KR101069119B1

KR101069119B1 - 신규한 폴리뉴클레오타이드

Info

Publication number: KR101069119B1
Application number: KR1020020030153A
Authority: KR
Inventors: 오무라사토시; 이케다하루오; 이시카와쥰; 호리카와히로시; 시바다다요시; 사카키요시유키; 핫토리마사히라
Original assignee: 도쿠리쓰교세이호진 세이힝효카기쥬쓰기반기구; 샤단호칭키타사토겐큐쇼
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2011-10-04
Also published as: KR20020091820A; US20030119018A1; EP1262562A2; CA2384352A1; EP1852508A3; JP2003284572A; US7630836B2; EP1262562A8; EP1852508A2; EP1262562A3

Abstract

본 발명은 방선균에 속하는 미생물 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어레이, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편의 염기 서열을 기록하는 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체 및 이의 사용, 또한 당해 폴리뉴클레오타이드 및/또는 펩타이드 서열 정보를 이용하는 비교 방법에 관한 것이다.

방선균, 폴리뉴클레오타이드 어레이, 기록 매체, 서열 정보, 비교 방법

Description

신규한 폴리뉴클레오타이드{Novel polynucleotides}

도 1은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) ATCC31267주의 게놈 상의 올리고마이신 생합성에 관여하는 영역의 유전자의 구성을 나타내는 도면이다.

도 2는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267주의 게놈 상의 펜타엔 생합성에 관여하는 영역의 유전자의 구성을 나타내는 도면이다.

도 3은 본 발명의 시스템을 이용한 예의 플로우 챠트이다.

도 4는 본 발명의 시스템을 이용한 예의 플로우 챠트이다.

본 발명은 방선균(actinobacteria)에 속하는 미생물 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편에 의해 암호화되는 폴리펩타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 어레이, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편의 염기 서열을 기록하는 컴퓨터 로 판독가능한 기록 매체 및 이의 사용, 및 당해 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 서열 정보를 이용하는 비교 방법에 관한 것이다.

방선균은 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 유연체(類緣體) 등을 전구 물질로 하는 항생 물질을 포함한 다양한 생물 활성 물질의 생산에 이용되는 산업상 대단히 유용한 미생물이며, 다수의 변이주가 공지되어 있다.

예를 들어, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스는 항기생충·항곤충 활성을 갖는 아버멕틴(avermectin) 생산균으로서 동정된 그램 양성 박테리아이며, 이의 변이주에 의해 아버멕틴이 생산되고 있다. 당해 아버멕틴은 가축의 구충약으로서 전세계에서 사용되고 있고, 열대 지방에서 유행하고 있는 사람·온코세르카증(onchocerciasis)의 치료 및 예방약으로서 이들 유행 국가에서 사용되고 있다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에 의한 아버멕틴의 생산은 주로 대사 경로 및 이의 조절 메카니즘이 변화된 변이주(대사 변이주)에 의해 수행되고 있다.

그러나, 대장균이나 고초균 등과 비교하여, 방선균에 관해서는 기본적인 유전학적, 생화학적, 분자생물학적인 지식의 집적이 충분하다고는 할 수 없어, 생물 활성 물질 생산 변이주에 있어서의 변이 유전자에 관해서도, 극히 약간의 발견밖에 없다. 이와 같이, 이들 미생물에서는 아직 알려져 있지 않은 여러가지의 생육 및 대사 조절 메카니즘이 존재하고 있다.

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267주에 관해서는 교잡에 의한 염색체 맵이 작성되어, 게놈 크기가 약 8,000킬로베이스로 추정되고 있다. 통상의 박테리아의 유전자 밀도로부터 산정하면, 이러한 약 8,000킬로베이스의 게놈 중에는 약 8,000개의 유전자가 존재하는 것으로 예상되지만, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서는 아버멕틴 생합성 유전자를 중심으로 하여 수십개 정도의 유전자만이 알려져 있고, 대부분의 유전자에 관해서 염기 서열은 아직 해명되어 있지 않다.

최근, 몇가지 미생물, 예를 들어, 대장균, 결핵균, 효모 등에 관해서 이의 게놈의 전체 염기 서열 결정이 보고되어 있다[참조: Science, 277, 1453-62 (1997), Nature, 393, 537-544 (1998), Nature, 387, 5-105 (l997)]. 결정된 전체 염기 서열에 근거하여, 유전자 영역의 추정, 공지된 유전자와의 염기 서열과의 비교가 수행되고 있으며, 유전학적, 생화학적, 분자생물학적인 실험을 수행하지 않으면서, 방대한 수의 유전자 기능의 추정이 이루어지고 있다.

또한, 최근에 유전자 또는 유전자 영역 이외의 게놈 영역의 부분 핵산 단편을 고체 지지체에 고착시킨 DNA 칩 또는 DNA 어레이 등을 사용하여, 방대한 수의 유전자에 대한 발현 상황을 동시에 관찰하거나 변이를 검출하는 기술이 개발되었으며, 효모, 결핵균 및 BCG 백신에 사용된다. 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 등의 미생물의 해석에 성과를 올리고 있다[참조: Science, 278, 680-686 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 12833-38 (1999), Science, 284, 1520-23 (1999)].

본 발명의 목적은 산업상 유용한 방선균 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 서열 정보, 당해 미생물의 해석 방법, 당해 해석에 사용하는 장치 및 시스템, 및 당해 미생물의 육종법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 유래의 전체 염기 서열을 결정함으로써, 아직 동정되어 있지 않은 유전자 영역의 특정, 공지 유전자의 염기 서열 및 공지 유전자에 유래하는 아미노산 서열과의 비교에 의한 당해 미생물 유래의 미지 유전자의 기능 추정, 당해 미생물에 의한 유용 생산물의 대사 조절 메카니즘의 추정에 의해 유용한 생산 변이주를 취득할 수 있다고 생각하여, 예의 연구를 거듭한 결과, 전체 게놈 샷건법(shotgun method)을 적용함으로써 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 게놈의 전체 염기 서열을 결정할 수 있음을 밝혀내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 방선균 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드를 고착시킨 올리고뉴클레오타이드 어레이, 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드를 인식하는 항체, 당해 폴리펩타이드 또는 당해 항체를 고착시킨 폴리펩타이드 어레이, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드의 염기 서열 및 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체 및 당해 기록 매체를 사용하는 컴퓨터를 이용하는 시스템, 및 당해 폴리펩타이드 및/또는 폴리펩타이드 서열 정보를 이용하는 비교 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 다음의 (1) 내지 (53)에 관한 것이다:

(1) (a) 서열 1 내지 7551 중의 어느 하나에 제시된 염기 서열로 이루어진 제1 폴리뉴클레오타이드류, 당해 뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 제2 폴리뉴클레오타이드류, 또는 제1 또는 제2 폴리뉴클레오타이드류의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기 서열로 이루어진 제3 폴리뉴클레오타이드류로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드류를 고체 지지체에 고착시켜, 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하는 공정,

(b) 당해 폴리뉴클레오타이드 어레이에 고착된 폴리뉴클레오타이드, 방선균 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드, 방사선의 변이주 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드 또는 피검 표지화 폴리뉴클레오타이드 중의 하나 이상을 하이브리드화 조건하에 배양하는 공정,

(c) 하이브리드화를 검출하는 검출 공정 및

(d) 하이브리드화 결과를 해석하는 해석 공정을 포함하여,

[1] 방선균의 변이주 유래의 유전자 변이점을 동정하거나, [2] 방선균 유래의 유전자 발현량을 측정하거나, [3] 방선균 유래의 유전자 발현 프로파일을 해석하거나, [4] 방선균 유래의 유전자 발현 패턴을 분석하거나, [5] 피검 유전자와 상동한 유전자를 방선균에서 검색하기 위한 방법.

여기서, 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 제1 폴리뉴클레오타이드류로부터 선택된 2종 이상, 제2 폴리뉴클레오타이드류로부터 선택된 2종 이상, 제3 폴리뉴클레오타이드류로부터 선택된 2종 이상, 및 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레 오타이드류를 조합하여 선택된 2종 이상일 수 있다.

(2) 방선균이 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 스트렙토스포란기움(Streptosporangium) 속, 아미콜라톱시스(Amycolatopsis) 속, 악티노플라네스(Actinoplanes) 속, 노카르디오이데스(Nocardioides) 속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia) 속, 악티노비스포라(Actinobispora) 속, 사카로모노스포라(Saccharomonospora) 속, 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora) 속, 사카로트릭스(Saccharothrix) 속, 악티노폴리스포라(Actinopolyspora) 속, 악티노마두라(Actinomadura) 속, 미크로비스포라(Microbispora) 속, 미크로테트라스포라(Microtetraspora) 속, 써모모노스포라(Thermomonospora) 속 또는 미크로모노스포라(Micromonospora) 속에 속하는 미생물인, 상기 (1)에 기재된 방법.

(3) 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물이 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 선택되는 미생물인, 상기 (2)에 기재된 방법.

(4) 방선균 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드, 방선균의 변이주 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드 또는 피검 표지화 폴리뉴클레오타이드가 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산, 항생 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상의 생합성에 관련된 유전자인, 상기 (1)에 기재된 방법.

(5) 피검 폴리뉴클레오타이드가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 유래의 피검 폴리뉴클레오타이드인, 상기 (1)에 기재된 방법.

(6) 서열 1 내지 7551 중의 어느 하나에 제시된 염기 서열로 이루어진 제1 폴리뉴클레오타이드류, 당해 제1 폴리뉴클레오타이드류와 엄격한 조건하에 하이브 리드화하는 제2 폴리뉴클레오타이드류, 또는 제1 또는 제2 폴리뉴클레오타이드류의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오타이드류를 포함하는 그룹으로부터 선택된 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 고체 지지체에 고착시킨 폴리뉴클레오타이드 어레이.

여기서, 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 제1 폴리뉴클레오타이드류로부터 선택된 2종 이상, 제2 폴리뉴클레오타이드류로부터 선택된 2종 이상, 제3 폴리뉴클레오타이드류로부터 선택된 2종 이상, 및 제1, 제2 및 제3 폴리뉴클레오타이드류를 조합하여 선택된 2종 이상일 수 있다.

(7) 서열 1 내지 7551 중의 어느 하나에 제시된 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드와 80% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드.

(8) 서열 2 내지 7551 중의 어느 하나에 제시된 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드.

(9) 서열 7552 내지 15101 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드.

(10) 서열 2 내지 7551에 제시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 있어서, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5' 상류 또는 3' 하류에 위치하여, 당해 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하는 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드.

(11) 상기 (7) 내지 (10) 중의 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드가 갖는 염기 서열 중의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기를 포함하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.

(12) 상기 (8) 내지 (11) 중의 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합체 DNA.

(13) (8) 내지 (11) 중의 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 (12)에 기재된 재조합체 DNA를 포함하는 형질전환체.

(14) 상기 (13)에 기재된 형질전환체를 배지에서 배양하여, 배양물 중에 상기 (8) 또는 (9)에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드를 생성 축적시켜, 당해 배양물로부터 당해 폴리펩타이드를 채취함을 특징으로 하는, 폴리펩타이드의 제조 방법.

(15) 상기 (13)에 기재된 형질전환체를 배지에서 배양하여, 배양물 중에 항생 물질을 포함한 생물 활성 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상을 생성 축적시켜, 당해 배양물로부터 항생 물질을 포함한 생물 활성 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상을 채취함을 특징으로 하는, 항생 물질을 포함한 생물 활성 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상의 제조 방법.

(16) 서열 2 내지 7551로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드.

(17) 서열 7552 내지 15101로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타 이드.

(18) 상기 (16) 또는 (17)에 기재된 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 있어서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되어 있지 않은 당해 폴리펩타이드가 갖는 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드.

(19) 상기 (16) 또는 (17)에 기재된 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 당해 폴리펩타이드가 갖는 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드.

(20) 상기 (16) 내지 (19) 중의 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드를 인식하는 항체.

(21) 상기 (16) 내지 (19) 중의 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드 및 당해 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드 또는 부분 단편 폴리펩타이드 1종 이상을 개체 지지체에 고착시킨 폴리펩타이드 어레이.

(22) 상기 (16) 내지 (19) 중의 어느 한 항에 기재된 폴리펩타이드 및 당해 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드로부터 선택된 폴리펩타이드 또는 부분 단편 폴리펩타이드를 인식하는 항체 1종 이상을 개체 지지체에 고착시킨 폴리펩타이드 어레이.

(23) (i) 서열 1 내지 7551로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보, 및 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 입력하기 위한 입력 수단,

(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하기 위한 데이터 기록 수단,

(iii) 당해 데이터 기록 수단에 의해 기록된, 서열 1 내지 7551로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보와 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 비교하여, 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보와 일치하거나 유사한 염기 서열 정보를 검색하거나 해석하는 컴퍼레이터(comparator) 수단 및

(iv) 당해 컴퍼레이터 수단에 의해 수득된 검색 또는 해석 결과를 표시하기 위한 출력 수단을 구비함을 특징으로 하는,

방선균 유래의 표적 서열 또는 표적 구조 모티브를 동정하기 위한, 컴퓨터를 이용하는 시스템.

(24) (i) 서열 1 내지 7551로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보, 및 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 입력하는 공정,

(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하는 공정,

(iii) 서열 1 내지 7551로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보와 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 비교하는 공정 및

(iv) 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보와 일치하거나 유사한 염기 서열 정보를 검색하거나 해석하는 공정을 포함함을 특징으로 하여,

방선균 유래의 표적 서열 또는 표적 구조 모티브를 동정하기 위해 컴퓨터를 이용하는 방법.

(25) (i) 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보, 및 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 입력하기 위한 입력 수단,

(iii) 당해 데이터 기록 수단에 의해 기록된, 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보와 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 비교하여, 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보와 일치하거나 유사한 아미노산 서열 정보를 검색하거나 해석하는 컴퍼레이터 수단 및

(26) (i) 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보, 및 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 입력하는 공정,

(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하는 공정,

(iii) 당해 데이터 기록 수단에 의해 기록된, 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보와 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 비교하는 공정 및

(iv) 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보와 일치하거나 유사한 아미노산 서열 정보를 검색하거나 해석하는 공정을 포함함을 특징으로 하여,

(27) (i) 서열 2 내지 7551로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보 및 당해 염기 서열이 암호화하는 폴리펩타이드의 기능 정보, 및 표적 염기 서열 정보를 입력하기 위한 입력 수단,

(iii) 당해 데이터 기록 수단에 의해 기록된, 서열 2 내지 7551로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보와 표적 염기 서열 정보를 비교하여, 서열 2 내지 7551로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 일치하거나 유사한 표적 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 폴리펩타이드의 기능을 결정하는 컴퍼레이터 수단 및

(iv) 당해 컴퍼레이터 수단에 의해 수득된 기능을 표시하기 위한 출력 수단을 구비함을 특징으로 하는,

방선균 유래의 표적 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 기능을 결정하기 위한, 컴퓨터를 이용하는 시스템.

(28) (i) 서열 2 내지 7551로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열 정보 및 당해 염기 서열이 암호화하는 폴리펩타이드의 기능 정보, 및 표적 염기 서열 정보를 입력하는 공정,

(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하는 공정,

(iii) 당해 데이터 기록 수단에 의해 기록된, 서열 1의 염기 서열 정보와 표적 염기 서열 정보를 비교하는 공정 및

(iv) 서열 2 내지 7551로부터 선택된 하나 이상의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드와 일치하거나 유사한 표적 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 폴리펩타이드의 기능을 결정하는 공정을 포함함을 특징으로 하여,

방선균 유래의 표적 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드의 기능을 결정하기 위해, 컴퓨터를 이용하는 방법.

(29) (i) 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보 및 당해 서열에 기초하는 기능 정보, 및 표적 아미노산 서열 정보를 입력하기 위한 입력 수단,

(iii) 당해 데이터 기록 수단에 의해 기록된, 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보와 표적 아미노산 서열 정보를 비교하여, 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 일치하거나 유사한 표적 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 기능을 결정하는 컴퍼레이터 수단 및

방선균 유래의 표적 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 기능을 결정하기 위한, 컴퓨터를 이용하는 시스템.

(30) (i) 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보 및 당해 서열에 기초하는 기능 정보, 및 표적 아미노산 서열 정보를 입력하는 공정,

(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하는 공정,

(iii) 당해 데이터 기록 수단에 의해 기록된, 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보와 표적 아미노산 서열 정보를 비교하는 공정 및

(iv) 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드와 일치하거나 유사한 표적 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 기능을 결정하는 공정을 포함하여,

방선균 유래의 표적 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 기능을 결정하기 위해 컴퓨터를 이용하는 방법.

(31) 방선균이 스트렙토마이세스 속, 스트렙토스포란기움 속, 아미콜라톱시스 속, 악티노플라네스 속, 노카르디오이데스 속, 슈도노카르디아 속, 악티노비스포라 속, 사카로모노스포라 속, 사카로폴리스포라속, 사카로트릭스 속, 악티노폴리스포라 속, 악티노마두라 속, 미크로비스포라 속, 미크로테트라스포라 속, 써모모노스포라 속 또는 미크로모노스포라 속에 속하는 미생물인, 상기 (23), (25), (27) 및 (29) 중의 어느 한 항에 기재된 시스템.

(32) 방선균이 스트렙토마이세스 속, 스트렙토스포란기움 속, 아미콜라톱시스 속, 악티노플라네스 속, 노카르디오이데스 속, 슈도노카르디아 속, 악티노비스포라 속, 사카로모노스포라 속, 사카로폴리스포라속, 사카로트릭스 속, 악티노폴리스포라 속, 악티노마두라 속, 미크로비스포라 속, 미크로테트라스포라 속, 써모모노스포라 속 또는 미크로모노스포라 속에 속하는 미생물인, 상기 (24), (26), (28) 및 (30) 중의 어느 한 항에 기재된 방법.

(33) 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물이 스트렙토마이세스 아베르미틸 리스로부터 선택되는 미생물인, 상기 (31)에 기재된 시스템.

(34) 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물이 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 선택되는 미생물인, 상기 (32)에 기재된 방법.

(35) 서열 1의 염기 서열 정보 또는 당해 서열에 기초하는 기능 정보를 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체로서, 상기 (23) 또는 (27)에 기재된 시스템, 또는 (24) 또는 (28)에 기재된 방법에 이용할 수 있는 기록 매체 또는 기억 장치.

(36) 서열 7552 내지 15101로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열 정보 또는 당해 서열에 기초하는 기능 정보를 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체로서, 상기 (25) 또는 (29)에 기재된 시스템, 또는 (26) 또는 (30)에 기재된 방법에 이용할 수 있는 기록 매체 또는 기억 장치.

(37) 컴퓨터로 판독가능한 매체가 플로피 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 랜덤 액세스 메모리(RAM), 읽기 전용 메모리(ROM), 자기 광학 디스크(MO), CD-ROM, CD-R, CD-RW, DVD-ROM, DVD-RAM 및 DVD-RW로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 (35) 또는 (36)에 기재된 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체 또는 기억 장치.

(38) (i) 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산, 항생 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 발효법에 의해 생산할 수 있도록 변이 육종된, 방선균 유래의 생산 균주의 게놈 또는 유전자의 염기 서열과, 서열 1에 대응하는 염기 서열을 비교하는 공정,

(ii) (i)에서 수득된 비교 결과로부터, 당해 생산 균주에 존재하는 변이점을 동정하는 공정,

(iii) (ii)의 공정에서 동정한 변이점을, 당해 변이를 갖지 않는 방선균에 도입하는 공정 및

(iv) (iii)의 공정에서 수득된 방선균의, (i)에서 선택된 화합물의 발효법에 의한 생산성을 조사하는 공정을 포함하며,

서열 1에 제시된 염기 서열 정보를 이용하는, 방선균의 육종 방법.

(39) 유전자가, 생합성 경로 또는 시그널 전달 경로 상의 효소를 암호화하는 유전자인, 상기 (38)에 기재된 육종 방법.

(40) 변이점이, 생산성을 향상시키거나 안정화시키는 유효 변이에 관한 변이점인, 상기 (38)에 기재된 육종 방법.

(41) (i) 항생 물질을 포함한 생물 활성 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 발효법에 의해 생산할 수 있도록 변이 육종된, 방선균 유래의 생산 균주의 게놈 또는 유전자 염기 서열과, 서열 1에 대응하는 염기 서열을 비교하는 공정,

(iii) (ii)의 공정에서 동정한 변이점을, 당해 변이를 갖는 방선균으로부터 제거하는 공정 및

(42) 유전자가, 생합성 경로 또는 시그널 전달 경로 상의 효소를 암호화하는 유전자인, 상기 (41)에 기재된 육종 방법.

(43) 변이점이, 생산성을 저하 또는 불안정하게 하는 변이에 관한 변이점인, 상기 (41)에 기재된 육종 방법.

(44) (i) 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산, 항생 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상의 화합물의 생합성에 관여하는 아이소자임을 서열 2 내지 7551에 제시된 염기 서열 정보에 기초하여 동정하는 공정,

(ii) (i)의 공정에서 동정한 아이소자임을 동일 활성을 갖는 아이소자임으로 분류하는 공정,

(iii) 동일 활성을 갖는 아이소자임을 암호화하고 있는 모든 유전자를 일괄하여 변이시키는 공정 및

(iv) (iii)의 공정에서 수득된 유전자를 이용하여 형질전환시킨 방선균의, (i)에서 선택된 화합물의 발효법에 의한 생산성을 조사하는 공정을 포함하며,

서열 2 내지 7551에 제시된 염기 서열 정보를 이용하는, 방선균의 육종 방법.

(45) (i) 서열 2 내지 7551에 제시된 오픈 리딩 프레임(ORF)의 기능 정보를 정리하는 공정,

(ii) 공지된 생합성 경로 또는 시그널 전달 경로 상의 효소에 당해 정리된 ORF를 대응시키는 공정,

(iii) 방선균에 있어서 공지되어 있는 생합성 경로 또는 시그널 전달 경로에 관한 정보와 조합하여, 불명이었던 방선균에서의 생합성 경로 및 시그널 전달 경로를 해명하는 공정,

(iv) (iii)의 공정에서 해명된 경로와 목적으로 하는 유용 생산물의 생합성 경로를 비교하는 공정 및

(v) (iv)의 공정에서 목적으로 하는 유용 생산물의 생합성에 중요하다고 판단되는 경로를 강화시키기 위해, 또는 (iv)의 공정에서 목적으로 하는 유용 생산물의 생합성에는 중요하지 않은 경로를 약화시키기 위해, 서열 2 내지 7551에 제시된 염기 서열 정보에 기초하여 유전자 공학적 수법에 의해 방선균을 변이시키는 공정을 포함하며,

(46) 상기 (38) 내지 (45) 중의 어느 한 항에 기재된 육종 방법에 의해 수득되는 방선균.

(47) 방선균이 스트렙토마이세스 속, 스트렙토스포란기움 속, 아미콜라톱시스 속, 악티노플라네스 속, 노카르디오이데스 속, 슈도노카르디아 속, 악티노비스포라 속, 사카로모노스포라 속, 사카로폴리스포라속, 사카로트릭스 속, 악티노폴리스포라 속, 악티노마두라 속, 미크로비스포라 속, 미크로테트라스포라 속, 써모모노스포라 속 또는 미크로모노스포라 속에 속하는 미생물인, 상기 (46)에 기재된 방선균.

(48) 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물이 스트렙토마이세스 아베르미틸 리스로부터 선택되는 미생물인, 상기 (47)에 기재된 방선균.

(49) 상기 (46) 내지 (48) 중의 어느 한 항에 기재된 방선균을 배지에 배양하여, 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산, 항생 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 생성 축적시켜, 당해 배양물로부터 당해 화합물을 채취함을 특징으로 하는, 당해 화합물의 제조 방법.

(50) 화합물이 폴리펩타이드인, 상기 (49)에 기재된 제조 방법.

(51) (i) 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산, 항생 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 발효법에 의해 생산할 수 있도록 변이 육종된, 방선균 유래의 생산 균주 및 당해 생산 균주의 친주의 균체로부터 각각 균체 유래의 단백질을 조제하는 공정,

(ii) (i)의 공정에서 조제한 단백질을 2차원 전기영동법에 의해 분리하는 공정,

(iii) 분리된 단백질을 검출하여, 생산 균주 유래의 단백질과 친주 유래의 단백질의 각 발현량을 비교하는 공정,

(iv) 비교한 결과, 다른 발현량을 나타내는 단백질을 펩티다제로 처리하여, 펩타이드 단편을 추출하는 공정,

(v) (iv)의 공정에서 수득된 펩타이드 단편의 아미노산 서열을 해석하는 공정 및

(vi) (v)의 공정에서 수득된 아미노산 서열과 서열 7552 내지 15101에 제시된 아미노산 서열을 비교하여, 당해 아미노산 서열을 갖는 단백질을 동정하는 공정 을 포함하여,

프로테옴 해석에 기초하는, 유용 변이에 관한 단백질의 동정 방법.

여기서, 프로테옴(proteome)이란, 단백질(protein)과 게놈(genome)으로부터 이루어진 조어이며, 유전자의 발현을 폴리펩타이드의 수준으로 조절하는 방법이다.

(52) 방선균이 스트렙토마이세스 속, 스트렙토스포란기움 속, 아미콜라톱시스 속, 악티노플라네스 속, 노카르디오이데스 속, 슈도노카르디아 속, 악티노비스포라 속, 사카로모노스포라 속, 사카로폴리스포라속, 사카로트릭스 속, 악티노폴리스포라 속, 악티노마두라 속, 미크로비스포라 속, 미크로테트라스포라 속, 써모모노스포라 속 또는 미크로모노스포라 속에 속하는 미생물인, 상기 (51)에 기재된 동정 방법.

(53) 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물이 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 선택되는 미생물인, 상기 (52)에 기재된 동정 방법.

이하, 방선균의 전체 염기 서열 결정에 근거하여, 본 발명을 상세하게 설명한다.

1. 방선균의 전체 염기 서열의 결정

본 발명에서 언급되는 방선균이란 문헌[참조: Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8, 599 (1974)]에서 정의되는, 스트렙토마이세스 속, 스트렙토스포란기움 속, 아미콜라톱시스 속, 악티노플라네스 속, 노카르디오이데스 속, 슈도노카르디아 속, 악티노비스포라 속, 사카로모노스포라 속, 사카로폴리스포 라속, 사카로트릭스 속, 악티노폴리스포라 속, 악티노마두라 속, 미크로비스포라 속, 미크로테트라스포라 속, 써모모노스포라 속 또는 미크로모노스포라 속에 속하는 미생물을 말한다.

구체적으로는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 등을 들 수 있다.

보다 구체적으로는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267을 들 수 있다.

(1) 방선균의 게놈 DNA의 조제

방선균을 통상적인 방법에 의해 배양한다.

배지로서, 당해 미생물에 의해 동화될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하여, 당해 미생물의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지의 어느 것이나 사용할 수 있다.

예를 들어, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서는, 당해 배지로서, TSB 배지(17g/ℓ 펩톤, 3g/ℓ 대두 펩타이드, 5g/ℓ 염화나트륨, 2.5g/ℓ 포도당, 2.5g/ℓ 인산일수소칼륨, pH 7.3) 등을 들 수 있다. 배양 방법으로서는, 25 내지 35℃에서 밤새 배양한다.

배양 후, 배양액으로부터 원심분리에 의해 균체를 회수한다. 수득된 균체를 세정액으로 세정한다.

당해 세정액으로서, 예를 들어, STE 완충액[10.3% 슈크로스, 25mmol 트리스 염산염, 25mmol/ℓ 에틸렌디아민테트라아세트산(이하, EDTA라고 약기), pH 8.0] 등을 들 수 있다.

당해 세정 균체로부터 게놈 DNA의 취득은, 균체를 아가로스로 감싼 후, 리소자임 및 계면활성제인 SDS 또는 사르코실 등을 사용하여 당해 균체의 세포벽을 용해한 다음, 단백질을 프로테이나제 K로 분해한다. 이후, 선상 플라스미드를 제거하기 위해 게놈 DNA를 포함하는 아가로스 겔 블럭을 필드-반전(field-inversion) 전기영동을 수행한다. 구체적으로는, 하기의 방법을 예시할 수 있다.

5ml의 배양액으로부터 수득한 세정 균체를 2.5ml의 STE 완충액에 현탁하여, 2.5ml의 1.5% 펄스 필드 전기영동 샘플 조제용 저융점 아가로스(InCert agarose, 제조원: Takara Shuzo)와 혼합하여, 80mm 직경의 샤알레에 유입하고, 실온에서 30분 이상 방치하여 고화시킨다. 1 내지 5mg/ml의 리소자임을 함유하는 STE 완충액을 20ml 가하여, 30℃에서 6 내지 20시간 동안 보온하여, 세포벽을 분해한다. STE 완충액을 제거하여, TE 완충액(10mmol/ℓ 트리스 염산염, 1mmol/ℓ EDTA, pH 8.0)으로 세정하여, 1mg/ml의 프로테이나제 K를 함유하는 10ml의 용해 완충액(0.5mol/ℓ EDTA, pH 9.5, 1% 사르코실)을 가하여, 50℃에서 24시간 동안 완만하게 진탕시켜 용해시킨다. 용해 후, 완충액을 제거하여, 50mmol/ℓ EDTA, pH 8.0 용액 20ml로 수회 세정한다. 이후, 1mM PMSF를 함유하는 50mmol/ℓ EDTA, pH 8.0 용액을 20ml 가하여, 잔존하는 프로테이나제 K를 불활성화시킨다.

게놈 DNA를 함유하는 아가로스 겔을 5x5mm의 블럭으로 절단하여, 1% 아가로 스 겔(45mmol/ℓ 트리스 붕산, 1mmol/ℓ EDTA, 0.1mmol/ℓ 티오요산, pH 8.3)의 시료구에 유입하고, 전기영동 완충액을 충전시켜, 정방향 3초, 역방향 1초의 펄스 설정으로 120볼트 1만, 영동을 수행한다. 영동 완료 후, 아가로스 블럭을 취출하여, 50mmol/ℓ EDTA, pH 8.0 용액으로 세정한다. 세정한 아가로스 블럭을 65℃에 보온하여 용해시킨다. 5 내지 10ml의 트리스 중화 페놀을 가하여, 실온에서 5분 동안 완만하게 진탕시킨 다음, 5 내지 10ml의 클로로포름을 가하여 5분 동안 완만하게 진탕시킨다.

진탕시킨 후, 원심분리(10,000xg, 10분간, 20℃)를 수행하고, 수층을 분취한다. 수층을 10 내지 20ml 페놀/클로로포름 추출(2회)을 수행한 후, 수층에 1/10 양의 3mol/ℓ 아세트산나트륨 용액, 0.56배 양의 이소프로판올을 가하여, 완만하게 혼화하고, 게놈 DAN를 침전시킨다. 생성된 게놈 DNA 침전을 70% 에탄올로 세정한 다음, 공기 건조시켜, TE 완충액에 용해시킴으로써, 게놈 DNA 용액을 취득할 수 있다.

(2) 샷건 라이브러리의 작제

상기 (1)에서 조제한 방선균의 게놈 DNA를 사용하여 게놈 DNA 라이브러리를 작제하는 방법으로서는, 문헌[참조: Molecular Cloning, A laboratory Manual, Second Edition (1989)(이하, 몰레큘러 클로닝 제2판이라고 약칭한다)]에 기재된 방법을 이용할 수 있지만, 특히 샷건법에 의한 전체 염기 서열의 결정에 사용하는데 적절한 게놈 DNA 라이브러리의 작제법으로서는 다음에 기재된 방법을 예시할 수 있다.

상기 (1)에서 조제한 방선균의 게놈 DNA 0.01mg을 전체량 0.4ml로 되도록 TE 완충액 등의 완충액을 가하여, 하이드로쉐어(HydroShare)(제조원: GeneMachines)를 사용하여, 1 내지 2kb의 단편으로 분단한다. 하이드로쉐어의 처리 조건으로서는 출력 6에서 20회 처리하는 조건을 들 수 있다. 수득된 게놈 DNA 단편은 SizeSep400 Span 칼럼(SeparoseCL4B, 제조원: Amasham)을 통과시켜, 500bp 이하의 단편을 제거한다. 500bp 이하의 단편을 제거한 DNA 단편의 말단을 DNA 블런팅 키트(DNA blunting Kit, 제조원: Takara Shuzo) 등을 사용하여 평활화한다.

당해 DNA 용출액을 페놀/클로로포름 처리 후, 에탄올 침전시켜, 게놈 라이브러리 삽입체를 취득한다.

당해 삽입체를 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase, 제조원: Takara Shuzo) 등을 사용하여, 적당한 벡터, 예를 들어, pUC118 HincII/BAP(제조원: Takara Shuzo) 등에 연결한다. 연결 조건으로서는, 10 내지 20℃에서 20 내지 50시간 동안 정치하는 조건을 들 수 있다.

수득된 연결 반응물을 에탄올 침전시켜, 5 내지 20㎕의 TE 완충액에 용해시킨다. 당해 연결 용액 0.5 내지 2㎕를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 대장균을 형질전환시킨다. 당해 형질전환 방법으로서는, 대장균 DH5α를 사용한 전기천공법을 예시할 수 있다. 전기천공법은 10 내지 25kV/cm의 조건으로 수행할 수 있다.

형질전환된 대장균을, 한천을 함유하는 적당한 선택 배지, 예를 들어, 클로닝벡터로 pUC18을 사용하는 경우에는, 10 내지 100mg/ℓ의 암피실린을 함유하는 LB 평판 배지[한천을 1.5% 함유하는 LB 배지(10g/ℓ 박토트립톤, 5g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ 염화나트륨, pH 7.0)]에 도포하여 배양한다. 형질전환체는 당해 평판 배지 위에 형성되는 콜로니로서 취득할 수 있다. 이때, 평판 배지에 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인딜-β-D-갈락토피라노시드) 및 IPTG(이소프로필-β-티오갈락토피라노시드)를 첨가하여 둘 경우, 게놈 DNA를 함유하는 재조합체 DNA를 보유하는 형질전환주를 백색 콜로니로서 선택할 수 있다.

당해 형질전환체는 0.1mg/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지를 0.05ml씩 첨가한 96웰 역가 플레이트 중에서 정치 배양한다. 당해 배양에 의해 수득된 배양액은 하기 (4)의 실험에 사용할 수 있다. 또한, 당해 배양액에 50% 글리세롤을 0.05ml씩 첨가, 혼합함으로써, 당해 배양액을 -80℃로 보존하는 것이 가능하여, 필요시에 사용할 수 있다.

(3) 코스미드 라이브러리의 작성

상기 (1)에서 조제한 방선균의 게놈 DNA 0.1mg을 제한 효소, 예를 들어, MboI 등으로 부분 분해하고, 저융점 아가로스를 사용하여 필드-반전 전기영동을 수행한다.

영동 후, 약 40kb의 단편을 다량 함유하는 아가로스 겔 분획을 수집하여, 당해 아가로스 겔을 65℃에서 용해시킨다. 용해액을 순차적으로 페놀 처리, 클로로포름으로 처리한 후, 수층을 분취하여 에탄올 침전시킨다.

수득된 DNA 단편을, 당해 단편과 연결할 수 있는 부착 말단을 갖는 코스미드 벡터에 연결한다. 예를 들어, 게놈 DNA를 MboI을 사용하여 부분 분해하는 경우에는, 당해 부분 분해물을 pKU402[참조: Actomycetol, 8, 21-25 (1994)]의 BamHI 부위에 연결할 수 있다.

수득된 연결 산물은 Molecular Cloning 제2판에 기재된 방법에 따라 조제할 수 있는 패키징 추출물 등을 사용하여 패키징한 다음, 대장균의 형질전환에 사용할 수 있다. 구체적으로는, 시판하는 패키징 추출물인 레디-투-고 람다 패키징 키트(Ready-To-Go Lambda Packaging Kit, 제조원: Amasham) 등을 사용하여, 첨부 실험 수순서에 따라 패키징하여 대장균 XL-1-BlueMR(제조원: Stratagene)주 등에 도입할 수 있다.

형질전환된 대장균은 암피실린을 함유하는 LB 평판 배지에 도포하여 배양한다. 형질전환체는 당해 평판 배지 위에 형성된 콜로니로서 취득할 수 있다. 당해 형질전환체를, 암피실린 0.1mg/ml를 함유하는 LB 배지 0.05ml를 첨가한 96웰 역가 플레이트 중에서 정치 배양한다.

배양에 의해 수득된 배양액은 하기 (4)의 실험에 사용할 수 있다. 당해 배양액에 50% 글리세롤을 함유하는 LB 배지를 0.05ml씩 첨가, 혼합함으로써, 당해 배양액을 -80℃로 보존하는 것이 가능하여, 필요시에 사용할 수 있다.

(4) 염기 서열의 결정

(4-1) 주형의 조제

방선균 게놈 DNA의 전체 염기 서열은 전체 게놈 샷건법[참조: Science, 269, 496-512 (1995)]을 기본으로 하여 결정할 수 있다.

전체 게놈 샷건법에서 사용하는 주형으로서는, 상기 (2)에서 조제한 라이브러리를 사용하여 PCR에 의해 조제할 수 있다[참조: DNA Research, 5, 1-9 (1998)].

구체적으로는, 하기의 방법으로 주형을 조제할 수 있다.

암피실린 0.1mg/ml를 함유하는 LB 배지를 웰당 0.08ml씩 분주한 96웰 역가 플레이트의 각 웰에 전체 게놈 샷건 라이브러리 유래 클론을 레플리케이터(제조원: GENETIX)로 식균하여, 30℃에서 밤새 정치 배양을 수행한다.

당해 배양액을 멸균수로 40배 희석하여, 이의 5㎕를 100㎍/ml의 M13 정방향(GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG)(서열 15104) 및 역방향 프라이머(TCCGGCTCGTATGTTGTGTGGA)(서열 15105), Ex Taq 완충액(제조원: Takara Shuzo), 5mmol/ℓ dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0.25U TaKaRa Ex Taq(제조원: Takara Shuzo)를 함유하는 용액 5㎕와 혼합하여, Biometra(제조원: Biotron)를 사용하여, 96℃에서 5분, 이어서, 96℃에서 15초, 70℃에서 60초의 사이클을 20 내지 40회 수행하고, 삽입 단편의 증폭을 수행한다. 또한, 증폭 반응에는 96웰 연결 플레이트(제조원: PE Biosystems) 등을 사용할 수 있다.

PCR 산물 정제용 키트(제조원: Amersham Pharmacia Biotech)에 의해 잉여 프라이머 및 뉴클레오타이드의 제거를 수행하여, 이것을 서열분석 반응의 주형으로서 사용한다.

일부의 염기 서열 결정은 이본쇄 DNA 플라스미드를 주형으로 하여 수행할 수 있다. 주형으로서 사용하는 이본쇄 DNA 플라스미드는 하기의 방법으로 취득할 수 있다. 암피실린 0.1mg/ml를 함유하는 TSB 배지(17g/ℓ 펩톤, 3g/ℓ 대두 펩톤, 5g/ℓ 염화나트륨, 2.5g/ℓ 포도당, 2.5g/ℓ 인산일수소칼륨, pH 7.3)를 1ml씩 분주한 96웰 플레이트의 각 웰에 전체 게놈 샷건 라이브러리 유래 클론을 식균하여, 30℃에서 밤새 진탕 배양을 수행한다. 당해 배양액으로부터 플라스미드 자동 조제기 KURAB0 PI-50(제조원: Kurabo Industries), MultiScreen(제조원: Millipore) 등을 사용하고, 제조사(Kurabo Industries 또는 Millipore)의 프로토콜에 따라 이본쇄 DNA 플라스미드를 조제할 수 있다. 수득된 정제 이본쇄 DNA 플라스미드를 0.1mg/ml 정도가 되도록 물에 용해시켜, 서열분석의 주형으로서 사용할 수 있다.

(4-2) 서열분석 반응

서열분석 반응은 시판하는 서열 키트 등을 사용하여 수행할 수 있으며, 구체적으로는 하기한 방법을 예시할 수 있다.

ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(제조원: PE Biosystems) 용액 6㎕에 대하여 M13 정방향 프라이머(M13-21) 또는 M13 역방향 프라이머(M13REV)[참조: DNA Research, 5, 1-9 (1998)]를 각각 1 내지 2pmol 및 상기 (4-1)에서 조제한 주형(PCR 산물 또는 플라스미드) 50 내지 200ng를 혼합하여, 10㎕의 서열분석 반응액을 조제한다.

당해 반응액을 사용하고, Biometra(제조원: Biotron) 등을 사용하여, 35 내지 55사이클의 다이 터미네이터(dye terminator) 서열분석 반응을 수행한다. 사이클 파라미터는 시판하는 키트, 예를 들어, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit 등에 부속하는 매뉴얼에 따라 수행할 수 있다.

샘플의 정제는 MultiScreen HV 플레이트(제조원: Millipore) 등의 시판 제품을 사용하여, 시판 제품에 부속된 매뉴얼에 따라서 Sephadex G50(제조원: Pharmacia) 등을 사용하여 수행할 수 있다.

정제된 반응물을 직접 분석에 사용한다. 당해 반응물은 -20℃에서 암소(暗所)에서 보존할 수 있으며, 필요시에 사용할 수 있다.

당해 반응물은 시판 서열분석기 및 분석기를 사용하여, 부속 매뉴얼에 따라서 분석할 수 있다.

시판 서열분석기로서는, ABI 3700 DNA 서열분석기(제조원: PE Biosystems), MegaBace 1000 서열분석기(제조원: Amasham) 등을 들 수 있다. 분석기로서는, ABI PRISM 3700 DNA Analyser(제조원: PE Biosystems) 등을 들 수 있다.

(5) 어셈블리

상기 (4)에서 수득된 서열 정보의 해석에 사용하는 베이스 콜(base call)에는 phred(The University of Washington) 등의 소프트웨어를 사용할 수 있다. 벡터 서열 정보를 제거하는데는, Cross Match(The University of Washington), SPS Cross Match(제조원: Southwest Parallel Software) 등의 소프트웨어를 사용할 수 있다.

어셈블리에는 phrap(The University of Washington), SPS phrap(제조원: Southwest parallel Software) 등의 소프트웨어를 사용할 수 있다.

상기한 해석 및 결과의 출력 작업에는 UNIX, Windows, Macintosh 등의 컴퓨터를 사용할 수 있다. 어셈블리의 결과, 수득되는 콘티그는 그래피컬 에디터 consed(The University of Washington) 등을 사용하여 해석할 수 있다. 베이스 콜로부터 어셈블리까지의 일련의 작업을 consed에 부속하는 스크립트 phredPhrap를 이용하여 일괄적으로 수행할 수 있다.

본 발명에서, 소프트웨어는 컴퍼레이터(비교기)로도 기재한다.

(6) 갭 부분의 염기 서열 결정

상기 (3)에서 구축한 코스미드 라이브러리 중의 각 코스미드를 (4-1)에 기재한 이본쇄 DNA 플라스미드 조제와 동일한 방법으로 조제한다. 이러한 코스미드의 삽입 단편 말단부의 염기 서열을 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(제조원: PE Biosystems) 등의 시판 키트를 이용하여, 부속 매뉴얼에 따라 결정한다.

코스미드 약 4,000개 클론의 삽입 단편의 양쪽 말단의 서열분석을 수행하여, 이의 서열과 일치하는 (5)에서 수득된 샷건 서열분석 유래 콘티그 중의 염기 서열을 검색한다. 당해 작업에 의해 각 코스미드 클론과 각 콘티그의 연쇄 관계를 해명하여, 상호 정렬화를 수행한다.

또한, 콘티그로는 커버되지 않는 영역(갭부)의 서열은 하기의 방법으로 결정한다. 콘티그의 말단에 위치하는 서열을 함유하는 클론을 선별한다. 이들 중에서, 삽입 단편의 한쪽 말단의 서열밖에 결정되어 있지 않은 클론을 선별하여, 삽입 단편의 역말단의 서열을 결정한다. 2개의 콘티그에 삽입 단편의 각각의 말단의 서열이 함유되도록 전체 게놈 유래 샷건 라이브러리 클론 또는 코스미드 클론을 동정하여, 당해 클론의 삽입 단편의 전체 염기 서열을 결정한다. 당해 방법에 의해, 이러한 갭 부분의 염기 서열을 결정할 수 있다. 갭 부분을 커버하는 샷건 라이브러리 클론 또는 코스미드 클론이 부재하는 경우에는, 이의 콘티그 말단의 서열에 상보하는 프라이머를 작성하여 PCR에 의해 갭 영역의 DNA 단편을 증폭시킨다. 당해 증폭 DNA 단편을 주형으로서 사용하는 프라이머 워킹법에 의해 또는 당해 증폭 DNA 단편으로부터 조제한 샷건 클론의 서열을 결정하는 샷건법에 의해 서열분석을 수행하여, 당해 영역의 염기 서열을 결정할 수 있다.

서열 정밀도가 낮은 영역에 관해서는 consed(The Uhiversity of Washington)의 AUT0FINISH 기능과 NAVIGATING 기능을 이용하여 프라이머를 합성하여, 프라이머 워킹법에 의해 서열 결정을 수행하여 서열 정밀도를 높일 수 있다.

이와 같이 결정되는 전체 게놈의 염기 서열로서, 예를 들어, 서열 1에 제시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267주 게놈의 전체 염기 서열을 들 수 있다.

(7) 서열 1에 제시된 염기 서열을 이용한 미생물 게놈 DNA의 염기 서열의 결정

상기에서 결정된 서열 1에 제시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267주 게놈의 전체 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 염기 서열을 서열 1에 제시된 염기 서열을 이용하여 결정할 수 있으며, 본 발 명의 서열 1에 제시된 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드이다. 본 발명의 서열 1에 제시된 염기 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드란 서열 1에 제시된 염기 서열에서 연속한 5 내지 50개 염기로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여, 예를 들어, 염색체 DNA를 주형으로 하는 PCR법을 이용하여, 이의 염색체 DNA의 전체 염기 서열을 결정할 수 있는 폴리뉴클레오타이드이다.

전체 염기 서열을 결정하는데 특히 바람직한 프라이머는 서로 300 내지 500bp 정도 떨어져 위치하는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드이며, 당해 올리고뉴클레오타이드 중에서도 주요 대사 경로에 관련된 단백질을 암호화하는 DNA로부터 선택된 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 특히 바람직하다. 당해 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 염색체 DNA의 전체 염기 서열을 결정할 수 있는 폴리뉴클레오타이드로서는, 예를 들어, 방선균에 속하는 미생물 유래의 염색체 DNA를 구성하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있으며, 바람직하게는 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물 유래의 염색체 DNA를 구성하는 폴리뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 염색체 DNA를 구성하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.

2. 전체 게놈 염기 서열 정보를 이용한 오픈 리딩 프레임[open reading frame(전사 해독틀; 이하, ORF로 약기한다] 및 발현 조절 단편의 동정 및 ORF의 기능 추정

상기 1.에 의해 결정된 방선균 유래의 게놈의 전체 염기 서열 정보에 의해, ORF 및 발현 조절 단편을 동정할 수 있으며, 또한 동정된 ORF의 기능을 추정할 수 있다.

ORF란 mRNA의 염기 서열 중에서 아미노산 서열로서 해독되며, 단백질로 될 수 있는 연속된 영역이며, mRNA의 ORF를 암호화하는 DNA 상의 영역도 ORF라고 불린다.

발현 조절 단편(expression modulating fragment, 이하, EMF로 약기한다)이란 작동적으로 연결된 ORF 또는 이외의 서열의 발현을 조절하는 일련의 폴리뉴클레오타이드 단편을 의미한다. 「작동적으로 연결된 서열의 발현을 조절한다」란 EMF의 존재에 의해 서열의 발현이 변화하는 것을 의미한다. EMF로서는, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 사일런서(silencer), 리보솜 결합 서열, 전사 종결 서열 등을 들 수 있다. 방선균의 경우, EMF는 통상적으로 유전자간 절편(2개의 유전자 사이에 있는 단편; 길이 약 10 내지 200개 뉴클레오타이드)에 존재한다. 즉, 길이가 10개 뉴클레오타이드 이상인 유전자간 절편에는, EMF가 존재하는 경우가 많다. EMF는 또한 공지된 EMF의 서열을 표적 서열, 표적 구조 모티브(또는 표적 모티브)에 사용하여, FASTA[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-48 (1988)], BLAST[참조: J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990)] 등의 적당한 소프트웨어 또는 컴퍼레이터에 의해 추정할 수 있다. 또는, 공지된 EMF 포획 벡터(예를 들어, pKK232-8; 제조원: Amersham Pharmacia Biotech)에 의해 동정 및 평가할 수 있다.

「표적 서열」이란 6개 이상의 뉴클레오타이드의 염기 서열 또는 2개 이상의 아미노산 서열 또는 당해 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열이다. 표적 서열은 서열이 길어질수록, 데이터베이스 중에 랜덤하게 나타날 가능성은 적어진다. 표적 서열의 가장 바람직한 길이는 약 10 내지 100개의 아미노산 또는 약 30 내지 300개의 뉴클레오타이드 잔기이다.

「표적 구조 모티브」 또는 「표적 모티브」란 임의의 합리적으로 선택되는 서열 또는 서열의 조합을 말하며, 당업자에게 공지된 수단에 의해 폴리펩타이드를 중첩시킬 때에 형성되는 3차원 구조에 근거하여 선택되는 것으로, 다양한 모티브가 공지되어 있다.

폴리펩타이드의 표적 모티브는, 예를 들어, 효소 활성 부위, 단백질-단백질 상호 작용 부위나 시그널 서열이지만, 이들에 한정되지 않는다. 핵산의 표적 모티브로서는, 프로모터 서열, 전사 조절 인자 결합 서열이나 헤어핀 구조 등을 들 수 있다.

유용성이 높은 EMF로서는, 예를 들어, 고효율 프로모터나 유도 발현 프로모터를 들 수 있다. 이들의 취득은 발현이 높은 것으로 나타나고 있거나, 또는 예상되는 유전자(예를 들어, 리보솜 RNA 유전자: GenBank 수탁번호 M16175, Z46753)나 목적하는 유도 패턴을 나타내는 유전자(예를 들어, 아세트산으로 유도되는 이소시트르산 리아제 유전자: 일본 공개특허공보 제(평)5-56782호)의 염기 서열을 상기 1.에서 결정한 전체 게놈 염기 서열과 정렬하여 위치를 결정하고, 이의 상류 부분(통상적으로 해독 개시 위치로부터 200 내지 500개 뉴클레오타이드)의 게놈 단편을 단리하는 것에 의해 가능할 수 있다. 또한, 상기 EMF 포획 벡터로 포획한 프로모 터 중에서 고효율의 것이나, 목적하는 유도 패턴을 나타내는 것을 선택함으로써, 유용성이 높은 EMF를 취득할 수 있다.

ORF의 동정은 개개의 ORF에 공통하는 특징을 추출하여, 여기에 근거하는 일반적 모델을 구축하여, 대상 서열과 이의 모델의 적합도를 측정함으로써 실시할 수 있다. 당해 동정에는 GeneMark[참조: Nuc. Acids. Res., 22, 4756-67 (1994): 제조원: GenePro], GeneMark.hmm(제조원: GenePro), GeneHacker[참조: 단백질 핵산 효소, 42, 3001-07 (1997)], Glimmer[참조: The Institute of Genomic Research; Nuc. Acids. Res. 26, 544-548 (1998)] 등의 소프트웨어를 사용할 수 있다. 통상적으로, 이들 소프트웨어를 사용하는 예측에는 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 사용하지만, 필요에 따라 파라미터를 변경할 수 있다.

상기한 예측 작업에는 UNIX, Windows, Macintosh 등의 컴퓨터를 사용할 수 있다. 당해 방법에 의해 예측되는 ORF로서, 예를 들어, 서열 1에 제시된 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 게놈 중에 존재하는 서열 2 내지 7551에 제시된 염기 서열을 갖는 ORF 등을 들 수 있다. 당해 ORF에는 서열 7552 내지 15101에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 암호화되어 있다.

ORF의 기능 추정은 동정된 ORF의 아미노산 서열을 GenBank 데이터베이스, 0WL 등 유래의 단백질 암호화 영역으로 이루어진 데이터베이스인 Swiss-Prot, PIR, GenBank-nr-aa, GenPept의 아미노산 데이터베이스에 대하여, 상동성 검색 소프트웨어 BLAST, FASTA, Smith & Waterman 등을 사용한 공지된 호모로그 서열과의 상동성 검색을 수행함으로써 실시할 수 있다.

또한, 상동성 검색에 의해, 공지된 단백질의 아미노산 서열과의 동일성 및 유사성도 해석할 수 있다. 동일성이란, 예를 들어, 3개의 아미노산 위치가 다른 10개 아미노산 길이의 2개의 폴리펩타이드는 70%의 동일성을 갖는 것을 의미한다. 또한, 서로 다른 3개의 아미노산 중의 1개에 관해서 아미노산은 상이하여도 유사(예를 들어, 로이신과 이소로이신)이면 80%의 유사성을 갖는 것으로 한다.

이와 같이, 본 발명의 방법에 따라서, 방선균 유래의 게놈의 전체 염기 서열를 결정함으로써, 방대한 수의 방선균 유래의 신규 유전자를 동정할 수 있으며, 또한 당해 유전자의 기능의 추정이 가능하다. 방선균은 산업상 유용한 미생물이므로, 동정된 유전자의 대부분은 산업상 유용하다.

또한, 추정된 기능을 분류하는 것으로 이의 미생물의 특징이 분명해지며, 육종상의 귀중한 정보를 수득할 수 있다.

또한, 상기에서 수득한 방선균 유래의 ORF 정보로부터, 당해 미생물에서 대응하는 ORF를 Molecular Cloning 제2판 등에 기재된 통상적인 방법에 의해 조제하여, 취득할 수 있다. 즉, ORF에 인접하는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하여, 이를 프라이머로서, 방선균으로부터 수득한 염색체 DNA를 주형으로서 사용하여, 통상적인 PCR 클로닝 기법에 의해 ORF를 단리, 취득할 수 있다. 이와 같이 취득되는 ORF 서열로서, 예를 들어, 서열 2 내지 7551 중의 어느 하나에 제시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.

ORF 또는 프라이머는 상기 서열 정보에 근거하여, 폴리뉴클레오타이드 합성기를 사용해도 조제할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드로서는, 상기에서 취득된 ORF의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 및 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다. 본 발명에서 말하는 폴리뉴클레오타이드는, 일본쇄 및 이본쇄 DNA 및 일본쇄 RNA를 함유하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기에서 취득된 ORF의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에는 당해 ORF의 축퇴성 변이체가 포함된다. 축퇴성 변이체란 염기 서열에서는 본 발명의 ORF의 서열과 상이하지만, 유전 암호화의 축퇴성에 의해 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 말한다.

구체적인 예로서는, 서열 1 내지 7551 중의 어느 하나에 제시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 등을 들 수 있다.

엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드는 상기에서 동정된 ORF의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 프로브로서, 콜로니 하이브리드화 방법, 플라크 하이브리드화 방법 또는 서던 블롯 하이브리드화 등을 이용함으로써 수득되는 폴리뉴클레오타이드를 의미하며, 구체적으로는 콜로니 또는 플라크 유래의 폴리뉴클레오타이드를 고정화시킨 필터를 사용하여, 0.7 내지 1.0mol/ℓ의 염화나트륨 존재하에, 65℃에서 하이브리드화를 수행한 다음, 0.1 내지 2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150mmol/ℓ 염화나트륨, 15mmol/ℓ 시트르산나 트륨으로 이루어진다)을 사용하여, 65℃ 조건하에 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.

하이브리드화는 문헌[참조: Molecular Cloning 제2판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)(이하, Current Protocols in Molecular Biology로 생략한다), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, 0xford University (1995)] 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 수행할 수 있다. 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드로서 구체적으로는, FASTA, BLAST, Smith-Waterman[문헌: Meth. Enzym., 164, 765 (1988)] 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 사용하여 계산할 때에, 서열 2 내지 7551에 제시된 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로서, 서열 7552 내지 15101 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로서, 서열 1에 제시된 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 있어서 서열 2 내지 7551로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 5' 상류 또는 3' 하류 영역에 위치하며, 당해 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 활성을 갖는 폴리뉴클레오 타이드를 들 수 있다. 당해 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드로서 구체적으로는, 상술한 EMF, 즉 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서, 사일런서, 리보솜 결합 서열, 전사 종결 서열 등을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 들 수 있다.

상기 PCR 클로닝 기법에 의해 ORF를 취득할 때에 사용하는 프라이머로서는, 당해 ORF 및 인접하는 영역의 염기 서열 중의 연속한 10 내지 200개 염기와 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 또는 당해 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 들 수 있다. 예를 들어, 서열 1 내지 7551 중의 어느 하나에 기재된 염기 서열 중의 연속한 10 내지 200개 염기와 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 또는 당해 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 들 수 있다. 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머로서 사용하는 경우에는, 양자의 융해 온도(Tm) 및 염기수가 극단적으로 변하지 않는 상기한 올리고뉴클레오타이드가 바람직하다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드로서, 서열 1 내지 7551 중의 어느 하나에 제시된 염기 서열 중 연속한 10 내지 200개 염기와 동일한 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 또는 당해 올리고뉴클레오타이드와 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 들 수 있다.

또한, 이들 올리고뉴클레오타이드의 유도체(이하, 올리고뉴클레오타이드 유도체라고 한다)도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드로서 이용할 수 있다.

당해 올리고뉴클레오타이드 유도체로서는, 올리고뉴클레오타이드 중의 인산 디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중 인산디에스테르 결합이 N3'-P5' 포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 리보스와 인산디에스테르 결합이 펩타이드 핵산 결합으로 변환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 우라실이 C-5 프로피닐우라실로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 우라실이 C-5 티아졸우라실로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 시토신이 C-5 프로피닐시토신으로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중 시토신이 페녹사진-변형된 시토신(phenoxazine-modified cytosine)으로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체, 올리고뉴클레오타이드 중의 리보스가 2'-O-프로필리보스로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체 또는 올리고뉴클레오타이드 중의 리보스가 2'-메톡시에톡시리보스로 치환된 올리고뉴클레오타이드 유도체 등을 들 수 있다[참조: Cell Engineering, 16, 1463 (1997)].

본 발명의 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 유도체는 프라이머 이외에도 하기의 하이브리드화용 프로브 또는 안티센스 핵산으로서도 유용하다.

안티센스 핵산으로서 사용하는 경우에는, 상기한 올리고뉴클레오타이드에 제한되지 않으며, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건으로 하이브리드화하며, 또한 당해 폴리뉴클레오타이드가 암호화하는 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 활성을 갖는 폴리뉴클레오타이드이면 사용할 수 있다.

3. 아이소자임의 결정

방선균을 사용하여 유용한 미생물 활성 물질이 다수 생산되어 있다.

이와 같은 생물 활성 물질로서는, 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산, 항생 물질 등을 들 수 있다.

방선균에 있어서 이러한 유용한 생물 활성 물질의 생산의 생산 효율을 향상시키기 위해 다수의 유용한 변이주가 취득된다.

그러나, 상기 미생물에서는 유전자 서열 정보의 발견이 적으므로, 주로 니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이제에 의한 변이 조작에 의해 유용 변이주가 취득된다.

상기 변이제에 의한 변이법으로서는, 랜덤하게 유전자를 변이시킬 수 있지만, 중간 물질의 대사에 관련하는 유사 성질을 갖는 아이소자임을 암호화하는 각각의 유전자를 일괄적으로 변이시키는 것은 곤란하다. 또한, 변이제에 의한 변이법으로서는, 랜덤하게 유전자가 변이하므로, 생육 지연이나 발포성 상승 등의 배양 특성 저하를 가져오는 유해한 변이도 동시에 부여될 가능성이 높다.

그러나, 유전자 서열 정보가 있으면, 목적하는 아이소자임을 암호화하는 모든 유전자를 목적에 따라 모두 변이시키는 것이 가능해지며, 목적하는 유전자 이외의 유해한 변이가 도입되는 경우는 없다.

즉, 상기 2.에서 동정된 ORF 정보에 의해 방선균 중의 목적하는 아이소자임의 정확한 수, 서열 정보를 취득할 수 있으며, 당해 서열 정보를 이용하여, Molecular Cloning 제2판 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법 등에 의해, 목적하는 아이소자임 유전자 모두를 목적하는 성질을 갖는 유전자로 변이시켜, 유용 물질의 생산성이 향상된 유용 변이주를 취득할 수 있다.

4. 생합성 경로 및 시그널 전달 경로의 해명

생합성 경로 및 시그널 전달 경로는 다수의 생물에서 해명이 시도되고 있으며, 많은 발견이 있었다. 그러나, 방선균에서는 아직 많은 유전자가 동정되어 있지 않으므로, 불명인 점이 다수 존재한다.

이러한 불명인 점은 하기 방법에 의해 해명할 수 있다.

상기 2.의 방법에 의해 동정된 방선균 유래의 ORF의 추정 기능 정보를 정리한다. 여기서 말하는 「정리」란, 추정된 기능 정보에 따라 각각의 ORF가 어떠한 물질의 생합성 경로 또는 어떠한 시그널 전달 경로에 속하는지를, 공지된 정보를 이용하여 분류하는 것을 말한다. 다음에, 공지된 타생물의 생합성 경로 또는 시그널 전달 경로 상의 효소에 당해 정리된 ORF를 대응시킨다. 방선균에 있어서 공지되어 있는 정보와 조합하여, 불명이던 방선균에서의 생합성 경로 및 시그널 전달 경로를 해명할 수 있다.

불명이거나 명확하지 않던 경로를 해명함으로써, 목적하는 유용 생산물을 생산하기 위한 유용 변이주를 우수한 효율로 취득할 수 있다.

즉, 명확해진 경로가 목적하는 유용 생산물의 생합성에 중요하다고 판단되는 경우에는, 당해 경로를 강화시킨 변이주를 취득함으로써 유용 변이주를 취득할 수 있다. 또한, 명확해진 경로가 목적하는 유용 생산물의 생합성에는 중요하지 않다 고 판단되는 경우에는, 당해 경로의 이용 빈도를 저하시킨 변이주를 취득함으로써 유용 변이주를 취득할 수 있다.

5. 유효 변이점의 해명

방선균에 있어서, 항생 물질을 포함한 생물 활성 물질 등의 유용 생산물의 생산에 적합하고 유용한 변이주가 다수 취득되어 있지만, 어떠한 변이점을 유전자에게 부여하면 생산성을 향상시키는 것이 가능한가는 거의 공지되어 있지 않다.

그러나, 방선균으로부터 변이 수법에 의해 육종된 생산 균주의 게놈 DNA의 목적하는 서열을 상기 1. 및 2.의 방법에 의해 결정된, 방선균 유래의 대응하는 게놈 DNA 및 ORF의 염기 서열과 비교 해석함으로써, 생산 균주가 갖는 변이점을 동정할 수 있다.

또한, 대사 경로나 대사 조절 메카니즘, 효소의 구조 활성 상관 등에 관한 기지의 정보에 근거하면, 이들의 변이점 중에서 생산에 기여하고 있는 유효 변이점을 용이하게 특정할 수 있다.

기지의 정보에 의해 유효 변이의 특정이 어려운 경우에는 동정된 변이점을 방선균의 야생형주 또는 당해 변이를 갖고 있지 않은 생산균에 도입하여, 생산에 플러스의 효과를 가져오는지 여부를 확인할 수 있다.

6. 공업적으로 유리한 생산 균주의 육종 방법

항생 물질을 포함한 생물 활성 물질 등의 목적으로 하는 유용 생산물의 발효 생산에 공업적으로 사용되고 있는 생산 균주는 일반적으로 NTG 등의 변이제를 사용하는 랜덤 변이와 선택에 근거하는 변이 육종을 중첩시킴으로써 조성되어 있다.

변이 수법은 발효 공업에 큰 공헌을 가져왔지만, 염색체의 여러 곳에 랜덤하게 다수의 변이가 도입된다는 중대한 결점이 있다. 균주 개량도에 다수의 변이가 동일 염색체 상에 축적되어 있으므로, 변이 육종된 생산 균주는 야생형주와 비교하여, 일반적으로 생육이 나쁘거나, 당의 소비가 느리거나, 온도나 산소 등의 스트레스에 약하거나 하는 등의 성질을 갖게 되며, 생산성이 충분하게 상승되지 않고, 잡균 오염의 영향을 받기 쉬우며, 배양 관리가 번잡하게 되는 등의 실제 제조에서 제조 원가를 높이는 요인으로 되고 있다. 또한, 랜덤 변이이므로, 생산성 향상의 메카니즘은 명확하지 않으며, 하기 생산성 향상을 향한 합리적인 육종 전략을 세우기 어렵다.

본 발명에 따르면, 방선균으로부터 변이 수법에 의해 육종된 생산 균주의 염색체 상에 축적된 다수의 변이점 중에서 생산에 기여하는 유효 변이점을 효율적으로 특정할 수 있으므로, 방선균에 이들 유효 변이를 조합한다는 신규한 육종 방법을 확립할 수 있다. 당해 방법에 의해, 유용 생산균의 재구축을 수행할 수 있게 되며, 야생형주로부터도 유용 생산 균주를 구축할 수 있다.

구체적으로는, 하기의 방법으로 유용 변이주를 구축할 수 있다.

변이점 1개를 방선균의 야생형주에 도입하여 생산에 플러스의 효과를 가져오는지 여부를 조사한다. 이러한 평가로 효과가 있는 경우에는 당해 변이점을 잔류시키며, 효과가 없는 경우에는 당해 변이점을 제거한다. 다음에, 효과가 있는 변 이점만을 갖는 균주를 친주로 하여, 동일한 조작을 반복 수행한다. 일반적으로는 생합성 경로의 하류에 율속점이 존재하면, 상류의 변이의 유효성을 명확히 평가할 수 없는 경우가 있는 것으로, 이러한 방법을 이용하는 경우에는 변이점의 평가를 하류에서 상류로 향하여 순차적으로 수행하는 것이 바람직하다.

이상과 같이, 야생형주, 또는 야생형주와 같이 생육 속도나 당의 소비 능력이 높은 균주를 베이스로 유효 변이를 재구성하면, 상기와 같은 종래법의 결점을 가지지 않으며, 단시간에 발효 생산을 할 수 있거나, 발효를 보다 높은 온도에서 수행할 수 있으며, 공업적으로 유리한 균주를 조성할 수 있다.

이상과 같이, 재구축한 생산 균주를 친주로 사용하여, 통상적인 변이 처리법, 재조합 DNA 기술에 의한 유전자 증폭법이나 유전자 치환법, 형질도입법 또는 세포 융합법을 이용하여, 추가로 육종을 하면, 목적 생산물의 생산성이 한층 높아진 균주를 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 미생물로서는 육종 과정에서 2개 이상의 유효 변이를 방선균에 집적시킨다는 공정을 거친 생산 균주이면, 변이주, 세포 융합주, 형질전환주, 형질도입주 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 조성한 재조합주 중의 하나이면, 특별히 한정되는 것은 아니다.

한편, 생육이나 생산에서 유해하다고 판단되는 변이점이 특정된 경우에는, 현재 사용하고 있는 생산 균주에 당해 변이점이 존재하는지 여부를 조사하여, 당해 변이를 갖고 있는 경우에는 야생형의 유전자로 복귀시키는 것에 의해, 더욱 유용한 생산 균주로 육종할 수 있다.

이상과 같은 육종 방법은 방선균 이외의 산업상 유리한 성질을 갖는 미생물( 보다 염가인 탄소원을 신속하게 이용할 수 있는 미생물, 보다 고온이라도 생육할 수 있는 미생물 등)에도 적용할 수 있다.

7. 폴리뉴클레오타이드 어레이의 작제 및 이용

(1) 폴리뉴클레오타이드 어레이의 작제

상기 1. 및 2.에서 취득되는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제할 수 있다.

구체적으로는, 서열 2 내지 7551 중의 어느 하나에 제시된 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이들 폴리뉴클레오타이드가 갖는 염기 서열 중 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기로 이루어진 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 고체 지지체에 고착시킨 폴리뉴클레오타이드 어레이 및 서열 7552 내지 15101 중의 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드와 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이들 폴리뉴클레오타이드가 갖는 염기 서열 중의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기로 이루어진 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 고체 지지체에 고착시킨 폴리뉴클레오타이드 어레이를 들 수 있다.

본 발명에 있어서 폴리뉴클레오타이드 어레이란, DNA 칩, DNA 마이크로어레이, DNA 마크로어레이 등으로 불리는 것을 포함하며, 고체 지지체의 표면에 복수의 폴리뉴클레오타이드 또는 당해 단편을 고착시킨 것을 나타낸다.

고체 지지체로서는, 평판 유리나 나일론막 등을 사용할 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 또는 당해 단편의 고체 지지체 표면에 대한 고착에는 어레이 작제의 일반적인 수법을 이용할 수 있다. 즉, 폴리라이신 등의 폴리양이온의 부착 등의 화학적으로 표면 처리한 고체 지지체에 고착시키는 방법[참조: Nat. Genet., 21, 15-19 (1999)] 등을 사용할 수 있다. 이러한 화학적으로 표면 처리한 고체 지지체는 시판되고 있으며, 당해 시판품을 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 어레이의 고체 지지체로서 사용할 수 있다.

고체 지지체에 고착시킨 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드로서는 상기 1. 및 2.에서 취득되는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.

고체 지지체에 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 고밀도로 고착시킴으로써, 하기의 해석을 효율적으로 실시할 수 있지만, 반드시 고밀도일 필요는 없다.

고밀도로 고착시키기 위한 어레이어 로봇 등의 장치는 Takara Shuzo(GMS417 Arrayer) 등에서 시판하고 있으며, 당해 시판품을 사용할 수 있다.

또한, 사진석판술 등에 의해 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 고체 지지체 상에서 직접 합성할 수 있다[참조: Nat. Genet., 21, 20-24 (1999)]. 당해 방법에서는 우선, 광조사에 의해 제거할 수 있는 보호 그룹을 갖는 링커를 슬라이드 유리 등의 고체 지지체에 고착시킨다. 당해 고착 부위의 한정된 부분만 빛을 투과시키 기 위한 마스크(사진석판 마스크)를 통해 빛을 조사한다. 당해 영역에 광조사에 의해 제거할 수 있는 보호 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 가함으로써, 빛이 조사된 부분만 당해 뉴클레오타이드와의 연결 반응이 일어난다. 당해 조작을 반복함으로써, 영역마다 상이한 목적하는 서열의 올리고뉴클레오타이드를 합성할 수 있다. 통상적으로, 합성하는 올리고뉴클레오타이드의 길이는 10 내지 30개 염기이다.

(2) 폴리뉴클레오타이드 어레이의 이용

상기 (1)에서 작제된 폴리뉴클레오타이드 어레이를 사용하여, 하기 (a) 및 (b)를 수행할 수 있다.

(a) 방선균의 변이주의 변이점의 동정 및 게놈에 의해 암호화되는 유전자의 발현량 및 발현 프로필의 해석

방선균의 변이주 유래 유전자 또는 피검 유전자에 관해서 하기 (i) 내지 (iv)의 공정을 실시함으로써, 당해 유전자의 변이점의 동정 또는 당해 유전자의 발현량 및 발현 프로필을 해석할 수 있다.

(i) 상기 (1)의 방법으로 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하는 공정,

(ii) (i)의 공정에서 작제된 폴리뉴클레오타이드 어레이를 사용하여, 당해 폴리뉴클레오타이드 어레이 상에 고정화된 폴리펩타이드와 표지화된 방선균의 변이주 유래 유전자를 하이브리드화 조건하에 항온 처리하는 공정,

(iii) 하이브리드화를 검출하는 검출 공정 및

(iv) 하이브리드화 결과를 해석하는 해석 공정.

방선균의 변이주 유래 유전자 또는 피검 유전자로서, 예를 들어, 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 유연체로부터 선택되는 하나 이상의 생합성에 관련하는 유전자를 들 수 있다.

구체적인 방법을 하기에 상술한다.

폴리뉴클레오타이드 어레이를 사용하여, 사람의 2,300kb에 걸치는 영역 중의 SNP(1염기 다형)이 동정되어 있다[참조: Science, 280, 1077-82 (1998)]. 당해 SNP의 동정 방법 및 문헌[참조: Science, 278, 680-686 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 12833-38 (1999), Science, 284, 1520-23 (1999)] 등에 기재된 방법에 준하여, 상기 (1)에서 작제된 폴리뉴클레오타이드 어레이 및 방선균 유래의 핵산 분자(DNA, RNA)를 사용하여, 하이브리드화법에 의해 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 등에 유용한 당해 미생물의 유용 변이주의 변이점의 동정 및 유전자 발현량 및 발현 프로필의 해석이 가능하다.

방선균 유래의 핵산 분자(DNA, RNA)의 취득은 Molecular Cloning 제2판 등에 기재된 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 통상적으로, 목적하는 mRNA 이외에 대과잉의 리보솜 RNA(rRNA)도 취득되지만, 해석상 큰 지장은 되지 않는다.

취득된 방선균 유래의 핵산 분자를 표지화한다. 당해 표지에는 형광 색소를 사용하는 방법이나 방사성 동위원소를 사용하는 방법 등이 사용된다.

구체적으로는, 미생물로부터 추출한 RNA에 솔라렌-비오틴을 자외선광으로 가교결합시켜, 하이브리드화 반응 후에 스트렙토아비딘을 결합시킨 형광 색소를 비오 틴 잔기에 결합시킴으로써 표지화하는 방법[참조: Nat. Biotechnol., 16, 45-48 (1998)], 미생물로부터 추출한 RNA를 주형으로, 랜덤 프라이머를 프라이머로 하는 역전사 반응을 수행하여, 형광 색소, 예를 들어, Cy3, Cy5를 결합시킨 dUTP(제조원: Amersham Pharmacia Biotech)를 cDNA에 취입함으로써 표지화하는 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 12833-38 (1999)] 등을 들 수 있다.

랜덤 프라이머 대신에 ORF의 3' 말단의 상보 서열군을 프라이머로 사용하는 것으로 표지의 특이성을 보다 높일 수 있다[참조: J. Bacteriol., 181, 6425-40 (1999)].

하이브리드화법에 있어서, 하이브리드화 및 이후의 세정 조작은 통상적인 방법으로 수행할 수 있다[참조: Nat. Biotechnol., 14, 1675-80 (1996) 등].

당해 조작 후, 표지에 사용하는 핵산 분자의 하이브리드화 양에 따른 하이브리드화의 강도를 측정함으로써, 변이점의 동정 및 유전자의 발현량을 산정할 수 있다.

하이브리드화의 강도는 형광 시그널, 방사능, 발광량 등을 레이저 공초점 현미경, CCD 카메라, 방사선의 이미징 장치(예를 들어, STORM, 제조원: Amersham Pharmacia Biotech) 등에 의해 가시화한 다음, 당해 가시화 데이터를 정량화함으로써 측정할 수 있다.

고체 지지체 위의 폴리뉴클레오타이드 어레이에 관한 해석·정량에는 GMS418 Array Scanner(제조원: Takara Shuzo) 등의 시판 장치를 사용할 수 있다.

유전자 발현량의 해석에는 시판하는 해석 소프트웨어(예: ImaGene, 제조원: Takara Shuzo; Array Gauge, 제조원: Fuji Photo Film; ImageQuant, 제조원: Amersham Pharmacia Biotech 등)를 사용할 수 있다. 방선균 유래의 핵산 분자로서 배양 시간 경과에 따라 취득된 핵산 분자를 사용함으로써, 특정한 유전자의 발현 변동을 추적할 수 있다. 당해 변동을 파악함으로써, 배양 조건을 최적화할 수 있다.

또한, 당해 미생물의 전체 게놈 서열로부터 밝혀진 다수의 유전자의 서열을 갖는 핵산 분자를 사용함으로써, 당해 미생물의 전체 유전자 수준에서의 발현 프로필, 즉 게놈에 의해 암호화되는 다수의 유전자 중에 어떠한 유전자군이 어떠한 비율로 발현하는가를 분명히 할 수 있다. 이와 같이, 전체 게놈 서열로부터 밝혀진 유전자의 발현 프로필을 파악함으로써, 당해 미생물의 생물학적인 상태를 전체 유전자 수준에서 발현 패턴으로서 파악할 수 있다.

(b) 피검 유전자에 상동인 유전자의 방선균에서의 존재 확인

상기 (1)에서 작제된 폴리뉴클레오타이드 어레이를 사용하여, 방선균 이외의 생물에 존재하는 피검 유전자에 상동인 유전자가 방선균에 존재하는지 여부를 검색할 수 있다.

당해 검색은, 상기 (a)의 동정·해석 방법에 있어서, 방선균 유래의 핵산 분자 대신에 방선균 이외의 생물에 존재하는 피검 유전자를 사용하는 방법에 의해 수행할 수 있다.

8. 전체 게놈 염기 서열 및 ORF 정보를 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체

「컴퓨터로 판독가능한 기록 매체 또는 기억 장치」란 컴퓨터에 의해 직접 판독되고 액세스될 수 있는 임의의 기록 매체 또는 기억 장치를 말한다. 이러한 기록 매체 또는 기억 장치로서는, 플로피 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프 등의 자기 기록 매체, CD-ROM, CD-R, CD-RW, DVD-ROM, DVD-RAM, DVD-RW 등의 광학 기록 매체, RAM이나 ROM 등의 전기 기록 매체 및 이들 카테고리의 하이브리드(예: MO 등의 자기/광학 기록 매체)를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

상기한 기록 매체에 기록하거나 입력시키기 위한 기기, 기록 매체 중의 정보를 판독하기 위한 기기 또는 장치의 선택은 기록 매체의 종류와 액세스 방법에 근거한다. 또한, 여러가지 데이터 프로세서 프로그램, 소프트웨어, 컴퍼레이터 및 포맷이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열 정보 등을 당해 매체에 기록하기 위해 사용된다. 당해 정보는, 예를 들어, 시판 소프트웨어로 포맷된 바이너리 파일, 텍스트 파일 또는 ASCII 파일의 형태로 나타낼 수 있다. 이들 서열 정보에 액세스하기 위한 소프트웨어도 공적으로 입수할 수 있다.

당해 매체에 기록하는 정보로서는, 상기 2.에서 취득된 방선균의 전체 게놈 염기 서열 정보, ORF의 염기 서열 정보, 당해 ORF에 의해 암호화되는 아미노산 서열 정보, 당해 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 갖는 기능 정보 등을 들 수 있다.

본 발명의 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체 또는 기억 장치는 상기 정보를 기록한 매체이다. 구체적으로는, 서열 1 내지 7551에 제시된 염기 서열 정보, 7552 내지 15101에 제시된 아미노산 서열 정보, 서열 1 내지 7551에 제시된 염기 서열이 갖는 기능 정보 및 7552 내지 15101에 제시된 아미노산 서열이 갖는 기능 정보를 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체 또는 기억 장치를 들 수 있다.

9. 본 발명의 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체를 이용한 컴퓨터를 이용하는 시스템

「컴퓨터를 이용하는 시스템」이란 본 발명의 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체에 기록된 정보를 분석하기 위해 사용되는 하드웨어 수단, 소프트웨어 수단 및 데이터 기록 수단으로 구성된 것을 말한다.

하드웨어 수단은 기본적으로 입력 장치, 데이터 기록 장치, 중앙 연산 처리 장치 및 출력 장치로 이루어진다.

소프트웨어 수단은 기록된 정보와 상기 하드웨어 수단을 사용하여, 본 발명의 매체에 기록된 정보에 관한 검색 또는 해석을 실행할 수단을 수행한다. 구체적으로는, 본 발명의 기록 매체에 기록된 염기 서열, 아미노산 서열 등의 정보로부터 생물학적으로 의미가 있는 구조, 정보를 검색, 해석 또는 비교하기 위해, 컴퓨터를 이용하는 시스템으로 실행되는 하나 또는 그 이상의 프로그램을 사용할 수단을 의미한다.

ORF, EMF 영역의 동정을 위한 소프트웨어로서는 GeneMark[참조: Nuc. Acids. Res., 22, 4756-67 (1994)], GeneHacker[참조: 단백질 핵산 효소, 42, 3001-07 (1997)], Glimmer[참조: The Institute of Genomic Research; Nuc. Acids. Res., 26, 544-548 (1998)] 등을 들 수 있다. 통상적으로, 이들 소프트웨어를 사용하는 예측에는 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 사용하지만, 필요에 따라 파라미터를 변경할 수 있다.

표적 서열 또는 표적 구조 모티브에 유사한 게놈 영역 또는 폴리펩타이드 영역의 동정(상동성 검색)을 위한 소프트웨어로서는 FASTA, BLAST, Smith-Waterman, GenetyxMac(제조원: Software Development), GCG 패키지(제조원: Genetics Computer Group), GenCore(제조원: Compugen) 등을 들 수 있다. 통상적으로, 이들 소프트웨어를 사용하는 예측에는 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 사용하지만, 필요에 따라 파라미터를 변경할 수 있다.

이러한 전체 게놈 서열의 정보를 함유하는 기록 매체는 방선균의 게놈 DNA가 암호화하는 유전자의 발현량 및 당해 미생물의 전체 유전자 수준에서의 발현 프로필, 즉 당해 미생물의 게놈에 의해 암호화되는 다수의 유전자 중에 어떠한 유전자군이 어떠한 비율로 발현하는가를 밝힐 수 있는 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하기 위해 유용하다.

데이터 기록 수단이란 본 발명의 기록 매체에 기록된 정보 및 표적 서열, 표적 구조 모티브 정보 등을 기록하는 메모리 및 여기에 액세스할 수 있는 메모리 액세스 수단을 말하다.

즉, 본 발명의 컴퓨터를 이용하는 시스템은,

(i) 본 발명의 기록 매체에 기록된 정보 및 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 입력하기 위한 입력 수단,

(iii) (ii)의 데이터 기록 수단에 의해 기록된 본 발명의 기록 매체에 기록된 정보와 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 비교하여, 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보와 일치하거나 유사한 염기 서열 정보를 검색하거나 해석하는 컴퍼레이터 수단 및

(iv) (iii)의 컴퍼레이터 수단에 의해 수득된 검색 또는 해석 결과를 표시하기 위한 출력 수단을 구비함을 특징으로 하는, 컴퓨터를 이용하는 시스템이다.

당해 시스템을 상기 2. 내지 5.의 방법에 사용함으로써, 방선균의 ORF, EMF 영역, 표적 서열, 표적 구조 모티브 등의 검색·해석, 호모로그의 검색, 아이소자임의 검색·해석, 생합성 경로·시그널 전달 경로의 해명, 유용 변이점의 해명 및 프로테옴 해석으로 발견한 스폿의 동정에 이용할 수 있다. 상기, 동족체에는 오르토로그(ortholog), 파라로그(paralog) 양쪽 모두 포함된다.

10. 방선균 유래의 ORF를 이용한 폴리펩타이드의 제조

상기 2.의 방법으로 취득되는 ORF를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여, 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 폴리펩타이드는 Molecular Cloning 제2판이나 Current Protocols in Molecular Biology 등에 기재된 방법 등을 사용하여, 예를 들어, 하기의 방법에 따라 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편을 숙주 세포 중에서 발현시켜 제조할 수 있다.

전장 ORF 서열을 바탕으로 하여, 필요에 따라, 당해 폴리펩타이드를 암호화하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.

또한, 필요에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 부분의 염기 서열을 숙주 세포의 발현에 최적인 코돈으로 되도록 염기를 치환한 DNA를 조제한다. 당해 DNA는 본 발명의 폴리펩타이드의 효율적 제조에 유용하다.

이들 DNA 단편을 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 작제한다.

당해 재조합 벡터를 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입한다.

숙주 세포로서는, 세균, 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등의 목적하는 유전자를 발현시킬 수 있는 것이면, 어느 것이나 사용할 수 있다.

발현 벡터로서는, 상기 숙주 세포에서 자립 복제가능하거나 염색체 중으로 삽입할 수 있으며, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다.

세균 등의 원핵 생물을 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유하여 이루어진 재조합 벡터는 원핵 생물 중에서 자립 복제할 수 있는 동시에, 적어도 프로모터, 리보솜 결합 서열, 본 발명의 DNA, 전사 종결 서열이 작동할 수 있는 상태로 구성된 벡터인 것이 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함될 수 있다.

발현 벡터로서는, 예를 들어, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서 복제할 수 있는 벡터 플라스미드인 pIJ6021 및 에스케리키아 콜라이에서 복제할 수 있는 벡터인 pET3, pET11(이상의 제조원: Stratagene), pBAD, pThioHis, pTrcHis(이상의 제조원: Invitrogen), pKK223-3, pGEX2T(이상의 제조원: Amersham Pharmacia Biotech) 이외에, pBTrp2, pBTac1, pBTac2(이상의 제조원: Boehringer Mannheim), pSE280(제조원: Invitrogen), pGEMEX-1(제조원: Promega), pQE-8(제조원: QIAGEN), pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK(-)(제조원: Stratagene), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400[참조: J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX(제조원: Pharmacia), pET 시스템(제조원: Novagen) 등을 들 수 있다.

프로모터로서는, 숙주 세포 중에서 기능하는 것이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터, T7 프로모터 등의 대장균이나 파아지 등에 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한, Ptrp를 2개 직렬시킨 프로모터(Ptrp×2), tac 프로모터, lacT7 프로모터, letI 프로모터와 같이 인위적으로 설계 변형된 프로모터 등도 사용할 수 있다.

리보솜 결합 서열인 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리(예: 6 내지 18개 염기)로 조절한 플라스미드를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터에서는 본 발명의 DNA의 발현에는 전사 종결 서열은 반드시 필요하지 않지만, 구조 유전자의 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다. 상기 구성 요소의 코돈은 이용되는 숙주 세포나 환경 상태에 따라 공지된 방법에 따라 최적화할 수 있다.

숙주 세포로서는, 에스케리키아 속, 세라티아(Serratia) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 미크로박테리움(Microbacterium) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 스트렙토마이세스 속, 스트렙토스포란기움 속, 아미콜라톱시스 속, 악티노플라네스 속, 노카르디오이데스 속, 슈도노카르디아 속, 악티노비스포라 속, 사카로모노스포라 속, 사카로폴리스포라 속, 사카로트릭스 속, 악티노폴리스포라 속, 악티노마두라 속, 미크로비스포라 속, 미크로테트라스포라 속, 써모모노스포라 속 또는 미크로모노스포라 속 등에 속하는 미생물, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 XL1-Blue, 에스케리키아 콜라이 XL2-Blue, 에스케리키아 콜라이 DH1, 에스케리키아 콜라이 MC1000, 에스케리키아 콜라이 KY3276, 에스케리키아 콜라이 W1485, 에스케리키아 콜라이 JMl09, 에스케리키아 콜라이 HB101, 에스케리키아 콜라이 W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis), 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스, 스트렙토마이세스 그리세우스, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 등을 들 수 있다.

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 또는 이의 유연(類緣) 미생물을 숙주로 하는 경우, 당해 폴리펩타이드의 발현에 필요한 EMF는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 EMF를 함유하는 한, 벡터측에 특별히 구비하고 있지 않을 수 있다. 이와 같은 EMF가 당해 폴리뉴클레오타이드에 포함되지 않은 경우에는, 별도로 EMF를 조제하여 작동할 수 있는 상태로 폴리뉴클레오타이드에 연결할 필요가 있다. 또는, 보다 높은 발현량 또는 특이적인 발현 조절을 기대하는 경우에도, 여기에 적당한 EMF를 작동할 수 있는 상태로 폴리뉴클레오타이드에 연결할 필요가 있다.

재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 상기 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 예를 들어, 칼슘 이온을 사용하는 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], 프로토플라스트법(Nature)에 기재된 방법 등을 들 수 있다. 효모를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들어, pYES2(제조원: Invitrogen), YEP13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 들 수 있다.

프로모터로서는, 효모 균주 중에서 발현할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 헥소스 키나제 등의 해당계의 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal1 프로모터, gal10 프로모터, 열 쇼크 폴리펩타이드 프로모터, CUP1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주 세포로서는, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 쉬조사카로마이세스(Schizosacchromyces) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 트리코스포론(Trichosporon) 속, 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 속, 피키아(Pichia) 속, 칸디다(Candida) 속 등에 속하는 미생물, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 슈완니오마이세스 알루비우스(Schwanniomyces alluvius), 칸디다 우틸루스(Candida utilis) 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 전기천공법[참조: Meth. Enzym., 194, 182 (1990)], 스페로플라스트법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)], 아세트산리튬법[참조: J. Bacteriology, 153, 163 (1983)], 문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 1929 (1978)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들어, pcDNA3.1, pSinRep5, pCEP4(제조원: Invitrogen), pRev-Tre(제조원: Clontech), pAxCAwt(제조원: Takara Shuzo), pcDNAI, pcDM8(제조원: Funakoshi), pAGE107[참조: 일본 공개특허공보 제(평)3-22979호, Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-227075호], pCDM8[참조: Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp(제조원: Invitrogen), pPREP4(제조원: Invitrogen), pAGE103[참조: J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pAGE210 등을 들 수 있다.

프로모터로서는, 동물 세포 중에서 기능하는 것이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 열 쇼크 프로모터, SR 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 사람 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 같이 사용할 수 있다.

숙주 세포로서는, 사람의 세포인 나말바(Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 C0S 세포, 챠이니즈 햄스터의 세포인 CH0 세포, HBT5637[참조: 일본 공개특허공보 제(소)63-299호] 등을 들 수 있다.

동물 세포로의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 전기천공법[참조: Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 인산칼슘법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-227075호], 리포펙션법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)], 문헌[참조: Virology, 52, 456 (1973)]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

곤충 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예를 들어, 문헌[문헌: Current Protocols in Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology, 6, 47 (1988)] 등에 기재된 방법에 의해 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다.

즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큘로바이러스를 곤충 세포에 공동도입하여 곤충 세포 배양 상등액 중에 재조합 바이러스를 수득한 다음, 다시 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다.

당해 방법에서 사용되는 유전자 도입 벡터로서는, 예를 들어, pBlueBac4.5, pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII(모두의 제조원: Invitorogen) 등을 들 수 있다.

바큘로바이러스로서는, 예를 들어, 밤도둑나방과 곤충에 감염되는 바이러스인 아우토그라파 캘리포니카 뉴클레어 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.

곤충 세포로서는, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)의 난소 세포인 Sf9, Sf21[참조: Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)], 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)의 난소 세포인 High5(제조원: Invitrogen) 등을 사용할 수 있다.

재조합 바이러스를 조제하기 위한 곤충 세포로의 재조합 유전자 도입 벡터와 바큘로바이러스의 공동도입 방법으로서는, 예를 들어, 인산칼슘법(일본 공개특허공보 제(평)2-227075호), 리포펙션법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] 등을 들 수 있다.

식물 세포를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예를 들어, Ti 플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

프로모터로서는, 식물 세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 양배추 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터, 벼 액틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주 세포로서는 담배, 감자, 토마토, 당근, 대두, 유채, 알파파, 벼, 소맥, 대맥 등의 식물 세포 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 식물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 아그로박테리움(Agrobacterium)[참조: 일본 공개특허공보 제(소)59-140885호, 제(소)60-70080호, 제W0 94/00977호], 전기천공법[참조: 일본 공개특허공보 제(소)60-251887호], 파티클 건(유전자총)을 사용하는 방법[참조: 일본 특허 제2606856호, 특허 제2517813호) 등을 들 수 있다.

본 발명의 형질전환체로서, 상기한 재조합 벡터를 보유하는 형질전환체뿐만 아니라, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 재조합 벡터로서가 아닌, 그 자체로서 보 유하는 형질전환체, 즉 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 숙주의 염색체에 도입된 상태에서 보유된 형질전환체도 포함된다.

효모, 동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포에 의해 발현시킨 경우에는 당 또는 당쇄가 부가된 폴리펩타이드를 수득할 수 있다.

이상과 같이 수득된 본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하여, 배양물 중에 본 발명의 폴리펩타이드 또는 본 발명의 EMF의 제어하에 발현되는 임의의 폴리펩타이드를 생성 축적시켜, 당해 배양물로부터 채취함으로써, 이들의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.

본 발명의 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 숙주의 배양에 사용되는 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다.

본 발명의 형질전환체가 대장균 등의 원핵 생물 또는 효모 등의 진핵 생물을 숙주로 하여 수득된 형질전환체인 경우, 당해 형질전환체를 배양한다.

배지로서, 당해 형질전환체에 의해 동화될 수 있는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하여, 당해 형질전환체의 배양을 효율적으로 수행할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중의 어느 것을 사용할 수 있다.

탄소원으로서는, 당해 형질전환체에 의해 동화될 수 있는 것이면 사용할 수 있으며, 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류 등을 사용할 수 있다.

질소원으로서는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산 암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 기타 질소 함유 화합물, 및 펩톤, 고기 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지물, 카제인 가수분해물, 대두박 및 대두박 가수분해물, 각종 발효 균체 및 이의 분해물 등을 사용할 수 있다.

무기염으로서는, 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다. 배양은 진탕 배양 또는 심부 통기 배양 등의 호기적 조건하에서 수행한다. 배양 온도는 15 내지 40℃가 바람직하며, 배양 시간은 통상적으로 16시간 내지 7일간이다. 배양 중의 pH는 3.0 내지 9.0으로 유지시키는 것이 바람직하다. pH의 조정은 무기산 또는 유기산, 알칼리 용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 수행한다.

또한, 배양 중에 필요에 따라 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서(inducer)를 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들어, lac 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 사용하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가할 수 있다.

동물 세포를 숙주로 하여 수득된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI-1640 배지[참조: The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], 이글스 MEM 배지[참조: Science, 122, 501 (1952)], 둘베코 개변 MEM 배지[참조: Virology, 8, 396 (1959)], 199 배지[참조: Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상적으로 pH 6 내지 8, 30 내지 40℃, 5% 탄산 가스 존재하 등의 조건하에 1 내지 7일 동안 수행한다.

또한, 배양 중에 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.

곤충 세포를 숙주로 하여 수득된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지(제조원: Pharmingen), Sf-900 II SFM 배지(제조원: Life Technologies), ExCell 400, ExCell 405(모두의 제조원: JRH Biosciences), 그레이스 곤충 배지[참조: Nature, 195, 788 (1962)] 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상적으로 pH 6 내지 7, 25 내지 30℃ 등의 조건하에 1 내지 5일 동안 수행한다.

또한, 배양 중에 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.

식물 세포를 숙주로 하여 수득된 형질전환체는, 세포로서, 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜 배양할 수 있다. 당해 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 무라시게 앤드 스쿠그(MS: Murashige and Skoog) 배지, 화이트(White) 배지 또는 이들 배지에 옥심, 사이토카이닌 등의 식물 호르몬을 첨가 한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상적으로 pH 5 내지 9, 20 내지 40℃의 조건하에 3 내지 60일 동안 수행한다.

또한, 배양 중에 필요에 따라 카나마이신, 하이그로마이신 B 등의 항생 물질을 배지에 첨가할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 도입한 재조합 벡터를 보유하는 미생물, 동물 세포 또는 식물 세포 유래의 형질전환체를 통상적인 배양 방법에 따라 배양하여, 당해 폴리펩타이드를 생성 축적시켜, 당해 배양물로부터 폴리펩타이드를 채취함으로써 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.

유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에 Molecular Cloning 제2판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 분비 생산, 융합 폴리펩타이드 발현 등을 수행할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드의 생산 방법으로서는, 숙주 세포내에 생산시키는 방법, 숙주 세포외에 분비시키는 방법 또는 숙주 세포 외막 위에 생산시키는 방법이 있으며, 사용하는 숙주 세포나 생산시키는 폴리펩타이드의 구조를 변경시키는 것에 의해 당해 방법을 선택할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드가 숙주 세포내 또는 숙주 세포 외막 위에 생산되는 경우, 문헌[참조: Paulson et al., J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], 문헌[참조: Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)] 또는 문헌[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-336963호, 제W0 94/23021호] 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 당해 폴리펩타이드를 숙주 세포외에 적극적으로 분비시킬 수 있다.

즉, 유전자 재조합의 수법을 이용하여, 본 발명의 폴리펩타이드의 활성 부위를 포함하는 폴리펩타이드 바로 앞에 시그널 펩타이드를 부가한 형으로 발현시킴으로써, 본 발명의 폴리펩타이드를 숙주 세포외에 적극적으로 분비시킬 수 있다.

또한, 일본 공개특허공보 제(평)2-227075호에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디하이드로엽산 환원 효소 유전자 등을 사용하는 유전자 증폭계를 이용하여 생산량을 상승시킬 수 있다.

또한, 유전자 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써, 유전자가 도입된 동물 개체(형질전환 비사람 동물) 또는 식물 개체(형질전환 식물)를 조성함으로써, 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.

형질전환체가 동물 개체 또는 식물 개체의 경우에는 통상적인 방법에 따라 사육 또는 재배하여, 당해 폴리펩타이드를 생성 축적시켜, 동물 개체 또는 식물 개체로부터 폴리펩타이드를 채취함으로써, 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.

동물 개체를 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서는, 예를 들어, 공지된 방법[참조: American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996), Bio/Technology, 9, 830 (1991)]에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물 중에 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 들 수 있다.

동물 개체의 경우에는, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 도입하는 형질전환 비사람 동물을 사육하여, 당해 폴리펩타이드를 동물 중에 생성, 축적시켜, 동물 중으로부터 당해 폴리펩타이드를 채취함으로써, 당해 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 당해 동물 중의 생성, 축적 장소로서는, 예를 들어, 동물의 밀크[참조: 일본 공개특허공보 제(소)63-309192호], 알 등을 들 수 있다. 이 때에 사용되는 프로모터로서는, 동물에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있지만, 예를 들어, 유선 세포 특이적인 프로모터인 α 카제인 프로모터, β 카제인 프로모터, β 락토글로불린 프로모터, 유장 산성 단백질 프로모터 등이 적절하게 사용된다.

식물 개체를 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서는, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 도입한 형질전환 식물을 공지된 방법[참조: Tissue Culture, 20 (1994), Tissue Culture, 21 (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)]에 준하여 재배하여, 당해 폴리펩타이드를 식물 중에 생성, 축적시켜, 당해 식물 중으로부터 폴리펩타이드를 채취함으로써, 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 시험관내 해독에 의해 취득할 수 있다.

시험관내 해독 시스템을 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 시험관내 해독에는, 예를 들어, RNA를 주형으로 하는 방법과 DNA를 주형으로 하는 방법의 2가지가 있지만, 주형 RNA로서는 전체 RNA, mRNA, 시험관내 전사 산물 등을 사용할 수 있으며, 주형 DNA로서는 전사 프로모터와 해독 개시점의 하류에 도입된 목적 유전자를 함유하는 플라스미드나 PCR/RT-PCR 산물을 사용할 수 있다. 시험관내 해독에 최적인 시스템의 선택에는, 합성하는 단백질을 암호화하는 유전자의 유래(원핵 세포/진핵 세포), 주형의 종류(DNA/RNA) 또는 합성 후의 단백질의 사용 목적 등을 고려하여 수행하는 것이 필요하다. 여러가지 특징을 갖는 시험관내 해독의 키트가 각 제조원(Boehringer Mannheim, Promega, Stratagene 등)으로부터 시판되고 있지만, 어떠한 키트를 사용해도, 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.

시험관내 전사/해독 시스템 이. 콜라이 T7 S30 익스트랙트 시스템 포 서큘라 DNA(Extract System for Circular DNA)(제조원: Promega; 카탈로그 번호 L1130)를 사용하면, T7 프로모터를 함유하는 플라스미드에 클로닝된 DNA 염기 서열의 전사/해독을 수행할 수 있다. 또한, 시험관내 해독 전사/해독 시스템 이. 콜라이 S30 익스트랙트 시스템 포 리니어 템플레이트(Extract System for Linear Templates)(제조원: Promega; 카탈로그 번호 L1030)을 사용하면, 슈퍼코일 비감수성의 프로모터, 예를 들어, lacUV5, tac 등이 갖는 직쇄 상의 원핵 생물의 DNA를 주형으로 하여 전사/해독을 실시할 수 있다. 직쇄 상의 원핵 생물의 DNA를 주형으로 하는 것은 DNA 단편, PCR 증폭 DNA 산물, 중복 올리고뉴클레오타이드 연결체, 시험관내 전사 RNA, 원핵 생물 RNA 등을 사용할 수 있다.

이러한 시스템을 사용하는 것으로, 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있는 이외에, 방사성 표지 단백질의 합성, 클로닝된 유전자의 발현능의 확인, 전사 반응 또는 해독 반응의 기능 해석 연구 등을 실시할 수 있다.

본 발명의 형질전환체에 의해 제조된 폴리펩타이드를 단리 정제하기 위해서 는, 통상적인 효소의 단리 정제법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드가 세포내에 용해 상태로 발현하는 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심분리에 의해 회수하여, 수계 완충액에 현탁한 다음, 초음파 파쇄기, 프렌치 프레스, 맨튼 가울린 균질화기, 다이노밀(Dynomill) 등에 의해 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 수득한다. 당해 무세포 추출액을 원심분리함으로써 수득되는 상등액으로부터 통상적인 효소의 단리 정제법, 즉 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(제조원: Mitsubishi Chemical) 등의 수지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(제조원: Pharmacia) 등의 수지를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸 세파로스, 페닐 세파로스 등의 수지를 사용하는 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용하는 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 수법을 단독 또는 조합 이용하여, 정제 표준품을 수득할 수 있다.

또한, 당해 폴리펩타이드가 숙주 세포내에 불용체를 형성하여 발현하는 경우에는, 동일하게 세포를 회수한 다음, 파쇄하여, 원심분리를 실시함으로써, 침전 분획으로서 폴리펩타이드의 불용체를 회수한다. 회수한 폴리펩타이드의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 당해 가용화액을 희석하거나 투석하여, 가용화액 중의 단백질 변성제의 농도를 낮춤으로써, 당해 폴리펩타이드를 정상적인 입체 구조로 복귀시킨다. 당해 조작 후에 상기와 같은 단리 정제법에 의해 당해 폴리펩타이드의 정제 표준품을 수득할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드 또는 당해 폴리펩타이드에 당쇄가 부가된 폴리펩타이드 등의 유도체가 세포외에 분비된 경우에는, 배양 상등액에 당해 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 당해 배양물을 상기와 동일한 원심분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 배양 상등액을 취득하여, 당해 배양 상등액으로부터 상기와 같은 단리 정제법을 이용함으로써, 정제 표준품을 수득할 수 있다.

상기한 방법으로 취득되는 폴리펩타이드가 본 발명의 폴리펩타이드이며, 예를 들어, 서열 2 내지 7551로부터 선택되는 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 또는 서열 7552 내지 15101 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 들 수 있다.

또한, 당해 폴리펩타이드가 갖는 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 당해 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드도 본 발명에 포함된다. 당해 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성이란 결실, 치환, 삽입 또는 부가하기 전의 폴리펩타이드가 갖는 고유의 기능 또는 효소 활성 등으로 대표되는 활성과 동일한 활성을 의미하고 있다. 당해 폴리펩타이드는 문헌[참조: Molecular Cloning 제2판, Current Protocols in Molecular Biology, Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)] 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여 취득할 수 있다. 예를 들어, 서열 7552 내지 15101 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다. 결실, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기의 수는 특별히 한정되지 않지만, 상기한 부위 특이적 변이법 등의 공지된 방법에 의해 결실, 치환, 삽입 또는 부가할 수 있는 정도의 수이며, 1개 내지 수십개, 바람직하게는 1개 내지 20개, 보다 바람직하게는 1개 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개이다.

본 발명의 폴리펩타이드가 갖는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된다는 것은 동일 서열 중의 임의적이며 또한 1개 또는 복수의 아미노산 서열 중의 위치에서 1개 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 있는 것을 의미하고, 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 동시에 발생할 수 있으며, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형에 상관하지 않는다. 천연형 아미노산 잔기로서는 L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소로이신, L-로이신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, L-시스테인 등을 들 수 있다.

다음에, 서로 치환할 수 있는 아미노산 잔기의 예를 제시한다. 동일군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환할 수 있다.

A군: 로이신, 이소로이신, 노르로이신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 사이클로헥실알라닌;

B군: 아스파라긴산, 글루탐산, 이소아스파라긴산, 이소글루탐산, 2-아미노아 디핀산, 2-아미노수베린산;

C군: 아스파라긴, 글루타민;

D군: 라이신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산;

E군: 프롤린, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린;

F군: 세린, 트레오닌, 호모세린;

G군: 페닐알라닌, 티로신.

또한, 수득되는 변이 폴리펩타이드가 변이 전의 폴리펩타이드가 갖는 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖기 위해서는, 변이 전의 폴리펩타이드가 갖는 아미노산 서열과 BLAST나 FASTA 등의 해석 소프트웨어로 디폴트(초기 설정)의 파라미터를 사용하여 계산했을 때에, 적어도 60% 이상, 통상은 80% 이상, 특히 95% 이상의 상동성을 갖고 있는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 펩타이드 합성기(제조원: Advanced ChemTech, Perkin-Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation 등)를 이용하여 화학 합성할 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 폴리펩타이드 생산 이외의 목적으로도 사용할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 재조합 벡터를 함유하는 형질전환체를 배지에 배양하여, 배양물 중에 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 유연체로부터 선택되는 1종 이상을 생성 축적시켜, 당해 배양물로부터 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 유연체로부터 선택되는 1종 이상을 채취, 제조할 수 있다.

또한, 항생 물질을 포함한 생물 활성 물질의 생성에 사용되는 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산 및 이들의 유연체 등의 생합성 경로, 분해 경로 및 이의 조절 메카니즘은 생물 종에 따라 상이하다. 또한, 항생 물질을 포함한 생물 활성 물질 및 이들의 유연체 등의 생합성 경로 및 이의 조절 메카니즘도 생물 종에 따라 상이하다. 이러한 차이를 이용하여, 이종 유래의 이러한 생합성 관련 유전자를 도입함으로써, 이러한 생리 활성 물질의 생산성을 높이는 것이 가능하다.

이러한 생리 활성 물질의 생산을 위한 본 발명의 형질전환체의 배양은 상기한 본 발명의 폴리펩타이드 생산을 위한 형질전환체의 배양 방법과 같은 방법으로 수행할 수 있다. 배양물로부터의 당해 생리 활성 물질의 채취도 유기 용매 전용법, 이온 교환 수지법, 흡착법, 기타 공지된 방법의 조합으로 수행할 수 있다.

공지의 방법이란, 예를 들어, 숙주 생물이 세균인 경우, 전기천공법, 칼슘 트랜스펙션, 프로토플라스트법, 바이러스를 통한 방법 등이며, 진핵 생물의 경우에는 미세주입법, 인산칼슘 트랜스펙션, 양성 하전 지질 중개법 또는 바이러스를 사용하는 방법 등을 들 수 있다[참조: Molecular Cloning 제2판, 및 Spector et al., Cells/a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998)]. 숙주 생물이란, 원핵 생물, 하등 진핵 생물(예를 들어, 효모) 또는 고등 진핵 생물(예를 들어, 포유 동물)이며, 이러한 생물로부터 단리된 세포를 함유한다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 단편의 숙주 세포내에서의 존재 형태로서는, 숙주 염색체에 통합될 수 있고, 염색체외에서 독립된 복제 단위를 갖는 인자(예를 들어, 플라스미드)에 재조합된 형태일 수 있다. 이러한 형질전환체는 본 발명의 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 게놈의 ORF에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 이외에, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 당해 단편을 생산하기 위해 사용할 수 있다. 또는, 본 발명의 EMF의 제어하에 임의의 폴리펩타이드를 생산하기 위한 목적 등에 사용할 수 있다.

11. 본 발명의 폴리펩타이드를 인식하는 항체의 조제

본 발명의 폴리펩타이드 또는 당해 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드의 정제 표준품 또는 본 발명의 폴리펩타이드의 일부의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 항원으로서 사용함으로써, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 등, 본 발명의 폴리펩타이드를 인식하는 항체를 작제할 수 있다.

(1) 폴리클로날 항체의 작제

본 발명의 폴리펩타이드 또는 당해 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드의 정제 표준품 또는 본 발명의 폴리펩타이드의 일부의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 항원으로서 사용하여, 동물에게 투여함으로써 폴리클로날 항체를 작제할 수 있다.

투여하는 동물로서, 토끼, 염소, 래트, 마우스, 햄스터, 닭 등을 사용할 수 있다.

당해 항원의 투여량은 동물 1마리당 50 내지 100㎍이 바람직하다.

펩타이드를 사용하는 경우에는, 펩타이드를 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet haemocyanin) 또는 소 티로글로불린 등의 캐리어 단백질에 공유 결합시킨 것을 항원으로 하는 것이 바람직하다. 항원으로 하는 펩타이드는 펩타이드 합성기로 합성할 수 있다.

당해 항원의 투여는, 예를 들어, 1회째의 투여 후 1 내지 2주 간격을 두고 3 내지 10회 수행한다. 각 투여 후, 3 내지 7일째에 안저 정맥총으로부터 채혈하고, 당해 혈청이 면역에 사용한 항원과 반응하는 것을 효소 면역 측정법[참조: Enzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA): Igaku Shoin (1976), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 등으로 확인한다.

면역에 사용하는 항원에 대하여, 이러한 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 면역된 비사람 포유 동물로부터 혈청을 취득하고, 당해 혈청을 분리, 정제함으로써, 폴리클로날 항체를 취득할 수 있다.

분리, 정제하는 방법으로서는, 원심분리, 40 내지 50% 포화 황산암모늄에 의한 염석, 카프릴산 침전[참조: Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 또는 DEAE-세파로스 칼럼, 음이온 교환 칼럼, 프로테인 A 또는 G-칼럼 또는 겔 여과 칼럼 등을 사용하는 크로마토그래피 등을 단독 또는 조합하여 처리하는 방법을 들 수 있다.

(2) 모노클로날 항체의 작제

(a) 항체 생산 세포의 조제

면역에 사용한 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드에 대하여, 이러한 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 래트를 항체 생산 세포의 공급원으로서 제공한다.

당해 항체가를 나타낸 래트에 항원 물질을 최종 투여한 후 3 내지 7일째에 비장을 적출한다.

당해 비장을 MEM 배지(제조원: Nissui Pharmaceutical) 중에서 세단하여, 핀셋으로 풀어, 1,200rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후 상청액을 버린다.

수득된 침전 분획의 비장 세포를 트리스-염화암모늄 완충액(pH 7.65)으로 1 내지 2분 동안 처리하여 적혈구를 제거한 다음, MEM 배지에서 3회 세정하여, 수득된 비장 세포를 항체 생산 세포로서 사용한다.

(b) 골수종 세포의 조제

골수종 세포로서는 마우스 또는 래트로부터 취득한 주화 세포주를 사용한다. 예를 들어, 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(이하, P3-Ub1로 약칭한다)[참조: Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978), Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)], SP2/0-Ag14(SP-2)[참조: Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653(653)[참조: J. Immunol., 123, 1548 (1979)], P3-X63-Ag8(X63)[참조: Nature, 256, 495 (1975)] 등을 사용할 수 있다. 이러한 세 포주는 8-아자구아닌 배지[1.5mmol/ℓ 글루타민, 5x10^-5mol/ℓ 2-머캅토에탄올, 10㎍/ml 겐타마이신 및 10% 소 태아 혈청(FCS)(제조원: CSL)이 되도록 RPMI-1640 배지에 첨가한 배지(이하, 정상 배지라 함)에 추가로 8-아자구아닌을 15㎍/ml 첨가한 배지]로 교체하는데, 세포 융합 3 내지 4일 전에 정상 배지에서 배양하고, 융합에는 상기 세포를 2x10⁷개 이상 사용한다.

(c) 하이브리도마의 작제

(a)에서 취득한 항체 생산 세포와 (b)에서 취득한 골수종 세포를 MEM 배지 또는 PBS(1.83g 인산이나트륨, 0.21g 인산칼륨, 7.65g 식염, 증류수 1ℓ, pH 7.2)로 충분히 세정하여, 세포수가 항체 생산 세포:골수종 세포 = 5~10:1이 되도록 혼합하고, 1,200rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후, 상청액을 버린다.

수득된 침전 분획의 세포군을 잘 풀고, 상기 세포군에 교반하면서 37℃에서 10⁸개 항체 생산 세포당 폴리에틸렌 글리콜-1000(PEG-1000) 2g, MEM 2ml 및 디메틸 설폭사이드(DMS0) 0.7ml를 혼합한 용액을 0.2 내지 1ml 첨가하고, 다시 1 내지 2분 간격으로 MEM 배지 1 내지 2ml를 수회 첨가한다.

첨가 후, MEM 배지를 첨가하여 전량이 50ml로 되도록 조제한다. 상기 조제액을 900rpm에서 5분 동안 원심 분리 후, 상청액을 버린다. 수득된 침전 분획의 세포를 완만히 푼 다음, 매스 피펫에 의한 흡입, 흡출하여 완만히 HAT 배지[10^{- 4}mol/ℓ 하이포크산틴, 1.5xl0^-5mol/ℓ 티미딘 및 4x10^-7mol/ℓ 아미노프테린이 되도록 정상 배지에 첨가한 배지] 100ml 중에 현탁시킨다.

상기 현탁액을 96웰 배양용 플레이트에 100㎕/웰씩 분주하고, 5% 탄산 가스 항온 배양기 중, 37℃에서 7 내지 14일 동안 배양한다.

배양 후, 배양 상청액의 일부를 덜어 문헌[참조: Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter l4 (1988)] 등에 기술되어 있는 효소 면역 측정법에 의해 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드에 특이적으로 반응하는 하이브리도마를 선택한다.

효소 면역 측정법의 구체적인 예로서 하기의 방법을 들 수 있다.

면역시, 항원에 사용한 본 발명의 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드를 적당한 플레이트에 피복시켜, 하이브리도마 배양 상청액 또는 후술하는 (d)에서 수득되는 정제 항체를 제1 항체로서 반응시키고, 추가로 제2 항체로서 비오틴, 효소, 화학발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 항래트 또는 항마우스 면역글로불린 항체를 반응시킨 다음에, 표지 물질에 따른 반응을 수행하여, 본 발명의 폴리펩타이드에 특이적으로 반응하는 것을 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로서 선택한다.

당해 하이브리도마를 사용하여, 한계 희석법에 의한 클로닝을 2회 반복하고[1회째는 HAT 배지(HAT 배지에서 아미노프테린을 제외한 배지), 2회째는 정상 배지를 사용한다], 안정되고 강한 항체가가 평가된 것을 본 발명의 모노클로 날 항체를 생산하는 하이브리도마주로서 선택한다.

(d) 모노클로날 항체의 조제

프리스탄 처리[2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(pristane) 0.5ml를 복강내 투여하여 2주간 사육한다]한 8 내지 10주령의 마우스 또는 누드 마우스에게, (c)에서 취득한 본 발명의 폴리펩타이드 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 세포 5 내지 20x10⁶개 세포/마리를 복강내에 주사한다. 10 내지 21일 사이에 하이브리도마는 복수암을 유발시킨다.

상기 복수암화된 마우스로부터 복수를 채취하여, 3,000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 고형분을 제거한다.

수득된 상청액으로부터 폴리클로날에서 사용하는 방법과 같은 방법으로 모노클로날 항체를 정제, 취득할 수 있다.

항체의 서브클래스의 결정은 마우스 모노클로날 항체 타이핑 키트 또는 래트 모노클로날 항체 타이핑 키트를 사용하여 실시한다. 폴리펩타이드 양은 로리 방법(Lowry method) 또는 280nm에서의 흡광도로부터 산출한다.

상기에서 취득된 항체는 본 발명의 항체이다.

당해 항체는 항체를 사용한 통상의 검정법, 즉 방사성 면역검정법(RIA), 경쟁적 결합 검정법, 면역 조직화학 염색법(ABC법, CSA법 등), 면역 침강법, 웨스턴 블롯 분석, ELISA 검정법 등에 사용할 수 있다[참조: An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science (1986), Techniques in Immunocytochemistry, Academic press 제1권(1982), 제2권(1983), 제3권(1985), Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Science (1985), Enzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA): Igaku Shoin (1976), Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987), Second Series Biochemical Experiment Course, Vol. 5, Immunobiochemistry Research Method, Tokyo Kagaku Dojin (1986)].

본 발명의 항체는 그대로 또는 표지하여 사용할 수 있다.

표지로서는, 방사성 동위원소, 친화성 표지(비오틴, 아비딘 등), 효소 표지(서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 등), 형광 표지(FITC 또는 로다민 등), 로다민 원자를 사용한 표지를 들 수 있다[참조: J. Histochem. Cytochem., 18, 315 (1970), Meth. Enzym., 62, 3089 (1979), Immunol., 109, 129 (1972), J. Immunol. Meth., 13, 215 (1979)].

표기 분석법, 후술하는 폴리펩타이드 어레이 또는 프로테옴 해석법에 의해 상기 항체 또는 상기 표지 항체를 사용하여 방선균에서의 본 발명의 폴리펩타이드의 발현, 상기 발현의 변동, 핵 폴리펩타이드의 구조 변화의 유무, 방선균 이외의 생물에서의 본 발명의 폴리펩타이드에 상응하는 폴리펩타이드의 존재의 유무를 해석할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체를 사용한 면역 친화성 크로마토그래프에 의해 상기 항 체가 인식하는 폴리펩타이드를 정제할 수 있다.

12. 폴리펩타이드 어레이의 작제 및 이용

(1) 폴리펩타이드 어레이의 작제

상기 10.에서 취득된 본 발명의 폴리펩타이드 또는 상기 11.에서 취득된 본 발명의 항체를 사용하여 폴리펩타이드 어레이를 작제할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드 어레이란 단백질 칩이라는 것을 포함하여, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 항체를 고체 지지체의 표면에 복수로 고착시킨 것을 말한다.

고체 지지체로서는, 폴리카보네이트와 같은 플라스틱, 폴리아크릴아미드와 같은 아크릴 수지, 아가로스 및 세파로스와 같은 복합 탄수화물, 실리카 또는 실리카 베이스의 재료, 카본, 금속, 무기 유리, 라텍스 비즈 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드 또는 항체를 문헌[참조: Biotechniques, 27, 1258-61 (1999), Molecular medicine Today, 5, 326-7 (1999), Handbook of Experimental Immunology 4th edition Blackwell Scientific Publications chapter 10 (1986), Meth. Enzym., 34 (1974), Advances in Experimental Medicine and Biology, 42 (1974), 미국 특허 제4,681,870호, 미국 특허 제4,282,287호, 미국 특허 제4,762,881호] 등에 기재된 방법에 준하여, 고체 지지체 표면에 고착시킬 수 있다.

고체 지지체에 본 발명의 폴리펩타이드 또는 항체를 고밀도에 고착시킴으로써, 후술하는 해석을 효율적으로 실시하는 것이 가능한데, 반드시 고밀도일 필요는 없다.

(2) 폴리펩타이드 어레이의 이용

상기 (1)에서 작제된 본 발명의 폴리펩타이드를 고착시킨 폴리펩타이드 어레이를 사용하면, 어레이에 고착된 본 발명의 폴리펩타이드와 결합하여, 상호 작용하는 폴리펩타이드 또는 화합물을 동정할 수 있다.

즉, 본 발명의 폴리펩타이드에 관해서 하기 (i) 내지 (iv)의 공정을 실시함으로써, 상기 폴리펩타이드와 결합하여, 상호 작용하는 폴리펩타이드 또는 화합물을 탐색할 수 있다.

(i) 상기 (1)의 방법으로 본 발명의 폴리펩타이드가 고착된 폴리펩타이드 어레이를 작제하는 공정,

(ii) 상기 폴리펩타이드 어레이상에 고정화된 본 발명의 폴리펩타이드와 임의의 제2 폴리펩타이드 또는 화합물 중의 하나 이상을 항온 처리하는 공정,

(iii) 어레이 상에 고정화된 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 또는 화합물 중의 하나 이상과 형성된 결합체를, 예를 들어, 제2 폴리펩타이드 또는 화합물 중의 하나 이상과의 결합을 표지하고, 당해 결합체로부터 결합하지 않은 물질을 제거한 다음, 당해 결합체 성분에 대해 특이적인 결합을 형성하는 표지를 사용하여 검출하는 검출 공정 및

(iv) 당해 검출 결과를 해석하는 해석 공정.

본 발명의 폴리펩타이드가 고착된 폴리펩타이드 어레이로서, 구체적으로는 서열 7552 내지 15101로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 당해 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 당해 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드 및/또는 당해 폴리펩타이드 일부의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 중 하나 이상을 고체 지지체에 고착시킨 폴리펩타이드 어레이를 들 수 있다.

또한, 상기 (1)에서 작제된 본 발명의 항체를 고착시킨 폴리펩타이드 어레이에 사용하면, 방선균의 폴리펩타이드 발현량의 해석을 수행하는 것이 가능해진다.

즉, 방선균의 변이주 유래 유전자에 관해서 하기 (i) 내지 (iv)의 공정을 실시함으로써, 상기 유전자의 발현량을 해석할 수 있다.

(i) 상기 (1)의 방법으로 폴리펩타이드 어레이를 작제하는 공정,

(ii) 상기 폴리펩타이드(제1 항체) 어레이와 방선균 유래의 폴리펩타이드를 항온 처리하는 공정,

(iii) 어레이 상에 고정화된 항체와 결합한 폴리펩타이드를 표지한 본 발명의 제2 항체를 사용하여 검출하는 검출 공정 및

(iv) 상기 검출 결과를 해석하는 해석 공정.

본 발명의 항체가 고착된 폴리펩타이드 어레이로서, 구체적으로는 서열 7552 내지 15101로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이 드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 당해 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 당해 폴리펩타이드의 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드의 부분 단편 폴리펩타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드의 일부의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 인식하는 항체 중 하나 이상을 고체 지지체에 고착시킨 폴리펩타이드 어레이를 들 수 있다.

또한, 방선균 유래의 폴리펩타이드로서, 배양 경과 시간에 따라 취득된 폴리펩타이드를 사용함으로써, 특정한 폴리펩타이드의 발현 변동을 추적할 수 있다. 당해 변동을 파악함으로써, 배양 조건을 최적화하는 것이 가능해진다.

방선균의 변이주 유래의 폴리펩타이드를 사용하는 경우에는 변이 폴리펩타이드를 검출할 수 있다.

13. 프로테옴 해석에 의한 변이주에서의 유용 변이의 동정

통상, 프로테옴은 폴리펩타이드를 2차원 전기영동으로 분리하고, 분리된 폴리펩타이드를 효소 절단한 후, 질량 분석계(MS)와 데이터베이스 검색을 사용하여, 당해 폴리펩타이드를 동정하는 방법을 가리킨다.

2차원 전기영동이란, 원리가 다른 2종류의 전기영동을 조합하여 수행하는 전기영동법을 말한다. 예를 들어, 1차 영동을 폴리펩타이드의 분자량으로 분리하고, 이어서 겔을 90도 또는 180도 회전시켜, 등전점에서 2차 영동하여 분리함으로써 여 러가지의 분리 패턴을 실현시킬 수 있다(JIS K 3600 2474).

데이터베이스 검색에는, 상기 2. 및 8.에서 작제된 본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산 서열 정보 및 본 발명의 기록 매체를 이용할 수 있다.

방선균 및 당해 미생물의 변이주를 각각 프로테옴 해석함으로써, 양자간에 변동이 인정된 폴리펩타이드를 동정할 수 있다.

방선균의 야생형주와 목적 산물의 생산성이 향상된 생산 균주를 각각 프로테옴 해석함으로써, 목적 산물의 생산 능력의 향상을 목적으로 하는 육종에 유용한 변이 단백질 또는 발현량이 변동된 단백질을 효율적으로 동정할 수 있다.

구체적으로는, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에서는 야생형주와 라이신 공정 균주를 각각 프로테옴 해석함으로써, 야생형주와 비교하여 라이신 공정 균주에서 증대되는 스폿을 발견하여, 데이터베이스 검색함으로써, 라이신 생산성의 향상에 따라 생산량이 증대된 폴리펩타이드를 동정할 수 있다.

또한, 본 발명의 방선균의 염기 서열 정보, 아미노산 서열 정보 및 당해 서열이 기록된 기록 매체를 사용하여, 발현 수준이 높은 단백질을 프로테옴 해석에 의해 동정함으로써, 당해 단백질을 암호화하는 유전자의 염기 서열과 이의 상류 영역의 염기 서열도 동시에 검색하는 것이 가능해져, 고발현 프로모터를 갖는 염기 서열을 효율적으로 선택할 수 있다.

또한, 프로테옴 해석에 있어서는, 변동하는 스폿이 변형된 단백질에 유래할 수 있는데, 본 발명의 방선균의 게놈의 염기 서열 정보, 아미노산 서열 정보 및 당해 서열이 기록된 기록 매체를 사용하는 검색에 의해, 변형된 단백질을 효율적으로 동정할 수 있다.

또한, 동정된 당해 단백질에 관한 염기 서열(프로모터, ORF 등의 염기 서열)을 본 발명의 방선균의 게놈의 염기 서열 정보, 아미노산 서열 정보 및 당해 서열이 기록된 기록 매체를 사용하여 검색하고, 발견된 염기 서열을 기초로 설계한 프라이머를 사용함으로써, 용이하게 유용 변이주가 갖는 유용 변이점을 특정할 수 있다. 상기 변이점이 특정됨으로써, 용이하게 당해 유용 변이 또는 당해 유용 변이로부터 유도되는 유용 변이를 갖는 산업상 유용한 변이주를 육종할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 기초로 상세히 설명하지만, 이에 제한되지는 않는다.

실시예 1

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 게놈의 전체 염기 서열의 결정

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 게놈의 전체 염기 서열의 결정은 전체 게놈 샷건법[참조: Science, 269, 496-512 (1995)]을 기본으로 하였다. 당해 방법에서는, 게놈 라이브러리를 작성하여, 이의 말단 서열을 랜덤하게 결정하고, 당해 서열을 컴퓨터 상에서 연결하여 전체 게놈을 덮어 나갔다. 구체적으로는 다음과 같이 수행하였다.

(1) 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267주의 게놈 DNA의 조제

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267주를 TSB 배지(17g/ℓ 펩톤, 3g/ ℓ 대두 펩톤, 5g/ℓ 염화나트륨, 2.5g/ℓ 포도당, 2.5g/ℓ 인산일수소칼륨, pH 7.3) 5ml에서 30℃에서 밤새 배양하고, 원심 분리에 의해 균체를 회수하였다. STE 완충액(10.3% 슈크로스, 25mmol/ℓ 트리스 염산염, 25mmol/ℓ EDTA, pH 8.0)으로 균체를 세정한 후, 2.5ml의 1.5% 펄스 필드 전기영동 샘플 조제용 저융점 아가로스(InCert agarose, 제조원: Takara Shuzo)와 혼합하고, 80mm 직경의 샤알레에 유입시켜, 실온에 30분 이상 방치하여 고화시켰다.

당해 샤알레에 1 내지 5mg/ml의 리소자임을 함유하는 STE 완충액 20ml를 첨가하여, 30℃에서 6 내지 20시간 동안 보온하여 세포벽을 분해하였다. STE 완충액을 제거하고, TE 완충액(10mmol/ℓ 트리스 염산염, 1mmol/ℓ EDTA, pH 8.0)으로 세정하여, 1mg/ml의 프로테이나제 K를 함유하는 10ml의 용액 완충액(0.5mol/ℓ EDTA, pH 9.5, 1% 사르코실)을 첨가하여, 50℃에서 24시간 동안 온화하게 진탕하였다. 진탕 후, 완충액을 제거하고, 50mmol/ℓ EDTA, pH 8.0 용액 20ml로 수회 세정하였다. 이후, 1mM PMSF를 함유하는 50mmol/ℓ EDTA, pH 8.0 용액을 20ml 첨가하여, 잔존하는 프로테이나제 K를 불활성화시켰다.

상기한 바와 같이 처리한 게놈 DNA를 포함하는 아가로스 겔을 5x5mm의 블럭으로 절단하여, 1% 아가로스 겔(45mmol/ℓ 트리스 붕산, 1mmol/ℓ 티오요소, pH 8.3)의 시료구에 유입하고, 전기영동 완충액을 충전시켜, 정방향 3초, 역방향 1초의 펄스 설정으로 120볼트에서 하룻밤 동안 영동을 수행하였다.

영동 종료 후, 아가로스 블럭을 취출하여, 50mmol/ℓ EDTA, pH 8.0 용액으로 세정하였다. 세정한 아가로스 블럭을 65℃로 보온하여 용해시킨 후, 5 내지 10ml 의 트리스 중화 페놀을 첨가하여, 실온에서 5분 동안 완만하게 진탕하고, 추가로 5 내지 10ml의 클로로포름을 첨가하여 5분 동안 완만하게 진탕하였다.

진탕 후, 원심 분리(10,000xg, 10분간, 20℃)를 수행하여, 수층을 분취하였다. 당해 수층을 사용하여, 10 내지 20ml의 페놀/클로로포름 추출(2회)를 수행한 후, 당해 수층에 1/10 양의 3mol/ℓ 아세트산나트륨 용액, 0.56배량의 이소프로판올을 첨가하여, 완만하게 혼화하여, 게놈 DNA를 침전시켰다.

생성된 게놈 DNA 침전을 70% 에탄올로 세정한 후, 공기 건조시켜, TE 완충액에 용해시킴으로써, 게놈 DNA 용액을 취득하였다.

(2) 샷건 라이브러리의 작제

상기에서 조제한 방선균의 게놈 DNA 0.1mg에 전량 0.4ml가 되도록 TE 완충액 등의 완충액을 첨가한다. 수득된 게놈 DNA 용액을 하이드로쉐어(HydroShare)(제조원: GeneMachines)를 이용하여, 출력 6에서 20회 처리함으로써, 당해 용액 중의 게놈 DNA를 1 내지 2kb의 단편으로 절단하였다.

수득된 게놈 DNA 단편을 SizeSep400 Span Columm(SeparoseCL4B, 제조원: Amasham)에 통과시켜 500b 이하의 단편을 제거하였다.

500b 이하의 단편을 제거하고, 수득된 DNA 단편의 말단을 DNA 블런팅 키트(DNA blunting kit, 제조원: Takara Shuzo) 등을 이용하여 평활화하였다.

평활화한 DNA 단편을, 페놀/클로로포름 처리 후, 에탄올 침전시킴으로써 취득하여, 게놈 라이브러리 삽입체로서 사용하였다.

당해 삽입체를, T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase, 제조원: Takara Shuzo)를 사용하여, pUC118 HincII/BAP(제조원: Takara Shuzo)에 10 내지 20℃에서 24시간 동안 방치하여, 연결하였다.

수득된 연결 반응물을 에탄올 침전시켜, 5 내지 20㎕의 TE 완충액에 용해시켰다.

당해 연결 용액 0.5㎕를 사용하여 대장균 Electro-Cells DH5α(제조원: Takara Shuzo)를 전기천공법으로 형질전환시켰다.

형질전환시킨 대장균을 100mg/ℓ의 암피실린 및 0.4mg/ℓ의 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인딜-β-D-갈락트피라노시드)을 함유하는 LB 평판 배지[한천을 1.5% 함유하는 LB 배지(10g/ℓ 박토트립톤, 5g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ 염화나트륨, pH 7.0)]에 도포하여 배양하였다. 또한, 게놈 DNA를 함유하는 재조합체 DNA를 보유하는 형질전환주를 백색 콜로니로서 선택하였다.

백색 콜로니의 형질전환체를 0.1mg/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지를 0.05 ml씩 첨가한 96웰 역가 플레이트 중, 37℃에서 하룻밤 정치 배양하였다. 배양 후, 당해 배양액에 50% 글리세롤을 0.05ml씩 첨가, 혼합하여 -80℃에서 보존하였다.

(3) 코스미드 라이브러리의 작성

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267주 게놈 DNA 약 0.1mg을 제한 효소 MboI으로 부분 분해하고, 저융점 아가로스 겔을 이용한 필드-반전 전기영동(정방향 0.3초, 역방향 0.1초)을 수행하였다.

영동 후, 약 40kb의 DNA 단편을 다량 함유하는 아가로스 겔 분획을 수집하여, 당해 아가로스 겔을 65℃에서 용해시켰다. 용해액을 순차적으로 페놀 처리, 클로로포름으로 처리한 후, 수층을 분취하여 DNA를 에탄올 침전시켰다.

수득된 DNA 단편을 BamHI 분해한 pKU402[참조: Actonomycetol. 8, 21-25, 1994]와 혼합하여, 0.3mg/ml의 농도로 만들고, T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase, 제조원: Takara Shuzo)를 이용하여 연결하였다.

수득된 연결 산물은 시판 중인 패키징 추출물인 Ready-To-Go Lambda Packging Kit(제조원: Amasham)를 이용하고 첨부 실험 순서에 따라 패키징하여, 대장균 XL-1-BlueMR(제조원: Stratagene)주에 도입하였다.

형질도입한 대장균은, 암피실린을 함유하는 LB 평판 배지에 도포하고, 30℃에서 하룻밤 배양하였다.

당해 형질전환체를 암피실린 0.1mg/ml를 함유하는 LB 배지 0.05ml를 첨가한 96웰 역가 플레이트 중에서 정치 배양한 후, 당해 배양액에 50% 글리세롤을 0.05 ml씩 첨가, 혼합하여 -80℃에서 보존하였다.

(4) 염기 서열의 결정

(4-1) 주형의 조제

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267주 게놈의 전체 염기 서열을 전체 게놈 샷건법을 기본으로 하여 결정하였다. 당해 방법에서 사용한 주형은 상기 (2)에서 조제한 라이브러리로부터 PCR법을 이용하여 조제하였다.

구체적으로는, 암피실린 0.1mg/ml를 함유하는 LB 배지를 웰당 0.08ml씩 분주한 96웰 역가 플레이트에 전체 게놈 샷건 라이브러리 유래 클론을 레플리케이터(제조원: GENETIX)로 식균하고, 30℃에서 밤새 정치 배양을 수행하였다.

당해 배양액을 멸균수로 40배 희석하여, 이의 5㎕를 100㎍/ml의 M13 정방향(GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG)(서열 15104) 및 역방향 프라이머(TCCGGCTCGTATGTTGTGTGGA)(서열 15105), Ex Taq 완충액(제조원: Takara Shuzo), 5mmol/ℓ dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 0.25U TaKaRa Ex Taq(제조원: Takara Shuzo)를 함유하는 용액 5㎕와 혼합하여, Biometra(제조원: Biotron)를 사용하여, 96℃에서 5분, 이어서, 96℃에서 15초, 70℃에서 60초의 사이클을 20 내지 40회 수행하고, 삽입 단편의 증폭을 수행하였다.

PCR 산물 정제용 키트(제조원: Amersham Pharmacia Biotech)에 의해 잉여 프라이머 및 뉴클레오타이드의 제거를 수행하여, 이것을 서열분석 반응의 주형으로서 사용하였다.

또한, 이본쇄 DNA 플라스미드를 주형으로 하여, 염기 서열을 결정하였다. 주형으로서 사용하는 이본쇄 DNA 플라스미드는 하기의 방법으로 취득하였다. 암피실린 0.05mg/ml를 함유하는 TSB 배지(17g/ℓ 펩톤, 3g/ℓ 대두 펩톤, 5g/ℓ 염화나트륨, 2.5g/ℓ 포도당, 2.5g/ℓ 인산일수소칼륨, pH 7.3)를 1ml씩 분주한 96웰 플레이트의 각 웰에, 전체 게놈 샷건 라이브러리 유래 클론을 식균하여, 30℃에서 밤새 진탕 배양하였다.

수득된 배양액으로부터 플라스미드 자동 조제기 KURABO PI-50(제조원: Kurabo Industries), MultiScreen(제조원: Millipore) 등을 이용하여, 제조사(Kurabo Industries 또는 Millipore)의 프로토콜에 따라 이본쇄 DNA 플라스미드를 조제하였다. 수득된 정제 이본쇄 DNA 플라스미드를 0.1mg/ml 정도가 되도록 물에 용해시켜, 서열분석의 주형으로서 사용하였다.

(4-2) 서열분석 반응

ABI PRISM BigDye Teminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(제조원: PE Biosystems) 용액 6㎕에 대하여 M13 정방향(H13-21) 프라이머 또는 M13 역방향(M13REV) 프라이머[DNA Research, 5, 1-9 (1998)], 및 상기 (4-1)에서 조제한 주형(PCR 산물 또는 플라스미드)를 혼합하여, 10㎕의 서열분석 반응액으로 하였다. 프라이머 및 주형의 양은 각각 1.6pmole 및 50 내지 200ng이다.

당해 반응액을 사용하여, GeneAmp PCR System 9700(제조원: PE Biosystems)로 45사이클의 다이 터미네이터 서열분석 반응을 수행하였다. 사이클 파라미터는 ABI PRISM BigDye Teminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit에 부속하는 매뉴얼에 따랐다. 샘플의 정제는 MultiScreen HV plate(제조원: Millipore)를 이용하고, 제조사(Milipore)의 매뉴얼에 따라서 수행하였다. 정제된 반응물은 ~30℃의 암소에서 보존하였다.

ABI PRISM 3700 DNA Analyser(제조원: PE Biosystem)를 이용하여, 부속된 매뉴얼에 따라, 당해 건조 반응물을 분석하였다.

3700 DNA Analyser에서 수득된 약 200,000회 반응의 데이터는, 서버(알파 서 버 ES40; 제조원: Compaq)로 전송하여 보존하였다. 약 200,000회 반응분의 데이터는 게놈 크기의 약 10배에 상당하였다.

(5) 어셈블리

모든 작업은 UNIX 플랫폼에 기초하여 수행하였다. 베이스 콜을 phred(The University of Washington)로, 벡터 서열의 제거를 Cross Match(The University of Washington)로 수행하고, 어셈블리를 phrap(The University of Washington)로 수행하였다. 어셈블리의 결과로 수득되는 콘티그는 그래피컬 에디터 consed(The University of Washington)를 이용하여 해석하였다. 베이스 콜부터 어셈블리까지의 일련의 작업은 consed에 부속하는 스크립트 phredPhrap를 이용함으로써 일괄하여 수행하였다.

(6) 갭 부분의 염기 서열 결정

(3)에서 구축한 코스미드 라이브러리 중의 각 코스미드를 (4-1)에 기재한 이본쇄 DNA 플라스미드 조제와 동일한 방법으로 조제하였다. 당해 코스미드의 삽입 단편 말단부의 염기 서열을 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(제조원: PE Biosystems)를 이용하여, 부속 매뉴얼에 따라 결정하였다.

코스미드 약 4,000개 클론의 삽입 단편의 양쪽 말단의 서열분석을 수행하고, 당해 서열과 일치하는 (5)에서 수득된 샷건 서열분석 유래 콘티그 중의 염기 서열 을 검색하였다. 이러한 작업에 의해 각 코스미드 클론과 각 콘티그의 연쇄 관계를 해명하여, 상호 정렬화를 수행하였다.

또한, 콘티그로는 커버되지 않는 영역(갭부)의 서열은 하기의 방법으로 결정하였다.

콘티그의 말단에 위치하는 서열을 포함하는 클론을 선별하였다. 이들 중에서, 삽입 단편의 한쪽의 말단 서열밖에 결정되어 있지 않은 약 4,000개 클론을 선별하여, 삽입 단편의 역말단의 서열을 결정하였다. 이어서, 2개의 콘티그에 삽입 단편 각각의 말단의 서열이 포함되는 전체 게놈 유래 샷건 라이브러리 클론 또는 코스미트 클론을 동정하고, 당해 클론의 삽입 단편의 전체 염기 서열을 결정함으로써, 당해 갭 부분의 염기 서열을 결정하였다. 갭 부분을 커버하는 샷건 라이브러리 클론 또는 코스미드 클론이 부재하는 경우에는, 당해 콘티그 말단의 서열에 상보하는 프라이머를 작성하여, PCR에 의해 갭 영역의 DNA 단편을 증폭시키고, 이것을 주형으로 한 프라이머 워킹법, 또는 증폭시킨 PCR 단편으로 조제한 샷건 클론의 서열을 결정하는 샷건법에 의해 서열분석을 수행하여, 상기 영역의 염기 서열을 결정하였다.

서열 정밀도가 낮은 영역에 대해서는 consed(The University of Washington)의 AUTOFINlSH 기능과 NAVIGATING 기능을 이용하여 프라이머를 합성하고, 프라이머워킹법에 의해 서열 결정하여, 서열 정밀도를 높였다. 이와 같이 하여 결정한 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267주 게놈의 염기 서열을 서열 1에 제시한다.

(7) ORF의 동정과 기능 추정

서열 1에 제시된 염기 서열 중의 ORF의 동정은, 다음과 같이 실시하였다. 우선, UNIX 플랫폼 상에서 ORF 동정 소프트웨어 Glimmer, GeneMark, 및 GeneMark.hmm을 이용하고, 소프트웨어에 부속하는 매뉴얼에 따라, ORF 영역의 추정을 수행하였다. 또한, 대응 학습 자료로서, 스트렙토마이세스 코엘리콜로르 A3(2)의 공표 데이터 1,000 ORF를 이용하였다. 이러한 결과를 바탕으로 서열 1에 제시된 염기 서열 중의 ORF를 동정하였다.

ORF의 기능 추정은, 동정된 ORF의 염기 서열을 GeneBank 데이터베이스 유래의 단백질 암호화 영역으로 이루어지는 데이터베이스인 Swiss-Prot, PIR, GenPept 등의 아미노산 데이터베이스에 대하여, 상동성 검색함으로써 또는 동정된 ORF의 아미노산 서열을 GeneBank 데이터베이스 유래의 단백질 암호화 영역을 포함하는 데이터베이스인 Swiss-Prot, PIR, GenPept 등의 아미노산 데이터베이스에 대하여, 상동성 검색 소프트웨어 BLAST를 이용하여 상동성 검색함으로써 수행하였다. 이와 같이 하여 결정한 ORF의 염기 서열을 서열 2 내지 7551에, 또한 당해 ORF에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 서열 7552 내지 15101에 제시한다.

실시예 2

신규한 폴리케타이드(polyketide) 화합물 올리고마이신의 생합성 유전자군의 탐색 및 동정

(1) 올리고마이신 생합성 유전자군의 탐색

스트렙토마이세스 아베르미틸리스는 항기생충·항곤충 활성을 갖는 폴리케타이드 화합물인, 아버멕틴을 생산하는데, 이외에 수종류의 폴리케타이드 화합물을 병산하고 있다. 그러나, 이러한 생합성 유전자의 존재에 대한 발견은 없으며, 또한 아버멕틴 생합성 유전자의 일부를 프로브로 하여, 서던 하이브리드화를 수행하여도 명확한 동정에는 도달하지 못한다. 그러나, 폴리케타이드 합성효소 유전자의 해석으로부터 기능 도메인 중의 β-케토아실-ACP 합성 및 아실 전이에 관한 도메인은 다른 도메인에 비하여 아미노산 서열의 상동성이 높은 것으로 공지되어 있다[참조: Science 252, 675 (1991), Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 9509 (1999)].

스트렙토마이세스 아베르미틸리스가 생산하는 아버멕틴의 생합성 유전자군의 염기 서열의 β-케토아실-ACP 합성 및 아실 전이에 관한 도메인의 아미노산 서열과 서열 1 내지 140에 제시된 염기 서열과의 BLAST 검색을 수행한 결과, 여러 종류의 폴리케타이드 합성효소 유전자라고 생각되는 영역이 발견되었다. 이 중 전체 길이가 60kb 이상인 유전자군 2종에 대하여 해석을 수행하였다. 서열 15102에 제시된 염기 서열의 ORF 검색을 수행한 결과, 당해 영역에 7개의 폴리케타이드 합성효소 유전자가 암호화되어 있음을 확인하였다. 또한, 추정되는 아미노산 서열에 관하여 폴리케타이드 합성효소의 각 도메인과의 상동성을 검색함으로써 도메인의 구성을 밝혔다(도 1). 도메인 구성의 해석 결과, 7개의 추정된 폴리케타이드 합성효소는 17개의 모듈(아실 측쇄 신장에 관한 도메인군)이 존재하여 16회의 축합이 이루어진 것으로 추정되었다. 이것은 올리고마이신의 폴리케타이드 골격과 일치하고 있었다.

(2) 올리고마이신 생합성 유전자군의 동정

서열 15102에 제시된 염기 서열에는 올리고마이신의 생합성 유전자군을 포함하고 있는 것으로 추정되었다. 이것을 확인하기 위하여, 폴리케타이드 합성효소를 암호화하는 영역에 상동적 재조합에 의한 삽입 변이를 실시하여, 올리고마이신 생산에 대한 영향을 검토하였다. 서열 15102의 염기 서열 중, 폴리케타이드 합성효소를 암호화하고 있는 것으로 추정되는 영역의 100,926번째 염기로부터 104,455번째 염기까지의 3.53kb의 BamHI 단편을 당해 폴리케타이드 합성효소를 암호화하고 있는 영역을 포함하는 코스미드 클론으로부터 추출하여, pUC19의 BamHI 부위에 서브클로닝하였다. 3,530bp의 BamHI 단편에는 BglII 부위가 하나 있고, 이 부위에 스트렙토마이신·스펙티노마이신 내성 유전자(aad3")를 포함하는 1.95kb의 BamHI 단편을 연결하였다.

수득된 연결물을 대장균 DH10B에 도입하고, O.1mg/ml의 암피실린, O.1mg/ml의 스펙티노마이신을 함유하는 LA 배지에서 목적으로 하는 형질전환체를 선택하였다. 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출한 후, BamHI으로 분해하여 클로닝한 5.48kb의 BamHI 단편을 절단하여, pKC7의 BamHI 부위에 연결하였다. 연결물을 대장균 DH1OB에 도입하고, 0.05mg/ml의 카나마이신, 0.1mg/ml의 암피실린 및 0.1mg/ml의 스펙티노마이신을 포함하는 LA 배지에서 목적으로 하는 형질전환체를 선택하였다. 스트렙토마이세스 아베르미틸리스는 Dam 및 Dcm에 의해 메틸화된 DNA를 제한하므로, 이러한 메틸화 결손 대장균으로 DNA를 조제한 DNA를 사용하여, 스 트렙토마이세스 아베르미틸리스를 형질전환시켜야 한다. 또한, 상기에서 수득된 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하여, dam 및 dcm 결손 대장균 GM2929주를 형질전환시켰다. 형질전환체로부터 수득된 플라스미드 DNA를 사용하여 스트렙토마이세스 아베르미틸리스를 통상법에 의해 프로토플라스트로 하고, 폴리에틸렌 글리콜에 의해 형질전환시키고, 재생 배지에 도포하여, 30℃에서 배양하였다.

배양 20시간 후에 0.1mg/ml의 네오마이신을 함유하는 연한천을 평판 1매당 2.5ml 중층하고, 추가로 7일 동안 배양을 계속함으로써, 형질전환체의 선택을 수행하였다.

선택 배지에서 생육한 형질전환체를 수집하고, YMS 한천 배지(4g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ 맥아 추출물, 4g/ℓ 가용성 전분, 20g/ℓ 한천, pH 7.5)에 도포하여, 30℃에서 7일 동안 배양하였다. 표면에 착생한 포자를 긁어내어, YMS 한천 평판 1매당 200개 콜로니가 되도록 도포하여, 30℃에서 5일 동안 배양하였다.

포자가 착생되었다는 것을 확인하고, 0.1mg/ml 스펙티노마이신을 함유하는 YMS 한천 평판 배지, 및 0.002mg/ml 네오마이신 및 0.1mg/ml 스펙티노마이신을 함유하는 YMS 한천 평판 배지의 2종류의 배지에 복제하여, 30℃에서 5일 동안 배양하였다.

각각의 플레이트에 생육한 콜로니 중, 네오마이신에 감수성이, 스펙티노마이신에 내성이 된, 2회 교차 재조합을 발생시킨 상동적 재조합체를 선택하였다.

폴리케타이드 합성효소 영역에 상동적 재조합에 의해 삽입 변이를 갖는 재조합체를 생산 배지(46g/ℓ 글루코스, 24g/ℓ 펩톤화 우유, 2.5g/ℓ 효모 추출물, 20g/ℓ 한천, pH 7.5)에 1평방센티미터의 패치상으로 도포하여 28℃에서 7일 동안 배양하였다.

배양 종료 후, 패치상으로 생육된 각각의 재조합체를 도려내어, O.5ml의 메탄올로 균체에 축적된 배양물을 추출하였다.

모든 재조합체의 배양물로부터 아버멕틴의 축적은 관찰되었으나, 올리고마이신은 축적되어 있지 않았다. 이것으로부터 서열 15102에 포함되는 7종의 ORF는 올리고마이신 생합성효소를 암호화하고 있다는 것이 명확해졌다.

실시예 3

신규한 폴리케타이드 화합물 펜타엔의 생합성 유전자군의 탐색 및 동정

(1) 펜타엔 생합성 유전자군의 탐색

스트렙토마이세스 아베르미틸리스가 생산하는 아버멕틴의 생합성 유전자군 염기 서열의 β-케토아실-ACP 합성 및 아실 전이에 관한 도메인의 아미노산 서열과, 서열 1에 제시된 염기 서열의 BLAST 검색을 수행한 결과, 여러 종류의 폴리케타이드 합성효소 유전자라고 생각되는 영역이 발견되었다.

이 중 전체 길이가 60kb 이상인 유전자군 2종 중의 하나는 올리고마이신이 생합성 유전자군인 것으로 밝혀졌다.

또 다른 1종의 유전자군에 대하여 올리고마이신 생합성 유전자의 해석과 동일하게 ORF의 검색을 수행하였다.

서열 15103에 제시된 염기 서열의 ORF 검색을 수행한 결과, 이 영역에 5개의 폴리케타이드 합성효소 유전자가 암호화되어 있음을 확인하였다. 추가로 추정되는 아미노산 서열에 관해서 폴리케타이드 합성효소의 각 도메인과의 상동성을 검색함으로써 도메인의 구성을 밝혔다(도 2)． 도메인 구성의 해석 결과, 5개의 추정된 폴리케타이드 합성효소는 14개의 모듈이 존재하여, 13회의 축합이 이루어진 것으로 추정되었다. 이것은 펜타엔 화합물 피리빈의 폴리케타이드 골격과 일치하고 있었다.

(2) 펜타엔 생합성 유전자군의 동정

서열 15103에 제시된 염기 서열에는 펜타엔의 생합성 유전자군을 포함하고 있는 것으로 추정되었다.

이것을 확인하기 위하여, 폴리케타이드 합성효소를 암호화하는 영역에 상동적 재조합에 의한 삽입 변이를 실시하여, 펜타엔 생산에 대한 영향을 검토하였다.

서열 15103의 염기 서열 중, 폴리케타이드 합성효소를 암호화하고 있는 것으로 추정되는 영역의 43,293번째 염기로부터 48,851번째 염기까지의 5.56kb의 SacI 단편을 당해 폴리케타이드 합성효소를 암호화하고 있는 영역을 포함하는 코스미드 클론으로부터 절단하여, pUC19의 SacI 부위에 서브클로닝하였다. 5.56kb의 SacI 단편에는 EcoRV 부위가 1개소 있으며, 이 부위에 스트렙토마이신·스펙티노마이신 내성 유전자(aad3")를 포함하는 1.95kb의 DraI 단편을 연결하였다.

수득된 연결물을 대장균 DH1OB에 도입하고, O.1mg/ml 암피실린 및 0.1mg/ml 스펙티노마이신을 함유하는 LA 배지에서 목적으로 하는 형질전환체를 선택하였다.

형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출한 후, EcoRI와 HindIII로 분해하여 클로닝된 7.51kb의 EcoRI-HindIII 단편을 절단하여, pKC7의 EcoRI/HindIII 부위에 연결하였다.

연결물을 대장균 DH10B에 도입하고, 0.05mg/ml 카나마이신, 0.1mg/ml 암피실린 및 O.1mg/ml 스펙티노마이신을 함유하는 LA 배지에서 목적으로 하는 형질전환체를 선택하였다.

상술한 바와 같이 스트렙토마이세스 아베르미틸리스는 메틸화된 DNA를 제한하기 때문에 상기로부터 수득된 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하여, dam 및 dcm 결손의 대장균 GM2929주를 형질전환시켰다.

형질전환체로부터 수득된 메틸화 부재의 플라스미드 DNA를 이용하여, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 프로토플라스트에 폴리에틸렌 글리콜법으로 형질전환시키고, 재생 배지에 도포하여, 30℃에서 배양하였다.

배양 20시간 후에 0.1mg/ml의 네오마이신을 함유하는 연한천을 평판 1매당 2.5ml 중층하여, 추가로 7일 동안 배양을 계속함으로써, 형질전환체를 선택하였다.

선택 배지에서 생육한 형질전환체를 수집하여, YMS 한천 배지(4g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ 맥아 추출물, 4g/ℓ 가용성 전분, 20g/ℓ 한천, pH 7.5)에 도포하여, 30℃에서 7일 동안 배양하였다. 표면에 착생한 포자를 긁어내어, YMS 한천 평판 1매당 200개 콜로니가 되도록 도포하여, 30℃에서 5일 동안 배양하였다.

포자가 착생된 것을 확인하고, O.1mg/ml의 스펙티노마이신을 함유하는 YMS 한천 평판 배지, 및 0.002mg/ml 네오마이신 및 0.1mg/ml 스펙티노마이신을 함유하 는 YMS 한천 평판 배지의 2종류의 배지에 복제하여, 30℃에서 5일 동안 배양하였다.

폴리케타이드 합성효소 영역에 상동적 재조합에 의해 삽입 변이를 갖는 재조합체를, 생산 배지(40g/ℓ 가용성 전분, 20g/ℓ 탈지 대두, 0.5g/ℓ 황산제일철 7수화물, 1g/ℓ 인산이칼륨, 0.3g/ℓ 염화칼륨, 20g/ℓ 한천, pH 6.5)에 1평방센티미터의 패치상으로 도포하여, 28℃에서 7일 동안 배양하였다.

배양 종료 후, 패치상으로 생육한 각각의 재조합체를 도려내어, 0.5ml의 메탄올로 균체에 축적한 배양물을 추출하였다. 모든 재조합체의 배양물로부터 아버멕틴의 축적은 관찰되었으나, 펜타엔은 축적되어 있지 않았다. 이러한 것으로부터 서열 15103에 포함되는 5종의 ORF는 펜타엔 생합성효소를 암호화하고 있는 것으로 밝혀졌다.

상기에 제시한 신규한 폴리케타이드 화합물의 생합성 유전자군의 발견으로부터 예증되는 바와 같이, 본 발명은 종래의 분자 유전학적인 클로닝의 수법을 이용하지 않고 폴리케타이드 화합물의 생합성 유전자군을 발견하는 데에 있어서, 유효하고 또한 신속한 탐색 방법을 제공하는 것이다. 또한, 발견된 폴리케타이드 합성효소의 도메인 구성은 신규 폴리케타이드 화합물 창제에 있어서도 유용한 정보를 제공하는 것이다. 이러한 폴리케타이드 화합물의 신속한 탐색 방법론은 본 발명에서 개시한 게놈의 염기 서열 정보를 이용함으로써 효율적으로 실시할 수 있는 접근 법이고, 이러한 유효성은 본 발명에 의해서 최초로 발견된 것이다.

실시예 4

스트렙토마이세스 아베르미틸리스 게놈 서열을 이용한 호모로그 검색

(1) 트랜스케톨라제(Transketolase)의 검색

Swiss-prot 데이터베이스로부터, 트랜스케톨라제(Transketolase; EC2.2.1.1)로서의 기능이 확인되어 있는 단백질의 아미노산 서열로서 대장균 트랜스케톨라제의 서열(ECTKT)을 입수하였다. 이러한 아미노산 서열의 전체 길이를 조회 서열로 하고, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 게놈 서열로 이루어지는 염기 서열 데이터베이스에 대하여 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스에 대하여, FASTA 프로그램을 이용하여 상동성 검색을 수행하였다. E-값이 10^-10 이하인 것을 근거로 유의적인 상동성을 갖는다고 판정하였다.

그 결과, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 게놈 서열로 이루어지는 염기 서열 데이터베이스 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어지는 데이터베이스내에서, 서열 1755에 제시된 염기 서열을 갖는 ORF 및 서열 6292에 제시된 염기 서열을 갖는 ORF에 의해 암호화되는 아미노산 서열에 대장균 트랜스케톨라제의 ORF와의 유의적인 상동성이 발견되었다.

이러한 ORF에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 타생물종의 트랜스케톨라제와의 유사성을 보다 상세히 조사하기 위하여, 이러한 아미노산 서열을 조회 서열로 하고, GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) nr-aa 데이터베이스, PDB 데이터베이스, Swiss-Prot 데이터베이스, PIR 데이터베이스, PRF 데이터베이스에 등록되어 있는 것으로부터, 중복을 제외하고 작성된 아미노산 서열 데이터베이스에 대하여 BLAST 프로그램을 이용하여 검색을 수행하였다.

그 결과, 이들 2개의 아미노산 서열 모두, 타생물종의 트랜스케톨라제에 대하여 유의적인 상동성을 나타내며, 또한 다른 단백질의 아미노산 서열과의 상동성과 비교하여 명백하게 트랜스케톨라제에 대한 상동성이 높기 때문에, 이들 2개의 ORF가 암호화하는 아미노산 서열을 갖는 단백질은 트랜스케톨라제로서 기능하고 있는 것으로 추정되었다. 이러한 것으로부터, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에는 트랜스케톨라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 ORF가 2개 존재하는 것으로 추정되었다.

(2) 트랜스알돌라제(Transaldolase)의 검색

Swiss-prot 데이터베이스로부터 트랜스알돌라제(Transaldolase; EC2.2.1.2)로서의 기능이 확인되어 있는 단백질의 아미노산 서열로서 대장균 트랜스케톨라제의 서열 TalA(D13159) 및 TalB(S80045)를 입수하였다. 이러한 아미노산 서열의 전체 길이를 조회 서열로 하여, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 게놈 서열을 포함하는 염기 서열 데이터베이스에 대하여 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어지는 데이터베이스에 대하여, FASTA 프로그램을 이용하여 상동성 검색을 수행하였다. E-값이 l0^-10 이하라는 것을 근거로 유의적인 상동성을 갖는다고 판정하였다.

그 결과, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 게놈 서열로 이루어지는 염기 서열 데이터베이스 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어지는 데이터베이스내에서, 서열 1756에 제시된 염기 서열을 갖는 ORF 및 서열 6291에 제시된 염기 서열을 갖는 ORF에 의해 암호화되는 아미노산 서열에, 대장균 트랜스케톨라제 TalA 및 TalB의 ORF와의 유의적인 상동성이 발견되었다.

이러한 ORF에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 타생물종의 트랜스케톨라제와의 유사성을 보다 상세하게 조사하기 위하여, 이러한 아미노산 서열을 조회 서열로 하여, GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) nr-aa 데이터베이스, PDB 데이터베이스, Swiss-Prot 데이터베이스, PIR 데이터베이스, PRF 데이터베이스에 등록되어 있는 것으로부터, 중복을 제외하고 작성된 아미노산 서열 데이터베이스에 대하여, BLAST 프로그램을 이용하여 검색을 수행하였다.

그 결과, 이들 2개의 아미노산 서열 모두, 타생물종의 트랜스알돌라제에 대하여 유의적인 상동성을 나타내고, 또한 다른 단백질의 아미노산 서열과의 상동성과 비교하여 명백하게 트랜스알돌라제에 대한 상동성이 높기 때문에, 이들 2개의 ORF가 암호화하는 아미노산 서열을 갖는 단백질은 트랜스알돌라제로서 기능하는 것으로 추정되었다. 이러한 것으로부터, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에는 트랜스케톨라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 ORF가 2개 존재하는 것으로 추정되었다. 또한, 서열 1756에 제시된 ORF는 서열 1755에 제시된 ORF의 하류와 인접하고 있었다. 한편, 서열 6291에 제시된 ORF도 서열 6292에 제시된 ORF의 하류와 인접하고 있었다.

(3) 글루코스-6-인산 데하이드로게나제(Glucose-6-phosphate dehydrogenase)의 검색

Swiss-prot 데이터베이스로부터, 글루코스-6-인산 데하이드로게나제(Glucose-6-phosphate dehydrogenase; EC1.1.1.49)로서의 기능이 확인되어 있는 단백질의 아미노산 서열로서 대장균 글루코스-6-인산 데하이드로게나제의 서열(수탁번호 M55005)을 입수하였다. 당해 아미노산 서열의 전체 길이를 조회 서열로 하고, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 게놈 서열로 이루어지는 염기 서열 데이터베이스에 대하여 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어지는 데이터베이스에 대하여, FASTA 프로그램을 이용하여 상동성 검색을 수행하였다. E-값이 10^-10 이하인 것을 근거로 유의적인 상동성을 갖는다고 판정하였다.

그 결과, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스의 게놈 서열로 이루어지는 염기 서열 데이터베이스 또는 게놈 서열로부터 예측한 ORF 영역의 아미노산 서열로 이루어지는 데이터베이스내에서, 서열 1757에 제시된 염기 서열을 갖는 ORF 및 서열 6290에 제시된 염기 서열을 갖는 ORF에 의해 암호화되는 아미노산 서열에, 대장균 글루코스-5-인산 데하이드로게나제의 ORF와의 유의적인 상동성이 발견되었다.

이러한 ORF에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 타생물종의 트랜스케톨라제와의 유사성을 보다 상세하게 조사하기 위하여, 이러한 아미노산 서열을 조회 서열로 하여, GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) nr-aa 데이터베이스, PDB 데이터베이스, Swiss-Prot 데이터베이스, PIR 데이터베이스, PRF 데이터베이스에 등록되어 있는 것으로부터, 중복을 제외하고 작성된 아미노산 서열 데이터베이스에 대하여 BLAST 프로그램을 이용하여 검색을 수행하였다.

그 결과, 이들 2개의 아미노산 서열 모두, 타생물종의 글루코스-6-인산 데하이드로게나제에 대하여 유의적인 상동성을 나타내고, 또한 다른 단백질의 아미노산 서열과의 상동성과 비교하여 명백하게 글루코스-6-인산 데하이드로게나제에 대한 상동성이 높기 때문에, 이들 2개의 ORF가 암호화하는 아미노산 서열을 갖는 단백질은 글루코스-6-인산 데하이드로게나제로서 기능하는 것으로 추정되었다. 이러한 것으로부터, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스에는 글루코스-6-인산 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 ORF가 2개 존재하는 것으로 추정되었다. 또한, 서열 1757에 제시된 ORF는 서열 1756에 제시된 ORF의 하류와 인접하고 있었다. 한편, 서열 6290에 제시된 ORF도 서열 6291에 제시된 ORF의 하류와 인접하고 있었다.

이상의 점으로부터 서열 1755에 제시된 ORF, 서열 1756에 제시된 ORF와 서열 1757에 제시된 ORF는 오페론을 형성하고 있고, 또한 서열 6292에 제시된 ORF, 서열 6291에 제시된 ORF와 서열 6290에 제시된 ORF도 오페론을 형성하고 있는 것으로 밝 혀졌다.

실시예 5

신규한 2차 대사 산물 생합성 유전자군의 탐색

스트렙토마이세스 속은 다종 다양한 2차 대사 산물을 생산하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 2차 대사 산물은 생합성의 양식에 의해, 멜라닌, β-락탐, 펩타이드, 아미노글리코시드, 방향족 폴리케타이드(테트라사이클린, 퀴논, 안트라사이클린 등 방향환을 포함하는 것), 마크로라이드(대환상 락톤·락탐 포함), 시키미산(shikimic acid), 테르펜, 및 시데로포어(siderophore)계 화합물 등으로 분류할 수 있다. 멜라닌 화합물은 방향족 아미노산 대사물이 축합하여 생성된다. β-락탐 및 펩타이드계 화합물은 아미노산이 리포솜에 의한 펩타이드 신장을 거치지 않고, 펩타이드 합성효소에 의해 축합하여 생성된다. 아미노글리코시드계 항생 물질은 당 및 아미노사이클리틀이 배당화하여 생성된다. 방향족 폴리케타이드 화합물은 아세트산 또는 말론산이 II형 폴리케타이드 합성효소에 의해 축합, 탈수, 환화를 거쳐 생성된다. 마크로라이드 등의 대환상 락톤(락탐 포함)은 아세트산, 프로피온산 등의 저급 지방산 또는 이들의 디카복실산이 I형 폴리케타이드 합성효소에 의해 축합, 환원 등을 거친 후 환화하여 생성된다. 시키미산계 화합물은 방향족 아미노산이 대사되어 생성된다. 테르펜계 화합물은 이소프레노이드-2 인산이 축합하여 생성된다. 또한, 시데로포어계 화합물은 석신산이나 디아미노카복실산이 결합하여 생성된다.

이미 보고되어 있는 이러한 2차 대사 산물 생합성효소의 아미노산 서열과 서 열 1에 제시된 염기 서열과의 BLAST 검색을 수행한 결과, 아버멕틴, 올리고마이신 및 폴리엔 화합물 외에 27종의 2차 대사 산물 생합성 유전자군으로 추정되는 영역이 발견되었다. 이들 27종 유전자군의 내역은 멜라닌 생성(방향족 멜라닌 포함)에 관여하는 유전자군 4종, 테르펜 화합물 생성에 관여하는 유전자군 5종, 시데로포어 생성에 관여하는 유전자군 1종, 폴리케타이드 락톤 또는 락탐 화합물 생성(I형 폴리케타이드 합성효소가 관여)에 관여하는 유전자군 6종, 방향족 폴리케타이드 화합물 생성(II형 폴리케타이드 합성효소가 관여)에 관여하는 유전자군 2종, 이외의 폴리케타이드 화합물 생성(I형, II형 폴리케타이드 합성효소 이외의 폴리케타이드 합성효소가 관여)에 관여하는 유전자군 1종, 펩타이드 화합물 생성(펩타이드 합성효소가 관여)에 관여하는 유전자군 8종이었다. 다음에 각각의 유전자군에 포함되는 서열을 제시한다.

(1) 멜라닌 생성에 관여하는 유전자군

1) Mel1(티로시나제 관여) 영역에는 서열 1125 및 서열 1126에 제시된 ORF가 존재하였다.

2) Mel2(티로시나제 관여)영역에는 서열 5345 및 서열 5346에 제시된 ORF가 존재하였다.

3) Hpd(하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 관여) 영역에는 서열 5133 및 서열 5134에 제시된 ORF가 존재하였다.

4) Spp(II형 폴리케타이드 합성효소 관여) 영역에는 서열 2821 내지 2830에 제시된 ORF가 존재하였다.

(2) 테르펜 화합물 생성에 관여하는 유전자군

1) Crt 영역에는 서열 1008 내지 1014에 제시된 ORF가 존재하였다.

2) Terp 영역에는 서열 77에 제시된 ORF가 존재하였다.

3) Shr 영역에는 서열 1638 내지 1643에 제시된 ORF가 존재하였다.

4) Geo 영역에는 서열 2151 내지 2153에 제시된 ORF가 존재하였다.

5) Ptc 영역에는 서열 2986 내지 2988에 제시된 ORF가 존재하였다.

(3) 시데로포어 생성에 관여하는 유전자군

1) Sdf 영역에는 서열 5252 내지 5256에 제시된 ORF가 존재하였다.

(4) 폴리케타이드 락톤(또는 락탐) 생성에 관여하는 유전자군

1) Pks-1 영역에는 서열 7337 내지 7341에 제시된 ORF가 존재하였다.

2) Pks-2 영역에는 서열 1539 내지 1542에 제시된 ORF가 존재하였다.

3) Pks-3 영역에는 서열 2263 내지 2272에 제시된 ORF가 존재하였다.

4) Pks-4 영역에는 서열 7163 내지 7198에 제시된 ORF가 존재하였다.

5) Pks-5 영역에는 서열 2353 내지 2356에 제시된 ORF가 존재하였다.

6) Pks-11 영역에는 서열 101 및 서열 102에 제시된 ORF가 존재하였다.

(5) 방향족 폴리케타이드 화합물 생성에 관여하는 유전자군

1) Pks-8 영역에는 서열 3637 내지 3653에 제시된 ORF가 존재하였다.

2) Pks-9 영역에는 서열 2359 내지 2376에 제시된 ORF가 존재하였다.

(6) I형 및 II형 폴리케타이드 합성효소 이외의 합성효소로 생합성되는 폴리케타이드 화합물 생성에 관여하는 유전자군

1) Pks-10 영역에는 서열 7109 및 서열 7110에 제시된 ORF가 존재하였다.

(7) 펩타이드 화합물 생성에 관여하는 유전자군

1) Nrps-1 영역에는 서열 3179 내지 3190에 제시된 ORF가 존재하였다.

2) Nrps-2 영역에는 서열 3621 내지 3635에 제시된 ORF가 존재하였다.

3) Nrps-3 영역에는 서열 3143 내지 3152에 제시된 ORF가 존재하였다.

4) Nrps-4 영역에는 서열 7142 내지 7145에 제시된 ORF가 존재하였다.

5) Nrps-5 영역에는 서열 6586 내지 6611에 제시된 ORF가 존재하였다.

6) Nrps-6 영역에는 서열 595 내지 603에 제시된 ORF가 존재하였다.

7) Nrps-7 영역에는 서열 825 내지 859에 제시된 ORF가 존재하였다.

8) Nrps-8 영역에는 서열 1238 내지 1241에 제시된 ORF가 존재하였다.

상기한 I형 폴리케타이드 합성효소에 의한 폴리케타이드 락톤(또는 락탐) 생성에 관여하는 유전자군 및 펩타이드 화합물 생성에 관여하는 유전자군의 ORF 중, 폴리케타이드 합성효소 및 펩타이드 합성효소를 암호화하고 있는 영역은 다기능 폴리펩타이드로 추정된다. 이러한 폴리펩타이드에 존재하는 기능 도메인의 추정은 폴리케타이드 합성효소 및 펩타이드 합성효소의 각각의 기능 도메인의 컨센서스 서열[참조: Science 252, 675 (1991), Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 9509 (1999), Chem. & Biol. 6, 493 (1999)]을 조사함으로써 추정하는 것이 가능하다. 표 1에 폴리케타이드 합성효소로 추정되는 ORF의 기능 도메인을, 표 2에는 펩타이드 합성효소로 추정되는 ORF의 기능 도메인 및 활성화되는 추정 아미노산에 대하여 통합하였다.

I형 폴리케타이드 합성효소의 기능 도메인 구성

펩타이드	모듈	기능 도메인
Pks-1_1	모듈 1	KS	AT			ACP	KR
Pks-1_2	모듈 2	KS	AT
Pks-2	모듈 1	KS	AT	DH	KR	ACP
Pks-2	모듈 2	KS	AT	DH	KR	ACP	TE
Pks-3_1	도입 모듈	KS^*	AT			ACP
Pks-3_2	모듈 1				KR	ACP
Pks-4	모듈 1	KS	AT		KR	ACP
Pks-5	도입 모듈	KS^*	AT			ACP
	모듈 1	KS	AT	DH	KR	ACP
	모듈 2	KS	AT	DH	KR^*	ACP
Pks-6	모듈 1	KS	AT			ACP
Pks-7	모듈 1	KS				ACP
기능 도메인 약어의 설명: ACP, 아실 캐리어 단백질; AT, 아실 전이 효소; DH, 탈수 효소; KR, β-케토아실-ACP 환원 효소; KS, β-케토아실-ACP 합성효소; TE, 티오에스테라제 *는 컨센서스 서열 영역의 아미노산의 치환 또는 결실에 의해 기능하지 않은 것으로 추정

펩타이드 합성효소의 아미노산 아데닐화 도메인의 컨센서스 서열과 활성화 아미노산 및 도메인 구성

펩타이드	아데닐화 도메인의 컨센서스 서열^*								추정 기질	도메인 구성^***
펩타이드	235	236	239	278	299	301	322	330	추정 기질	도메인 구성^***
Nrps-1_1	D	F	W	N	V	G	M	V	트레오닌	C-A-T
Nrps-1_2	D	A	W	L	L	G	A	V	로이신	C-A-T-E
Nrps-1_3	D	V	W	H	V	S	L	L	세린	A-T
	D	G	T	L	T	A	E	V	티로신	C-A-T
Nrps-2_1	D	A	Q	E	L	A	V	L	글루타민	A-T
Nrps-2_2	D	A	W	L	Y	G	L	V	로이신	C-A-T-E
	D	L	P	K	V	G	E	V	아스파라긴	C-A-T
Nrps-2_3	D	V	W	N	L	S	L	I	세린	C-A-T-E
	D	L	P	K	V	G	E	V	아스파라긴	C-A-T-E
	D	L	P	K	V	G	E	V	아스파라긴	C-A-T-Te
Nrps-3_1	D	M	E	L	L	G	L	I	오르티닌	C-A-T
Nrps-3_2	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd^**	-	E-Te
Nrps-3_3	D	V	W	H	V	S	L	V	세린	A-T
Nrps-4	D	L	T	K	L	G	E	V	아스파라긴	A-T
Nrps-5	D	V	Q	L	L	A	H	V	프롤린	A-T
Nrps-6	D	V	Q	L	I	A	H	V	프롤린	C-A-T
Nrps-7_1	D	F	E	T	T	A	A	V	발린	A-T
Nrps-7_2	D	A	K	D	L	G	V	V	글루타민산	A
Nrps-7_3	D	F	Q	L	L	G	L	A	피페콜린산	A-T
Nrps-7_4	D	A	F	W	L	G	G	T	발린	A-T-C
Nrps-7_5	D	A	Q	D	L	G	L	V	글루타민산	A-T
Nrps-7_6	D	F	Q	L	V	G	V	A	피페콜린산	C-A-T
Nrps-7_7	D	V	W	H	V	T	V	V	세린	A-T
Nrps-7_8	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd^**	-	T-C
Nrps-7_9	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd^**	-	C
Nrps-7_10	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd^**	-	C
Nrps-7_11	D	L	Y	N	L	S	L	I	시스테인	A-T
Nrps-7_12	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd^**	-	T-C-T-Te
Nrps-7_13	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd	nd^**	-	T-C
Nrps-8	D	L	V	F	G	L	G	I	알라닌	A
Nrps-9	D	H	E	S	D	V	G	I	시스테인	A
* Grs(그라미시딘 합성효소) 펩타이드 합성효소 아데닐화 도메인으로부터의 아미노산 서열을 기준으로 한 N 말단측부터의 번호. 기존의 컨센서스 서열을 발견할 수 없거나 아데닐화 도메인이 존재하지 않는다. * 기능 도메인 약어의 설명: C, 축합 효소; A, 아데닐화 효소; T, 펩타이드 캐리어 단백질; E, 전이 효소; Te, 티오에스테라제

실시예 6

아버멕틴 생산 향상에 유효한 유전자의 검색 및 게놈 정보에 기초하는 아버멕틴 생산 향상주의 재구축

(1) 아버멕틴 생산 향상에 유효한 유전자의 검색

에스. 아베르미틸리스 ATCC31267(야생주)와 이 야생주로부터 변이 유기제 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘에 의한 랜덤 변이와 선택을 다단층에 걸쳐 반복함으로써 수득된, 아버멕틴 고생산 변이주를 아버멕틴 생산 배지에서 배양하여, 24시간째 및 48시간째의 균체내 단백질과 전사 산물의 전체 RNA를 비교하였다. 그 결과, 수종류의 mRNA의 전사량이 다르다는 것이 관찰되어, 다시 생산 배지를 교체하여 재확인한 결과, 이들 중의 2종이 유전자의 발현량이 변화되었음이 밝혀졌다. 이러한 2종의 mRNA의 cDNA 단편의 부분 서열을 조사한 결과, 서열 3692 및 서열 923이었다. 서열 923의 ORF는 아버멕틴 생합성 유전자군에 존재하는 제어 유전자로 동정되었다. 한편, 서열 3692은 신규한 ORF이었다. 서열 3692에 상당하는 mRNA는 아버멕틴 고생산주로부터는 소량밖에 검출되지 않으므로, 당해 ORF의 유전자 산물은 에스. 아베르미틸리스에서의 아버멕틴 생산에 대한 억제제로 추정되었다.

(2) 아버멕틴 고생산주의 재구축

에스. 아베르미틸리스 ATCC31267로부터 변이 유기제 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘에 의한 랜덤 변이와 선택을 다단층에 걸쳐 반복함으로써 수득된, 아버멕틴 고생산 변이주는 억제제인 서열 3692에 제시된 ORF가 유전자 산물의 발현이 감소하고 있기 때문에, 아버멕틴의 생산이 상승하고 있는 것으로 추찰되었다. 따라서, 야생주의 서열 3692에 제시된 ORF를 파괴함으로써, 아버멕틴 생산의 향상을 기대할 수 있다.

에스. 아베르미틸리스 ATCC31267의 염색체 DNA에서 서열 3692에 제시된 ORF 부분 및 이의 상류와 하류를 포함하는 부분을 PCR로 증폭시켜, ORF의 거의 중앙에 내성 유전자를 배치한 DNA 단편을 작성하고, 이것을 야생주 염색체의 동일 영역과 상동적 재조합을 발생시켜 파괴주를 작제하였다. 서열 ORF4831 상류측의 증폭에는 프라이머 1(5'-CTCGAGGATCCGAGCGCTTCAGCACGTCGGAGATGGTT-3')(서열 15106)과 프라이머 2(5'-CTCGAGAAGCTTCACCCAGATCACCAGGTTGTCGCCCTCG-3')(서열 15107)를 사용하고, 에스. 아베르미틸리스 ATCC31267의 염색체 DNA를 주형으로 하여 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 존재하에 Expand Taq DNA 폴리머라제(제조원: Boehringer Mannheim) 0.2U를 첨가하여, 96℃, 5분간 변성시키고, 다시 98℃, 15초, 70℃, 60초의 사이클을 30회 수행하여, 1861bp의 단편을 증폭시켰다. 한편, 서열 ORF3692의 하류측 증폭에는 프라이머 3(5'-CTCGAGAAGCTTGGAGCCGTACCCGTTGACGATGAAGGACC-3')(서열 15108)과 프라이머 4(5'-CTCGAGGATCCATCTGATGCCGTCCTTCGCCATGCC-3')(서열 15109)를 사용하고, 에스. 아베르미틸리스 ATCC31267의 염색체 DNA를 주형으로 하여 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 존재하에 Expand Taq DNA 폴리머라제(제조원: Boehringer Mannheim) 0.2U를 첨가하고, 96℃, 5분간 변성시키고, 다시 98℃, 15초, 70℃, 60초의 사이클을 30회 수행하여, 1656bp의 단편을 증폭시켰다. 각각의 증폭 단편을 BamHI 및 HindIII로 분해하고, 이들 2개 단편을 HindIII로 분해한 PUC19와 혼합하여, T4 DNA 폴리머라제, ATP를 첨가하여 3개 단편의 연결을 수행하였다. 연결물을 대장균 DH10B에 도입하고, 0.1mg/ml 암피실린을 포함하는 LA 배지에서 목적으로 하는 형질전환체를 선택하였다. 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출한 후, BamHI으로 부분 분해 한 다음, 스트렙토마이신·스펙티노마이신 내성 유전자(aad3")를 포함하는 1.95kb의 BamHI 단편을 연결하였다. 연결물을 대장균 DH10B에 도입하고, 0.1mg/ml 암피실린 및 0.1mg/ml 스펙티노마이신을 함유하는 LA 배지에서 형질전환체를 선택하였다. 각각의 형질전환체로부터 재조합하여 플라스미드를 추출하고, EcoRI/HindIII로 절단하여, 스트렙토마이신·스펙티노마이신 내성 유전자(aad3")가 벡터의 클로닝 부위의 BamHI에는 아니고, 클로닝된 단편의 중앙에 배치한 클론을 선택하였다. 목적으로 하는 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출한 후, HindIII로 분해하여 클로닝된 5.47kb의 HindIII 단편을 절단하여, pKC7의 HindIII 부위에 연결하였다. 연결물을 대장균 DH10B에 도입하고, 0.05mg/ml 카나마이신, 0.1mg/ml 암피실린 및 0.1mg/ml 스펙티노마이신을 함유하는 LA 배지에서 목적으로 하는 형질전환체를 선택하였다. 상술한 바와 같이 스트렙토마이세스 아베르미틸리스는 메틸화된 DNA를 제한하기 때문에, 상기에서 수득된 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출하여, dam 및 dcm 결손된 대장균 GM2929주를 형질전환시켰다. 형질전환체로부터 수득된 메틸화 부재의 플라스미드 DNA를 이용하여, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 ATCC31267의 프로토플라스트에 폴리에틸렌 글리콜법으로 형질전환시키고, 재생 배지에 도포하여, 30℃에서 배양하였다. 배양 20시간 후에 0.1mg/ml의 네오마이신을 함유하는 연한천을 평판 1매당 2.5ml 중층하고, 추가로 7일 동안 배양을 계속함으로써 형질전환체를 선택하였다. 선택 배지에서 생육한 형질전환체를 수집하고, YMS 한천 배지(4g/ℓ 효모 추출물, 10g/ℓ 맥아 추출물, 4g/ℓ 가용성 전분, 20g/ℓ 한천, pH 7.5)에 도포하여, 30℃에서 7일 동안 배양하였다. 표면에 착생한 포 자를 긁어내어, YMS 한천 평판 1매당 200개 콜로니가 되도록 도포하고, 30℃에서 5일 동안 배양하였다.

포자가 착생된 것을 확인하고, 0.1mg/ml의 스펙티노마이신을 함유하는 YMS 한천 평판 배지, 및 0.002mg/ml 네오마이신 및 0.1mg/ml 스펙티노마이신을 함유하는 YMS 한천 평판 배지의 2종류의 배지에 복제하여, 30℃에서 5일 동안 배양하였다. 각각의 플레이트에 생육한 콜로니 중, 네오마이신에 감수성이, 스펙티노마이신에 내성이 된, 2회 교차 재조합을 발생시킨 상동적 재조합체를 선택하였다. 염색체 상의 서열 3692에 제시된 ORF에 상동적 재조합에 의해 삽입 변이를 갖는 재조합체를 생산 배지(46g/ℓ 글루코스, 24g/ℓ 펩톤화 우유, 2.5g/ℓ 효모 자기분해물, pH 7.5) 10ml를 포함하는 100ml용 삼각 플라스크에 이식하여, 28℃에서 7일 동안 진탕 배양하였다.

배양 종료 후, 10ml의 메탄올을 첨가하고, 30분 동안 진탕하여 배양물을 추출하였다. 균체 잔사를 3,000rpm 5분간의 원심 분리에 의해서 제거하여 상청을 수득하였다. 상청에 포함되는 아버멕틴의 양을 ODS 컬럼(4.6ømmx250mm; 이동층; 메탄올-물 = 80:20)을 사용하여 정량하였다. 에스. 아베르미틸리스 ATCC31267는 대략 5㎍/ml의 아버멕틴을 축적하고 있었으나, 서열 3692에 제시된 ORF가 파괴된 재조합체로부터는 대략 28㎍/ml의 아버멕틴의 축적이 평가되었다.

이상 제시한 아버멕틴 생산 향상주의 재구축으로부터 예증되는 바와 같이, 본 발명은 종래의 변이 육종의 결점을 배제하여 공업적으로 유리한 균주를 취득하는데 있어서, 유효하고 또한 신규한 육종 방법을 제공한다. 이러한 유효 변이를 재구성하여 생산균을 재구성하는 방법론은 본 발명에서 개시한 게놈의 염기 서열을 이용함으로써 효율적으로 실시할 수 있는 접근법이며, 이러한 유효성은 본 발명에 의해 최초로 발견된 것이다.

본 발명에 의해, 방선균 유래의 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드, 당해 폴리뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드를 고착시킨 올리고뉴클레오타이드 어레이, 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드, 당해 폴리펩타이드를 인식하는 항체, 당해 폴리펩타이드 및/또는 상기 항체를 고착시킨 폴리펩타이드 어레이, 당해 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드의 염기 서열 및 당해 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체 및 당해 기록 매체를 이용하는 컴퓨터를 이용한 시스템을 제공할 수 있다.

서열 목록

서열 목록은 CD-R로 제출한다.

Claims

(a) 서열 1에 제시된 염기 서열로 이루어진 제1 폴리뉴클레오타이드류 또는 제1 폴리뉴클레오타이드류의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기 서열로 이루어진 제2 폴리뉴클레오타이드류로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드류를 고체 지지체에 고착시켜, 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하는 공정,

(b) 당해 폴리뉴클레오타이드 어레이에 고착된 폴리뉴클레오타이드, 방선균 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드, 방선균의 변이주 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드 또는 피검 표지화 폴리뉴클레오타이드 중의 하나 이상을 하이브리드화 조건하에 배양하는 공정,

(c) 하이브리드화를 검출하는 검출 공정 및

(d) 하이브리드화 결과를 해석하는 해석 공정

을 포함하여, 방선균의 변이주 유래의 유전자 변이점을 동정하는 방법.
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서열 1에 제시된 염기 서열로 이루어진 제1 폴리뉴클레오타이드류 또는 제1 폴리뉴클레오타이드류의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오타이드류를 포함하는 그룹으로부터 선택된 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 고체 지지체에 고착시킨 폴리뉴클레오타이드 어레이.
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(i) 서열 1에 제시된 염기 서열 정보, 및 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 입력하기 위한 입력 수단,

(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하기 위한 데이터 기록 수단,

(iii) 당해 데이터 기록 수단에 의해 기록된, 서열 1에 제시된 염기 서열 정보와 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 비교하여, 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보와 일치하거나 유사한 염기 서열 정보를 검색하거나 해석하는 컴퍼레이터(comparator) 수단 및

(iv) 당해 컴퍼레이터 수단에 의해 수득된 검색 또는 해석 결과를 표시하기 위한 출력 수단을 구비함을 특징으로 하는,

방선균 유래의 표적 서열 또는 표적 구조 모티브를 동정하기 위한, 컴퓨터를 이용하는 시스템.
(i) 서열 1에 제시된 염기 서열 정보, 및 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 입력하는 공정,

(ii) 입력된 정보를 적어도 일시적으로 기록하는 공정,

(iii) 서열 1에 제시된 염기 서열 정보와 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보를 비교하는 공정 및

(iv) 표적 서열 또는 표적 구조 모티브 정보와 일치하거나 유사한 염기 서열 정보를 검색하거나 해석하는 공정을 포함함을 특징으로 하여,

방선균 유래의 표적 서열 또는 표적 구조 모티브를 동정하기 위해 컴퓨터를 이용하는 방법.
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제23항에 있어서, 방선균이 스트렙토마이세스 속, 스트렙토스포란기움 속, 아미콜라톱시스 속, 악티노플라네스 속, 노카르디오이데스 속, 슈도노카르디아 속, 악티노비스포라 속, 사카로모노스포라 속, 사카로폴리스포라속, 사카로트릭스 속, 악티노폴리스포라 속, 악티노마두라 속, 미크로비스포라 속, 미크로테트라스포라 속, 써모모노스포라 속 또는 미크로모노스포라 속에 속하는 미생물인 시스템.
제24항에 있어서, 방선균이 스트렙토마이세스 속, 스트렙토스포란기움 속, 아미콜라톱시스 속, 악티노플라네스 속, 노카르디오이데스 속, 슈도노카르디아 속, 악티노비스포라 속, 사카로모노스포라 속, 사카로폴리스포라속, 사카로트릭스 속, 악티노폴리스포라 속, 악티노마두라 속, 미크로비스포라 속, 미크로테트라스포라 속, 써모모노스포라 속 또는 미크로모노스포라 속에 속하는 미생물인 방법.
제31항에 있어서, 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물이 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 선택되는 미생물인 시스템.
제32항에 있어서, 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물이 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 선택되는 미생물인 방법.
서열 1의 염기 서열 정보 또는 당해 서열에 기초하는 기능 정보를 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체로서, 제23항에 기재된 시스템, 또는 제24항에 기재된 방법에 이용할 수 있는 기록 매체 또는 기억 장치.
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제35항에 있어서, 컴퓨터로 판독가능한 매체가 플로피 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 랜덤 액세스 메모리(RAM), 읽기 전용 메모리(ROM), 자기 광학 디스크(MO), CD-ROM, CD-R, CD-RW, DVD-ROM, DVD-RAM 및 DVD-RW로 이루어진 그룹으로부터 선택된 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체 또는 기억 장치.
(i) 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산, 항생 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 발효법에 의해 생산할 수 있도록 변이 육종된, 방선균 유래의 생산 균주의 게놈 또는 유전자의 염기 서열과, 서열 1에 대응하는 염기 서열을 비교하는 공정,

(ii) (i)에서 수득된 비교 결과로부터, 당해 생산 균주에 존재하는 변이점을 동정하는 공정,

(iii) (ii)의 공정에서 동정한 변이점을, 당해 변이를 갖지 않는 방선균에 도입하는 공정 및

(iv) (iii)의 공정에서 수득된 방선균의, (i)에서 선택된 화합물의 발효법에 의한 생산성을 조사하는 공정을 포함하며,

서열 1에 제시된 염기 서열 정보를 이용하는, 방선균의 육종 방법.
제38항에 있어서, 유전자가, 생합성 경로 또는 시그널 전달 경로 상의 효소를 암호화하는 유전자인 육종 방법.
제38항에 있어서, 변이점이, 생산성을 향상시키거나 안정화시키는 유효 변이에 관한 변이점인 육종 방법.
(i) 항생 물질을 포함한 생물 활성 물질 및 이들의 유연체로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 발효법에 의해 생산할 수 있도록 변이 육종된, 방선균 유래의 생산 균주의 게놈 또는 유전자 염기 서열과, 서열 1에 대응하는 염기 서열을 비교하는 공정,

(ii) (i)에서 수득된 비교 결과로부터, 당해 생산 균주에 존재하는 변이점을 동정하는 공정,

(iii) (ii)의 공정에서 동정한 변이점을, 당해 변이를 갖는 방선균으로부터 제거하는 공정 및

(iv) (iii)의 공정에서 수득된 방선균의, (i)에서 선택된 화합물의 발효법에 의한 생산성을 조사하는 공정을 포함하며,

서열 1에 제시된 염기 서열 정보를 이용하는, 방선균의 육종 방법.
제41항에 있어서, 유전자가, 생합성 경로 또는 시그널 전달 경로 상의 효소를 암호화하는 유전자인 육종 방법.
제41항에 있어서, 변이점이, 생산성을 저하 또는 불안정하게 하는 변이에 관한 변이점인 육종 방법.
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(a) 서열 1에 제시된 염기 서열로 이루어진 제1 폴리뉴클레오타이드류 또는 제1 폴리뉴클레오타이드류의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기 서열로 이루어진 제2 폴리뉴클레오타이드류로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드류를 고체 지지체에 고착시켜, 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하는 공정,

(b) 당해 폴리뉴클레오타이드 어레이에 고착된 폴리뉴클레오타이드, 방선균 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드, 방선균의 변이주 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드 또는 피검 표지화 폴리뉴클레오타이드 중의 하나 이상을 하이브리드화 조건하에 배양하는 공정,

(c) 하이브리드화를 검출하는 검출 공정 및

(d) 하이브리드화 결과를 해석하는 해석 공정

을 포함하여, 방선균 유래의 유전자 발현량을 측정하는 방법.
(a) 서열 1에 제시된 염기 서열로 이루어진 제1 폴리뉴클레오타이드류 또는 제1 폴리뉴클레오타이드류의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기 서열로 이루어진 제2 폴리뉴클레오타이드류로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드류를 고체 지지체에 고착시켜, 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하는 공정,

(b) 당해 폴리뉴클레오타이드 어레이에 고착된 폴리뉴클레오타이드, 방선균 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드, 방선균의 변이주 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드 또는 피검 표지화 폴리뉴클레오타이드 중의 하나 이상을 하이브리드화 조건하에 배양하는 공정,

(c) 하이브리드화를 검출하는 검출 공정 및

(d) 하이브리드화 결과를 해석하는 해석 공정

을 포함하여, 방선균 유래의 유전자 발현 프로파일을 해석하는 방법.
(a) 서열 1에 제시된 염기 서열로 이루어진 제1 폴리뉴클레오타이드류 또는 제1 폴리뉴클레오타이드류의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기 서열로 이루어진 제2 폴리뉴클레오타이드류로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드류를 고체 지지체에 고착시켜, 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하는 공정,

(b) 당해 폴리뉴클레오타이드 어레이에 고착된 폴리뉴클레오타이드, 방선균 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드, 방선균의 변이주 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드 또는 피검 표지화 폴리뉴클레오타이드 중의 하나 이상을 하이브리드화 조건하에 배양하는 공정,

(c) 하이브리드화를 검출하는 검출 공정 및

(d) 하이브리드화 결과를 해석하는 해석 공정

을 포함하여, 방선균 유래의 유전자 발현 패턴을 분석하는 방법.
(a) 서열 1에 제시된 염기 서열로 이루어진 제1 폴리뉴클레오타이드류 또는 제1 폴리뉴클레오타이드류의 연속하는 적어도 10 내지 200개 염기 서열로 이루어진 제2 폴리뉴클레오타이드류로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 2종 이상의 폴리뉴클레오타이드류를 고체 지지체에 고착시켜, 폴리뉴클레오타이드 어레이를 작제하는 공정,

(b) 당해 폴리뉴클레오타이드 어레이에 고착된 폴리뉴클레오타이드, 방선균 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드, 방선균의 변이주 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드 또는 피검 표지화 폴리뉴클레오타이드 중의 하나 이상을 하이브리드화 조건하에 배양하는 공정,

(c) 하이브리드화를 검출하는 검출 공정 및

(d) 하이브리드화 결과를 해석하는 해석 공정

을 포함하여, 피검 유전자와 상동한 유전자를 방선균에서 검색하는 방법.
제1항 및 제54항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, 방선균이 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 스트렙토스포란기움(Streptosporangium) 속, 아미콜라톱시스(Amycolatopsis) 속, 악티노플라네스(Actinoplanes) 속, 노카르디오이데스(Nocardioides) 속, 슈도노카르디아(Pseudonocardia) 속, 악티노비스포라(Actinobispora) 속, 사카로모노스포라(Saccharomonospora) 속, 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora) 속, 사카로트릭스(Saccharothrix) 속, 악티노폴리스포라(Actinopolyspora) 속, 악티노마두라(Actinomadura) 속, 미크로비스포라(Microbispora) 속, 미크로테트라스포라(Microtetraspora) 속, 써모모노스포라(Thermomonospora) 속 또는 미크로모노스포라(Micromonospora) 속에 속하는 미생물인 방법.
제58항에 있어서, 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물이 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)로부터 선택되는 미생물인 방법.
제1항 및 제54항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, 방선균 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드, 방선균의 변이주 유래의 표지화 폴리뉴클레오타이드 또는 피검 표지화 폴리뉴클레오타이드가 아미노산, 핵산, 비타민, 당, 유기산, 항생 물질 및 이들의 유연체(類緣體)로부터 선택된 1종 이상의 생합성에 관련된 유전자인 방법.
제1항 및 제54항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, 피검 폴리뉴클레오타이드가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 유래의 피검 폴리뉴클레오타이드인 방법.