特徴とするDNA。(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ様酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNA。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有用な酵素をコードする遺伝子、当該遺伝子によってコードされる遺伝子産物、当該遺伝子を含む組換えベクター、当該組換えベクターを宿主細胞へ導入して得られる形質転換体、及び当該形質転換体を利用した有用な酵素の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミド類を加水分解して有機酸を製造するには、反応触媒として酸又はアルカリを用いて処理する化学合成法が知られている。近年、アミダーゼを含有する微生物を触媒として用いて、アミド類から有機酸を製造する微生物合成法が知られるようになった。この微生物法は、常温常圧で反応を行なうことができるとともに、エナンチオ選択的に反応を行なうことができるため、光学活性な有機酸類を製造する際に、広く用いられる方法である（特開昭６１−８８８９４号公報）。
現在、上述の方法を含め微生物合成法に従って、アミド結合を加水分解する種々の酵素が見出されてきており、その一部は、いくつかの抗生物質の工業規模での物質生産に適用されている。例えば、ペニシリンＧやペニシリンＶといった天然のペニシリンの側鎖アミド結合を酵素（ペニシリンアミダーゼ）で加水分解することにより、６−アミノペニシラン酸が調整される。続いて、６−アミノペニシラン酸の６位のアミノ基に種々の物質を付加することによりペニシリン誘導体が合成されている。
【０００３】
【（非）特許文献１】
特開昭６１−８８８９４号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、放射菌由来の酵素に関して研究が殆どなされていない。
したがって、これら放射菌由来の有用な酵素及びこれをコードする遺伝子を見出すことができれば、当該酵素の大量生産や更なる高機能を有する変異酵素の調整が容易となるので、医薬品製造や機能性食品素材製造の分野において有意義である。
【０００５】
また、これまで、ペニシリンＧやペニシリンＶあるいはアンピシリンなどに対する酵素が数多く見出されているが、汎用的にアミド結合を加水分解、合成する有用な酵素は、これまで知られていない。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、汎用的にアミド結合を加水分解、合成し得るアミダーゼ様酵素の提供、及び当該酵素の大量生産方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、発明者らは、ペニシリンなどのβ―ラクタム系抗生物質の側鎖アミド結合、Ｎ−ａｃｙｌ−Ｌ−ｐｅｐｔｉｄｅのＮ−ａｃｙｌ基、Ｚ−Ｌ‐ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓのアミド結合、およびカプサイシンのアミド結合など種々のアミド結合を特異的、かつ、効率的に加水分解ならびにその誘導体を合成する能力を有する優れた新規な酵素及び当該酵素をコードする遺伝子を見出すに至った。
【０００８】
本発明の遺伝子は、アミダーゼ様酵素をコードすることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の遺伝子の好ましい態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１示す、塩基配列１−２４４５で示される塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ様酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の遺伝子の好ましい態様において、アミダーゼ様酵素活性が、カプサイシン分解合成酵素活性、並びに、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、及びアンピシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質の側鎖アミド結合の分解合成酵素活性、Ｎα−アシル−Ｌ−アミノ酸、Ｎα−アシル−Ｌ−ペプチドのＮα−アシル基、Ｎε−アシル−Ｌ−Ｌｙｓの側鎖アミド結合の分解合成酵素活性、Ｚ−Ｌ−アミノ酸のアミド結合の分解合成酵素活性からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明のポリペプチドは、上記いずれかに記載の遺伝子にコードされることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸配列番号１ー８１４で示されるアミノ酸配列、（ｂ）アミダーゼ様酵素活性を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、（ａ）配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１ー１７３で示されるアミノ酸配列、（ｂ） （ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。からなることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号４に示す、アミノ酸配列番号１ー５７０で示されるアミノ酸配列、（ｂ） （ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号５に示す、アミノ酸配列番号１ー４３で示されるアミノ酸配列、（ｂ） アミダーゼ様酵素前駆体ポリペプチドの細胞膜通過を誘導する機能を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の組換えベクターは、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子を含むことを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の形質転換体は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子又は請求項９記載の組換えベクターを宿主細胞へ導入して得られることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、宿主細胞が、アミダーゼ様酵素生産菌株であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、アミダーゼ様酵素生産菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明のアミダーゼ様酵素の生産方法は、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にアミダーゼ様酵素を生成蓄積させ、当該培養物から当該酵素を採取することを特徴とする。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明は、アミダーゼ様酵素をコードする遺伝子群のＤＮＡ配列に関わる。アミダーゼ様酵素とは、ペニシリンなどのβ―ラクタム系抗生物質の側鎖アミド結合、Ｎ−ａｃｙｌ−Ｌ−ｐｅｐｔｉｄｅのＮ−ａｃｙｌ基、Ｚ−Ｌ‐ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓのアミド結合、およびカプサイシンのアミド結合など種々のアミド結合を特異的、かつ、効率的に加水分解し、又は合成する能力を有する酵素を広く意味する。当該アミダーゼ様酵素は、また、下記（１）〜（３）の理化学的性質を有する。すなわち、（１）作用及び基質特異性カプサイシンの分解反応又は合成反応を触媒する。（２）至適温度の範囲 ５５℃近傍である。（３）至適ｐＨの範囲 ７〜８である。また、本発明の分解合成酵素の分子量は、およそ４５ｋＤａ〜６０ｋＤａの間にある。
【００２３】
また、好ましい態様において、本発明の遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）、すなわち、（ａ）配列表の配列番号１示す、塩基配列１−２４４５で示される塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ様酵素活性を有するポリペプチドを コードするＤＮＡ、からなる。本発明の遺伝子は、アミダーゼ様酵素を発現し得る。また、本発明の遺伝子は、アミダーゼ様酵素活性を有する類似タンパク質を探索するプローブとしても使用することができる。
【００２４】
本発明の遺伝子を得るには、まず、放線菌株より、ＲＮＡを抽出し、アフィニティークロマトグラフィーなどの常法を用いて該ＲＮＡからｍＲＮＡを精製することから始まる。
【００２５】
得られたｍＲＮＡを逆転写酵素で逆転写することによりｃＤＮＡを得ることができる。当該ｃＤＮＡから目的とするタンパク質を発現し得る遺伝子をスクリーニングするには、例えば、短時間に探索することができるという観点から、ＰＣＲ法等の増幅法を利用するのが好ましい。
【００２６】
ＰＣＲ法に用いるプライマーは、既知のアミダーゼ様酵素の配列を参考にして設計、合成することができる。また、アミダーゼ様酵素活性を有する精製酵素のＮ末端アミノ酸配列等の当該精製酵素の一部又は全部をプライマーとして用いることができる。逆転写酵素により得たｃＤＮＡを鋳型として上記プライマーにより、目的とするｃＤＮＡ断片を増幅することができる。
【００２７】
目的とするｃＤＮＡの配列決定は、ターミネータ法等の常法を利用して行うことができる。
【００２８】
また、遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行うことにより、天然の遺伝子と同様の或いは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明は、そのような変異遺伝子を含むものである。
【００２９】
すなわち、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列において１０個以下、好ましくは７個以下、更に好ましくは３個以下の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列を有する遺伝子である。また、そのような遺伝子は、配列表の配列番号１に示す遺伝子と９０％以上、好ましくは、９５％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号１に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。こうした遺伝子もアミダーゼ様酵素活性を有する限り、本発明の遺伝子に含まれる。
【００３０】
上述の方法で取得したＤＮＡ及びＤＮＡ断片を用いて、常法により本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡを含む折後ヌクレオチドを調製することができる。上述のように得られたＤＮＡ配列情報をもとに、ＤＮＡ合成機により、当該オリゴヌクレオチドを合成することができる。当該オリゴヌクレオチドを、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）及び塩基数が極端に変わることがないオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３１】
また、本発明においては、アミダーゼ様酵素活性が、カプサイシン分解合成酵素活性、、並びに、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、及びアンピシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質の側鎖アミド結合の分解合成酵素活性、Ｎα−アシル−Ｌ−アミノ酸、Ｎα−アシル−Ｌ−ペプチドのＮα−アシル基、Ｎε−アシル−Ｌ−Ｌｙｓの側鎖アミド結合の分解合成酵素活性、Ｚ−Ｌ−アミノ酸のアミド結合の分解合成酵素活性からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００３２】
また、本発明のポリペプチドは、上記本発明のいずれかの遺伝子にコードされる。当該遺伝子にコードされたポリペプチドは、それ自体アミダーゼ様酵素活性を有するか、有しない場合であっても、アミダーゼ様酵素及び／又はその類似体を探索するプローブとしても使用することができる。
【００３３】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸配列番号１ー８１４で示されるアミノ酸配列、（ｂ）アミダーゼ様酵素活性を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなる。
【００３４】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、（ａ）配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１ー１７３で示されるアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなる。なお、当該配列番号３に示すポリペプチドは、配列番号２に示すポリペプチドからなるアミダーゼ様酵素のαサブユニット部分に相当する。配列番号３に示すポリペプチドは、当該アミダーゼ様酵素のリンカー部分を分解する機能を有すると推定される。
配列番号３に示すポリペプチドは、また、本発明に係る遺伝子又はポリペプチドをスクリーニングする際に、プローブとして使用することが可能である。
【００３５】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号４に示す、アミノ酸配列番号１ー５７０で示されるアミノ酸配列、（ｂ） （ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなる。なお、当該配列番号４に示すポリペプチドは、配列番号２に示すポリペプチドからなるアミダーゼ様酵素のβサブユニット部分に相当する。配列番号４に示すポリペプチドは、、本発明に係る遺伝子又はポリペプチドをスクリーニングする際に、プローブとして使用することが可能である。
【００３６】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号５に示す、アミノ酸配列番号１ー４３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ） アミダーゼ様酵素前駆体ポリペプチドの細胞膜通過を誘導する機能を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド、からなる。アミダーゼ様酵素のシグナルペプチドとしての意義を有する。当該シグナルペプチドは、アミダーゼ様酵素前駆体ポリペプチドの細胞膜通過を誘導する機能を有する。アミダーゼ楊酵素ポリペプチド前駆体が、細胞膜通過時にシグナルペプチドが切断され、さらに膜通過後に、リンカーペプチドが削除されることにより、αサブユニットとβサブユニットが生じ、最後にこの２つのサブユニットが会合して酵素タンパク質となり、細胞壁を通過し、分泌されると考えられる。
【００３７】
ここで、アミノ酸配列の一部が、欠失、置換若しくは付加されたものを含めたのは、このようなアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、アミダーゼ様酵素活性を有するものがあり、アミダーゼ様酵素活性を有する限り本発明に含まれると考えられるからである。
【００３８】
また、本発明のポリペプチドにおいては、アミノ酸配列を、化学的又は物理的に修飾して得られるポリペプチドであっても、アミダーゼ様酵素活性を有する限り、本発明のポリペプチドに含まれる。化学的又は物理的修飾の例としては、メチル化、アミド化などのＮ末端修飾、Ｃ末端修飾等を挙げることができる。これらの修飾を常法に従って行うことができる。
【００３９】
次に、本発明の組換えベクターについて説明する。本発明の組換えベクターは、上記本発明の遺伝子を含むことができる。すなわち、アミダーゼ様酵素をコードする遺伝子、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子、又は当該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アミダーゼ様酵素活性を有する遺伝子を含むことができる。アミダーゼ様酵素活性とは、上述の本発明の遺伝子の項で説明したものをそのまま用いることができる。
【００４０】
次に、本発明の形質転換体は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子又は請求項９記載の組換えベクターを宿主細胞へ導入して得られる。
【００４１】
ここで、宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００４２】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチド遺伝子発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４３】
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＱＥ−９（キアゲン社製）、ｐＱＥ−７０（キアゲン社製）、ｐＱＥ−６０（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＥＴ−１１ａ（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４８， ６６９ （１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ２７７ （１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８２， ４３０６ （１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒＳ３２〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ， ３３， １０３ （１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＫＣ３０（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９８３，ｉｎ ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，” Ｖｏｌ． １０１， ｐｐ． １２３−１３８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）、ｐＤＲ５４０（ファルマシア社製）、ｐＲＩＴ２Ｔ（ファルマシア社製）、ｐｔｒｃ９９ａ〔Ｇｅｎｅ， ６９， ３０１（１９８８）〕、等を例示することができる。
【００４４】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４５】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００４６】
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａ ｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｄ−０１１０等をあげることができる。
【００４７】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ６９， ２１１０ （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２号公報）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １６， ６１２７ （１９８８）〕等をあげることができる。
【００４８】
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＧ−１、ｐＸＴ１（ストラタジーン社製）、ｐＳＧ５（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（ファルマシア社製）、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ（ファルマシア社製）、ｐＳＶＬ ＳＶ４０（ファルマシア社製）等を用いることができる。
【００４９】
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００５０】
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ等をあげることができる。組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４， １８２ （１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８１， ４８８９ （１９８４）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３， １６３ （１９８３）〕、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
７５， １９２９ （１９７８）等をあげることができる。
【００５１】
また、動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９号公報）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ， ３２９， ８４０ （１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， １０１， １３０７ （１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。
【００５２】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００５３】
また、宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
【００５４】
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ： ＣＲＬ−１５７３）、２９３等、ヒト白血病細胞としては、ＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
【００５５】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３， １３３ （１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， ７４１３ （１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２， ４５６ （１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
【００５６】
また、昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６， ４７ （１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
【００５７】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００５８】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ） 等を用いることができる。
【００５９】
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ Ｎ４等をあげることができる。
【００６０】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， ７４１３ （１９８７）〕等をあげることができる。
【００６１】
また、植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
【００６２】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等をあげることができる。
【００６３】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。 酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
【００６４】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、宿主細胞が、アミダーゼ様酵素生産菌株である。好ましくは、アミダーゼ様酵素生産菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物であり、また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２であることが好ましい。これは、これらの微生物が、本発明のアミダーゼ様酵素の生産性が高いという観点からである。
【００６５】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にアミダーゼ様酵素を生成蓄積させ、当該培養物から当該酵素を採取することができる。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行なうことができる。
【００６６】
また、形質転換体を培養する培地としては、該生物が質化し得る炭素原、窒素原、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行なえる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６７】
培養の形態としては、液体培養、固体培養等を挙げることができ、いずれも適用可能である。工業的に有利に培養するために、振盪培養、通気攪拌培養等を行なっても良い。
【００６８】
培地の栄養原としては、特に限定されることはなく、微生物の培養に通常用いられる炭素原、窒素源等を挙げることができる。炭素源としては、酵母エキス、グリセリン、グルコースなどを、または窒素源としては、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機窒素化合物を挙げることができる。その他、無機塩類、例えば、食塩、リン酸塩類、硫酸塩類、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛などの金属塩類を適宜培地に加えても良い。培養温度、培養時間等の培養条件について、使用する微生物の発育に適し、かつ本発明の分解合成酵素の生産が最高になるような条件を適宜選択する。例えば、培地のｐＨは、中性、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは７．０近傍である。また、放線菌の生育温度は一般的には２８〜３７℃である。これらの菌体の好ましい培養温度としては２８〜３２℃の範囲である。特に、ＩＦＯでは、以下に述べるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２の２つの菌株の培養温度として２８℃を推奨している。
【００６９】
このようにして得られた培養物から本発明アミダーゼ様酵素を得るには、代謝産物を採取するのに通常用いられる方法を適宜利用することができる。例えば、当該分解合成酵素と不純物との溶解度の差を利用する方法、親和力を利用する方法、分子量の差を利用する方法等を、単独又は組み合わせて、あるいは反復して使用することができる。例えば、本発明の分解合成酵素は、微生物の体外に分泌されるので、微生物の培養を行ない、培溶液から濾過、あるいは遠心分離によって微生物を取り除いた培養上清を得、この培養上清から硫酸アンモニウムを用いた塩析、各種のイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を組み合わせて本発明の分解合成酵素を精製すればよい。
【００７０】
また、本発明のアミダーゼ様酵素は、上述のようにＤＮＡ、ポリペプチドを利用して、大量に生産可能であるが、本来以下のようなアミダーゼ様酵素生産菌から、精製することができる。以下、アミダーゼ様酵素の入手方法について説明する。
【００７１】
アミダーゼ様酵素の生産菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物を用いることができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 属に属する微生物の菌学的性質としては、真正法線菌に属し、菌糸状の状態で生育するグラム陽性（グラム染色性が陽性）の偏性好気性菌であることが挙げられる。
【００７２】
アミダーゼ様酵素の生産性が高いという観点から、微生物としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２であることが好ましい。
【００７３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２は、大阪の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）より入手可能であり、ＩＦＯ １３８１９、 ＩＦＯ １３４２２は、ＩＦＯの寄託番号を示す。
【００７４】
なお、ＩＦＯ１３８１９は、他の微生物保存期間にも同一菌株が寄託されており、理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）ではＪＣＭ４１６８、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ではＡＴＣＣ２９０３２、同じく米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＲＲＬ）ではＮＲＲＬ Ｂ−３７２９である。また、ＩＦＯ １３４２２は、同一菌株がＡＴＣＣではＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ ２７４４６である。
【００７５】
アミダーゼ様酵素の生産方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属し、カプサイシン分解合成酵素を生産する能力を有する微生物を、通常の方法で培養し、その培養液から前記アミダーゼ様酵素を採取すればよい。また、上記微生物の自然的又は人工的変異株の培養物から、アミダーゼ様酵素を採取してもよい。
【００７６】
培地の条件、培養の形態、栄養源等については、上記形質転換体で述べたものを、アミダーゼ様酵素を精製する過程において、そのまま適用することができる。
【００７７】
なお、採取したアミダーゼ様酵素から、免疫スクリーニング法を利用しても、当該酵素を構成する塩基配列、アミノ酸配列を算出することができる。
【００７８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００７９】
実施例１
＜アミダーゼ様酵素の精製＞
まず、アミダーゼ様酵素が菌体内と菌体外のどちらに多く含まれているかを調べた。菌体を超音波破砕して得た溶液と、培養上清について活性測定したところ、菌体外の比活性は培養日数と共に増加するが、菌体内の活性は培養６日間で殆ど見られなくなった。よって、本菌株の産生するアミダーゼ様酵素は効率よく菌体外に分泌されていると考えられる。
【００８０】
ついで、アミダーゼ様酵素活性の高いもの選別する目的で、種々のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．についてスクリーニングを行った。スクリーニング方法は以下の通りである。ここでは、アミダーゼ様酵素活性能を調べるのに、カプサイシンを基質として用いた。
【００８１】
培地は４％ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ、２％ｐｏｌｙＰｅｐｔｏｎ等を用いて精製し、初期ｐＨ７．０、振盪速度１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ、温度３０℃で７日間培養を行った。活性については、０．１３ｍＭカプサイシンを基質として、３７℃でインキュベート後にＨＰＬＣ測定を行った。なお、酵素活性１Ｕは、１μｍｏｌのカプサイシンを３７℃、１時間で加水分解するのに必要な酵素量として定義した。その結果、Ｓ，ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９の活性が１．２（Ｕ／ｍＬ）、Ｓ．ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２の活性が１．０（Ｕ／ｍＬ）と相対的に高い活性を示した。ただし、Ｓ．ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉはＡＴＣＣによる分類ではＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓに分類されている。
【００８２】
これらの知見から、菌株としてＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９を用いて、培養を行った。可溶性澱粉２．０％、ポリペプトン２．０％、肉エキス４．０％、酵母エキス０．２％、リン酸水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．１％からなるｐＨ７の液体培地にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９の胞子懸濁液を接種し、３０℃で７日間培養した。
【００８３】
その後、酵素を培養上清に終濃度５０％になるように硫酸アンモニウムを加え、硫安沈澱を行った。得られた沈澱をバッファーに溶解後、ＣＭ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０で分画し、さらに二回ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
【００８４】
ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０カラムクロマトグラフィーで溶出させた際、タンパク質濃度はＯＤ２８０で、カプサイシン（ＣＡＰ）加水分解活性は加水分解率で表した。活性分画は、ＮａＣｌ濃度４００ｍＭ付近で溶出した。この活性分画をヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画して活性分画を得た（図２（ａ））が、不純なタンパク質の混在が認められたため、この活性分画を再度ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画した。その結果、図２（ｂ）に示すように、リン酸濃度３５０ｍＭ付近で精製酵素を得た。
【００８５】
このようにして、遠心除菌して当該酵素を含む上清を得た。ついで、得られた上清についての活性を調べた。その結果、上清０．６Ｌ中の当該酵素の総活性は３４５Ｕ、比活性は０．０６１ Ｕ／ｍｇであった。ここで、酵素活性１Ｕは、３７℃、１時間で１μｍｏｌのカプサイシンを加水分解する酵素量であった。この上清に５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して沈澱画分を得た後、陽イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（２回）を行なうことにより、比活性は１９７．０ Ｕ／ｍｇとなり（表１）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に（分子量約６０ｋＤａ）に精製された酵素が得られた（図１）。
【００８６】
【表１】
【００８７】
なお、この比活性はこれまでに報告されているカプサイシン分解活性を有する諸酵素に比べると非常に高い値であった。
【００８８】
実施例２
次に、実施例１で得られた精製酵素をコードする遺伝子、アミノ酸配列の特定を試みた。
【００８９】
まず、ペプチドシクエンサーを用いて精製酵素のＮ末端アミノ酸配列２４残基を決定した。一方、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ菌体から全ＤＮＡを抽出し、種々の制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を調製した。決定されたＮ末端ペプチドの部分配列に相当する２種類のＤＮＡ塩基配列をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行い、プローブとハイブリッドを形成するＤＮＡ断片をゲルから抽出した。抽出したＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクタ−に挿入し、ミニライブラリーを作成後、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換された大腸菌ライブラリーの中から、コロニーハイブリダイゼーション法によりプローブとハイブリダイズするポジティブクローンを選択し、インサートＤＮＡの塩基配列ＤＮＡシーケンサーにより決定した。１回のクローニング作業では、本酵素のＯＲＦを決定できなかったので、順次適当なプライマーを用いて全ＯＲＦを含むＤＮＡ断片をクローニングし、塩基配列を決定した。さらに、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥとＳＤＳ存在下のＨＰＬＣの結果及びＨＰＬＣで単離されたタンパク質のＮ末端及びＣ末端ペプチドのアミノ酸配列と上記で決定された本酵素のＯＲＦの全塩基配列に基づいて、本酵素のサブユニット構造並びにサブユニットのアミノ酸配列を決定した。
【００９０】
その結果、本酵素遺伝子のＯＲＦの全塩基数は、２４４５ｂｐからなり（図３）、８１４アミノ酸残基であることが判明した。
【００９１】
さらに遺伝子産物は、４３アミノ酸残基（１２９塩基のＤＮＡ）からなるシグナルペプチド、１７３アミノ酸残基（４８９塩基のＤＮＡ）からなる小サブユニット（αサブユニット）、２８アミノ酸残基（８４塩基のＤＮＡ）からなるリンカーペプチド、及び５７０アミノ酸残基（１７１３塩基のＤＮＡ）からなる大サブユニット（βサブユニット）から構成されていることが判明した。さらに、大サブユニットのＮ末端はアミノ酸セリンであった。既存のペニシリンアシラーゼファミリーに属する酵素はすべてセリンが活性発現に関わるアミノ酸であることから本酵素においても大サブユニットのＮ末端のセリンが活性中心であることが示唆された（図４）。遺伝子産物は、翻訳後にシグナルペプチドとリンカーペプチドが除去されて、αサブユニットとβサブユニットからなる二量体タンパク質として分泌され、このタンパク質がアミダーゼ様酵素の実態（図５）であることが示された。
【００９２】
【発明の効果】
本発明によれば、大量生産が容易で、なおかつ高収率で、安定したカプサイシン類を合成するのに有用なアミダーゼ様酵素を提供し得るという有利な効果を奏する。
【００９３】
また、本発明によれば、本発明にかかる遺伝子を用いることによって、酵素の大量生産や、更なる高機能性を有する変異酵素の調製が容易となるので、医薬品製造や機能性食品素材製造の分野において有意義であるという有利な効果を奏する。
【００９４】
また、本発明の遺伝子から得られる遺伝子産物によれば、ペニシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質やＮ‐アシル‐Ｌ−アミノ、Ｎ‐アシル−Ｌ−ペプチド、Ｚ−Ｌ−アミノ酸、及びカプサイシンなどアミド結合を有する多種多様な物質を効率よく加水分解、合成することができるという有利な効果を奏する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例である精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。（ａ）が１回目、（ｂ）が２回目を示す。
【図３】アミダーゼ様酵素の塩基配列の一例を示す。
【図４】アミダーゼ様酵素前駆体のアミノ酸配列の一例を示す。
【図５】アミダーゼ様酵素のアミノ酸配列の一例を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、有用な酵素をコードする遺伝子、当該遺伝子によってコードされる遺伝子産物、当該遺伝子を含む組換えベクター、当該組換えベクターを宿主細胞へ導入して得られる形質転換体、及び当該形質転換体を利用した有用な酵素の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミド類を加水分解して有機酸を製造するには、反応触媒として酸又はアルカリを用いて処理する化学合成法が知られている。近年、アミダーゼを含有する微生物を触媒として用いて、アミド類から有機酸を製造する微生物合成法が知られるようになった。この微生物法は、常温常圧で反応を行なうことができるとともに、エナンチオ選択的に反応を行なうことができるため、光学活性な有機酸類を製造する際に、広く用いられる方法である（特開昭６１−８８８９４号公報）。
現在、上述の方法を含め微生物合成法に従って、アミド結合を加水分解する種々の酵素が見出されてきており、その一部は、いくつかの抗生物質の工業規模での物質生産に適用されている。例えば、ペニシリンＧやペニシリンＶといった天然のペニシリンの側鎖アミド結合を酵素（ペニシリンアミダーゼ）で加水分解することにより、６−アミノペニシラン酸が調整される。続いて、６−アミノペニシラン酸の６位のアミノ基に種々の物質を付加することによりペニシリン誘導体が合成されている。
【０００３】
【（非）特許文献１】
特開昭６１−８８８９４号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、放射菌由来の酵素に関して研究が殆どなされていない。
したがって、これら放射菌由来の有用な酵素及びこれをコードする遺伝子を見出すことができれば、当該酵素の大量生産や更なる高機能を有する変異酵素の調整が容易となるので、医薬品製造や機能性食品素材製造の分野において有意義である。
【０００５】
また、これまで、ペニシリンＧやペニシリンＶあるいはアンピシリンなどに対する酵素が数多く見出されているが、汎用的にアミド結合を加水分解、合成する有用な酵素は、これまで知られていない。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、汎用的にアミド結合を加水分解、合成し得るアミダーゼ様酵素の提供、及び当該酵素の大量生産方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するために、発明者らは、ペニシリンなどのβ―ラクタム系抗生物質の側鎖アミド結合、Ｎ−ａｃｙｌ−Ｌ−ｐｅｐｔｉｄｅのＮ−ａｃｙｌ基、Ｚ−Ｌ‐ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓのアミド結合、およびカプサイシンのアミド結合など種々のアミド結合を特異的、かつ、効率的に加水分解ならびにその誘導体を合成する能力を有する優れた新規な酵素及び当該酵素をコードする遺伝子を見出すに至った。
【０００８】
本発明の遺伝子は、アミダーゼ様酵素をコードすることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の遺伝子の好ましい態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１示す、塩基配列１−２４４５で示される塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ様酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、からなることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の遺伝子の好ましい態様において、アミダーゼ様酵素活性が、カプサイシン分解合成酵素活性、並びに、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、及びアンピシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質の側鎖アミド結合の分解合成酵素活性、Ｎα−アシル−Ｌ−アミノ酸、Ｎα−アシル−Ｌ−ペプチドのＮα−アシル基、Ｎε−アシル−Ｌ−Ｌｙｓの側鎖アミド結合の分解合成酵素活性、Ｚ−Ｌ−アミノ酸のアミド結合の分解合成酵素活性からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明のポリペプチドは、上記いずれかに記載の遺伝子にコードされることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸配列番号１ー８１４で示されるアミノ酸配列、（ｂ）アミダーゼ様酵素活性を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、（ａ）配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１ー１７３で示されるアミノ酸配列、（ｂ） （ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。からなることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号４に示す、アミノ酸配列番号１ー５７０で示されるアミノ酸配列、（ｂ） （ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなることを特徴とする。
【００１５】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号５に示す、アミノ酸配列番号１ー４３で示されるアミノ酸配列、（ｂ） アミダーゼ様酵素前駆体ポリペプチドの細胞膜通過を誘導する機能を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明の組換えベクターは、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子を含むことを特徴とする。
【００１７】
また、本発明の形質転換体は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子又は請求項９記載の組換えベクターを宿主細胞へ導入して得られることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、宿主細胞が、アミダーゼ様酵素生産菌株であることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、アミダーゼ様酵素生産菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明のアミダーゼ様酵素の生産方法は、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にアミダーゼ様酵素を生成蓄積させ、当該培養物から当該酵素を採取することを特徴とする。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明は、アミダーゼ様酵素をコードする遺伝子群のＤＮＡ配列に関わる。アミダーゼ様酵素とは、ペニシリンなどのβ―ラクタム系抗生物質の側鎖アミド結合、Ｎ−ａｃｙｌ−Ｌ−ｐｅｐｔｉｄｅのＮ−ａｃｙｌ基、Ｚ−Ｌ‐ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓのアミド結合、およびカプサイシンのアミド結合など種々のアミド結合を特異的、かつ、効率的に加水分解し、又は合成する能力を有する酵素を広く意味する。当該アミダーゼ様酵素は、また、下記（１）〜（３）の理化学的性質を有する。すなわち、（１）作用及び基質特異性カプサイシンの分解反応又は合成反応を触媒する。（２）至適温度の範囲 ５５℃近傍である。（３）至適ｐＨの範囲 ７〜８である。また、本発明の分解合成酵素の分子量は、およそ４５ｋＤａ〜６０ｋＤａの間にある。
【００２３】
また、好ましい態様において、本発明の遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）、すなわち、（ａ）配列表の配列番号１示す、塩基配列１−２４４５で示される塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ、（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ様酵素活性を有するポリペプチドを コードするＤＮＡ、からなる。本発明の遺伝子は、アミダーゼ様酵素を発現し得る。また、本発明の遺伝子は、アミダーゼ様酵素活性を有する類似タンパク質を探索するプローブとしても使用することができる。
【００２４】
本発明の遺伝子を得るには、まず、放線菌株より、ＲＮＡを抽出し、アフィニティークロマトグラフィーなどの常法を用いて該ＲＮＡからｍＲＮＡを精製することから始まる。
【００２５】
得られたｍＲＮＡを逆転写酵素で逆転写することによりｃＤＮＡを得ることができる。当該ｃＤＮＡから目的とするタンパク質を発現し得る遺伝子をスクリーニングするには、例えば、短時間に探索することができるという観点から、ＰＣＲ法等の増幅法を利用するのが好ましい。
【００２６】
ＰＣＲ法に用いるプライマーは、既知のアミダーゼ様酵素の配列を参考にして設計、合成することができる。また、アミダーゼ様酵素活性を有する精製酵素のＮ末端アミノ酸配列等の当該精製酵素の一部又は全部をプライマーとして用いることができる。逆転写酵素により得たｃＤＮＡを鋳型として上記プライマーにより、目的とするｃＤＮＡ断片を増幅することができる。
【００２７】
目的とするｃＤＮＡの配列決定は、ターミネータ法等の常法を利用して行うことができる。
【００２８】
また、遺伝子組み換え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変化させることなく、人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供される天然の塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行うことにより、天然の遺伝子と同様の或いは改善された特性を有するものとすることが可能であり、本発明は、そのような変異遺伝子を含むものである。
【００２９】
すなわち、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号１に示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配列番号１に示す塩基配列において１０個以下、好ましくは７個以下、更に好ましくは３個以下の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列を有する遺伝子である。また、そのような遺伝子は、配列表の配列番号１に示す遺伝子と９０％以上、好ましくは、９５％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。また、当該遺伝子は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号１に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。こうした遺伝子もアミダーゼ様酵素活性を有する限り、本発明の遺伝子に含まれる。
【００３０】
上述の方法で取得したＤＮＡ及びＤＮＡ断片を用いて、常法により本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡを含む折後ヌクレオチドを調製することができる。上述のように得られたＤＮＡ配列情報をもとに、ＤＮＡ合成機により、当該オリゴヌクレオチドを合成することができる。当該オリゴヌクレオチドを、センスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）及び塩基数が極端に変わることがないオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００３１】
また、本発明においては、アミダーゼ様酵素活性が、カプサイシン分解合成酵素活性、、並びに、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、及びアンピシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質の側鎖アミド結合の分解合成酵素活性、Ｎα−アシル−Ｌ−アミノ酸、Ｎα−アシル−Ｌ−ペプチドのＮα−アシル基、Ｎε−アシル−Ｌ−Ｌｙｓの側鎖アミド結合の分解合成酵素活性、Ｚ−Ｌ−アミノ酸のアミド結合の分解合成酵素活性からなる群から選択される少なくとも１種である。
【００３２】
また、本発明のポリペプチドは、上記本発明のいずれかの遺伝子にコードされる。当該遺伝子にコードされたポリペプチドは、それ自体アミダーゼ様酵素活性を有するか、有しない場合であっても、アミダーゼ様酵素及び／又はその類似体を探索するプローブとしても使用することができる。
【００３３】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸配列番号１ー８１４で示されるアミノ酸配列、（ｂ）アミダーゼ様酵素活性を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなる。
【００３４】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、（ａ）配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１ー１７３で示されるアミノ酸配列、（ｂ）（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなる。なお、当該配列番号３に示すポリペプチドは、配列番号２に示すポリペプチドからなるアミダーゼ様酵素のαサブユニット部分に相当する。配列番号３に示すポリペプチドは、当該アミダーゼ様酵素のリンカー部分を分解する機能を有すると推定される。
配列番号３に示すポリペプチドは、また、本発明に係る遺伝子又はポリペプチドをスクリーニングする際に、プローブとして使用することが可能である。
【００３５】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号４に示す、アミノ酸配列番号１ー５７０で示されるアミノ酸配列、（ｂ） （ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、からなる。なお、当該配列番号４に示すポリペプチドは、配列番号２に示すポリペプチドからなるアミダーゼ様酵素のβサブユニット部分に相当する。配列番号４に示すポリペプチドは、、本発明に係る遺伝子又はポリペプチドをスクリーニングする際に、プローブとして使用することが可能である。
【００３６】
また、本発明のポリペプチドの好ましい実施態様において、以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列、すなわち、（ａ）配列表の配列番号５に示す、アミノ酸配列番号１ー４３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ） アミダーゼ様酵素前駆体ポリペプチドの細胞膜通過を誘導する機能を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド、からなる。アミダーゼ様酵素のシグナルペプチドとしての意義を有する。当該シグナルペプチドは、アミダーゼ様酵素前駆体ポリペプチドの細胞膜通過を誘導する機能を有する。アミダーゼ楊酵素ポリペプチド前駆体が、細胞膜通過時にシグナルペプチドが切断され、さらに膜通過後に、リンカーペプチドが削除されることにより、αサブユニットとβサブユニットが生じ、最後にこの２つのサブユニットが会合して酵素タンパク質となり、細胞壁を通過し、分泌されると考えられる。
【００３７】
ここで、アミノ酸配列の一部が、欠失、置換若しくは付加されたものを含めたのは、このようなアミノ酸配列からなるポリペプチドであっても、アミダーゼ様酵素活性を有するものがあり、アミダーゼ様酵素活性を有する限り本発明に含まれると考えられるからである。
【００３８】
また、本発明のポリペプチドにおいては、アミノ酸配列を、化学的又は物理的に修飾して得られるポリペプチドであっても、アミダーゼ様酵素活性を有する限り、本発明のポリペプチドに含まれる。化学的又は物理的修飾の例としては、メチル化、アミド化などのＮ末端修飾、Ｃ末端修飾等を挙げることができる。これらの修飾を常法に従って行うことができる。
【００３９】
次に、本発明の組換えベクターについて説明する。本発明の組換えベクターは、上記本発明の遺伝子を含むことができる。すなわち、アミダーゼ様酵素をコードする遺伝子、配列表の配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子、又は当該塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アミダーゼ様酵素活性を有する遺伝子を含むことができる。アミダーゼ様酵素活性とは、上述の本発明の遺伝子の項で説明したものをそのまま用いることができる。
【００４０】
次に、本発明の形質転換体は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子又は請求項９記載の組換えベクターを宿主細胞へ導入して得られる。
【００４１】
ここで、宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００４２】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチド遺伝子発現ベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４３】
発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＱＥ−９（キアゲン社製）、ｐＱＥ−７０（キアゲン社製）、ｐＱＥ−６０（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＥＴ−１１ａ（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４８， ６６９ （１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５３， ２７７ （１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８２， ４３０６ （１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒＳ３２〔大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ， ３３， １０３ （１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＫＣ３０（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９８３，ｉｎ ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，” Ｖｏｌ． １０１， ｐｐ． １２３−１３８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）、ｐＤＲ５４０（ファルマシア社製）、ｐＲＩＴ２Ｔ（ファルマシア社製）、ｐｔｒｃ９９ａ〔Ｇｅｎｅ， ６９， ３０１（１９８８）〕、等を例示することができる。
【００４４】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４５】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００４６】
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｓａｃｃｈａ ｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． Ｄ−０１１０等をあげることができる。
【００４７】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ６９， ２１１０ （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４２号公報）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １６， ６１２７ （１９８８）〕等をあげることができる。
【００４８】
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＧ−１、ｐＸＴ１（ストラタジーン社製）、ｐＳＧ５（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（ファルマシア社製）、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ（ファルマシア社製）、ｐＳＶＬ ＳＶ４０（ファルマシア社製）等を用いることができる。
【００４９】
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＧＰＤプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
【００５０】
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属、ピチア属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ等をあげることができる。組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４， １８２ （１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８１， ４８８９ （１９８４）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３， １６３ （１９８３）〕、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
７５， １９２９ （１９７８）等をあげることができる。
【００５１】
また、動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９号公報）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ， ３２９， ８４０ （１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ， １０１， １３０７ （１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。
【００５２】
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００５３】
また、宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
【００５４】
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ： ＣＲＬ−１５７３）、２９３等、ヒト白血病細胞としては、ＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。
【００５５】
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３， １３３ （１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， ７４１３ （１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２， ４５６ （１９７３）に記載の方法等をあげることができる。
【００５６】
また、昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６， ４７ （１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
【００５７】
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにインビトロジェン社製）等をあげることができる。
【００５８】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ） 等を用いることができる。
【００５９】
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ Ｎ４等をあげることができる。
【００６０】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４， ７４１３ （１９８７）〕等をあげることができる。
【００６１】
また、植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
【００６２】
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５号公報、特開昭６０−７００８０号公報、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７号公報）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６号、特許第２５１７８１３号）等をあげることができる。
【００６３】
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。 酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
【００６４】
また、本発明の形質転換体の好ましい実施態様において、宿主細胞が、アミダーゼ様酵素生産菌株である。好ましくは、アミダーゼ様酵素生産菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物であり、また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２であることが好ましい。これは、これらの微生物が、本発明のアミダーゼ様酵素の生産性が高いという観点からである。
【００６５】
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中にアミダーゼ様酵素を生成蓄積させ、当該培養物から当該酵素を採取することができる。本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行なうことができる。
【００６６】
また、形質転換体を培養する培地としては、該生物が質化し得る炭素原、窒素原、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行なえる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６７】
培養の形態としては、液体培養、固体培養等を挙げることができ、いずれも適用可能である。工業的に有利に培養するために、振盪培養、通気攪拌培養等を行なっても良い。
【００６８】
培地の栄養原としては、特に限定されることはなく、微生物の培養に通常用いられる炭素原、窒素源等を挙げることができる。炭素源としては、酵母エキス、グリセリン、グルコースなどを、または窒素源としては、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等の有機窒素化合物を挙げることができる。その他、無機塩類、例えば、食塩、リン酸塩類、硫酸塩類、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛などの金属塩類を適宜培地に加えても良い。培養温度、培養時間等の培養条件について、使用する微生物の発育に適し、かつ本発明の分解合成酵素の生産が最高になるような条件を適宜選択する。例えば、培地のｐＨは、中性、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは７．０近傍である。また、放線菌の生育温度は一般的には２８〜３７℃である。これらの菌体の好ましい培養温度としては２８〜３２℃の範囲である。特に、ＩＦＯでは、以下に述べるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２の２つの菌株の培養温度として２８℃を推奨している。
【００６９】
このようにして得られた培養物から本発明アミダーゼ様酵素を得るには、代謝産物を採取するのに通常用いられる方法を適宜利用することができる。例えば、当該分解合成酵素と不純物との溶解度の差を利用する方法、親和力を利用する方法、分子量の差を利用する方法等を、単独又は組み合わせて、あるいは反復して使用することができる。例えば、本発明の分解合成酵素は、微生物の体外に分泌されるので、微生物の培養を行ない、培溶液から濾過、あるいは遠心分離によって微生物を取り除いた培養上清を得、この培養上清から硫酸アンモニウムを用いた塩析、各種のイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を組み合わせて本発明の分解合成酵素を精製すればよい。
【００７０】
また、本発明のアミダーゼ様酵素は、上述のようにＤＮＡ、ポリペプチドを利用して、大量に生産可能であるが、本来以下のようなアミダーゼ様酵素生産菌から、精製することができる。以下、アミダーゼ様酵素の入手方法について説明する。
【００７１】
アミダーゼ様酵素の生産菌は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物を用いることができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ 属に属する微生物の菌学的性質としては、真正法線菌に属し、菌糸状の状態で生育するグラム陽性（グラム染色性が陽性）の偏性好気性菌であることが挙げられる。
【００７２】
アミダーゼ様酵素の生産性が高いという観点から、微生物としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２であることが好ましい。
【００７３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２は、大阪の財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）より入手可能であり、ＩＦＯ １３８１９、 ＩＦＯ １３４２２は、ＩＦＯの寄託番号を示す。
【００７４】
なお、ＩＦＯ１３８１９は、他の微生物保存期間にも同一菌株が寄託されており、理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）ではＪＣＭ４１６８、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ではＡＴＣＣ２９０３２、同じく米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＮＲＲＬ）ではＮＲＲＬ Ｂ−３７２９である。また、ＩＦＯ １３４２２は、同一菌株がＡＴＣＣではＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ ２７４４６である。
【００７５】
アミダーゼ様酵素の生産方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属し、カプサイシン分解合成酵素を生産する能力を有する微生物を、通常の方法で培養し、その培養液から前記アミダーゼ様酵素を採取すればよい。また、上記微生物の自然的又は人工的変異株の培養物から、アミダーゼ様酵素を採取してもよい。
【００７６】
培地の条件、培養の形態、栄養源等については、上記形質転換体で述べたものを、アミダーゼ様酵素を精製する過程において、そのまま適用することができる。
【００７７】
なお、採取したアミダーゼ様酵素から、免疫スクリーニング法を利用しても、当該酵素を構成する塩基配列、アミノ酸配列を算出することができる。
【００７８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される意図ではない。
【００７９】
実施例１
＜アミダーゼ様酵素の精製＞
まず、アミダーゼ様酵素が菌体内と菌体外のどちらに多く含まれているかを調べた。菌体を超音波破砕して得た溶液と、培養上清について活性測定したところ、菌体外の比活性は培養日数と共に増加するが、菌体内の活性は培養６日間で殆ど見られなくなった。よって、本菌株の産生するアミダーゼ様酵素は効率よく菌体外に分泌されていると考えられる。
【００８０】
ついで、アミダーゼ様酵素活性の高いもの選別する目的で、種々のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．についてスクリーニングを行った。スクリーニング方法は以下の通りである。ここでは、アミダーゼ様酵素活性能を調べるのに、カプサイシンを基質として用いた。
【００８１】
培地は４％ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ、２％ｐｏｌｙＰｅｐｔｏｎ等を用いて精製し、初期ｐＨ７．０、振盪速度１２０ｓｔｒｏｋｅｓ／ｍｉｎ、温度３０℃で７日間培養を行った。活性については、０．１３ｍＭカプサイシンを基質として、３７℃でインキュベート後にＨＰＬＣ測定を行った。なお、酵素活性１Ｕは、１μｍｏｌのカプサイシンを３７℃、１時間で加水分解するのに必要な酵素量として定義した。その結果、Ｓ，ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９の活性が１．２（Ｕ／ｍＬ）、Ｓ．ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２の活性が１．０（Ｕ／ｍＬ）と相対的に高い活性を示した。ただし、Ｓ．ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉはＡＴＣＣによる分類ではＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓに分類されている。
【００８２】
これらの知見から、菌株としてＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９を用いて、培養を行った。可溶性澱粉２．０％、ポリペプトン２．０％、肉エキス４．０％、酵母エキス０．２％、リン酸水素カリウム０．２％、硫酸マグネシウム０．１％からなるｐＨ７の液体培地にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９の胞子懸濁液を接種し、３０℃で７日間培養した。
【００８３】
その後、酵素を培養上清に終濃度５０％になるように硫酸アンモニウムを加え、硫安沈澱を行った。得られた沈澱をバッファーに溶解後、ＣＭ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０で分画し、さらに二回ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。
【００８４】
ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−５０カラムクロマトグラフィーで溶出させた際、タンパク質濃度はＯＤ２８０で、カプサイシン（ＣＡＰ）加水分解活性は加水分解率で表した。活性分画は、ＮａＣｌ濃度４００ｍＭ付近で溶出した。この活性分画をヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画して活性分画を得た（図２（ａ））が、不純なタンパク質の混在が認められたため、この活性分画を再度ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで分画した。その結果、図２（ｂ）に示すように、リン酸濃度３５０ｍＭ付近で精製酵素を得た。
【００８５】
このようにして、遠心除菌して当該酵素を含む上清を得た。ついで、得られた上清についての活性を調べた。その結果、上清０．６Ｌ中の当該酵素の総活性は３４５Ｕ、比活性は０．０６１ Ｕ／ｍｇであった。ここで、酵素活性１Ｕは、３７℃、１時間で１μｍｏｌのカプサイシンを加水分解する酵素量であった。この上清に５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して沈澱画分を得た後、陽イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（２回）を行なうことにより、比活性は１９７．０ Ｕ／ｍｇとなり（表１）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に（分子量約６０ｋＤａ）に精製された酵素が得られた（図１）。
【００８６】
【表１】
なお、この比活性はこれまでに報告されているカプサイシン分解活性を有する諸酵素に比べると非常に高い値であった。
【００８８】
実施例２
次に、実施例１で得られた精製酵素をコードする遺伝子、アミノ酸配列の特定を試みた。
【００８９】
まず、ペプチドシクエンサーを用いて精製酵素のＮ末端アミノ酸配列２４残基を決定した。一方、Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ菌体から全ＤＮＡを抽出し、種々の制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を調製した。決定されたＮ末端ペプチドの部分配列に相当する２種類のＤＮＡ塩基配列をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行い、プローブとハイブリッドを形成するＤＮＡ断片をゲルから抽出した。抽出したＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクタ−に挿入し、ミニライブラリーを作成後、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換された大腸菌ライブラリーの中から、コロニーハイブリダイゼーション法によりプローブとハイブリダイズするポジティブクローンを選択し、インサートＤＮＡの塩基配列ＤＮＡシーケンサーにより決定した。１回のクローニング作業では、本酵素のＯＲＦを決定できなかったので、順次適当なプライマーを用いて全ＯＲＦを含むＤＮＡ断片をクローニングし、塩基配列を決定した。さらに、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥとＳＤＳ存在下のＨＰＬＣの結果及びＨＰＬＣで単離されたタンパク質のＮ末端及びＣ末端ペプチドのアミノ酸配列と上記で決定された本酵素のＯＲＦの全塩基配列に基づいて、本酵素のサブユニット構造並びにサブユニットのアミノ酸配列を決定した。
【００９０】
その結果、本酵素遺伝子のＯＲＦの全塩基数は、２４４５ｂｐからなり（図３）、８１４アミノ酸残基であることが判明した。
【００９１】
さらに遺伝子産物は、４３アミノ酸残基（１２９塩基のＤＮＡ）からなるシグナルペプチド、１７３アミノ酸残基（４８９塩基のＤＮＡ）からなる小サブユニット（αサブユニット）、２８アミノ酸残基（８４塩基のＤＮＡ）からなるリンカーペプチド、及び５７０アミノ酸残基（１７１３塩基のＤＮＡ）からなる大サブユニット（βサブユニット）から構成されていることが判明した。さらに、大サブユニットのＮ末端はアミノ酸セリンであった。既存のペニシリンアシラーゼファミリーに属する酵素はすべてセリンが活性発現に関わるアミノ酸であることから本酵素においても大サブユニットのＮ末端のセリンが活性中心であることが示唆された（図４）。遺伝子産物は、翻訳後にシグナルペプチドとリンカーペプチドが除去されて、αサブユニットとβサブユニットからなる二量体タンパク質として分泌され、このタンパク質がアミダーゼ様酵素の実態（図５）であることが示された。
【００９２】
【発明の効果】
本発明によれば、大量生産が容易で、なおかつ高収率で、安定したカプサイシン類を合成するのに有用なアミダーゼ様酵素を提供し得るという有利な効果を奏する。
【００９３】
また、本発明によれば、本発明にかかる遺伝子を用いることによって、酵素の大量生産や、更なる高機能性を有する変異酵素の調製が容易となるので、医薬品製造や機能性食品素材製造の分野において有意義であるという有利な効果を奏する。
【００９４】
また、本発明の遺伝子から得られる遺伝子産物によれば、ペニシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質やＮ‐アシル‐Ｌ−アミノ、Ｎ‐アシル−Ｌ−ペプチド、Ｚ−Ｌ−アミノ酸、及びカプサイシンなどアミド結合を有する多種多様な物質を効率よく加水分解、合成することができるという有利な効果を奏する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例である精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーの結果を示す図である。（ａ）が１回目、（ｂ）が２回目を示す。
【図３】アミダーゼ様酵素の塩基配列の一例を示す。
【図４】アミダーゼ様酵素前駆体のアミノ酸配列の一例を示す。
【図５】アミダーゼ様酵素のアミノ酸配列の一例を示す。
Claims (14)
- アミダーゼ様酵素をコードする遺伝子。
- 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１示す、塩基配列１−２４４５で示される塩基配列からなることを特徴とするＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミダーゼ様酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - アミダーゼ様酵素活性が、カプサイシン分解合成酵素活性、並びに、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、及びアンピシリンなどのβ−ラクタム系抗生物質の側鎖アミド結合の分解合成酵素活性、Ｎα−アシル−Ｌ−アミノ酸、Ｎα−アシル−Ｌ−ペプチドのＮα−アシル基、Ｎε−アシル−Ｌ−Ｌｙｓの側鎖アミド結合の分解合成酵素活性、Ｚ−Ｌ−アミノ酸のアミド結合の分解合成酵素活性からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする請求項１又は２項記載の遺伝子。
- 請求項１〜３のいずれかに記載の遺伝子にコードされるポリペプチド。
- 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号２に示す、アミノ酸配列番号１ー８１４で示されるアミノ酸配列。
（ｂ）アミダーゼ様酵素活性を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１ー１７３で示されるアミノ酸配列。
（ｂ） （ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号４に示す、アミノ酸配列番号１ー５７０で示されるアミノ酸配列。
（ｂ） （ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 以下の（ａ）又は（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（ａ）配列表の配列番号５に示す、アミノ酸配列番号１ー４３で示されるアミノ酸配列。
（ｂ） アミダーゼ様酵素前駆体ポリペプチドの細胞膜通過を誘導する機能を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列。 - 請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子又は請求項９記載の組換えベクターを宿主細胞へ導入して得られる形質転換体。
- 宿主細胞が、アミダーゼ様酵素生産菌株である請求項１０記載の形質転換体。
- アミダーゼ様酵素生産菌株が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物である請求項１１記載の形質転換体。
- Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属する微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ ＩＦＯ １３８１９又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｓｃｅｓ ｌｕｔｅｏｒｅｔｉｃｕｌｉ ＩＦＯ １３４２２であることを特徴とする請求項１２記載の形質転換体。
- 請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にアミダーゼ様酵素を生成蓄積させ、当該培養物から当該酵素を採取することを特徴とするアミダーゼ様酵素の生産方法。
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