CN105087507B - 一种整合酶及其在改造刺糖多孢菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的整合酶及其在刺糖多孢菌遗传改造中的应用。具体地，所述的整合酶来自糖多孢菌CCTCC AA208003(Saccharopolyspora endophytica)，且所述的整合酶通过特定的顺式原件,可在刺糖多孢菌染色体特异性定点整合外源DNA。此外，本发明人还通过刺糖多孢菌不同菌株遗传因子的研究发现了不同菌株来源的可在刺糖多孢菌内的自主游离复制区。基于本发明的整合酶以及复制区域序列构建载体可用于刺糖多孢菌的遗传改造，可能发现新型的多杀菌素类似物，也可能提高多杀菌素发酵产量。可通过质粒携带不同的抗性分子标记，用于刺糖多孢菌种间或者属间的基因组shuffling操作，实现高效基因组重排。

Description

一种整合酶及其在改造刺糖多孢菌中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程或分子生物学领域，具体涉及可用于刺糖多孢菌遗传改造的整合酶，其借助质粒载体鉴定系列功能基因，维持质粒载体在刺糖多孢菌中稳定遗传，为刺糖多孢菌的基因工程改造(核酸序列的功能分析、同源表达、异源表达或过量表达，分子标记等)及基因组优化提供有效的分子遗传操作工具，快速实现改良刺糖多孢菌及提高多杀菌素产量。

背景技术

刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)属于糖多孢菌属，可产生多种新型大环内酯类化合物A83543(1)。目前，从该类菌发酵液中至少分离到30 种结构类似物，依次命名为Spinosyn A，B，C等，其中以Spinosyn A和D活性最高(2)。美国陶氏益农公司于1997年推出以Spinosyn A和D为活性物的新型高效生物杀虫剂多杀菌素(Spinosad)。多杀菌素杀虫谱广，对蜘蛛、线虫、昆虫均有控制作用，特别是对鳞翅目和双翅目害虫有较好的毒杀作用；该类物质在环境中易降解，对哺乳动物、鸟类以及捕食性昆虫相对低毒，表现出更好的环境安全性。

Spinosyns类物质主要由三部分组成，核心骨架为21碳形成的12元大环内酯，另加一个鼠李糖和一个福乐胺糖。刺糖多孢菌不同菌株产生这类化合物的比例组分有所不同，如NRRL18395、18537、18538、18539主要产生Spinosyn A、B、C、D、E、F、G、H和J；NRRL18823主要合成Spinosyn Q、R、S和T； NRRL18719和NRRL18720主要产生Spinosyns J组分；NRRL18743主要合成 Spinosyn K、O、P、U、V、W和Y。

刺糖多孢菌和红霉素产生菌红色糖多孢菌均属于糖多孢菌属，但是前者的遗传操作非常困难，通过接合转移或原生质体转化导入质粒的效率很低；刺糖多孢菌染色体没有完整phiC31整合所需attB，通过识别可能的pseudo-attB 识别位点，通用的包含phiC31整合相关元件的质粒pSET152可以以非常低的效率导入(低于10-7接合转移效率)；通过同源片段重组可以导入外源基因或增加内源基因的拷贝数，但多限于单交换，会直接影响上下游基因的功能，所以通常需要选择可能的中性位点，且可能无法稳定遗传。

因此，本领域迫切需要开发一种能够用于高效改造刺糖多孢菌基因的方法及合适的改造工具。

发明内容

本发明提供了一种新的整合酶，借助该整合酶可以实现在刺糖多孢菌内进行外源基因的定点整合，并不影响原菌株的生长。

在本发明第一方面，提供了一种整合酶，在另一优选例中，所述的整合酶来自保藏号为CCTCC AA208003的糖多孢菌(Saccharopolyspora endophytica)，且所述的整合酶具有将外源基因进行特异性定点整合的功能。

在另一优选例中，所述特异性定点整合是基于以下定点整合位点的定点整合：

GCGGAGGATACGGGATTCGAACCCGTGAGGGCTATTAACCCAACACGATTTCCAAT(SEQ ID NO.:3)

在另一优选例中，所述的特异性定点整合是将外源基因定点整合入刺糖多孢菌染色体。

在另一优选例中，所述的整合酶的序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的整合酶选自下组：

(a)将SEQ ID NO.:1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的并具有对刺糖多孢菌染色体进行特异性定点整合的活性的衍生蛋白；

(b)序列中含有SEQ ID NO.:1所示的序列的衍生蛋白；

(d)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列同源性≥85％(较佳地≥90％，≥95％)，并具有特异性定点整合的功能的衍生蛋白。

本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的整合酶。

在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体还含有：

含SEQ ID NO.:3所示核苷酸序列的整合位点的协助整合元件；和/或

待定点整合的外源基因。

在另一优选例中，所述的协助整合元件和待定点整合的外源基因可以是毗邻的或直接相连的。

在另一优选例中，所述的协助整合元件位于所述外源基因的上游和/或下游。

在另一优选例中，所述的载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体，较佳地，所述的载体为表达载体。

在另一优选例中，所述的载体含有SEQ ID NO.:4所示序列。

在另一优选例中，所述的外源性基因与本发明第二方面所述多核苷酸位于相同或不同质粒中。

在另一优选例中，所述的外源性基因包括外源性标记基因和或外源性功能基因。

在另一优选例中，所述的外源性标记基因包括非内源性刺糖多孢菌的复制因子。

在另一优选例中，所述非内源性刺糖多孢菌的复制因子序列如SEQ ID NO.: 5-8所示。

在另一优选例中，所述的复制因子来自于刺糖多孢菌野生或突变菌株，较佳地来自刺糖多孢菌内源性质粒。

在另一优选例中，所述的来自刺糖多孢菌内源性质粒的复制因子核苷酸序列如SEQ ID NO.:9所示。

在另一优选例中，所述的来自刺糖多孢菌内源性质粒的复制因子编码的蛋白包括SEQ ID NO.:10-11。

在另一优选例中，所述的载体携带糖多孢菌复制因子。

在另一优选例中，所述的载体是一种双质粒载体系统，所述的系统含有第一质粒和第二质粒，其中，

(i)所述的第一质粒含有本发明第二方面所述的的多核苷酸；和

(ii)所述的第二质粒含有外源基因构建物。

在另一优选例中，所示的第一质粒导入宿主细胞后，依赖所表达的本发明第一方面所述的整合酶，实现携带任选的外源性功能基因表达。

在另一优选例中，所述的外源基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.:10-11所示。

在另一优选例中，所述的载体还具有以下一个或多个特征:

(a)不影响刺糖多孢菌的正常生长或代谢；

(b)含有一个或多个抗生素抗性基因编码片段；

(c)质粒可相互在刺糖多报菌中共存,不影响复制。

本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或宿主细胞的染色体整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为刺糖多孢菌细胞。

在另一优选例中，所述的载体含有SEQ ID NO.:3所示核苷酸序列的整合位点的协助整合元件；和/或待定点整合的外源基因。

本发明第五方面，提供了本发明第一方面所述的整合酶或其编码基因或本发明第三方面所述载体的用途，用于制备进行外源基因的定点整合的试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的外源性基因包括一个或多个外源性标记基因和/或外源性功能基因。

本发明第六方面，提供了一种定点整合方法，包括步骤：

在本发明第一方面所述的整合酶存在下，在一外源基因构建物存在下，对一含定点整合位点的核酸物质进行整合反应，其中，所述的构建物含有待整合的外源基因以及位于所述外源基因上游和/或下游的协助整合元件，从而将所述外源基因定点整合入所述核酸物质上的所述定点整合位点。

在另一优选例中，所述的整合在体外和/或体内进行。

在另一优选例中，所述的整合酶是外源添加的、或细胞内表达的。

在另一优选例中，所述的整合酶的表达是诱导型表达或组成型表达。

在另一优选例中，所述的含定点整合位点的核酸物质包括染色体或载体。

在另一优选例中，所述的定点整合包括knock-in整合。

在另一优选例中，所述的染色体是刺糖多孢菌染色体。

本发明第七方面，提供了一种刺糖多孢菌染色体进行外源性基因特异性定点整合的方法，包括步骤：

将本发明第三方面所述的载体导入到所述的刺糖多孢菌的细胞内，并使得所述载体表达所述的所述整合酶；

在所述整合酶存在下，对待定点整合的外源基因构建物进行定点整合，从而将所述外源基因整合入刺糖多孢菌染色体的特异性整合位点。

本发明第八方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有：

(i)本发明第一方面所述的整合酶或其编码序列或本发明第三方面所述的载体；

(ii)任选的SEQ ID NO.:3所示的特异性整合位点序列；和

(iii)任选的染色体中含有SEQ ID NO.:3所示的特异性整合位点的宿主细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括刺糖多孢菌以及经基因工程改造的宿主细胞(如大肠杆菌、酵母、植物细胞等)。

本发明第九方面，提供了一种特异性整合位点序列，所述的特异性整合位点序列如SEQ ID NO.:3所示。

本发明还提供了一系列新型可用于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)遗传操作的质粒，具体地，包括以下两类：

(1)染色体整合型质粒：通过PCR或人工合成包含质粒pCM32上编码整合酶的基因及其特定整合位点DNA片段，将该片段克隆到含有抗性选择标记的质粒载体中，获得表达载体。该载体可以携带一个或多个基因，在整合酶基因的协助下整合到刺糖多孢菌染色体上。

(2)自主游离复制质粒：通过PCR或人工合成两类DNA复制相关片段，包括来自于4株糖多孢菌(菌株保藏号为CCTCC AA208062、CCTCC AA207006T、 KCTC19303及其衍生菌株，其相对应的本发明实验室编号为YIM65359、 YIM60513、I05-00051和I05-00074)染色体复制区oriC、来源于糖多孢菌质粒 pCM32的复制起点及复制基因，将片段分别克隆到含有抗性选择标记的质粒载体中，获得可在刺糖多孢菌游离复制的载体。这些载体可以携带一个或多个基因，在刺糖多孢菌中游离复制并遗传。

在另一优选例中，所述DNA片段具有如下特征：

(I)包含整合位点及编码整合酶的片段具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(II)包含来自糖多孢菌的染色体复制区oriC片段：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8

(III)包含有来自糖多孢菌的质粒复制相关片段具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列。

(IV)核苷酸序列与(I)、(II)或(III)有85％以上(优选90％以上) 序列相同性；

(V)与(I)或(II)或(III)中序列编码的蛋白具有相同功能的序列。

在另一优选例中，包含整合相关DNA片段质粒载体，可以借助片段中整合酶作用，整合到刺糖多孢菌染色体上并稳定遗传。

在另一优选例中，包含复制有关DNA片段质粒载体，可在刺糖多孢菌染色体外独立复制和遗传。

在另一优选例中，所述的表达载体含有至少一个可用于刺糖多孢菌选择的编码抗生素抗性基因的片段：如阿泊拉霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和/或卡那霉素抗性基因；另外必须含有一个整合相关DNA片段或复制有关DNA片段。

在另一优选例中，这些质粒载体导入刺糖多孢菌中不影响菌株的正常生长以及代谢产物的产生。

在另一优选例中，所述的表达载体可携带至少一个基因在刺糖多孢菌中表达。

在另一优选例中，所述的表达载体含有游离复制有关DNA片段的表达载体需相应抗性选择压力维持在刺糖多孢菌中稳定表达。

在另一优选例中，所述的表达载体含有游离复制有关DNA片段的表达载体在无相应抗性选择压力培养，可能以一定比例从刺糖多孢菌中丢失。

在另一优选例中，所述的表达载体可通过合适的酶切位点或其他克隆技术引入一个或多个具有完整读码框(包括启动子区域)的基因(簇)。

在另一优选例中，所述的基因(簇)具有特定的功能，或者是多杀菌素合成途径中的限速酶，或者是前体合成相关酶，或者是修饰酶，或者是参与其他生理代谢相关的酶。

在另一优选例中，所述的基因来自细菌、放线菌或者真菌等微生物。

在另一优选例中，所述基因通过表达载体导入刺糖多孢菌中，可以显著改变刺糖多孢菌的代谢流，或提高多杀菌素产量，或产生新的多杀菌素结构类似物，或改变菌株生长特性等。

在另一优选例中，含有不同复制酶基因的表达载体可以作为一种分子标记，让刺糖多孢菌带上不同的抗性标记，包括阿泊拉霉素抗性标记，或者潮霉素抗性标记等。

在另一优选例中，两个不同标记菌株进行原生质体融合时，两种抗性标记可用于筛选融合子。

在另一优选例中，用两种抗性标记来筛选原生质体融合子，可以高效筛选到真正的融合子。

在另一优选例中，利用高效的融合子筛选过程，可以快速的筛选出多杀菌素高产菌株，提高多杀菌素产量。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1具有整合酶基因的质粒pCM238示意图。

图2具有复制酶基因的质粒示意图。图中的oriC代表来自任意选自本发明复制区基因的糖多孢菌的oriC。

图3利用来自质粒pCM32的自主复制成分构建的质粒pCM121。

图4利用质粒标记菌株开展基因组重排提高多杀菌素产量。

图5利用pCM238表达6磷酸果糖激酶提高多杀菌素产量。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了一种来源于保藏编号为CCTCC AA208003(本实验室编号YIM61095)糖多孢菌(Saccharopolyspora endophytica)的整合酶，其可利用特异性定点整合位点高效定点整合于刺糖多孢菌染色体上或游离于染色体之外的质粒载体，用于外源基因或内源基因的稳定表达。此外，本发明人还通过刺糖多孢菌不同菌株遗传物质的研究发现了存在于不同菌株内的自主游离复制区基因，包括其染色体内的复制区基因oriC 和内源性质粒中的复制区片段，该复制区可用于标记导入内源不含该复制区的刺多糖孢菌细胞内，从而在刺糖多孢菌中表达特殊功能的基因。基于本发明的整合酶以及复制区域序列用于刺糖多孢菌的遗传改造，可能发现新型的多杀菌素类似物，也可能提高多杀菌素发酵产量。可通过质粒携带不同的抗性分子标记，用于刺糖多孢菌种间或者属间的基因组shuffling操作，实现高效基因组重排。

本发明的目的在于提供一系列可用于刺糖多孢菌遗传改造的整合型或自主复制型质粒载体，进而借助所述载体可向刺糖多孢菌中随意导入和表达至少一个基因序列，并用于提高多杀菌素的产量或改善刺糖多孢菌的生长。

基因来源

整合酶：来源于CCTCC AA208003的糖多孢菌(Saccharopolyspora endophytica)，本发明的实验中的编号为YIM61095，蛋白序列如SEQ ID NO.: 1所示，也可称为int32整合酶，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示；

复制因子：

oriC65359：来源于保藏号为CCTCC AA208062菌株，本发明的实验中的编号为YIM65359，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示；；

oriC60513：来源于保藏号为CCTCC AA207006T菌株；本发明的实验中的编号为YIM60513，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示；

oriC00051：来源于保藏号为KCTC19303菌株的衍生菌株；本发明的实验中的编号为I05-00051，所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示；

oriC00074：来源于保藏号为KCTC19303菌株；本发明的实验中的编号为 I05-00074，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.:8所示。

YIM61095:来源于CCTCC AA208003的糖多孢菌(Saccharopolysporaendophytica)，本实验室编号YIM61095，其内源性质粒的复制因子核苷酸序列如SEQ IDNO.:9所示,其中3517..2504位编码的蛋白如SEQ ID NO.:10所示,909-2507位编码的蛋白如SEQ ID NO.:11所示。

术语

如本文所用，术语“外源性”的基因或序列泛指宿主细胞本身染色体或质粒中不含有的基因或其片段，其中“非内源性”的基因或序列通常指在同类菌株或不同菌株染色体内所含有的，但是并不在充当宿主细胞的具体野生或突变菌株染色体内含有的特定基因或序列。

如本文所用，术语“特异性定点整合位点”、“整合位点”、“特异性整合位点”均可互换使用，指的是可在本发明整合酶的帮助下，所识别的宿主细胞的整合位点序列，该整合位点可与本发明整合酶编码序列存在于同一质粒或独立质粒中，当质粒系统导入宿主细胞后识别宿主细胞同源的片段后进行插入整合。当所述的特异性定点整合位点位于质粒中，该位点还可以被称为“协助整合元件”。可用于本发明的特异性定点整合位点如SEQ ID NO.:3所示。

如本文所用，“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。

如本文所用，蛋白质或多核苷酸“突变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。突变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

如本文所用，“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。

如本文所用，“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。

如本文所用，“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。

如本文所用，“分离”是指将物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

术语“编码蛋白的多核苷酸”是指包括编码此蛋白的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

整合酶及其编码基因

在微生物中表达基因主要包括两种操作方式，一种是将目标基因整合到染色体上，和染色体基因组共同表达；另一种就是克隆到染色体之外的可自主复制的质粒序列上，同质粒一起表达。在刺糖多孢菌中表达基因也不例外。本发明中基于以上的两种可能性，筛选并发现一个可整合到刺糖多孢菌染色体上的整合酶基因以及特异性定点整合位点。利用该整合酶基因和特异性整合位点，可以在刺糖多孢菌中随意表达设想的基因，从而为刺糖多孢菌的基因工程改造提供便利的分子工具。

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“整合酶”、“本发明整合酶”、“int32”可互换使用，都指分子量约为55kDa的来自糖多孢菌(Saccharopolyspora endophytica，保藏号为CCTCC AA208003，本实验室编号YIM61095)的整合酶，且所述的整合酶具有对刺糖多孢菌染色体进行特异性定点整合的活性。在本发明中，所述的整合酶包括野生型和突变型。

一种优选的来自于糖多孢菌的整合酶为如SEQ ID NO.:1所示，其来源于糖多孢菌(Saccharopolyspora endophytica，保藏号为CCTCC AA208003，本实验室编号YIM61095)的内源性质粒pCM32。

此外，所述术语还包括具有对刺糖多孢菌染色体进行特异性定点整合功能的、SEQID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个 (通常为1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3-4个以内，更佳地为1-2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明蛋白。

本发明还包括所述整合酶的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持神经保护功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是：

(a)将SEQ ID NO.:1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加形成的并具有刺糖多孢菌染色体进行特异性定点整合的活性的衍生蛋白；

(b)序列中含有SEQ ID NO.:1所示的序列的衍生蛋白；

(d)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列同源性≥85％(较佳地≥90％，≥95％)，并具有刺糖多孢菌染色体特异性定点整合的活性的衍生蛋白。

根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3-4个，更佳地至多1-2个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。这些保守性变异蛋白最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还提供本发明整合酶的类似物。这些类似物与天然本发明整合酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

本发明还提供了编码整合酶的基因序列。如本文所用，术语“本发明基因”、“整合酶基因”可以互换使用，均指编码本发明整合酶的基因序列。优选地，所述的整合酶基因如SEQ ID NO.:2所示。

本发明还包括与本发明的基因序列(SEQ ID NO.:2)具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的核酸，所述核酸编码的蛋白也能有效地将外源性基因特异性定点整合入刺糖多孢菌的染色体内。“同源性”是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列相似性或同一性)。在本文中，所述基因的变体可以通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。

在本发明中，SEQ ID NO.:2中的核苷酸序列可以经过取代、缺失或添加一个或多个，生成SEQ ID NO.:2的衍生序列，由于密码子的简并性，即使与SEQ ID NO.: 2的同源性较低，也能基本编码出如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。另外，“在 SEQ ID NO.:2中的核苷酸序列经过取代、缺失或添加至少一个核苷酸衍生序列”的含义还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.:2所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。这些变异形式包括(但并小限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30 个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于糖多孢菌，但是来源于其它类似物种的、具有一定同源性(保守性)的糖多孢菌整合酶基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它物种中分离得到该序列。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR 的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。此外，还可以采用化学合成法合成本发明整合酶。

一旦获得了有关的序列，就可将整合酶基因导入质粒中并转染宿主细胞，本发明整合酶可以达到对刺糖多孢菌染色体进行特异性定点整合的作用。所述特异性定点整合的整合位点为SEQ ID NO.:3。

此外，当本发明整合酶用于对刺糖多孢菌染色体进行定点整合时，所述的整合酶还优选含有侧翼的同源臂序列。较佳地，所述的侧翼同源臂序列如SEQ ID NO.:4中1-136位核苷酸所示，所述的整合位点为137-192位；整合酶的编码基因为295-1782位。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞(如刺糖多孢菌细胞)，以及经重组技术产生向刺糖多孢菌细胞内导入外源性基因的方法。

复制因子

如本文所用，术语“复制相关DNA片段”、“复制区基因”、“复制因子”、“本发明oriC”“本发明复制酶编码基因”可互换使用，均指刺糖多孢菌非内源性的、具有能在刺糖多孢菌中独立复制能力的DNA片段。

通过研究糖多孢菌的复制相关元件，本发明提供了可于菌株细胞内游离复制或基于整合酶的位点特异性整合的载体。优选地，所述的复制相关片段来源于糖多孢菌菌株Saccharopolyspora tripterygii CCTCC AA208062，本实验室编号YIM65359)、Saccharopolyspora gloriosae CCTCC AA207006T，本实验室编号YIM60513)、Saccharopolyspora antimicrobica I05-00051(来源于保藏号为KCTC19303菌株的衍生菌株)和Saccharopolyspora antimicrobica KCTC19303，本实验室编号I05-00074)，分别构建了可自主复制的质粒。

其中，来自菌株CCTCC AA208062的oriC65359(SEQ ID NO:5)，来自菌株CCTCCAA207006T的oriC60513(SEQ ID NO:6)，来自菌株I05-00051的 oriC00051(SEQ ID NO:7)和来自菌株KCTC19303的oriC00074(SEQ ID NO: 8)均可以在刺糖多孢菌中完成质粒独立复制。

本发明还涉及上述描述复制相关片段的变异体，此复制相关片段的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其执行的复制起始功能。

以上片段可与整合酶的基因共同存在于同一质粒中，且所述的质粒还含有任意的外源性基因，或存在于第二质粒中，位于外源基因的上游或下游，在与含有整合酶的基因共同导入宿主细胞后，在整合酶的协助下将外源基因转染至宿主细胞的染色体中。

质粒系统

本发明整合酶可用于构建用于刺糖多孢菌遗传改造系统的第一质粒，其可以固定地识别特异的核苷酸序列，并整合到特定的核苷酸位点上。

将来自糖多孢菌内源性质粒pCM32的整合酶基因及其侧翼序列克隆到含有 aac(3)IV和oriT的质粒中，通过接合转移或原生质体转化的方式分别导入刺糖多孢菌中，能大量获得含有阿泊拉抗性的重组子，并且证实质粒整合在染色体上。其中构建的质粒pCM238导入到刺糖多孢菌中，经非抗性平板传5-10代，重组菌株可以稳定遗传。

优选地，利用本发明改造的pCM238作为表达载体，将刺糖多孢菌中的基因或者其他外源基因克隆到该载体上，再通过接合转移或者原生质体转化导入到刺糖多孢菌中。对自身基因来说，增加了一个拷贝数；对于外源基因，则可以引入刺糖多孢菌本身不具有的新特性。

对于刺糖多孢菌，促进多杀菌素生物合成的任何结构基因或调控基因均可作为候选基因，增加其拷贝数来增加多杀菌素的合成。这些基因包括spnA、 spnB、spnC、spnD、spnE、spnF、spnG、spnH、spnI、spnK、spnL、spnM、spnN、 spnO、spnP、spnQ、spnR、spnS、pfk等。

在一个优选例中，将pfk基因克隆到pCM238质粒中，再导入刺糖多孢菌中检测其对多杀菌素产量影响，能够大幅提高多杀菌素产量。

在pCM238质粒中，实现特异性整合功能的质粒片段可以如SEQ ID NO.:4 所示。其中295-1782位为整合酶编码基因,137-192位为特异性定点整合位点。

总之，利用本发明发现的整合酶基因及其衍生质粒，可以轻易将至少一个候选基因整合到刺糖多孢菌中稳定表达，并维持稳定遗传，使得刺糖多孢菌的基因工程改造更为便捷可靠。

此外，特异性定点整合位点还可以位于独立于整合酶之外的第二质粒中。此时，第二质粒还可以含有本发明所述的刺糖多孢菌外源性独立复制区(因子) 作为外源基因是否成功导入并复制的标记基因。即在一般情况下，质粒通过复制起始区，借助自身复制酶或宿主菌的复制酶独立复制，存在于染色体之外。复制起始区对复制酶或宿主选择性不同，可选取多个可能具有该功能的DNA片段克隆到含有aac(3)IV和oriT序列的质粒中，通过接合转移或原生质体转化的方式分别导入刺糖多孢菌中，检验其可在刺糖多孢菌中独立复制。其中，来自质粒pCM32的复制区rep61095(SEQ ID NO:9)，来自菌株65359染色体的 oriC65359(SEQ ID NO:5)，来自菌株60513染色体的oriC60513(SEQ ID NO: 6)，来自菌株00051染色体的oriC00051(SEQ ID NO:7)和来自菌株00074染色体的oriC00074(SEQ ID NO:8)均可以在刺糖多孢菌中完成质粒独立复制。

质粒稳定性测试显示在无抗性选择压力下，含有上述复制相关DNA片段的质粒载体在刺糖多孢菌中不能稳定复制，质粒很容易丢失；只有在抗性选择压力下，质粒才能稳定遗传到下一代菌株中；利用这些质粒的不稳定性特征，就可以用于测试特定基因作用。

对于刺糖多孢菌，外源基因的导入可能会引入一些新的特性，如一些聚酮化合物合成途径中的修饰酶、刺糖多孢菌自身不产生的新前体合成基因或刺糖多孢菌合成多杀菌素的限速酶基因等。将这些基因作为候选基因导入刺糖多孢菌中异源表达，有可能产生新型多杀菌素衍物，或者提高多杀菌素产量，或者改变菌株生长特性等。例如将来自于除虫链霉菌或天蓝色链霉菌的α淀粉酶基因导入刺糖多孢菌，可能改善刺糖多孢菌利用淀粉能力差等特性。

利用本发明所述的包含复制酶基因(复制酶基因指的是编码SEQ ID NO:10-11所示蛋白的基因，即如SEQ ID NO:9所示的核苷酸)构建的质粒，可以表达特定的目标基因，这些基因可以是来自刺糖多孢菌基因组，也可以来源于其它微生物基因组。

作为本发明的优选方式，任意选取两个含有不同复制片段的质粒载体，分别构建含阿泊拉霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的质粒，分别导入到刺糖多孢菌中，可以获得带不同的抗生素抗性标记刺糖多孢菌，实现我们相关专利 ZL200710043687.7有关的基因组改组技术，用于改良刺糖多孢菌，提高多杀菌素的产量。

应用

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的双质粒系统可用来在刺糖多孢菌中表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的整合酶或复制区基因以及外源性基因，或用含有刺糖多孢菌遗传改造目标的外源性基因的本发明双质粒系统转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化遗传改造目标蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于分别构建含本发明整合酶的编码DNA序列、或本发明复制区DNA片段，以及合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

在本发明中，所述的宿主细胞指的是糖多孢菌类细胞，优选地，所述的宿主细胞即刺糖多孢菌，其包括野生型或突变型菌株。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2 法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达外源性基因编码的蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中外源性基因编码的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC) 和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在本发明中，无论是含有整合酶基因的整合型质粒还是可游离复制的质粒，均可以用于在刺糖多孢菌中任意表达特定的基因，这些基因可来自刺糖多孢菌自身或其它微生物。总之，利用本发明系列载体，可以高效的实现刺糖多孢菌遗传改造，为利用微生物分子遗传操作手段改造多杀菌素产生菌，提高多杀菌素产量提供了一套高效实用的操作系统。

试剂盒

本发明还提供了一种用于对刺糖多孢菌进行外源性整合的试剂盒，其中，所示的试剂盒可以含有

(i)本发明第一方面所述的整合酶或其编码序列或办发明第三方面所述的载体；

(ii)任选的SEQ ID NO.:3所示的特异性整合位点序列；和

(iii)任选的染色体中含有SEQ ID NO.:3所示的特异性整合位点的宿主细胞。

本发明的主要优点在于：

(1)找到一种可以将任意核苷酸序列高效特异整合到刺糖多孢菌染色体上的位点特异性重组酶编码基因，该基因的存在可使外源核苷酸序列整合到刺糖多孢菌染色体上的效率高于1.0×10^-5。

(2)发现多个复制因子可协助质粒载体在刺糖多孢菌内独立复制遗传，且两种复制酶可以在同一菌体内共存。在没有抗性选择压力下，含有复制酶的质粒载体可以按要求去除。

(3)利用发现的整合酶或重组酶构建的载体可以在刺糖多孢菌中高效且无限制的表达一个或多个目标基因，为刺糖多孢菌的基因工程改造提供最为便利的分子工具。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York： Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料和方法

菌株、质粒

本发明涉及的菌株和质粒列出于表2中。

表2本专利所用的菌株及质粒

研究方法

刺糖多孢菌中质粒的导入

质粒通过接合转移或原生质体转化导入刺糖多孢菌。

质粒稳定性测试

将含有抗性质粒的刺糖多孢菌菌株先在非抗性平板上传一代，再利用稀释分离的方法，在非抗性平板上分单菌落传一代，并得到单菌落。将单菌落接种于空白平板和抗性平板上生长，检测每100-200株中非抗性菌落(质粒丢失的菌落)的比例。

实施例1：质粒的导入及稳定性测试

将构建好的质粒分别转化到大肠杆菌S17-1中，通过大肠杆菌-刺糖多孢菌属间接合转移转入刺糖多孢菌。纯化出的抗性菌落分别在非抗性平板上传一代和二代，收集孢子并稀释涂布后得到单菌落。分别挑取100-200个单菌落于抗性平板和非抗性平板，30℃培养，检测非抗性菌落(质粒丢失的菌落)的比例。结果见表3。

表3质粒稳定性试验

结果表明，自主复制的质粒在刺糖多孢菌中稳定性有差异，经过非抗性选择，质粒丢失率很高，可用于在刺糖多孢菌的循环基因组shuffling筛选时选择性的丢失质粒；整合型质粒可通过位点特异性重组酶整合到染色体上，并稳定遗传。

实施例2：刺糖多孢菌发酵产生多杀菌素。

成熟斜面上的刺糖多孢菌孢子用无菌接种铲接种于种子摇瓶中，种子摇瓶装量25ml/250ml三角瓶，于28℃220r/min培养64-72h。以10％接种量接入发酵培养基，发酵摇瓶装量25ml/250ml摇瓶，于28℃220r/min培养8-10d，

取样检测多杀菌素产量。

多杀菌素产量测定的HPLC分析条件：色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C84.6×12.5(5μm)；检测波长：246nm；流动相：甲醇:乙腈:水＝45: 45:10，另加0.005％乙酸铵；流速:1.0ml/min。

刺糖多孢菌斜面培养基配方为：全脂奶粉2％，葡萄糖0.5％，酵母抽提粉0.3％

刺糖多孢菌种子培养基配方为：全脂奶粉0-3％，葡萄糖0.5-3％，酵母抽提粉0-1.5％，蛋白胨0-1.5％

刺糖多孢菌发酵培养基配方为：全脂奶粉0-3％，葡萄糖5-15％，酵母抽提粉0-1.5％，白胨0-3％，豆油0-1.5％， K₂HPO₄0-0.5％，CaCO₃0-0.5％。

实施例3：抗性质粒标记在刺糖多孢菌基因组shuffling筛选中的应用

将含有潮霉素抗性基因质粒pSN11标记的菌株SN304和含有阿泊拉霉素抗性基因质粒pWT295标记的菌株SN0207分别制备原生质体，按照专利ZL200710043687.7的原理进行原生质体诱变融合试验(具体方法参照文献12)，随机挑取100个融合子发酵检测，发酵效价提高的占39％，最高增幅达41％(图 4)。融合子还可以进一步丢失其中一个抗性，结合物理或化学诱变，获得复合亲本，进行下一轮基因组shuffling，如此反复进行多轮融合，可筛选到高产菌株。

实施例4:通过整合型载体导入基因提高多杀菌素产量

将携带有刺糖多孢菌编码6-磷酸果糖激酶基因的整合型载体pCM279，按照实施案例1方法，通过结合转移导入子糖多孢菌菌株SN02，以导入空载体 pCM238的菌株为对照，按照实施案例2中方法发酵检测多杀菌素产量，统计数据显示，含有编码6-磷酸果糖激酶基因质粒菌株，发酵产量较携带空质粒的对照菌株高出约150％(图5)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献

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(7)Waldron,C.,K.Madduri,K.Crawford,D.J.Merlo,P.Treadway,M.C.Broughton, and R.H.Baltz.2000.A cluster of genes for the biosynthesis ofspinosyns,novel macrolide insect control agents produced by Saccharopolysporaspinosa.Antonie Van Leeuwenhoek.78: 385–390.

(8)Waldron,C.,P.Matsushima,P.R.Rosteck,M.C.Broughton,J.Turner,K.Madduri, K.P.Crawford,D.J.Merlo,and R H.Baltz.2001.Cloning and analysis ofthe spinosad biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora spinosa.ChemBiol.8:487–499.

(9)Madduri,K.,C.Waldron,P.Matsushima,M.C.Broughton,K.Crawford,D.J.Merlo, and R.H.Baltz.2001.Genes for the biosynthesis of spinosyns:applications for yield improvement in Saccharopolyspora spinosa.J IndMicrobiol Biotechnol.27:399–402.

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(11Simon,R.,U.Preifer,and A.Puhler.1983.“A broad host rangemobilization system for in vivo genetic engineering:transposon mutagenesis inGram negative bacteria,” Bio/Technology1:784-791.

(12)Kieser,T.,M.J.Bibb,M.J.Buttner,K.F.Chater,and D.A.Hopwood.2000.Practical Streptomyces Genetics.The John Innes Foundation,Norwich,UK

Claims (36)

1.一种整合酶，其特征在于，所述的整合酶来自保藏号为CCTCC AA208003的糖多孢菌(Saccharopolyspora endophytica)，且所述的整合酶具有将外源基因进行特异性定点整合的功能，所述整合酶如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的整合酶，其特征在于，所述特异性定点整合是基于以下定点整合位点的定点整合：

GCGGAGGATACGGGATTCGAACCCGTGAGGGCTATTAACCCAACACGATTTCCAAT(SEQ ID NO:3)。

3.如权利要求1所述的整合酶，其特征在于，所述的特异性定点整合是将外源基因定点整合入刺糖多孢菌染色体。

4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的整合酶。

5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

6.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有：

含SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的整合位点的协助整合元件；和/或

待定点整合的外源基因。

8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述的协助整合元件和待定点整合的外源基因可以是毗邻的或直接相连的。

9.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。

10.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体为表达载体。

11.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体含有SEQ ID NO:4所示序列。

12.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述的外源性基因与权利要求4所述多核苷酸位于相同或不同质粒中。

13.如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述的外源性基因包括外源性标记基因和/或外源性功能基因。

14.如权利要求13所述的载体，其特征在于，所述的外源性标记基因包括非内源性刺糖多孢菌的复制因子。

15.如权利要求14所述的载体，其特征在于，所述非内源性刺糖多孢菌的复制因子序列如SEQ ID NO:5-8所示。

16.如权利要求14所述的载体，其特征在于，所述的复制因子来自于刺糖多孢菌野生或突变菌株。

17.如权利要求14所述的载体，其特征在于，所述的复制因子来自刺糖多孢菌内源性质粒。

18.如权利要求17所述的载体，其特征在于，所述的刺糖多孢菌内源性质粒的复制因子的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

19.如权利要求17所述的载体，其特征在于，所述的刺糖多孢菌内源性质粒的复制因子编码的蛋白包括SEQ ID NO:10-11。

20.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体携带糖多孢菌复制因子。

21.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体是一种双质粒载体系统，所述的系统含有第一质粒和第二质粒，其中，

(i)所述的第一质粒含有权利要求4所述的多核苷酸；和

(ii)所述的第二质粒含有外源基因构建物。

22.如权利要求21所述的载体，其特征在于，所述的第一质粒导入宿主细胞后，依赖所表达的权利要求1所述的整合酶，实现携带任选的外源性功能基因表达。

23.如权利要求22所述的载体，其特征在于，所述的外源基因的氨基酸序列如SEQ IDNO:10-11所示。

24.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体还具有以下一个或多个特征:

(a)不影响刺糖多孢菌的正常生长或代谢；

(b)含有一个或多个抗生素抗性基因编码片段；

(c)质粒可相互在刺糖多孢菌中共存不影响复制。

25.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的载体或宿主细胞的染色体整合有权利要求4所述的多核苷酸。

26.权利要求1所述的整合酶或其编码基因或权利要求6所述载体的用途，其特征在于，用于制备进行外源基因的定点整合的试剂或试剂盒。

27.一种在刺糖多孢菌中进行定点整合方法，其特征在于，包括步骤：

在权利要求1所述的整合酶存在下，在一外源基因构建物存在下，对一含定点整合位点的核酸物质进行整合反应，其中，所述的构建物含有待整合的外源基因以及位于所述外源基因上游和/或下游的协助整合元件，从而将所述外源基因定点整合入所述核酸物质上的所述定点整合位点，所述的定点整合位点如SEQ ID NO:3所示。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的整合在体外和/或体内进行。

29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的整合酶是外源添加的、或细胞内表达的。

30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的整合酶的表达是诱导型表达或组成型表达。

31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的含定点整合位点的核酸物质包括染色体或载体。

32.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述的定点整合包括knock-in整合。

33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述的染色体是刺糖多孢菌染色体。

34.一种刺糖多孢菌染色体进行外源性基因特异性定点整合的方法，包括步骤：

将权利要求6所述的载体导入到所述的刺糖多孢菌的细胞内，并使得所述载体表达所述整合酶；

在所述整合酶存在下，对待定点整合的外源基因构建物进行定点整合，从而将所述外源基因整合入刺糖多孢菌染色体的特异性整合位点，所述的定点整合位点如SEQ ID NO:3所示。

35.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：

(i)权利要求1所述的整合酶或其编码序列或权利要求6所述的载体；

和

(ii)任选的染色体中含有SEQ ID NO:3所示的特异性整合位点的宿主细胞。

36.一种特异性整合位点序列，其特征在于，所述的特异性整合位点序列如SEQ ID NO:3所示。