CN118028274A - 酶突变体及其在合成氯吡格雷中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酰化酶突变体及其应用，本发明对对来自于巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)的酰化酶的氨基酸序列的第224位、第339位、第467位、第474位、第494位、第518位进行单突变或多点联合突变获得了用于催化合成(S)‑氯吡格雷中间体(S)‑邻氯苯甘氨酸的高活性酰化酶突变体，其酶活力较野生型酰化酶提高了1.5‑12.2倍，解决了现有技术中因酰化酶酶活较差而导致(S)‑邻氯苯甘氨酸合成产量不理想的问题，满足生物酶法拆分制备(S)‑邻氯苯甘氨酸的大规模工业化生产需求，具有广泛的应用前景。

Description

酶突变体及其在合成氯吡格雷中的应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种酶突变体及其在合成氯吡格雷中的应用，具体为一种酰化酶突变体及其在合成(S)-邻氯苯甘氨酸以及(S)-氯吡格雷中的应用。

背景技术

氯吡格雷(Clopidogrel,(S)-α-(2-氯苯基)-6,7-二氢噻吩并[3,2-c]吡啶-5(4H)-乙酸甲酯，methyl(+)-(S)-α-(o-chlorophenyl)-6,7-dihydrothieno[3,2-c]pyridine-5(4H)-acetate))是于1986年首先研制得到的一种抗血小板凝聚药物，它被广泛应用于不稳定性的心绞痛、心肌梗塞、中风等血栓性疾病的临床治疗。目前氯吡格雷是最受欢迎的P2Y12受体(一种驱动血小板活化的G蛋白偶联受体)拮抗剂，与传统的抗血小板药物阿司匹林、噻氯吡啶相比，氯吡格雷作用强度和耐受性大大增强，且副作用并没有明显增大，成为目前抗血小板凝聚的主流药物之一。

目前氯吡格雷的合成方法主要是通过不对称合成技术实现的，其中主要以(S)-邻氯苯甘氨酸或(R)-邻氯扁桃酸为主要的手性合成底物。(S)-邻氯苯甘氨酸传统的化学合成法是对D-樟脑磺酸和L-酒石酸进行化学拆分。但化学拆分法选择性差，得到的是S型和R型的混合物，从而加大分离纯化的成本，进而影响终产物氯吡格雷的光学纯度。近年来，生物催化拆分制备(S)-邻氯苯甘氨酸成为主流的研究方向，但目前相关研究都有各自的不足，如立体选择性不足、产物得率低或生产成本高等一系列问题。

酰化酶对含苯环的酰基侧链有高度立体选择性，能够特异性地将N-苯乙酰-(S)-邻氯苯甘氨酸水解生成(S)-邻氯苯甘氨酸。利用生物合成得到的(S)-邻氯苯甘氨酸，再经过化学合成，可以生产(S)-氯吡格雷，该方法具有选择性高、收率高、反应条件温和、环境污染小等优点，然而现有酰化酶活性普遍不高。

发明内容

针对现有技术中酰化酶活性不高的问题，本发明对来自于Priestia megaterium的酰化酶进行了分子改造以提高其酶活，通过高通量筛选方法得到用于催化合成(S)-氯吡格雷中间体(S)-邻氯苯甘氨酸的高活性酰化酶突变体，解决了现有技术中因酰化酶酶活较差而导致(S)-邻氯苯甘氨酸合成产量不理想的问题。

本发明采用的技术方案是：一种酰化酶突变体，所述酰化酶突变体是对巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)来源的酰化酶的氨基酸序列的第224位、第339位、第467位、第474位、第494位、第518位进行单突变或多点联合突变获得的。所述巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)来源的酰化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过大分子建模技术对Priestia megaterium来源的酰化酶PmPGA的三维结构进行模拟，利用能量最低原理和分子对接技术，经蛋白结构自由能计算预测出可能与催化相关的一个或多个氨基酸位点，通过定点突变来降低蛋白整体结构的自由能来增加蛋白稳定性。在确定突变的位点以及突变的氨基酸种类后，以碱基序列如SEQ ID NO.1所示的野生型酰化酶PmPGA为模板，采用定点突变引物进行PCR扩增，分别将突变产物通过载体转化至宿主菌中，经培养筛选出具有突变基因的阳性克隆。随后从阳性克隆中提取载体DNA进行序列测定分析，以确定引入的突变。最后将筛选得到的突变产物转入宿主菌中诱导表达，从中筛选出活性显著提高的突变体，即所述的酰化酶突变体。

作为优选，所述酰化酶突变体是对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行了以下位点的单突变或多点联合突变获得的：

(7)第224位谷氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、天冬氨酸中的一种；

(8)第339位缬氨酸突变为丙氨酸或天冬氨酸；

(9)第467位缬氨酸突变为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸中的一种；

(10)第474位谷氨酸突变为脯氨酸或缬氨酸；

(11)第494位谷氨酸突变为甲硫氨酸；

(12)第518位缬氨酸突变为脯氨酸或丙氨酸。

作为优选，所述酰化酶突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的酰化酶第224位谷氨酸突变为亮氨酸、第339位缬氨酸突变为天冬氨酸、第467位缬氨酸突变为丝氨酸获得的。

作为优选，所述酰化酶突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的酰化酶第224位谷氨酸突变为亮氨酸、第467位缬氨酸突变为天冬氨酸、第494位谷氨酸突变为甲硫氨酸获得的。

作为优选，所述酰化酶突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的酰化酶第224位谷氨酸突变为亮氨酸、第339位缬氨酸突变为天冬氨酸、第467位缬氨酸突变为丝氨酸、第494位谷氨酸突变为甲硫氨酸获得的。

本发明还提供了上述任一酰化酶突变体的编码基因。作为优选，所述酰化酶突变体是在碱基序列如SEQ ID NO.1所示的野生型酰化酶PmPGA的基础上，将编码第224位谷氨酸的密码子突变成编码亮氨酸的密码子，将编码第339位缬氨酸的密码子突变成编码天冬氨酸的密码子，将编码第467位缬氨酸的密码子突变成编码丝氨酸的密码子，将编码第494位谷氨酸的密码子突变成编码甲硫氨酸的密码子而得到的。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。

本发明还提供了含有上述酰化酶突变体编码基因的重组载体。所述重组载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作地连接的多核苷酸。所述重组载体的骨架结构可以为各种表达载体，包括但不限于pET表达载体、pCW表达载体、pUC表达载体或pPIC9k表达载体中的任意一种表达载体。优选以质粒pET-28a(+)为表达载体，并将所述的酰化酶突变体编码基因克隆至所述的质粒pET-28a构成重组载体。

本发明还提供了含有上述酰化酶突变体编码基因的基因工程菌。所述基因工程菌是将上述的酰化酶突变体的编码基因连接到表达载体得到重组载体，然后将重组载体转化到宿主菌，即得到基因工程菌。所述宿主菌可以为本领域的各种常规宿主载体，包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或毕赤酵母，优选大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)作为宿主菌。

本发明还提供了上述的酰化酶突变体，或上述酰化酶突变体编码基因的重组载体，或含有上述酰化酶突变体编码基因的基因工程菌在催化合成(S)-邻氯苯甘氨酸中的应用，所述应用包括：以含酰化酶突变体编码基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体破碎后提取的酶液为催化剂，以N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸为底物，以缓冲液为反应介质，构成反应体系，反应获得(S)-邻氯苯甘氨酸。可以理解的是，当涉及本发明的酰化酶突变体的应用时，有多种可行的形式选择。这包括以下几种形式：基因工程菌全细胞形式使用，未经纯化的粗酶形式使用，部分或完全纯化的酶形式使用。此外，利用已知的酶固定化技术可以将本发明的酰化酶突变体制成固定化酶或固定化细胞形式的生物催化剂，从而进一步提高酶的稳定性和可重复使用性，并有助于其在工业生产等领域的应用。

在上述催化合成(S)-邻氯苯甘氨酸的应用中，作为优选，所述反应体系pH为7-8.5，更优选为8.0。

作为优选，所述反应温度为40-50℃，更优选为45℃。

作为优选，所述反应体系中N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸的初始浓度以缓冲液体积计为100-300mM，优选200-300mM，更优选为250mM。

作为优选，所述反应体系中酶液的加入量以破碎前湿菌体质量计为2-20mg/mL缓冲液，优选为8-15mg/mL缓冲液，更优选为10mg/mL缓冲液。

作为优选，所述反应体系中缓冲液为40-60mM磷酸钾缓冲液。

本发明的有益效果：本发明构建的酰化酶突变体与野生型酶相比，酶活力提高了1.5-12.2倍。其中，在高活性突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M催化作用下，(S)-邻氯苯甘氨酸的产量在6小时后达到最高产量123.8mM，较野生型提高8.7倍。本发明提供的酰化酶突变体不仅可以显著降低催化合成(S)-邻氯苯甘氨酸过程中酶的使用量，降低发酵容量和成本；且能极大缩短反应时间，满足生物酶法拆分制备(S)-邻氯苯甘氨酸的大规模工业化生产需求，利用生物合成得到的(S)-邻氯苯甘氨酸，再经过化学合成，可以用于高效生产(S)-氯吡格雷，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1构建的PmPGA蛋白模型。

图2为本发明实施例1制备的PmPGA突变体粗酶液相对酶活。

图3为本发明实施例1中PmPGA及其突变体在催化合成(S)-邻氯苯甘氨酸后反应上清液吸光值。

图4为本发明实施例1筛选得到的含单突变体的粗酶液比酶活。

图5为本发明实施例2筛选得到的含双突变体的粗酶液比酶活。

图6为本发明实施例2筛选得到的含多点联合突变体的粗酶液比酶活。

图7为本发明实施例3中温度对突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M和野生型酶活的影响。

图8为本发明实施例4中pH对突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M和野生型酶活的影响。

图9为本发明实施例5中N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸浓度对突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M和野生型酶活的影响。

图10为本发明实施例7中野生型PmPGA和突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M在催化合成(S)-邻氯苯甘氨酸的产量曲线图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

LB平板组成：10g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠、5g/L酵母提取物、15g/L琼脂，溶剂为水，pH自然。

LB液体培养基组成：10g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠、5g/L酵母提取物，溶剂为水，pH自然。

制备例：

【野生型E.coli BL21(DE3)-PmPGA的构建及表达】

根据GenBank中来自巨大普里斯特氏菌Priestia megaterium的酰化酶蛋白序列(PmPGA，GenBank号：AF161313.1)，针对大肠杆菌密码子偏好性优化，并在序列C端融合一个6His标签，由北京擎科生物公司(中国北京)合成长度为2427bp的重组基因PmPGA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。将重组基因PmPGA插入到pET-28a(+)的T7启动子下，得到表达质粒pET28-PmPGA。将该表达质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，挑取阳性克隆，即为野生型E.coli.BL21(DE3)-PmPGA，用于表达重组PmPGA。

【粗酶液的制备】

将获得的野生型E.coli BL21(DE3)-PmPGA接种至含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，180rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，180rpm下培养至菌体OD₆₀₀＝0.6，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有表达重组PmPGA的湿菌体。收集的湿菌体按100g/L的量用pH为8.0的50mM磷酸钾缓冲液(PBS)重悬成菌悬液，并使用超声波细胞粉碎机破碎，破碎功率为200W，每工作1s，间歇2s，总共破碎5min。收集细胞破碎液，在4℃、8000rpm离心10min，取上清，即为粗酶液，后续粗酶液的用量以对应破碎前菌悬液中菌体量计。

【纯酶的制备】

取5mL粗酶液稀释到40mL磷酸钾缓冲液(20mM，pH7.5)中，然后上样到GEHealthcare公司的HisTrap HP纯化柱中(10mL柱体积，预先用含500mM氯化钠的pH 7.5、20mM磷酸钾缓冲液冲洗)。上样后的纯化柱用100mL清洗缓冲液(500mM氯化钠+50mM咪唑的pH7.5、20mM磷酸钾缓冲液)以0.5mL/min的速度洗脱，除去结合在纯化柱上的杂蛋白。然后用洗脱缓冲液(500mM氯化钠+250mM咪唑的pH7.5、20mM磷酸钾缓冲液)以0.5mL/min的速度洗脱，收集含目的蛋白的洗脱液，再用pH7.5的20mM磷酸钾缓冲液在透析袋(截留分子量为14KDa)中透析48h，取截留液，即为纯酶，纯酶浓度用碧云天BCA蛋白浓度试剂盒(P0012)测定，后续纯酶的用量以蛋白含量计。

【酶活的测定】

0.15mg上述方法制备的粗酶液或0.01mg纯酶、终浓度20mM的N-苯乙酰-(S)-邻氯苯甘氨酸，加入到0.5mL 50mM的磷酸钾缓冲液中(pH8.0)。反应液在45℃孵育5min后加入20μL6M/L氢氧化钠水溶液终止反应。最终溶液中的(S)-邻氯苯甘氨酸含量用HPLC方法测定。

HPLC所用的仪器为Agilent 1260InfinityⅡ(安捷伦科技有限公司，美国)，配置Agilent 2414紫外检测器，Agilent 1525泵，Agilent 717进样器。色谱柱为Chirobiotic R手性柱(5μm，4.6×250mm，Sigma，USA)。流动相速率为1mL/min，紫外检测波长为220nm，流动相为V(0.5％乙酸)：V(乙腈)＝20:80，进样量为3μL，检测时间为15min。以不同浓度的(S)-邻氯苯甘氨酸(0.1mM、0.2mM、0.5mM、1.0mM、2.0M和5.0mM)进样得到的峰面积数据，得到(S)-邻氯苯甘氨酸浓度与峰面积标准曲线，曲线方程为y＝(x-0.6478)/145.76(R²＝0.995)，其中y为(S)-邻氯苯甘氨酸浓度(mM)，x为液相得到(S)-邻氯苯甘氨酸峰面积。

酶活定义：一个酶活定义为上述条件下每分钟产生1μmol(S)-邻氯苯甘氨酸所需的酶量(前5分钟)。

实施例1：PmPGA单突变体的构建

【突变位点的筛选】

采用Alphafold2构建PmPGA蛋白模型，使用AutoDock Vina进行分子对接，结果如图1所示。选取底物附近范围的氨基酸残基以及更大范围以外与底物有相互作用的氨基酸残基进行丙氨酸扫描，可能有益的突变位点为E224、G337、N338、V339、Y465、P466、V467、R468、E474、I490、P491、E494、N495、P496、E516、W517、V518。采用制备例中构建的pET28-PmPGA质粒为模板，采用Quick-change的突变方法，利用表1中列举的引物，分别将各个位点的氨基酸突变为丙氨酸，得到多个PmPGA单突变体。

将突变后的质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)，采用制备例中方法制备粗酶液并测定相对酶活。结果如图2显示，以野生型粗酶液的活力为100％，G337、N338、Y465、P466、R468、P491、N495、P496和E516氨基酸残基突变为丙氨酸后，含有PmPGA突变体的裂解液上清彻底失去活力，说明这些位点为保守氨基酸，不适合进行进化研究。而E224、V339、V467、E474、I490、E494、W517和V518突变为丙氨酸后酶活发生了显著变化，证明这些位点对PmPGA活力影响较大，对这些位点进行饱和突变研究。

表1.突变位点及引物

【定点饱和突变】

对上述筛选出丙氨酸扫描显著变化的氨基酸残基位点通过高通量筛选进行定点饱和突变。采用Quick-change的突变方法，以制备例中构建的pET28-PmPGA质粒为模板，采用表2引物，选取位点进行饱和突变。

表2.突变位点及引物

上述中N＝A，T，G，C；K＝G，T；M＝A，C。

【PmPGA突变体的获得】

将突变得到的质粒转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)中构建得到基因工程菌菌株，将PmPGA野生型菌株E.coli-pET28-PmPGA(WT)及突变体菌株(突变体菌株直接用96孔板进行编号)的种子液在37℃，180-250rpm的条件下培养12h后，于超净台内转接于装有含卡那霉素的LB培养基的96孔板(表达板)中的相应位置(A1孔依然对应A1孔)进行培养，野生型菌株接种4-8株于96孔板的第1列，其余孔接种PmPGA突变体菌株，整块96孔板布局见表3。

表达培养应在37℃，180-250rpm的条件下进行，当OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，并降低温度至28℃诱导细胞产PmPGA或其突变体，诱导时间应为12-15h。诱导结束后需离心收集细胞：离心条件应为4℃，3000rpm，离心10min，弃尽培养基，收集细胞以备酰化酶水解N-苯乙酰-(S)-邻氯苯甘氨酸生成(S)-邻氯苯甘氨酸。剩余的种子液需加入与剩余种子液等体积的30％的甘油进行保种，保种的96孔板应存放在-80℃冰箱中。

表3. 96孔板接种PmPGA及其突变体菌株布局表

1

2

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A

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D4

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E

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F

WT

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G

WT

G2

G3

G4

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G6

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G9

G10

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G12

H

WT

H2

H3

H4

H5

H6

H7

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H9

H10

H11

H12

【PmPGA突变体的筛选】

酰化酶及其突变体催化反应生成(S)-邻氯苯甘氨酸的反应结束后，除了N-苯乙酰-(R)-邻氯苯甘氨酸重新进入循环进行消旋化生成R型和S型混合物以外，还有副产物苯乙酸的生成，其不断积累会导致pH的下降，此时加入显色剂甲酚红(cresol red)，会有明显的颜色变化，并且在OD＝570nm处，吸光度会明显降低，根据该原理可快速筛选PmPGA突变体。

将上述收集得到的菌体重悬于pH为8.0的50mM磷酸钾缓冲液(PBS)中，加入终浓度为15mM/L的N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸，在高通量摇床上进行反应，转化条件为45℃，800rpm，10min。反应结束后立即使用离心机在4℃，3000rpm条件下离心10min，收集上清液并稀释适当倍数后与0.2％甲酚红进行显色反应，使用酶标仪在570nm处读取吸光度，吸光值越小，则说明(S)-邻氯苯甘氨酸产量越高，PmPGA突变体酶活越高。对E224、V339、V467、E474、I490、E494、W517和V518每个位点挑取200个随机突变进行通量饱和突变筛选，吸光值明显降低的突变为E224L、E224D、E224A、V339D、V339A、V467D、V467E、V467S、E474P、E474V、E494M、V518P、V518A(图3)。

【粗酶液验证】

挑取吸光值小的菌株进行粗酶液验证，即将高通量筛选时的种子液用96孔板解冻，并在含50μg/mL卡那霉素抗性平板上划线，37℃恒温培养12h左右，挑取单菌落，采用制备例方法制备粗酶液并测定相对酶活。结果如图4所示，含有E224L、E224D、E224A、V339D、V339A、V467D、V467E、V467S、E474P、E474V、E494M、V518P、V518A的单残基突变体酶活显著提升，是野生型PmPGA粗酶液的1.5-4.1倍。

实施例2：PmPGA多点联合突变体的构建

【双突变体的构建】

单残基突变酶活提高的位点位于PmPGA氨基酸序列的224、339、467、474、494以及518位点上。根据酶与底物对接结果显示，224、339、467和494位于底物结合口袋，而474和518位点距离底物结合位点较远。所以474和518位点与其他有益突变产生相互作用的可能性较小。因此首先对224、339、467和494位点进行了组合突变。为了将这些有益突变进行组合，采用Quick-change的突变方法，以含有E224L、E224D、E224A的单点突变的pET28-PmPGA质粒为模板，采用表3中339位点天冬氨酸、丙氨酸或467位点天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸或494位点甲硫氨酸突变扩增引物进行突变；以含有V339D、V339A单点突变的pET28-PmPGA质粒为模板，采用表3中467位点天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸或494位点甲硫氨酸突变扩增引物进行突变；以含有V467D、V467E、V467S单点突变的pET28-PmPGA质粒为模板，采用表4中494位点甲硫氨酸突变扩增引物进突变。

表4.突变位点氨基酸及引物

将上述突变的质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)后构建得到基因工程菌菌株，如制备例进行筛选、表达和纯化。结果如图5所示，带有E224L/V339D、E224D/V467E、E224D/V467S、V339D/E494M和V467E/E494M二突变的PmPGA突变体较单残基突变有较高的活性，其中V467E/E494M二突变为野生型的5.2倍。

【三突变体的构建】

将带有E224L/V339D、E224D/V467E、E224D/V467S、V339D/E494M和V467E/E494M的双位点突变的pET-PmPGA进行进一步突变，引入有益突变位点224位点亮氨酸、天冬氨酸；339位点天冬氨酸；467位点谷氨酸、丝氨酸；494位点甲硫氨酸，采用Quick-change的突变方法，以含有E224L/V339D、E224D/V467E、E224D/V467S、V339D/E494M和V467E/E494M的双位点突变的pET-PmPGA质粒为模板，采用表4中突变扩增引物进突变。

将上述突变的质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)后构建得到基因工程菌菌株，如制备例进行筛选、表达和纯化。结果如图6所示，带有E224L/V339D/V467S、E224L/V467D/E494M三位点突变的PmPGA活力较双突变体PmPGA显著提高，其它三突变体活力下降或彻底失去活力。

【四突变体的构建】

将带有的E224L/V339D/V467S、E224L/V467D/E494M三位点突变的pET-PmPGA进行进一步突变，引入有益突变位点339位点天冬氨酸、494位点甲硫氨酸，采用Quick change的突变方法，以含有E224L/V339D/V467S、E224L/V467D/E494M的三位点突变的pET-PmPGA质粒为模板，采用表4中突变扩增引物进突变。

将上述突变的质粒转化宿主菌E.coli BL21(DE3)后构建得到基因工程菌菌株，如制备例进行筛选、表达和纯化。结果如图6所示，带有E224L/V339D/V467D/E494M的四位点突变PmPGA活力显著提高，是野生型纯酶的12.2倍，而带有E224L/V339D/V467S/E494M的四位点突变PmPGA酶活较单点、双突变或三突变变化不明显。

实施例3：温度对PmPGA突变体的影响

分别将制备例构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-PmPGA和实施例2构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M采用制备例方法制备纯酶并测定酶活，测试酶活的温度分别改为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃或70℃。

结果见图7所示，虽然45℃是野生型PmPGA和突变型PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M的最佳反应温度，但突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M在40-70℃温度下表现出显著更高的相对活性。例如，突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M在60℃时保留了50％的活性，而野生型PmPGA在这种条件下失去了95％的活性。

实施例4：pH对PmPGA突变体的影响

分别将制备例构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-PmPGA和实施例2构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M采用制备例方法制备纯酶并测定酶活，并将缓冲液pH分别改为5.0-6.0(50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)，6.0-8.0(50mM磷酸钾缓冲液)，8.0-9.0(50mM硼砂-硼酸缓冲液)或9.0-10.0(50mM甘氨酸-NaOH缓冲液)。

结果见图8所示，野生型PmPGA和突变型PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M的相对活性在pH值为8.0时达到最大值。然而，突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M在酸性碱性较强的条件下仍具有较高的相对活性。

实施例5：底物N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸浓度对PmPGA突变体的影响

分别将制备例构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-PmPGA和实施例2构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M采用制备例方法制备纯酶并测定酶活，并将N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸浓度改为0.25mM、0.5mM、1.00mM、1.50mM、2.00mM、3.00mM、4.00mM、5.00mM、6.00mM、8.00mM。

结果见图9所示，野生型PmPG在N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸浓度为4.00mM时达到了最高的相对活性，而突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M在N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸浓度为3.00mM时达到了最高的相对活性。

实施例6：PmPGA突变体纯酶的动力学参数

分别将制备例构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-PmPGA和实施例2构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)-PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M采用制备例方法制备纯酶。采用pseudo-one-substrate动力学模型计算Km值与Kcat值。为了计算酶对底物的动力学，采用制备例方法测试酶活，但在调整N-苯乙酰-(S)-邻氯苯甘氨酸浓度(0.25mM、0.5mM、0.75mM、1.00mM、1.50mM、2.00mM、3.00mM、4.00mM、5.00mM、6.00mM、8.00mM)的条件下进行。

表5.野生型PmPGA和突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M对底物N-苯乙酰-(S)-邻氯苯甘氨酸的动力学参数

突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M对N-苯乙酰-(S)-邻氯苯甘氨酸的Km值较野生型PmPGA的Km值明显下降(表5)，说明突变体对底物N-苯乙酰-(S)-邻氯苯甘氨酸的亲和力上升。突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M的酶活性的提高可以解释为其对N-苯乙酰-(S)-邻氯苯甘氨酸的周转数(Kcat值)的增加。突变型PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M对N-苯乙酰-(S)-邻氯苯甘氨酸的催化效率(Kcat/Km)是野生型PmPGA的27.8倍。

实施例7：PmPGA突变体在催化合成(S)-邻氯苯甘氨酸中的应用

在1L的20mL磷酸钾缓冲液(50mM，pH 8.0)反应体系中加入终浓度250mM N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸、终浓度10mg/mL的PmPGA粗酶液或实施例2构建的突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M粗酶液，在45℃反应10h，在0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、10h取样进行HPLC分析。采用制备例中HPLC方法检测，(S)-邻氯苯甘氨酸保留时间为6.47分钟。结果如图10所示，8小时后在野生型PmPGA催化下(S)-邻氯苯甘氨酸产量最大达到14.3mM。而在高活性突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M催化作用下，(S)-邻氯苯甘氨酸的产量在6小时后达到最高产量123.8mM，较野生型提高8.7倍。反应结束后，将含有突变体PmPGA/E224L/V339D/V467D/E494M的反应液用6M盐酸调节pH值到2.0后，底物N-苯乙酰-(R)-邻氯苯甘氨酸析出。析出的N-苯乙酰-(R)-邻氯苯甘氨酸可在170℃下加热10min发生子消旋，产生的N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸作为下一批反应的底物。过滤液加入乙酸乙酯萃取掉滤液中含有的苯乙酸。得到的水层用氢氧化钠调至pH7.0，减压蒸干得到纯(S)-邻氯苯甘氨酸。共得到(S)-邻氯苯甘氨酸22.4g，收率96.6％，用于后续(S)-氯吡格雷的合成。

实施例8：利用生物合成的(S)-邻氯苯甘氨酸合成(S)-氯吡格雷

以(S)-邻氯苯甘氨酸为原料合成(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯：将250mL反应瓶置于在冰浴条件下反应，加入19g实施例7制得的(S)-邻氯苯甘氨酸和120mL甲醇。在搅拌条件下逐滴滴加20mL SOCl₂。滴加完成后反应瓶置于37℃反应48h。在60℃条件下减压蒸馏除去甲醇和SOCl₂。收集到的沉淀用50mL甲醇重溶，加入0.3g活性炭脱色后过滤，减压蒸馏除去甲醇得到(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯盐酸盐结晶体。加入二氯甲烷25mL，纯水50mL，并用氢氧化钠调pH至7.0，收集水相。水相用15mL二氯甲烷萃取2次，合并萃取液。减压蒸馏得到黄色(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯液体，收率92.4％。

2-(2-噻吩)对甲苯磺酸酯的合成：在反应瓶中加入甲苯磺酰氯10g，丙酮55mL，2-(2-噻吩)乙醇6mL，三乙胺8.5mL，置于37℃反应48h。减压抽滤反应液，再用丙酮洗涤除去白色沉淀。滤液在60℃条件下减压蒸馏除去丙酮。加入二氯甲烷100mL，蒸馏水洗涤，在有机层加入无水MgSO₄干燥。50℃条件下减压蒸馏，去除二氯甲烷。得到油状液体，置于冰箱低温冷却结晶。得到白色晶体2-(2-噻吩)对甲苯磺酸酯，收率90.4％。

以(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯和2-(2-噻吩)对甲苯磺酸酯为原料合成(S)-2-噻吩乙胺-2-氯苯基乙酸甲酯：向反应瓶中加入(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯10g、磷酸氢二钾14g、乙腈50mL。37℃下搅拌2h，期间缓慢加入2-(2-噻吩)对甲苯磺酸酯7.05g。置于80℃加热回流反应48h,采用减压蒸馏除去乙腈,加入水50mL和乙酸乙酯150mL,充分搅拌后静置,分离有机层。滤液置于冰水浴中，在滴加浓盐酸6mL，并剧烈搅拌，将所得白色沉淀减压抽滤，用乙酸乙酯洗涤并干燥，得白色固体(S)-2-噻吩乙胺-2-氯苯基乙酸甲酯，收率86.4％。

以(S)-2-噻吩乙胺-2-氯苯基乙酸甲酯为原料合成(S)-氯吡格雷的：在反应瓶中，加入(S)-2-噻吩乙胺-2-氯苯基乙酸甲酯3.6g。在室温条件下缓慢滴加6mL甲醛溶液。置于60℃下加热回流反应。反应结束后再用饱和NaHCO₃溶液调节pH至7.0，用30mL乙酸乙酯共萃取三次，水层加入无水MgSO₄干燥，过滤，滤液减压蒸馏出去乙酸乙酯。得到油状(S)-氯吡格雷。收率为78.6％。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种酰化酶突变体，其特征在于，所述酰化酶突变体是对巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)来源的酰化酶的氨基酸序列的第224位、第339位、第467位、第474位、第494位、第518位进行单突变或多点联合突变获得的，所述巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)来源的酰化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的酰化酶突变体，其特征在于，所述酰化酶突变体是对SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列进行了以下位点的单突变或多点联合突变获得的：

(1)第224位谷氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、天冬氨酸中的一种；

(2)第339位缬氨酸突变为丙氨酸或天冬氨酸；

(3)第467位缬氨酸突变为天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸中的一种；

(4)第474位谷氨酸突变为脯氨酸或缬氨酸；

(5)第494位谷氨酸突变为甲硫氨酸；

(6)第518位缬氨酸突变为脯氨酸或丙氨酸。

3.如权利要求1所述的酰化酶突变体，其特征在于，所述酰化酶突变体是对如SEQ IDNO.2所示的酰化酶的氨基酸序列的第224位谷氨酸突变为亮氨酸、第339位缬氨酸突变为天冬氨酸、第467位缬氨酸突变为丝氨酸、第494位谷氨酸突变为甲硫氨酸获得的。

4.编码权利要求1、2、3任一所述的酰化酶突变体的基因。

5.含有权利要求4所述酰化酶突变体编码基因的重组载体。

6.含有权利要求4所述酰化酶突变体编码基因的基因工程菌。

7.权利要求1、2、3任一所述的酰化酶突变体在催化合成(S)-邻氯苯甘氨酸中的应用，其特征在于，所述应用包括：以含酰化酶突变体编码基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体破碎后提取的酶液为催化剂，以N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸为底物，以缓冲液为反应介质，构成反应体系，反应获得(S)-邻氯苯甘氨酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述反应温度为40-50℃，所述反应pH为7-8.5。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述反应体系中N-苯乙酰-(R,S)-邻氯苯甘氨酸的初始浓度以缓冲液体积计为100-300mM，所述反应体系中酶液的加入量以破碎前湿菌体质量计为2-20mg/mL缓冲液，所述反应体系中缓冲液为40-60mM磷酸钾缓冲液。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用还包括：由(S)-邻氯苯甘氨酸为原料，依次合成(S)-邻氯苯甘氨酸甲酯、2-(2-噻吩)对甲苯磺酸酯、(S)-2-噻吩乙胺-2-氯苯基乙酸甲酯、(S)-氯吡格雷。