CN101649326B

CN101649326B - Φc31介导的基因重组和用于红霉素产生菌的遗传改造的方法

Info

Publication number: CN101649326B
Application number: CN2009101944194A
Authority: CN
Inventors: 刘�文; 张嗣良; 吴杰群; 张庆林; 邓玮
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS; East China University of Science and Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS; East China University of Science and Technology
Priority date: 2009-08-21
Filing date: 2009-08-21
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2029-08-21
Also published as: CN101649326A

Abstract

本发明公开了一种基于ΦC31介导的基因重组和用于红霉素产生菌的遗传改造。利用ΦC31位点特异性整合机制介导的基因重组的方法，使目的基因能够稳定地整合入宿主细胞基因组预先构建的位点上。本发明还涉及该方法在红霉素产生菌遗传改造上的应用。

Description

ΦC31介导的基因重组和用于红霉素产生菌的遗传改造的方法

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，更具体的，本发明涉及用于在红色糖多孢菌细胞中表达目的基因的方法、组合物和系统。本发明也涉及通过这种方法用于红霉素产生菌种的遗传改造。

背景技术

自从红霉素作为一种广谱抗生素药物进入临床以来，以提高其产生菌种发酵单位为目的的常规遗传育种和菌种选育工作一直未曾停止。近年来，基因工程技术的发展已经明显地涉及了红霉素生产菌种改良领域。利用这些技术，对红霉素生产有益的基因可以引入菌种中，并且可以很快地获得改良的菌种，从而避免了其传统常规育种方法的漫长过程。但是在技术策略上，这些研究都是通过同源重组的方式把对红霉素产量或者组份有影响的基因导入到红霉素生产菌染色体内。同源重组包含单交换和双交换两种方式。采用同源重组单交换获得的菌种在连续传代过程中，由于同源重组的可逆性容易使插入的目的基因丢失，从而导致基因工程菌的回复突变，而且通过同源重组插入目的基因使原有基因遭受破坏。而采用同源重组双交换的方式进行基因重组，操作过程繁琐，而且对于插入的目的片断包含有与宿主基因组同源的序列时，成功率极低。因此采用同源重组这一策略对红霉素生产菌种进行遗传改造在实际应用过程中受到了极大的限制。

人们发现来自链霉菌噬菌体ΦC31的整合酶，能够有效介导噬菌体基因组中attP位点与细菌染色体上attB位点间的重组反应，而且在介导整合时具有严格的位点特异性。该酶只催化attP/attB之间的重组从而形成杂合位点attL和attR，却不介导attL/attR之间的剪切。因此与细菌自身催化发生的同源重组不同的是，经该酶催化的重组是不可逆的，外源基因插入到细菌染色体的特异位点attB后能够稳定地传代。

虽然ΦC31整合酶所识别的附着位点序列attB在一般链霉菌基因组中是一种常见的序列，但在红霉素的生产菌种红色糖多孢菌基因组中却不存在这一特异序列。因此，基于ΦC31整合酶的基因重组体系无法直接应用于红霉素产生菌种红色糖多孢菌的遗传改造中。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、快速、稳定的基因重组的方法，具体涉及一种利用ΦC31位点特异性整合机制介导的整合子系统的方法，尤其涉及一种利用整合子系统将目的基因插入到红色糖多孢菌染色体上特定位点的基因重组方法。

本发明的目的还在于提供了该重组系统在红霉素产生菌遗传改造上的应用，用于在红霉素发酵生产过程中杂质组份的改善和产量的提高。

本方法采用ΦC31位点特异性整合机制介导的整合子系统作为工具，首先构建染色体上含有细菌附着位点attB序列的宿主细胞，然后将目的基因克隆到含有整合酶和噬菌体附着位点attP的载体上。目的基因在宿主菌表达ΦC31整合酶的情况下，能够定点地插入到宿主细胞染色体的attB位点中。

实践证明，本方法简便易行，只需常规简单的基因克隆操作，就可以将目的基因插入到宿主菌染色体DNA上构建的特定位点中。使用本发明所述的整合子系统还可以避免通过同源重组插入基因的可逆反应，提高了基因重组的稳定性和效率。

本发明提出的上述体系制备与应用具体如下：

1.制备染色体中含有细菌编码附着位点attB序列的红霉素工业生产菌。

首先在红色糖多孢菌中采用PCR的方法扩增出两段在染色体位置相隔不远，大小相近的DNA片段。把这两个片段按与染色体一致的方向连接到载体pKC1139中。然后在这两个片段之间插入一段attB序列。然后采用属间接合转移的方法把这个质粒转移进红色糖多孢菌中，筛选出两个片段之中任一同源片段发生单交换的阳性克隆。通过反复传代的方法使单交换阳性克隆的阿普拉霉素抗性丢失，从而筛选出同源双交换菌株，在这个同源双交换菌株里，attB靶序列被稳定地整合进了红霉素工业生产菌的染色体中。

2.在含有ΦC31整合酶及对应attP位点的载体中插入对红霉素合成有利的目的DNA片段

a.对于插入目的DNA片段较小(小于25kb)，采用质粒pSET152及其类似质粒为载体，其质粒骨架上已经包含有ΦC31整合酶及对应attP序列，并含有属间接合转移元件oriT。通过限制性内切酶酶切、T4连接酶连接等常用的分子生物学手段把目的DNA片段插入载体中。

b.对于插入目的DNA片段较大(大于25kb)，采用pOJ436及其类似质粒为载体，其质粒骨架上已经包含有ΦC31整合酶及对应attP序列，并含有属间接合转移元件oriT。通过筛选以pOJ436及类似质粒为母体构建文库的方法得到含有目的DNA 片段的黏粒。

3.将步骤2所得到的载体通过属间接合转移，导入由步骤1所构建的菌株中。

4.筛选阳性克隆菌株。

附图说明

图1表示单交换同源重组事件。供体质粒的B区域与受体细胞染色体上的B区域多核苷酸序列同源，两者在受体细胞自身的同源重组酶系的催化下，同源区域发生交换，供体质粒插入受体细胞染色体B区域。

图2表示双交换同源重组事件。供体质粒在A区域和B区域分别与受体细胞染色体上的A区域和B区域多核苷酸序列同源，A区域首先在受体细胞自身的同源重组酶系的催化下，同源区域发生交换，供体质粒插入受体细胞染色体A区域。随后，受体细胞染色体两段同源的B区域再次在同源重组酶系的催化下发生交换，质粒骨架被删除。

图3表示制备染色体中含有细菌编码附着位点attB靶序列的红色糖多孢菌的流程。靶序列attB的导入是通过同源重组双交换得以实现的。

图4表示由ΦC31整合酶介导的位点特异性重组事件。细菌附着位点attB在靶细胞的染色体上，噬菌体附着位点attP在供体质粒上。向靶细胞和供体分子引入ΦC31整合酶，从而形成由ΦC31整合酶介导的重组产物attL、attR。

图5表示一种示例性质粒pSET152的结构，其包含ΦC31整合酶基因序列、噬菌体附着位点attP序列。

图6表示一种示例性质粒pOJ436的结构，其包含ΦC31整合酶基因序列、噬菌体附着位点attP序列及构建柯斯黏粒文库所必需的cos位点序列。

图7表示细菌附着位点attB靶序列插入红色糖多孢菌染色体所需要的同源双交换整合质粒pKC-nrps-attB构建流程图。

图8表示对出发菌株S.erythraea HL3168 E3和重组菌发酵液进行HPLC分析

图9(1)、(2)、(3)表示LC-MS检测红霉素A、B、C组分。

图10出发菌株S.erythraea HL3168E3和重组菌红霉素产量的分析。

符号说明

附图1中，target gene目的基因chromosome染色体；tsr表示硫链丝菌素抗性基因。

附图2中，chromosome染色体neo表示新霉素抗性基因；tsr表示硫链丝菌素抗性基因；bla表示氨苄青霉素抗性基因。

附图3中，PCR聚合酶链式反应。

附图7中，EcoRI，BamHI，HindIII，BglII为限制性核酸内切酶；pKC1139为链霉菌温敏型穿梭质粒；left arm PCR product左臂PCR产物；right arm PCR product右臂PCR产物；8attB sequence八个attB序列。

附图8所示的发酵液HPLC测定结果，其中I为红霉素A(Er-A)、B(Er-B)、C(Er-C)标准品；II为S.erythraea HL3168 E3；III为整合了羟基化酶EryK基因和碳霉糖甲基化酶EryG基因的菌株S.erythraea E3-KGK。

附图9所示发酵液LC-MS结果，其中(1)为红霉素A，分子量734.35；(2)为红霉素B，分子量718.41；(3)为红霉素C，分子量720.42。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本方面的内容。

实施例1构建在染色体中含有细菌附着位点attB靶序列的红色糖多孢菌

按照文献(《链霉菌遗传学操作手册》Norwich，England：The John Innes Foundation；2000)所述的方法，通过同源重组双交换构把含有细菌附着位点attB序列的多核苷酸插入红色糖多孢菌染色体中。在本实施例中，我们选择把attB序列插入在红色糖多孢菌染色体一段功能缺失的NRPS基因簇中。为了增加ΦC31整合酶介导的整合效率以及在发生第一次位点特异性重组的基础上进行第二次或者多次重组，我们选择了含有8个拷贝的attB序列作为插入片段整合入红色糖多孢菌染色体中。此片段的插入不会对红色糖多孢菌的生长及红霉素的合成产生任何不利的影响。具体构建步骤如下：

1.同源双交换整合质粒的构建

(1)以红色糖多孢菌(S.erythraea HL3168E3)基因组DNA为模板，以PCR 方法扩增基因组上一段功能缺失的NRPS基因簇上的两段序列作为同源重组双交换的左、右两臂。

扩增左臂所用的引物为：

上游：5’-AAAGAATTCCGGAACCTGCTGGCCGACCA-3’(SEQ ID NO：5)

下游：5’-TTTGGATCCGAGAAGTCGAAGGCGTAGGA-3’(SEQ ID NO：6)

扩增右臂所用的引物为：：

上游：5’-TTTGGATCCCTGGAGCTGGACCGCGAGCA-3’(SEQ ID NO：7)

下游：5’-AAAAAGCTTGGATCACCCTCCGCACCGAG-3’(SEQ ID NO：8)

(2)合成具有8个拷贝的attB靶序列片段(SEQ ID NO：9)，把左同源臂、8个拷贝的attB靶序列片段、右同源臂连接入链霉菌温敏型质粒pKC1139，得重组质粒pKC-nrps-attB。质粒构建流程图如图7所示。

2.质粒pKC-nrps-attB从大肠杆菌向红色糖多孢菌的属间接合转移

培养含有适当质粒的E.coli ET12567(pUZ8002)至OD₆₀₀＝0.5-0.6，25mL培养液中的细菌细胞离心收集，用等体积的LB洗两次，重悬于2mL LB中，作为大肠杆菌供体细胞。取适量冻存于-80℃的S.erythraea HL3168E3的20％甘油孢子悬液500μL，用等体积的TES buffer洗两次，重悬于等体积的TES buffer，50℃热激10min使孢子萌发。再加等体积的TSB，37℃温育2-5hr。离心重悬于0.5-1mL LB中作为链霉菌受体细胞。将不同浓度的受体细胞100μL与等体积的供体细胞混合直接涂布在含有10mMMgCl₂的MS平板上，30℃培养20hr后，采用无菌水轻轻洗涤平板表面以洗去大部分大肠杆菌，在每一平板的表面覆盖含萘啶酮酸(终浓度为50ng/μL)和相应抗生素的1mL无菌水。30℃培养5天以上挑取接合子。

3.双交换突变菌株的筛选

将获得的阿普拉抗性(Am^R)的接合子转移至37℃阿普拉抗性MS平板培养，挑单菌落经非抗性TSB液体培养基松弛培养后，涂布非抗性MS平板，培养7天后影印至含阿普拉抗性平板，筛选表型为阿普拉霉素敏感的菌株，这些菌株则可能为双交换插入8个拷贝数attB序列的突变株。

4.双交换突变株的基因型验证

在双交换重组位点的外围设计一对引物，引物序列如下：

上游：5’-TCGCCGCCGCACTACTGAA-3’(SEQ ID NO：10)

下游：5’-GCACCAGGCTGTTGACGAAGAA-3’(SEQ ID NO：11)

提取表型为阿普拉霉素敏感菌株的基因组DNA为模板，以此引物PCR扩增目的片段。目的片段采用引物：5’-CGCCCGCCACGTACATCTCA-3’(SEQ ID NO：12)进行测序验证，筛选测序结果中含有8个拷贝attB序列的阳性片段。最终验证得一菌株其基因组一段功能缺失的NRPS基因簇中插入了8个拷贝的attB序列，菌株命名为：S.erythraea E3-attB。

实施例2把红霉素生物合成过程中大环骨架上碳12位羟基化酶EryK基因和碳霉糖甲基化酶EryG基因定向整合到红色糖多孢菌(S.erythraea E3-attB)attB靶序

列中

本实施例是在本发明人已经申请发明名称为‘一种优化红霉素发酵组分的菌种、构建方法和用途’的中国专利的基础上进一步进行改造，构建可以稳定强化表达红霉素生物合成过程中大环骨架上碳12位羟基化酶EryK和碳霉糖甲基化酶EryG的红霉素生产菌株，从而改善红霉素杂质组份和产量。

质粒构建：

为构建基于ΦC31整合酶介导的基因插入整合质粒，选择含有ΦC31整合酶基因及噬菌体附着位点attP序列的质粒pSET152(图5)作为质粒母体。用EcoRI/SpeI消化含有ermE^*-eryK-eryG-eryK结构的重组质粒pCY4-16-8(见中国专利申请：一种优化红霉素发酵组分的菌种、构建方法和用途)，回收4.6kb目的片段，与EcoRI/XbaI消化的pSET152连接，得到质粒pSET-eryKGK。

参照实施例1方法从大肠杆菌向红色糖多孢菌(S.erythraea E3-attB)进行属间接合转移。筛选含有阿普拉抗性的接合子。提取接合子染色体DNA，采用PCR验证。PCR验证引物为：

上游：5’-GACGCTGTTCCACTCCTACGCC-3’(SEQ ID NO：13)

下游：5’-CGCCCGCCACGTACATCTCA-3’(SEQ ID NO：12)

对照采用红色糖多孢菌(S.erythraea E3-attB)基因组DNA为模板，能扩增出500bp条带，而以接合子总DNA为模板能扩出约10kb的目的条带，把目的条带进行DNA测序进一步证明重组质粒pSET-eryKGK分别正确插入染色体细菌附着位点attB中。插入重组质粒pSET-eryKGK的菌株分别命名为S.erythraea E3-KGK。

将重组菌株和对照菌株接种到摇瓶发酵，通过HPLC和LC-MS对发酵产物进行定量和组分分析，摇瓶发酵条件如下：

红霉素工业生产菌株HL3168E3和它的重组菌株在斜面培养基[/L：10g玉米淀粉，10ml玉米浆，3g氯化钠，3g硫酸铵，5g碳酸钙，pH7.0，2g琼脂粉]34℃培养7天生长孢子，作为液体发酵的种子。

液体发酵时，从斜面培养基上取1cm²大小方块接入50ml发酵种子培养基[/L：50g玉米淀粉，18g黄豆饼粉，13ml玉米浆，3g氯化钠，1.2g硫酸铵，1.2g硝酸铵，5ml豆油，6g碳酸钙，pH6.8～7.0]，在34℃，250rpm培养2天。然后将5ml的种子培养液转接到50ml发酵培养基[/L：40g玉米淀粉，30g黄豆饼粉，30g糊精，2g硫酸铵，10ml豆油，6g碳酸钙，pH自然]，在34℃，250rpm培养6天。接种24小时后补加0.5ml的正丙醇。

红霉素发酵液产物抽提和组份分析

在100ml烧杯中，准确量取适量发酵液以NaOH调pH至8.9。若样品冰冻，应融化后混合均匀定量转移至250ml容量瓶中，以水定容，混合均匀，8000～9000离心10min。

取25ml上述溶液于125ml分液漏斗中，加25ml正己烷，震荡5min，收集水相(下层)于离心管中，用水洗涤己烷层2次后，水相与离心管水相混合，加入10ml氯仿，激烈震荡5min，2500离心5min，依样品情况，可能会在界面形成乳状液，可用玻棒分散或再次离心，弃水相，将氯仿(下层)移至10ml的小瓶中，浓缩。

组份分析：采用HPLC和LC-MS对红霉素组分进行的定性和定量鉴定

HPLC条件：

色谱柱：Luna 5u CN 100R(250×4.6mm，phenomenex)

流动相：55％A(32mM K₂HPO₄) 45％B(CH₃CN∶CH₃OH 80/20)

检测条件：流速1mL/min，UV检测波长215nm，分析时间为25分钟。

LC-MS条件：

色谱柱：Eclipse Plus C18(150×4.6mm，Agilent USA)

流动相：A 5mM乙酸铵(0.05％甲酸)B乙腈∶甲醇 80∶20(0.05％甲酸)

0min 85％A 15％B

3min 85％A 15％B

6min 60％A 40％B

12min 60％A 40％B

19min 45％A 55％B

25min 15％A 85％B

检测条件：流速1mL/min，UV检测波长215nm，在LC-MS上分析时间为25分钟。

分析测定发酵液中红霉素A、B、C三种物质的组分，如图9所示，菌株S.erythraea E3-KGK发酵液中红霉素A的产量与对照S.erythraea E3相比较，提高了20％左右，而且S.erythraea E3-KGK重组菌杂质组份红霉素B及红霉素C和对照菌株相比也显著降低。

本发明所涉及的序列

SEQ ID NO：1 ggtgccaggg cgtgcccttg ggctccccgg gcgcg 35

SEQ ID NO：2 ccccaactgg ggtaaccttt gagttctctc agttggggg 39

SEQ ID NO：3 ggtgccaggg cgtgcccttg agttctctca gttggggg 38

SEQ ID NO：4 ccccaactgg ggtaaccttt gggctccccg ggcgcg 36

SEQ ID NO：5 aaagaattcc ggaacctgct ggccgacca 29

SEQ ID NO：6 tttggatccg agaagtcgaa ggcgtagga 29

SEQ ID NO：7 tttggatccc tggagctgga ccgcgagca 29

SEQ ID NO：8 aaaaagcttg gatcaccctc cgcaccgag 29

SEQ ID NO：9

tcgagatctc gggtgccagg gcgtgccctt gggctccccg ggcgcgtaac tagtggatct 60

cgggtgceag ggcgtgccct tgggctcccc gggcgcgtaa ctagtggate tcgggtgcca 120

gggcgtgccc ttgggctccc cgggcgcgta actagtggat ctcgggtgcc agggcgtgcc 180

cttgggctcc ccgggcgcgt aactagtgga tctcgggtgc cagggcgtgc ccttgggctc 240

cccgggcgcg taactagtgg atctcgggtg ccagggcgtg cccttgggct ccccgggcgc 300

gtaactagtg gatctcgggt gccagggcgt gcccttgggc tccccgggcg cgtaactagt 360

ggatctcggg tgccagggcg tgcccttggg ctccccgggc gcgtaactag tggatccctg 420

g

SEQ ID NO：10 tcgccgccgc actactgaa 19

SEQ ID NO：11 gcaccaggct gttgacgaag aa 22

SEQ ID NO：12 cgcccgccac gtacatctca 20

SEQ ID NO：13 gtaggatcca gcggtgttag accagcaaac ca 32

Claims

1.一种在红霉素产生菌中获得位点特异性DNA重组的方法，其特征在于，该方法包括：

向红色糖多孢菌中的染色体的NRPS基因簇中引入ΦC31整合酶所识别的细菌附着位点靶序列attB；和

向上述含有靶序列attB的红色糖多孢菌细胞中引入包含ΦC31整合酶基因序列、ΦC31整合酶所识别的噬菌体附着位点靶序列attP，以及目的基因序列的复合体，

其中，所述的复合体为质粒。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细菌附着位点靶序列attB为一个或多个的attB核心核苷酸序列拷贝，attB核心核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的噬菌体附着位点靶序列attP的核心核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细菌附着位点靶序列attB和噬菌体附着位点靶序列attP，两者在ΦC31整合酶介导下发生重组，形成杂合位点attL和attR，其核心核苷酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复合体为一种质粒，这种质粒还含有抗性选择标记以及进行属间接合转移所必需的元件oriT。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复合体为一种黏粒，这种黏粒还含有抗性选择标记以及进行属间接合转移所必需的元件oriT。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的质粒，其所包含的目的基因片段为红霉素生物合成基因簇的全部或者一部分，其中所述的基因簇的一部分是羟基化酶EryK和/或碳霉糖甲基化酶EryG。

8.一种如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复合体是重组质粒，并且所述的重组质粒用于红霉素生产菌种的遗传改造，具体步骤如下：

（1）把对红霉素生产有影响的目的DNA片段克隆至一载体中，这种载体为pSET152或pOJ436载体，其中目的DNA片段为红霉素生物合成基因簇的全部或者一部分，其中所述的基因簇的一部分是羟基化酶EryK和/或碳霉糖甲基化酶EryG；

（2）把步骤1所构建的载体转化到大肠杆菌ET12567，和权利要求1所述的染色体中含有attB序列的细胞进行属间接合转移，所述质粒将在ΦC31整合酶的作用下通过位点特异重组定向插入至宿主细胞染色体中；

（3）通过载体所含有的抗性基因进行筛选接合子，把筛选出来的接合子进行基因型验证，并进一步发酵，考查其生产红霉素的能力。