CN101724646B

CN101724646B - 利用调控蛋白基因提高阿维菌素的产量

Info

Publication number: CN101724646B
Application number: CN2009101967425A
Authority: CN
Inventors: 唐功利; 王健博
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Priority date: 2009-09-29
Filing date: 2009-09-29
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2029-09-29
Also published as: CN101724646A

Abstract

本发明公开了除虫链霉菌中一类调控蛋白基因的用途，对该类基因的失活可以显著改变除虫链霉菌生产阿维菌素的能力。所述调控蛋白基因包括avaL2基因、avaR1基因或avaR2基因，前二者的基因置换突变菌种可明显提高阿维菌素的产生能力，而后者的基因置换突变菌种可显著降低阿维菌素的产生能力。本发明还公开了利用这些基因构建产量提高的除虫链霉菌突变菌种的方法和应用，相应突变菌种发酵获得的阿维菌素产量与未经改造的菌株相比有大幅提高。

Description

利用调控蛋白基因提高阿维菌素的产量

技术领域：

本发明涉及基因工程领域以及微生物学领域，特别涉及一类与阿维菌素产量相关的基因以及操作该类基因提高阿维菌素产量的方法。

技术背景：

阿维菌素(Avermectins，AVM)是一类广泛使用的农用抗生素，它由除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生，具有十六元大环内酯的化学结构，其分子根据C-5、C22-23，C26位置上的结构差别可分为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b八种组分。其中B1a是最具活性的组分，被广泛应用于家畜寄生虫的感染治疗和农业虫害的防治，目前已经成为一种非常重要的生物农药。

从阿维菌素作为一种广谱抗生素应用于实际生产以来，以提高菌种发酵产量的研究工作一直未曾停止，其中使用最为频繁的是常规的诱变育种，但是这种方法有相当大的随机性，而且菌种经长期使用诱变剂处理后，其生存能力会慢慢下降。通过对阿维菌素生物合成的研究，可以发现其生物合成途径受特异的调控基因调控，而这些调控基因有可能存在于阿维菌素生物合成基因簇之内，也有可能存在于生物合成基因簇之外。这些广泛存在的全局性调控基因、各种调控因子与其调控蛋白以及与特异的调控基因相互影响，形成了一个大型的调控网络来调控阿维菌素的产量。

目前，国际上对调控系统的研究主要集中在天蓝色链霉菌基因序列，而对除虫链霉菌中调控基因调控抗生素的生产研究不多，因此发现新的调控阿维菌素生产的基因，通过消除负调控基因，过量表达正调控基因，对提高阿维菌素的产量有着十分重要的应用意义。

发明内容

本发明的目的是提供若干提高阿维菌素生产的基因及调控方法。

在本发明的一个方面，提供两种位于阿维菌素生物合成基因簇序列以外的调控蛋白基因序列，通过在除虫链霉菌中敲除这两种调控蛋白基因可以提高阿维菌素的产量，所述的调控蛋白基因选自avaL2基因(核苷酸序列表序列1)和avaR1基因(核苷酸序列表序列2)，并且所述的基因来自除虫链霉菌基因组。

在另一优选例中，提供一种位于阿维菌素生物合成基因簇序列以外的调控蛋白基因序列，通过在除虫链霉菌中敲除该基因可以使得阿维菌素的产量降低，所述的调控蛋白基因选自avaR2基因，并且所述的调控蛋白基因选自除虫链霉菌基因组。

本发明的第二方面，提供一种提高除虫链霉菌中阿维菌素产量的方法，包括以下步骤：在除虫链霉菌基因组中敲除调控蛋白基因，并且诉述的调控蛋白基因选自avaL2基因或avaR1基因。

本发明中所述的将目的调控蛋白基因在除虫链霉菌基因组中敲除包括以下步骤：

(a)构建含有目标基因5’和3’旁侧序列和红霉素抗性基因的敲除载体。

(b)将含有基因取代载体的宿主菌株作为供体菌株，通过供体菌株-链霉菌接合转移的方法导入到除虫链霉菌中，得到含有基因取代载体的除虫链霉菌转化子。

(c)转化子经高温诱导得到单交换突变株，再将单交换突变株传代后获得发生了同源双交换的重组除虫链霉菌突变株。

(d)所述敲除载体中调控基因的5’端旁侧序列、红霉素抗性基因3’-5’序列和调控基因3’端旁侧序列按上述顺序且按上述方向顺次连接。

用于构建敲除载体的出发载体为任意一种大肠杆菌-链霉菌穿梭载体，如pKC1139，pKC505，pIJ653，pIJ8154，优选为pKC1139。

以pKC1139为出发载体构建的基因取代载体为pWJb309、pWJb360。

本发明的另一种优选例中，诉述的宿主细胞为大肠杆菌细胞。

本发明的第三个方面，提供一种调控蛋白调控阿维菌素产量的基因和降低阿维菌素产量的方法，包括以下步骤：在除虫链霉菌中敲除调控蛋白基因，并且所述基因选自avaR2基因(核苷酸序列表序列3)。

在本发明的一个优选例中，所述的将目的调控基因在除虫链霉菌基因组上敲除包括以下步骤：

(e)构建含有目标基因5’和3’旁侧序列和红霉素抗性基因的敲除载体。

(f)将含有基因取代载体的宿主菌株作为供体菌株，通过供体菌株-链霉菌接合转移的方法导入到除虫链霉菌中，得到含有基因取代载体的除虫链霉菌转化子。

(g)转化子经高温诱导得到单交换突变株，再将单交换突变株传代后获得发生了同源双交换的重组除虫链霉菌突变株。

(h)所述敲除载体中调控基因的5’端旁侧序列、红霉素抗性基因3’-5’序列和调控基因3’端旁侧序列按上述顺序且按上述方向顺次连接。

以pKC1139为出发载体构建的基因取代载体为pWJb374。

本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌细胞。

本发明的第四个方面，提供了一种生产阿维菌素的方法，包括下面步骤：

(1)：发酵本发明上述的敲除目的调控基因(包括负调控基因和正调控基因)的除虫链霉菌；

(2)：从发酵产物中分离阿维菌素。

在本发明的一个优选例中，所述的调控蛋白基因均位于除虫链霉菌基因组中，且只有一个拷贝，位于阿维菌素生物合成基因簇序列之外。

在本方明的第五个方面，提供所述的敲除调控蛋白基因的除虫链霉菌的用途，其特征在于用于生产阿维菌素。

本发明的其它方面由于本发明的公开内容，对于本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明：

图1：敲除avaL2基因置换质粒pWJb360的构建过程。

图2：avaL2基因置换突变菌株的基因型及Southern验证。经PvuII酶切后双交换的突变株在1.1kb和1.4kb区域显示信号。

图3：avaL2基因置换突变菌株与野生型菌株发酵产物的分析对比。B1a代表阿维菌素B1a组分。(A)HPLC图谱；(B)柱状对比图，1代表野生型，2代表avaL2基因置换突变株。

图4：敲除avaR1基因置换质粒pWJb309的构建过程。

图5：avaR1基因置换突变菌株的基因型及Southern验证。经NcoI酶切后双交换的突变株在3.8kb区域显示信号。

图6：avaR1基因置换突变菌株与野生型菌株发酵产物的分析对比。B1a代表阿维菌素B1a组分。(A)HPLC图谱；(B)柱状对比图，1代表野生型，2代表avaR1基因置换突变株。

图7：敲除avaR2基因置换质粒pWJb374的构建过程。

图8：avaR2基因置换突变菌株的基因型及Southern验证。经NcoI酶切后双交换的突变株在9.8kb区域显示信号。

图9：avaR2基因置换突变菌株与野生型菌株发酵产物的分析对比。B1a代表阿维菌素B1a组分。(A)HPLC图谱；(B)柱状对比图，1代表野生型，2代表avaR2基因置换突变株。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现了一类可调控除虫链霉菌抗生素(阿维菌素)生产的调控基因(包括正调控和负调控基因)，所述基因为avaL2基因和avaR1基因(负调控基因)，以及avaR2基因(正调控基因)。将所述的负调控基因在除虫链霉菌基因组中进行敲除，可大大提高阿维菌素的产量，而将所述正调控基因进行敲除，可大大降低阿维菌素的产量。基于以上完成了本发明。在所述的调控基因中，三个基因均来自除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis，简称S.avermitilis)本身的基因组中。如本发明所用到的三个基因均编码可能的属于TetR家族的转录调控因子，均是可能的γ-丁酸内酯依赖的调控蛋白，因此也称为调控蛋白基因。(Eriko Takano，g-Butyrolactones：Streptomyces signallingmolecules regulating antibiotic production and differentiation.Current Opinion in Microbiology 2006，9：287-294)

在本发明中，所用的“调控基因”是指用于调节控制特定结构基因表达的基因。正调控指可以提高或者维持结构基因表达的基因，负调控则是可以降低结构基因表达的基因。在本发明中，从除虫链霉菌基因组中获得的所述avaL2基因(GenBank登录号为BAC69979.1；从除虫链霉菌基因组中获得的所述avaR1基因(GenBank登录号为BAC71417.1)；从除虫链霉菌中得到的avaR2基因(GenBank登录号为BAC71414.1)，这些基因均由外源导入敲除载体后被红霉素抗性基因所替代，形成除虫链霉菌突变株。

在本发明中，“除虫链霉菌”(Streptomyces avermitilis)是一种能够产生阿维菌素(avermectins AVM)的菌。

在本发明中，大肠杆菌-链霉菌穿梭载体是指一类能由大肠杆菌转到链霉菌中的质粒，包括(但是不限于)pKC1139。

在本发明中，“基因转移”是指将外源的遗传物质由供体菌导入到受体菌内的过程，其可以通过转化、接合转移、转导、细胞融合等手段来实现。“接合转移”是指细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质(主要是质粒DNA)从供体菌转移给受体菌。

本发明敲除的负调控基因avaL2(核苷酸序列表序列1)，具有以下的核苷酸序列：

GTGGAGCCGGCAAAGGAGGGGAGCGTCATGCCCAAGCAGGCACGCGCCCTGCGTACCTACGACCGTGTA

CTCGACGCGGCCGCCTACGAGTTCGCCCGATACGGCTACACGAACGCGAACCTGCAGAACATCGCGGAC

CGCATCAGGCTGACGAAGGGAGCGCTCTACGGGCATTTCGCCAACAAGGAGGAACTGGCCGCCGCGCTG

GACCACCACCTGTCCGCCACGCTGGGGGTACTGCTCACCGAGGCCCGGACATCGCCCCATCCGGCACTG

GGCCGGCTGCAGTCCCTCGTCCTCGGTCTGGGCCGGCTCTTCCGGACGGATCTGCGGGCCCTCGCGGCG

CTGCGGCTCGCGGCGGAGACGGCCCGTTCGACCGCCAAGCCGATACCTCTGCTGACGGAGACGCACGAC

CTCGTCCTCCAGTTGGTGCGCGAGACACAGCAGGAGGGGCACTGGGACGCGTCGATCTCCACCAGGCCT

CTGGCGGACCTCATCGTGGCGGCCCTCTTCGGCACGTTCTGGACGGAGACCGACACCGGCCACCCAGGG

TCCGACGGGACCGTCGACACGATGTGGGAGGCCCTGGCTCAGGCGCTCGGCGGCGCCCCGGCCCGCTGA

在本发明所述的avaR1(核苷酸序列表序列2)，具有以下的核苷酸序列：

GTGGCGCGGCAGGAGCGAGCCATTCGGACGCGGCAGACGATTCTGGTCGCCGCGGCCGAGGTGTTCGAC

GAGGTGGGATACGAGGCGGCAACCATCTCCGACGTGCTGAAGCGCTCGGGGGTCACCAAGGGGGCCCTC

TACTTCCACTTCACGTCGAAGCAGGAGCTGGCCCAGGCCGTGCTGGCCGAGCAGGTCGCCTCCCTTCCG

CGCGTCCCCGAGCAGGAGCTGAAGCTCCAGCAGTCGCTGGACGAGGCGCTGCTGCTCGCCCATCTGCTC

AGGGAAGGCACCGGCGATCCGATCGTCCAGGGCAGTGTGCGGCTGACCGTGGACCAGGGCTCGCCCAGG

GACCATCTCAACCGGCGGGTCCCGATGCAGGCCTGGACCGAGCACACGCAGTCCCTCTTCGAAGAGGCC

AGGGCCAAGGGCGAGATCCTGCCCCACGCCGATGTGGAAGCGCTCGCCAAGCTGTTCGTGGGCGCGTTC

ACCGGCGTGCAGGTCCTCTCGAGGATCATGACCGGGCGCGCGGACCTGGCGGAGCGGGTGGCCGACCTC

TACCGCCATCTGATGCCGTCCTTCGCCATGCCGGGGATCCTGGTCCGCCTGGACTTCTCCCCGGAGCGG

GGCTCGCGGGTGTACGAAGCCGCCATGAAGCAGCGGGAGTCGGCGGCAGCGAGTACGACGGACGCGGCA

CGGACGTTGGAGTGA

本发明所述的avaR2(核苷酸序列表序列3)，具有以下的核苷酸序列：

GTGACGAAACAGGAACGCGCCGCCCGCACCCGCCACGCCCTCATCCGCTCCGCCGCCCACGCCTTCGAA

CGGCAGGGCTACACACAGGCGAGGCTGGCCGACATCAGCGCCTGCGCCGGTGTCAGCCCCGGCGCACTG

CACTTCCACTTCGAGAGCAAGGCAGAGGTGGCCAGGGCGGTGGAGGCGGCGGCGGGGGTGAGCCTGCGC

CGGGCGGCCTGGCTGGCCCAGCCGCCGGGCACGAACGCGCTGCAACGGCTGACGAACACGTCGCACGCC

CTGGCCGAGCGACTGCGCGGGGACGTCGTCGCCCGCGCGGGCTTCCGGCTGAACTGCGAATCGGCGGGC

GGCGGCGCGCTGAATCTGCTCCGGGAATGGCAGACCTGCGTGGAGCAGCTGCTCGCGGAGGCCGCCGAG

GAGGGGCTGCTGGCCCGGCGCCTCGTCCGCGCCGACACGGTCAGCGCGGTGGTGGCCGCGACCACCGGT

TTCGAACTGCTCGGCCGCCGGGACCCCGAGTGGCTCTCCGGCCAGTCGCTGGCCGCGTTCTGGCGGGTA

CTGCTGCCGCGCGCGGCCACGGCGGCGGCCCTGACCGCGGTGGACCCGGACGGGACGTGCCCCAGCCGG

GCGGAGACGCGGACCCCGGCGACCACCGCCGGATGA

如本发明所用，敲除上述基因包括对上述基因进行替换、关键残基点突、同框敲除等对目标基因失活的手段。

本发明提供的质粒的构建方法，系由载体和在多克隆位点上加入敲除的目的基因旁侧序列和红霉素抗性基因序列组成，载体为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒，可以为pKC1139、pOJ260、pWHM3等及其类似的载体。

进一步的描述如下：

本发明的负调控基因能够负向调控阿维菌素的生物合成，当将该类基因敲除后，可以提高阿维菌素的产量。并且本发明人选择了合适的接合转移载体，即带有温敏型复制子的质粒pKC1139，利用同源重组技术，得到了稳定的基因突变株。

在检测阿维菌素产量时，可通过测量出发菌株和改良菌株产生的有效组分B1a(avermectin B1a，中文全名：2，6-双脱氧-4-O-(2，6-双脱氧3-O-甲基-a-L-阿拉伯糖基-吡喃己基)-3-O-甲基-a-L-阿拉伯糖基-吡喃己基[氧化]-3’，4’，6，6’7，10，14，15，17a，20，20a，20b-十四氢-20，20b-双羟-5’，6，8，19-四甲基-6’-(1-甲丙基)螺旋[11，15-甲撑-2H，13H，17H-呋喃]4，3，2-pq，2，6，[苯丙双氧环八癸炔]-吡喃-17-酮)的含量为标准，检测阿维菌素的产量是否提高。

本发明中所用于实施例或其他内容所显示的成分用量、反应条件等数字均为大约数值。因此除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，其可根据所需得到的本发明的结果而加以变化。

除特别说明外。文中所用到的专业术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或者均等的方法及材料均可应用于本发明的方法之中。实验中未注明的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述条件或者按照制造厂商所建议的条件。

本发明的主要特点在于：

(1)发现了一类与除虫链霉菌的阿维菌素产量密切相关的几个调控基因。

(2)发明敲除其中的负调控基因avaL2基因和avaR1基因可以大大提高除虫链霉菌的阿维菌素的产量，敲除其中的证调控基因avaR2可以大大降低除虫链霉菌的阿维菌素的产量。

(3)本发明采用接合转移的手段将中断质粒导入到受体菌中，诱导发生双交换，得到了稳定的基因型突变株。

下面结合具体的实施例来进一步说明本发明。应该理解的是，所用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例中所用培养基，除特殊说明外，液体均用YEME培养基，固体均用MS培养基。

实施例一：敲除avaL2基因对阿维菌素(avermectin)产量的影响

1：左右交换同源臂的获得

以S.avermitilis的基因组为模板，采用引物5’-ATT AAG CTT CGA CCGGAT CAT CGC GGT GAA C-3’和引物TTA CTC GAG GGC GGG GAC CGA AGC ATA AAAG克隆得到左臂约2kb的PCR产物，利用酶切位点连入pGEM-7zf中，再用引物5’-AAT TCT AGA GGC CGG CCA CGG CCC GGT GAG-3’和引物5’-AAT GAT ATCACG GTC ACC CGC TCC CGC CTG-3’得到右臂约2kb的PCR产物，利用酶切位点连入pSP72中。

2：抗性基因片段的获得

红霉素抗性基因是通过利用酶切位点XhoI和XbaI从质粒pAGE-1中酶切所得，长约1.8kb。

3：重组质粒pWJb360的获得

将左臂从载体中用核酸内切酶HindIII和XhoI切出来，将右臂用核酸内切酶XbaI和EcoRV切出来，与获得的抗性片段一起连入用HindIII和EcoRV切好的pKC1139中，具体构建可见附图1。

4：敲除avaL2基因突变株的获得和生物效价的评定

将用于基因置换的重组质粒pWJb360转入到大肠杆菌ET12567中，通过大肠杆菌和链霉菌之间的属间接合转移将重组质粒导入到链霉菌中，37℃整合后松弛诱导发生双交换，筛选获得红霉素抗性而阿泊拉霉素敏感的双交换突变株。该突变菌株的基因型利用标记的红霉素抗性基因的探针进行Southern杂交验证，基因型验证结果见图2。得到突变株。

在相同发酵条件下对比出发菌株和突变后的菌株产阿维菌素B1a的量分析。

将保存好的孢子解冻后，涂于平板培养基上，平板培养基配方为：葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)1.5％、天门冬酰氨(华美生物工程公司)0.05％、进口牛肉浸膏(中国医药(集团)上海化学试剂公司)0.3％、磷酸二氢钾(天津市化学试剂六厂)0.05％、琼脂1.8％。30℃培养五天后，用打孔器取一小块放到种瓶内。

种子培养基配方为：玉米淀粉3％、豆粕粉0.8％、花生饼粉1％、酵母浸提物0.4％、氯化钴(中国医药(集团)上海化学试剂公司，1％的溶液)0.3％、淀粉酶4μ/g淀粉。

配制时先将玉米淀粉糊化(玉米淀粉用少量水溶解，加入淀粉酶，搅拌均匀，倒入约1/2总量的沸水中，煮沸)，加入其他原料(也用冷水调匀)，定容后调pH值6.8～7，分装40ml/250ml三角瓶，121℃灭菌25min。28℃，200rpm培养两天后，吸取1.5ml到摇瓶中。

发酵培养基配方为：玉米淀粉14％、豆粕粉2.8％、酵母粉1％、钼酸钠(1％)2.2‰、硫酸锰(0.1％)2.3‰、硫酸铵(5％)5‰、氯化钴(1％)2‰。

配制时先将玉米淀粉用冷水溶解调匀，加入淀粉酶(1.5～2单位没克淀粉)，水浴加热，变稀后计时保温12min(在升温过程中，料液会由乳白色变为半透明浆糊状，此时开始计时)，取出，加入其它原料(先用冷水调匀)，定容，调pH，起始pH值约6.3，调至7.5，然后加入碳酸钙0.8‰，搅拌均匀，边搅拌边分装30ml/250ml三角瓶，121℃灭菌25min。

摇瓶在28℃，200rpm的条件下培养十天，取1ml菌液，加4ml甲醇，超声10min，离心取上清，HPLC检测。

检测条件为：检测波长：UV＝245nm；柱子：VARIAN 250/4.6 SN 282566MICROSORB-MV 100-5 C18 R008620005；流动相条件：v＝1mL/min；A溶液＝H₂O；B溶液＝CH₃OH；洗脱条件为85％B，15％A，洗脱时间为20min。

分析HPLC结果可以看出，原始出发菌株阿维菌素的产量约为1321μg/ml，突变株的产量为1550μg/ml，增产为17％。具体的HPLC图谱以及产量对比柱形图见附图3。

实施例2：敲除avaR1对阿维菌素(avermectins)B1a产量的影响

1：左右交换同源臂的获得

以S.avermitilis的基因组为模板，采用引物5‘-ATT AAG CTT ACC CCTTGG CGA CCG CCG TC-3’和引物5’-TTA TCT AGA CTC GAG TCG CTC CTG CCGCGC CAC AC-3’克隆得到左臂约2kb的PCR产物，利用酶切位点连入pGEM-3zf 中，再用引物5’-AAT TCT AGA GGC ACG GAC GTT GGA GTG AC-3’和引物5’-TTA GAA TTC GTG CGG ATC GCG CGT TCC TG-3’得到右臂约2kb的PCR产物，利用酶切位点连入pGEM-3zf中。

2：抗性基因片段的获得

3：重组质粒pWJb309的获得

将左臂从载体中用核酸内切酶HindIII和XhoI切出，将右臂用核酸内切酶XbaI和EcoRI切出，与获得的抗性片段一起连入用HindIII和EcoRI切好的pKC1139中，具体构建可见附图4。

4：敲除ava R1基因突变株的获得和生物效价的评定

将用于中断的重组质粒pWJb309转入到大肠杆菌ET12567中，通过大肠杆菌和链霉菌之间的属间接合转移将重组质粒导入到链霉菌中，37℃整合后松弛诱导发生双交换，筛选获得红霉素抗性而阿泊拉霉素敏感的双交换突变株。该突变菌株的基因型利用标记的红霉素抗性基因的探针进行Southern杂交验证，基因型验证结果见图5。得到突变株。

发酵条件及HPLC检测方法同实施例1。

分析HPLC结果可以看出，原始出发菌株阿维菌素的产量约为1321μg/ml，突变株的产量为1756μg/ml，增产为33％。具体的HPLC图谱记柱形图对比可见附图6。

实施例3：敲除avaR2对阿维菌素(avermectins)产量的影响

1：左右交换同源臂的获得

以S.avermitilis的基因组为模板，采用引物5‘-GAA AAG CTT GAC GCCCCC TTC ATA G-3’和引物5’-CAC CTC GAG CTT GCT CTC GAA GTG-3’克隆得到左臂约2kb的PCR产物，利用酶切位点连入pGEM-7zf中，再用引物5’-AATTCT AGA GCC GTA CGG CAG CCG CTC-3’和引物5’-TAA GAA TTC TGC CCC TACGCC CTG GAC-3’得到右臂约2kb的PCR产物，利用酶切位点连入pGEM-3zf中。

2：抗性基因片段的获得

3：重组质粒pWJb374的获得

将左臂从载体中用核酸内切酶HindIII和XhoI切出，将右臂用核酸内切酶XbaI和EcoRI切出，与获得的抗性片段一起连入用HindIII和EcoRI切好的pKC1139中，具体构建可见附图7。

4：敲除avaR2基因突变株的获得和生物效价的评定

将用于中断的重组质粒pWJb374转入到大肠杆菌ET12567中，通过大肠杆菌和链霉菌之间的属间接合转移将重组质粒导入到链霉菌中，37℃整合后松弛诱导发生双交换，筛选获得红霉素抗性而阿泊拉霉素敏感的双交换突变株。该突变菌株的基因型利用标记的红霉素抗性基因的探针进行Southern杂交验证，基因型验证结果见图8。得到突变株。

发酵条件及HPLC检测方法同实施例1。

分析HPLC结果可以看出，原始出发菌株阿维菌素的产量约为1321μg/ml，突变株的产量为27μg/ml，产量降低明显。具体的HPLC图谱及柱形图对比见附图9。

核苷酸序列表

<110>中国科学院上海有机化学研究所

<120>利用调控蛋白基因提高阿维菌素的产量

<130>说明书，权利要求书

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>621

<212>DNA

<213>Streptomyces avermitilis

<400>1

gtggagccgg caaaggaggg gagcgtcatg cccaagcagg cacgcgccct gcgtacctac 60

gaccgtgtac tcgacgcggc cgcctacgag ttcgcccgat acggctacac gaacgcgaac 120

ctgcagaaca tcgcggaccg catcaggctg acgaagggag cgctctacgg gcatttcgcc 180

aacaaggagg aactggccgc cgcgctggac caccacctgt ccgccacgct gggggtactg 240

ctcaccgagg cccggacatc gccccatccg gcactgggcc ggctgcagtc cctcgtcctc 300

ggtctgggcc ggctcttccg gacggatctg cgggccctcg cggcgctgcg gctcgcggcg 360

gagacggccc gttcgaccgc caagccgata cctctgctga cggagacgca cgacctcgtc 420

ctccagttgg tgcgcgagac acagcaggag gggcactggg acgcgtcgat ctccaccagg 480

cctctggcgg acctcatcgt ggcggccctc ttcggcacgt tctggacgga gaccgacacc 540

ggccacccag ggtccgacgg gaccgtcgac acgatgtggg aggccctggc tcaggcgctc 600

ggcggcgccc cggcccgctg a 621

<210>2

<211>705

<212>DNA

<213>Streptomyces avermitilis

<400>2

gtggcgcggc aggagcgagc cattcggacg cggcagacga ttctggtcgc cgcggccgag 60

gtgttcgacg aggtgggata cgaggcggca accatctccg acgtgctgaa gcgctcgggg 120

gtcaccaagg gggccctcta cttccacttc acgtcgaagc aggagctggc ccaggccgtg 180

ctggccgagc aggtcgcctc ccttccgcgc gtccccgagc aggagctgaa gctccagcag 240

tcgctggacg aggcgctgct gctcgcccat ctgctcaggg aaggcaccgg cgatccgatc 300

gtccagggca gtgtgcggct gaccgtggac cagggctcgc ccagggacca tctcaaccgg 360

cgggtcccga tgcaggcctg gaccgagcac acgcagtccc tcttcgaaga ggccagggcc 420

aagggcgaga tcctgcccca cgccgatgtg gaagcgctcg ccaagctgtt cgtgggcgcg 480

ttcaccggcg tgcaggtcct ctcgaggatc atgaccgggc gcgcggacct ggcggagcgg 540

gtggccgacc tctaccgcca tctgatgccg tccttcgcca tgccggggat cctggtccgc 600

ctggacttct ccccggagcg gggctcgcgg gtgtacgaag ccgccatgaa gcagcgggag 660

tcggcggcag cgagtacgac ggacgcggca cggacgttgg agtga 705

<210>3

<211>657

<212>DNA

<213>Streptomyces avermitilis

<400>3

gtgacgaaac aggaacgcgc cgcccgcacc cgccacgccc tcatccgctc cgccgcccac 60

gccttcgaac ggcagggcta cacacaggcg aggctggccg acatcagcgc ctgcgccggt 120

gtcagccccg gcgcactgca cttccacttc gagagcaagg cagaggtggc cagggcggtg 180

gaggcggcgg cgggggtgag cctgcgccgg gcggcctggc tggcccagcc gccgggcacg 240

aacgcgctgc aacggctgac gaacacgtcg cacgccctgg ccgagcgact gcgcggggac 300

gtcgtcgccc gcgcgggctt ccggctgaac tgcgaatcgg cgggcggcgg cgcgctgaat 360

ctgctccggg aatggcagac ctgcgtggag cagctgctcg cggaggccgc cgaggagggg 420

ctgctggccc ggcgcctcgt ccgcgccgac acggtcagcg cggtggtggc cgcgaccacc 480

ggtttcgaac tgctcggccg ccgggacccc gagtggctct ccggccagtc gctggccgcg 540

ttctggcggg tactgctgcc gcgcgcggcc acggcggcgg ccctgaccgc ggtggacccg 600

gacgggacgt gccccagccg ggcggagacg cggaccccgg cgaccaccgc cggatga 657

Claims

1.一种改变除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)生产阿维菌素的能力的方法，其特征在于，是通过将除虫链霉菌中avaL2基因、avaR1基因或avaR2基因失活来改变除虫链霉菌生产阿维菌素的能力；

所述的avaL2基因的核苷酸序列为：

GTGGAGCCGGCAAAGGAGGGGAGCGTCATGCCCAAGCAGGCACGCGCCCTGCGTACCTACGACCGTGTACTCGACGCGGCCGCCTACGAGTTCGCCCGATACGGCTACACGAACGCGAACCTGCAGAACATCGCGGACCGCATCAGGCTGACGAAGGGAGCGCTCTACGGGCATTTCGCCAACAAGGAGGAACTGGCCGCCGCGCTGGACCACCACCTGTCCGCCACGCTGGGGGTACTGCTCACCGAGGCCCGGACATCGCCCCATCCGGCACTGGGCCGGCTGCAGTCCCTCGTCCTCGGTCTGGGCCGGCTCTTCCGGACGGATCTGCGGGCCCTCGCGGCGCTGCGGCTCGCGGCGGAGACGGCCCGTTCGACCGCCAAGCCGATACCTCTGCTGACGGAGACGCACGACCTCGTCCTCCAGTTGGTGCGCGAGACACAGCAGGAGGGGCACTGGGACGCGTCGATCTCCACCAGGCCTCTGGCGGACCTCATCGTGGCGGCCCTCTTCGGCACGTTCTGGACGGAGACCGACACCGGCCACCCAGGGTCCGACGGGACCGTCGACACGATGTGGGAGGCCCTGGCTCAGGCGCTCGGCGGCGCCCCGGCCCGCTGA；

所述的avaR1基因的核苷酸序列为：

GTGGCGCGGCAGGAGCGAGCCATTCGGACGCGGCAGACGATTCTGGTCGCCGCGGCCGAGGTGTTCGACGAGGTGGGATACGAGGCGGCAACCATCTCCGACGTGCTGAAGCGCTCGGGGGTCACCAAGGGGGCCCTCTACTTCCACTTCACGTCGAAGCAGGAGCTGGCCCAGGCCGTGCTGGCCGAGCAGGTCGCCTCCCTTCCGCGCGTCCCCGAGCAGGAGCTGAAGCTCCAGCAGTCGCTGGACGAGGCGCTGCTGCTCGCCCATCTGCTCAGGGAAGGCACCGGCGATCCGATCGTCCAGGGCAGTGTGCGGCTGACCGTGGACCAGGGCTCGCCCAGGGACCATCTCAACCGGCGGGTCCCGATGCAGGCCTGGACCGAGCACACGCAGTCCCTCTTCGAAGAGGCCAGGGCCAAGGGCGAGATCCTGCCCCACGCCGATGTGGAAGCGCTCGCCAAGCTGTTCGTGGGCGCGTTCACCGGCGTGCAGGTCCTC TCGAGGATCATGACCGGGCGCGCGGACCTGGCGGAGCGGGTGGCCGACCTCTACCGCCATCTGATGCCGTCCTTCGCCATGCCGGGGATCCTGGTCCGCCTGGACTTCTCCCCGGAGCGGGGCTCGCGGGTGTACGAAGCCGCCATGAAGCAGCGGGAGTCGGCGGCAGCGAGTACGACGGACGCGGCACGGACGTTGGAGTGA；

所述的avaR2基因的核苷酸序列为：

GTGACGAAACAGGAACGCGCCGCCCGCACCCGCCACGCCCTCATCCGCTCCGCCGCCCACGCCTTCGAACGGCAGGGCTACACACAGGCGAGGCTGGCCGACATCAGCGCCTGCGCCGGTGTCAGCCCCGGCGCACTGCACTTCCACTTCGAGAGCAAGGCAGAGGTGGCCAGGGCGGTGGAGGCGGCGGCGGGGGTGAGCCTGCGCCGGGCGGCCTGGCTGGCCCAGCCGCCGGGCACGAACGCGCTGCAACGGCTGACGAACACGTCGCACGCCCTGGCCGAGCGACTGCGCGGGGACGTCGTCGCCCGCGCGGGCTTCCGGCTGAACTGCGAATCGGCGGGCGGCGGCGCGCTGAATCTGCTCCGGGAATGGCAGACCTGCGTGGAGCAGCTGCTCGCGGAGGCCGCCGAGGAGGGGCTGCTGGCCCGGCGCCTCGTCCGCGCCGACACGGTCAGCGCGGTGGTGGCCGCGACCACCGGTTTCGAACTGCTCGGCCGCCGGGACCCCGAGTGGCTCTCCGGCCAGTCGCTGGCCGCGTTCTGGCGGGTACTGCTGCCGCGCGCGGCCACGGCGGCGGCCCTGACCGCGGTGGACCCGGACGGGACGTGCCCCAGCCGGGCGGAGACGCGGACCCCGGCGACCACCGCCGGATGA。