CN103224905A - 鉴定和表征来自生产多杀菌素的刺糖多孢菌的siponactin生物合成基因簇 - Google Patents

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Abstract

本发明内容涉及产生多杀菌素生产菌株的方法，包括通过导入、突变、缺失、替代或失活下述核酸序列来修饰编码SIPNACTIN的核酸分子，所述核酸序列编码一种或多种由所述核酸分子编码的活性。还公开了用于产生修饰的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)生物体的方法。

Description

鉴定和表征来自生产多杀菌素的刺糖多孢菌的SIPONACTIN生物合成基因簇
优先权要求 
本申请要求2011年12月28日提交的、名为“鉴定和表征来自生产多杀菌素的刺糖多孢菌的SIPONACTIN生物合成基因簇(IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF THE SPINACTIN BIOSYSNTHESIS GENE CLUSTER FROM SPINOSYN-PRODUCING SACCHAROPOLYSPORA SPINOSA)”的美国临时专利申请系列号61/580,947的优先权。 
技术领域
本公开内容一般涉及生产具有减少的杂质的多杀菌素(spinosyn)的方法，并涉及Spinactin及其生物合成。 
背景 
根据美国专利号5,362,634中公开的内容，发酵产物A83543是由刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)产生的相关化合物家族。该家族的已知成员被称为因子或组分，每种都已被赋予了识别性字母命名。这些化合物在后文中被称为多杀菌素A、B等。多杀菌素化合物可用于控制蛛形纲动物(arachnid)、线虫和昆虫，特别是鳞翅目和双翅目的物种，并且它们是相当环境友好的，具有吸引人的毒理学特性(toxicological profile)。 
天然产生的多杀菌素化合物由5，6，5-三环系统组成，与12元大环内酯、中性糖(鼠李糖)和氨基糖(福乐糖胺)融合(参见Kirst等人(1991))。如果不存在氨基糖，则该化合物被称为A、D等的拟糖苷配基(pseudoaglycone)；而如果不存在中性糖，则化合物被称为A、D等的逆拟糖苷配基(reverse pseudoaglycone)。更优选的命名法是称拟糖苷配基为多杀菌素A17-Psa、多杀菌素D17-Psa等，并且称逆拟糖苷配基为多杀菌素A9-Psa、多杀菌素D9-Psa等。 
可以通过发酵从培养物NRRL18395、18537、18538、18539、18719、 18720、18743和18823生产天然产生的多杀菌素化合物。这些培养物已经保藏，并且构成农业研究机构中西部地区北部区研究中心(Midwest Area Northern Regional Research Center，Agricultural Research Service，United States Department of Agriculture，1815North University Street，Peoria，Ill.，61604)的原种培养物保藏物的一部分。 
美国专利号5,362,634和相应的欧洲专利申请号375316A1涉及多杀菌素A、B、C、D、E、F、G、H和J。这些化合物据称是通过培养选自以下的新型微生物刺糖多孢菌的菌株生产的：NRRL18395、NRRL18537、NRRL18538和NRRL18539。 
WO93/09126涉及多杀菌素L、M、N、Q、R、S和T。其中还讨论了2种多杀菌素J生产菌株：NRRL18719和NRRL18720，和产生多杀菌素Q、R、S和T的菌株：NRRL18823。 
WO94/20518和美国专利号5,670,486涉及多杀菌素K、O、P、U、V、W和Y，及其衍生物。还讨论了多杀菌素K生产菌株NRRL18743。 
生产多杀菌素化合物中的难点来自于这样的事实，即需要非常大的发酵体积来生产非常少量的多杀菌素。非常希望增加多杀菌素的生产效率，并由此增加多杀菌素的可利用度，同时降低其成本。 
另一个难点是通过这样的方法生产多杀菌素化合物，所述方法减少或去除杂质，同时对多杀菌素生产水平没有有害影响。 
公开内容 
本发明的特定实施方案包括产生多杀菌素生产菌株的方法，包括通过导入、突变、缺失、替代或失活下述核酸序列来修饰编码Spinactin的核酸分子，所述核酸序列编码一种或多种由所述核酸分子编码的活性。此类导入的、突变的、缺失的、替代的或失活的序列可以导致编码多杀菌素的核酸分子合成与天然的多杀菌素生产菌株合成的聚酮不同的聚酮。另一个实施方案包括包含编码修饰的多杀菌素的核酸分子的宿主细胞，其中所述分子是通过上述方法获得的。 
另一个实施方案包括产生修饰的刺糖多孢菌生物体的方法。所述方法包括：提供包含刺糖多孢菌的Spinactin生物合成基因簇内的核苷酸序列的核酸；突变核苷酸序列；和将包含突变的核苷酸序列的核酸导入宿主刺糖多孢 菌生物体中，使得核酸稳定整合到宿主刺糖多孢菌生物体的基因组DNA中，由此产生修饰的刺糖多孢菌生物体，其中Spinactin生物合成基因簇内的基因不再表达功能性蛋白质。 
某些实施方案包括产生多杀菌素的混合物的方法。所述方法包括：提供至少一种包含破坏Spinactin生物合成的手段的刺糖多孢菌生物体的培养物；在发酵条件下培养至少一种刺糖多孢菌生物体；和从刺糖多孢菌发酵培养物获得多杀菌素的混合物。在其他实施方案中，产生多杀菌素的方法包括：提供根据上述方法制备的修饰的刺糖多孢菌生物体；和在发酵条件下培养所述生物体，由此产生至少一种多杀菌素。 
另一个实施方案涉及具有式(I)的化合物： 
或其盐或N-氧化物。在特定的实施方案中，用于分离式(I)的化合物的方法包括：在发酵条件下培养刺糖多孢菌菌株NRRL18395；从刺糖多孢菌发酵培养物获得包含次级代谢物的技术材料；在包含等量(1∶1)甲醇和水的溶液中形成所述技术材料的浆；过滤所述浆，从而形成包含富集量的化合物的滤液；然后通过制备型液相层析从多杀菌素因子中分离化合物(I)。 
根据参考附图继续进行对若干实施方案的下列详细说明，上述特征和其他特征因此将更加显而易见。 
附图的简单说明 
图1包括对Spinactin的化学结构的描述。 
图2包括根据X射线晶体学数据确定的Spinactin的Oak Ridge Thermal Ellipsoid Plot Program(ORTEP)分子建模图。 
图3包括从来自刺糖多孢菌菌株NRRL18395基因组序列的重叠群261中鉴定的、假定的Spinactin基因簇的物理标注图。 
图4包括由刺糖多孢菌基因组序列的假定的Spinactin基因簇组成的重叠 群261的示意图，所述重叠群261表现出与具有其相应插入物大小的已鉴定的3个粘粒克隆相关。显示了充当筛选策略中的探针的噻唑啉酰亚胺还原酶部分片段的位置。 
图5包括pCR8/GW/Topo_aac(3)-attB的质粒图示意。 
图6包括从粘粒克隆4G15中的Spinactin基因簇缺失7.6kb片段的示意图，所述粘粒克隆4G15是使用Redirect Recombineering TechnologyTM产生的。 
序列表 
使用核苷酸碱基的标准字母缩写，显示所附序列表中列举的核酸序列，如37C.F.R§1.822中定义的。每条核酸序列仅显示一条链，但通过任意参考所示链可理解也包括了互补链。在所附序列表中： 
SEQ ID NO：1提供了来自刺糖多孢菌基因组的重叠群261的多核苷酸序列； 
SEQ ID NO：2提供了NRPS1基因的多核苷酸序列； 
SEQ ID NO：3提供了含有噻唑啉酰亚胺还原酶编码序列的片段的412bp核苷酸序列的多核苷酸序列； 
SEQ ID NO：4提供了PCR扩增正向引物的多核苷酸序列； 
SEQ ID NO：5提供了PCR扩增反向引物的多核苷酸序列； 
SEQ ID NO：6提供了含有来自浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的放线菌噬菌体
Figure BSA00000865196300041
连接位点(attB)的片段的多核苷酸序列。分别向5’和3’端添加了BamHI和NdeI限制性酶切位点； 
SEQ ID NO：7提供了正向引物2的多核苷酸序列，一种PCR扩增引物； 
SEQ ID NO：8提供了反向引物2的多核苷酸序列，一种PCR扩增引物； 
SEQ ID NO：9提供了质粒pCR8/GW/Topo_aac(3)-attB的多核苷酸序列。 
SEQ ID NO：10提供了正向引物3的多核苷酸序列，一种PCR扩增引物，下划线序列与aac(3)-attB盒杂交，无下划线的序列来自噻唑啉酰亚胺还原酶基因： 
TCGACGGCCTGCTGCGCCGCATCCTCAACCAGCCGACAATGTAGGCTGGAGCTGCTTC； 
SEQ ID NO：11提供了反向引物3的多核苷酸序列，一种PCR扩增引物， 下划线序列与aac(3)-attB盒杂交，无下划线的序列来自噻唑啉酰亚胺还原酶基因： 
AACGCACCGCGCAGGCGCTGCGCGACGGATGGTTGAACACATATGGTCGACATGCCCGC；和 
SEQ ID NO：12提供了连接的多核苷酸序列，其中通过DNA测序确认了从粘粒克隆4G15缺失了噻唑啉酰亚胺还原酶基因。 
实施发明的方式 
克隆多杀菌素生物合成基因和相关的ORF，并确定每个的DNA序列。克隆的基因和ORF在下文中称为spnA、spnB、spnC、spnD、spnE、spnF、spnG、spnH、spnI、spnJ、spnK、spnL、spnM、spnN、spnO、spnP、spnQ、spnR、spnS、ORFL15、ORFL16、ORFR1、ORFR2、刺糖多孢菌gtt、刺糖多孢菌gdh、刺糖多孢菌epi和刺糖多孢菌kre。 
刺糖多孢菌产生被统称为“多杀菌素”的九种非常相关的化合物的混合物。在该混合物中，多杀菌素A和D(被称为Spinsoad)是主要组分，并具有对抗关键性昆虫靶的最高活性。多杀菌素J和L，即多杀菌素混合物中两种次要组分，是第二代多杀菌素杀虫剂Spinetoram的前体。 
Spinsoad是Dow AgroSciences(Indianapolis，Ind.)生产的杀虫剂，主要包括约85％多杀菌素A和约15％多杀菌素D。根据美国专利号5,362,634公开，多杀菌素A和D是通过发酵刺糖多孢菌产生的天然产物。Spinosad是可自Dow AgroSciences商业获得的若干种杀虫剂配方的活性成分，包括TRACERTM、SUCCESSTM、SPINTORTM和CONSERVETM昆虫控制产品。例如，TRACER产品包括约44％至约48％的Spinosad(w/v)，或约4磅(1.81kg)Spinosad/加仑(3.78升)。在颗粒和液体配方中的多杀菌素化合物具有用于控制蛛形纲动物、线虫和昆虫的确定用途，特别是鳞翅目(Lepidoptera)、缨翅目(Thysanoptera)和双翅目(Diptera)的物种。多杀菌素A和D在本文中还被称为多杀菌素A/D。 
Spinetoram是Dow AgroSciences生产的5，6-二氢-3’-乙氧基多杀菌素J(主要组分)和3’-乙氧基多杀菌素L的混合物。可以通过乙氧基化多杀菌素J和多杀菌素L的混合物，然后氢化，来制备该混合物。由于多杀菌素L及其3’-乙氧基衍生物中C-5上的甲基的空间位阻，多杀菌素J的5、6双键及其 3’-乙氧基比多杀菌素L及其3’-乙氧基衍生物的易于氢化得多。参见美国专利号6,001,981。多杀菌素J和L在本文中也被称为多杀菌素J/L。 
还可以通过诱变克隆的基因，和用突变基因取代它们在多杀菌素生产生物体中未突变的对应物，来产生新型多杀菌素。诱变可以涉及例如：1)缺失或失活酮还原酶、脱水酶或烯酰还原酶(KR、DH或ER)结构域，从而阻断一种或多种这些功能，并使菌株生产这样的多杀菌素，所述多杀菌素具有含不存在于多杀菌素A原子团中的双键、羟基或酮基的内酯原子团(参见Donadia等人，1993)；2)替代AT结构域，使内酯原子团中整合不同的羧酸(参见Ruan等人，1997)；3)向现有的PKS模块中添加KR、DH或ER结构域，使菌株生产这样的多杀菌素，所述多杀菌素具有含不存在于多杀菌素A原子团中的饱和键、羟基或双键的内酯原子团；或4)添加或删减完整的PKS模块，使环状内酯原子团具有更多或更少数量的碳原子。可以通过用异源PKS载入替代多杀菌素PKS载入结构域，生成杂交PKS。参见例如美国专利号7,626,010。还应注意到，通过修饰与多杀菌素内酯骨架连接的糖的多杀菌素包括修饰鼠李糖和/或福乐糖胺部分，或连接不同的脱氧糖。西班牙的Salas小组证实，可以通过用不同的糖分子取代现有的糖分子，产生新型聚酮化合物。Rodriguez等人，J.Mol.Microbiol Biotechnol.2000Jul；2(3)：271-6。本申请全文中的实例将帮助示例使用诱变生产具有修饰的功能的多杀菌素。 
可以使用多杀菌素基因簇区域的DNA作为杂交探针来鉴定同源序列。因此，本文克隆的DNA可用于定位刺糖多孢菌基因文库中的其他质粒，所述质粒与本文描述的区域重叠，但还含有来自刺糖多孢菌基因组中相邻区域的之前未克隆的DNA。此外，来自本文克隆的区域的DNA可用于鉴定其他生物体中不完全相同但相似的序列。杂交探针的长度通常是至少约20个碱基，并经过标记以允许检测。 
根据本发明的特定实施方案，用于产生多杀菌素生产菌株的方法包括通过导入、突变、缺失、替代或失活下述核酸序列来修饰编码Spinactin的核酸分子，所述核酸序列编码一种或多种由所述核酸分子编码的活性。此类导入的、突变的、缺失的、替代的或失活的序列可以导致编码下述多杀菌素的核酸分子，所述多杀菌素合成与从天然的多杀菌素生产菌株合成的聚酮不同的聚酮。多杀菌素生产菌株可以产生多杀菌素A和D，在特定的实施方案中，可以产生多杀菌素J和L。 
术语“严谨条件”或“在严谨条件下杂交”指这样的条件，在所述条件下，探针将优先与其靶亚序列杂交，而以较低的程度杂交其他序列或完全不与其他序列杂交。在核酸杂交实验(例如Southern和Northern杂交)的情况下，“严谨的杂交”和“严谨的杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。对核酸杂交的全面指导可见于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays，Elsevier，New York。一般而言，高严谨的杂交和洗涤条件选为比特定序列在定义的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃。Tm是(在定义的离子强度和pH下)50％靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。非常严谨的条件选为与特定探针的Tm相等。 
用于在Southern或Northern印迹的滤膜上，杂交具有超过100个互补残基的互补核酸的严谨杂交条件的实例是在42℃下，含1mg肝素的50％甲酰胺中杂交过夜。高严谨洗涤条件的实例是在72℃下，0.15M NaCl中约15分钟。严谨洗涤条件的实例是在65℃下，0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠缓冲液)中15分钟(参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Press，NY，关于SSC缓冲液的描述)。通常，在高严谨度洗涤之前先进行低严谨度洗涤，以去除背景探针信号。用于例如超过100个核苷酸的双链体的中等严谨度洗涤的实例是在45℃下，1x SSC中15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的低严谨度洗涤的实例是在40℃下，4-6x SSC中15分钟。一般而言，是不相关探针在特定杂交测定中观察到的信号/噪声比的2x(或更高)的信号/噪声比表示检测到特定的杂交。如果编码的多肽实质上相同，则在严谨条件下彼此不杂交的核酸仍然是实质上相同的。该情况出现在例如使用遗传密码子允许的最大密码子简并性生成核酸拷贝时。 
本发明还涉及在严谨条件下，优选在高严谨条件下，可以与本发明的多核苷酸杂交的分离的多核苷酸。 
如本文中使用的，术语“杂交”意在描述用于杂交和洗涤的条件，在所述条件下，彼此至少约50％、至少约60％、至少约70％、更优选至少约80％、甚至更优选至少约85％至90％、最优选至少95％同源的核苷酸序列通常仍然彼此杂交。 
在一个实施方案中，本发明的核酸与本申请中显示的核酸序列或其补体至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源。 
严谨杂交条件的另一个非限制性例子是在约45℃下，6x SSC中杂交，再在50℃，优选55℃，更优选60℃和甚至更优选65℃下，在1x SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。 
高严谨条件可以包括在42℃下使用标记的DNA探针(例如异羟基洋地黄毒甙元(DIG)标记的DNA探针)孵育若干天的时间，例如2-4天，再在室温下，2x SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次，和65-68℃下，0.5x SSC、0.1％SDS或0.1x SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次。特别的是，高严谨条件包括例如，在42℃下，使用DIG标记的DNA探针(通过例如使用DIG标记系统制备；Roche Diagnostics GmbH，68298Mannheim，Germany)，在溶液中孵育2h至4天，所述溶液是例如含或不含100μg/ml鲑精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH)，或包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基磺酸钠、0.1％N-月桂酰肌氨酸钠和2％封闭试剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液，再在室温下，在2x SSC和0.1％SDS中洗涤滤膜2次，每次5至15分钟，然后，在65-68℃下，在0.5x SSC和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗涤2次，每次15至30分钟。 
在一些实施方案中，与本发明的核苷酸序列在高严谨条件下杂交的本发明的分离的核酸分子可以对应于天然存在的核酸分子。如本文中使用的，“天然存在的”核酸分子指具有自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，编码天然蛋白质)。 
熟练的技术人员可知何种条件用于严谨的和高严谨的杂交条件。其他关于此类条件的指导是本领域易于获得的，例如在Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，NY.和Ausubel等人(编著)，1995，Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons，N.Y.)中。 
“功能多态性”在本文中指基因序列碱基对的改变，所述改变产生由该基因编码的蛋白质活性的质或量的改变(例如，活性特异性的改变；活性水平的改变)。术语“功能多态性”包括突变、缺失和插入。 
一般而言，可以通过收集含有来自来源的DNA的生物学样品，然后确 定生物学样品中存在或缺少含有目标多态性的DNA，进行目标多态性的检测步骤。 
可以用标记了合适的可检测基团的寡核苷酸探针，和/或通过扩增反应的手段，确定存在或缺少编码特定突变的DNA，所述扩增反应例如聚合酶链式反应或连接酶链式反应(然后，可以用标记的寡核苷酸探针或多种其他技术检测扩增反应的产物)。此外，检测步骤可以包括检测对象对于特定突变而言是杂合还是纯合的步骤。已知多种可用于执行本发明的、不同的寡核苷酸探针测定模式。参见例如，Wahl等人的美国专利号4,302,204；Falkow等人的美国专利号4,358,535；Ranki等人的美国专利号4,563,419；和Stavrianopoulos等人的美国专利号4,994,373。 
可以通过任何合适的手段进行选定的或靶向的核酸序列的扩增。一般参见Kwoh等人，Am.Biotechnol.Lab.8，14-25(1990)。合适的扩增技术的实例包括但不限于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链替换扩增(一般参见G.Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA89，392-396(1992)；G.Walker等人，Nucleic Acids Res.20，1691-1696(1992))、基于转录的扩增(参见Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA86，1173-1177(1989))、自我维持的序列复制(或“3SR”)(参见J.Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA87，1874-1878(1990))、QB复制酶系统(参见P.Lizardi等人，BioTechnology6，1197-1202(1988))、基于核酸序列的扩增(或“NASBA”)(参见R.Lewis，Genetic Engineering News12(9)，1(1992))、修复链式反应(或“RCR”)(参见R.Lewis，见上文)，和回旋镖DNA复制(boomerang DNA amplification)(或“BDA”)(参见R.Lewis，见上文)。一般优选的是聚合酶链式反应。 
可以根据已知的技术进行聚合酶链式反应(PCR)。参见例如美国专利号4,683,195；4,683,202；4,800,159和4,965,188。一般而言，PCR涉及：首先，在杂交条件下用针对待检测特定序列的寡核苷酸引物(每条链一种)处理核酸样品(例如，在存在热稳定性DNA聚合酶的条件下)，以合成与每条核酸链互补的各引物的延伸产物，其中，引物与特定序列的每条链充分互补至足以与其杂交，从而从每条引物合成延伸产物，当将延伸产物与其补体分开时，所述延伸产物可以作为合成另一引物的延伸产物的模板，然后，如果存在待检测的序列，则在变性条件下处理样品，分开引物延伸产物与其模板。循环重复上述步骤，直至获得理想的扩增程度。可以通过向反应产物中添加能够 与反应产物杂交的寡核苷酸探针(例如，本发明的寡核苷酸探针)，检测扩增的序列，所述探针携带了可检测的标签，然后，根据已知的技术检测标签，或通过在凝胶上直接显像。此类探针可以是5至500个核苷酸长度，优选5至250，更优选5至100或5至50个核酸。当PCR条件允许扩增所有的等位基因型时，可以通过与等位基因特异性探针杂交，通过限制性内切酶消化，通过变性梯度凝胶上的电泳或其他技术区分所述类型。 
还根据已知的技术进行连接酶链式反应(LCR)。参见例如，R.Weiss，Science254，1292(1991)。一般而言，用两对寡核苷酸探针进行反应：一对结合待检测序列的一条链；另一对结合待检测序列的另一条链。每对都与其对应的链完全重叠。反应如下进行：首先，变性(例如分开)待检测序列的链；然后，在存在热稳定性连接酶的条件下，将链与两对寡核苷酸探针反应，使每对寡核苷酸探针连接在一起；然后，分开反应产物；然后，循环重复上述过程，直至序列扩增至理想的程度。然后，可以按上述关于PCR相似的方式进行检测。 
术语“同源性”或“百分比同一性”在本文中可互换的使用。出于本发明的目的，在本文中定义为为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性，出于最佳比较的目的(例如，为了与第二氨基酸或核酸序列最佳比对，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中导入缺口)比对序列。然后，比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，分子在所述位置是相同的。两条序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置数的函数(即，％同一性＝相同位置数/位置总数(即，重叠位置x100))。优选的，两条序列的长度相同。 
本领域技术人员了解这样的事实，即，可利用若干种不同的计算机程序确定两条序列之间的同源性。例如，可以使用数学算法实施两条序列之间的序列比较和百分比同一性确定。在优选的实施方案中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol(48)：444-453(1970))算法，确定两条氨基酸序列之间的百分比同一性，所述算法整合在GCG软件包的GAP程序(可获得自因特网的accelrys网址，更具体的是http://www.accelrys.com)中，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重16、14、12、10、8、6或4，和长度权重1、2、3、4、5或6。本领域技术人员可理解所有上述不同的参数将产生略微区 别的结果，但当使用不同算法时，两条序列的整体百分比同一性没有显著改变。 
在仍然另一个实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序确定两条核苷酸序列之间的百分比同一性(可获得自因特网的accelrys网址，更具体的是http://www.accelrys.com)，使用NWSgapdna.CMP矩阵，缺口权重40、50、60、70或80，和长度权重1、2、3、4、5或6。在另一个实施方案中，使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4::11-17(1989)，已整合到ALIGN程序(2.0版)中(可获得自因特网的vega网址，更具体的是ALIGN-IGH Montpellier，或更具体的在http://vega.igh.cnrs.fr/bin/aligh-guess.cgi)的算法确定两条氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12和缺口罚分为4。 
本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，来实施对公众数据库的检索，例如鉴定其他的家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol215：403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)实施此类检索。可以用BLASTN程序，分值＝100，字节长度＝12实施BLAST核苷酸检索，获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，分值＝50，字节长度＝3实施BLAST蛋白质检索，获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。出于比较目的，为了获得带缺口的比对，可以如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述，利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。(可获得自因特网的ncbi网址，更具体的是http://www ncbi nlm nihgov)。 
另一个实施方案可包括宿主细胞，所述宿主细胞包含编码修饰的多杀菌素的核酸分子，其中所述分子是通过上述方法获得的。可选的方法还可以生产修饰的聚酮，导致核酸分子在宿主细胞中表达，还可以进一步纯化所述聚酮。在特定的具体实施方案中，突变的、缺失的、替代的或失活的序列可以包括：提供核酸文库，所述核酸包括一个或多个与至少一个转录调节序列可操作地连接的多核苷酸区段；将核酸文库导入受体细胞群或胞内细胞器，从而所述核酸使得Spinactin生产不能进行，同时维持多杀菌素生产；鉴定具有理想表型的至少一个受体细胞、胞内细胞器或包含受体细胞的生物体，从而控制多杀菌素生产菌株。突变核苷酸序列可包括导入缺失、突变或终止密码 子。核苷酸序列可以包含在选自下组的基因内：ABC转运蛋白底物结合蛋白、氨基酸ABC转运蛋白通透酶、EmrB QacA家族抗药性转运蛋白、单加氧酶、NRPS1、NRPS2、位于刺糖多孢菌基因组中的NRPS1和NRPS2之间的基因、噻唑啉酰亚胺还原酶、硫酯酶、甲基转移酶、pabAB、转录调节子、酰基CoA合酶、N-甲基转移酶、吡哆胺5’-磷酸氧化酶、2，3-二氢苯甲酸-AMP连接酶和氨基转移酶。包含在噻唑啉酰亚胺还原酶基因中的核苷酸序列与SEQ ID NO：3至少80％相同。 
修饰的刺糖多孢菌生物体能够产生比导入所述核酸前的宿主刺糖多孢菌生物体更少的Spinactin，或不生产Spinactin。在一些实施方案中，修饰的刺糖多孢菌生物可以生产：与导入所述核酸前的宿主刺糖多孢菌生物体中产生的多杀菌素A的量基本上相同的量的多杀菌素A；与导入所述核酸前的宿主刺糖多孢菌生物体中产生的多杀菌素D的量基本上相同的量的多杀菌素D；和与导入所述核酸前的宿主剌糖多孢菌生物体中产生的Spinactin的量相比更少量的Spinactin。 
生产多杀菌素混合物的方法，方法包括：提供至少一种包含破坏Spinactin合成的手段的刺糖多孢菌生物体的培养物；在发酵条件下培养所述至少一种刺糖多孢菌生物体；和从刺糖多孢菌发酵培养物获得多杀菌素的混合物。可以通过失活Spinactin基因簇的基因，或突变Spinactin基因簇的基因，实现破坏Spinactin合成。从刺糖多孢菌发酵培养物中获得的多杀菌素的混合物可包括至少一种多杀菌素A和多杀菌素D。从刺糖多孢菌发酵培养物中获得的多杀菌素的混合物可不包括Spinactin。在一些实施方案中，Spinactin基因簇的基因是噻唑啉酰亚胺还原酶基因。可以通过根据所述方法生产修饰的刺糖多孢菌生物体。生物体可以包括参与多杀菌素生物合成的转基因。修饰的刺糖多孢菌生物体可以包括参与多杀菌素生物合成的转基因，所述转基因被稳定的整合到生物体的基因组DNA中稳定整合核酸的位点上。 
本发明的另一个实施方案包括包含破坏Spinactin合成的手段的修饰的刺糖多孢菌生物体，其中所述生物体能够在不产生显著量的Spinactin的条件下，产生多杀菌素A和/或多杀菌素D。 
另一个实施方案包括产生修饰的刺糖多孢菌生物体的方法。所述方法包括：提供包含刺糖多孢菌的Spinactin生物合成基因簇内的核苷酸序列的核酸；突变核苷酸序列；和将包含突变的核苷酸序列的核酸导入到宿主刺糖多 孢菌生物体中，使所述核酸稳定的整合到宿主刺糖多孢菌生物体的基因组DNA中，从而产生修饰的刺糖多孢菌生物体，其中Spinactin生物合成基因簇中的基因不再表达功能性蛋白质。 
在其他实施方案中，产生多杀菌素的方法包括：提供根据上述方法制备的修饰的刺糖多孢菌生物体；和在发酵条件下培养所述生物，从而生产至少一种多杀菌素。 
仍然另一种实施方案涉及具有式(I)的化合物： 
或其盐或N-氧化物。在特定的实施方案中，分离式(I)的化合物的方法包括：在发酵条件下培养刺糖多孢菌菌株NRRL18395；从刺糖多孢菌发酵培养物中获得包含次级代谢物的技术材料，在包含等量(1∶1)甲醇和水的溶液中形成所述技术材料的浆；过滤所述浆，从而形成包含富集量的化合物的滤液；然后通过制备型液相层析从多杀菌素因子中分离化合物(I)。 
提供下列实施例，用于示例某些特定的特征和/或实施方案。实施例不应视为限制公开内容至特定的特征或所说明的实施方案。 
实施例
实施例1：从刺糖多孢菌中鉴定和表征Spinactin分子 
Spinactin是从刺糖多孢菌发酵培养物中鉴定的含硫化合物。图1示例了Spinactin的化学结构。该结构是使用NMR谱确定并用X射线晶体学验证的。参见图2。 
使用Strobel和Nakatshkasa(1993)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.11(2)：121-7描述的发酵规程，增殖菌株NRRL18395的刺糖多孢菌发酵培养物。液相层析分析鉴定出存在之前未检测的次级代谢物，所述次级代谢物具有特征性的UV谱，λmax＝227和358nm。使用下列规程分离次级代谢物。在甲醇和水(1∶1)中浆化来自刺糖多孢菌发酵培养物的技术材料(3kg)，并过滤。 发现滤液含有富集量的之前未检测的次级代谢物。通过制备型反向液相层析，从剩余的多杀菌素材料中分离出该次级代谢物。使用该方法，获得了6mg新分子，占总技术材料质量的约0.2％。从甲醇/水中重新结晶被称为Spinactin的新分子，为淡绿色固体(mp79℃)。高解析度探针电子冲击质谱(EI/MS)提示，Spinactin具有C20H28N4O3S2的分子式。通过极化转移(DEPT)谱进行1H、 13C分析和无失真增强，提示存在二甲氨基、第二个甲氨基和单个S-甲基。还显而易见的是1，2，4-三取代苯环。氯仿中的其余谱包括复杂的非一阶多重态，包括在2D谱中可见的虚拟耦合效应，是由4-H和5-H的同步化学位移导致的。因此，使用标准的2-D NMR技术(包括COSY、HSQC和HMBC)，在甲醇-d4中解析如下所述的一阶谱的结构(参见表1)。 
在1H谱中容易的鉴定了3个自旋系统；在7.3和6.7ppm之间检测到3个芳香基多重态，提示含有氧或氮取代基的1，2，4-三取代苯环；另一个也提示了氮取代的自旋系统，该自旋系统由2个亚甲基(一个是氧取代的，一个是氮取代的)夹住甲川基；和延长的自旋系统，该自旋系统含有3个连续的甲川基，末端是亚甲基。没有在高于2.5ppm的区域共振的多重态提示高度的杂原子取代。除上述自旋系统外，有3种甲基单线态，表示是二甲氨基，另一个是N-甲基和甲基硫酯。两个亚甲基之间的耦合常数小，提示碳原子不是直接连接的。两个这类碳原子都具有N-甲基的HMBC杂峰，提示其位于甲基化三级氮的任一侧。 
通过HMBS实验的广泛分析装配分子。因此，鉴定了与芳香环的C-2连接的噁唑啉环。确定该环具有与C-5连接的亚甲基，该亚甲基被用作帮助装配二氮二环辛烷系统的柄(handle)。该亚甲基(在3.9和3.5ppm共振)提示了属于扩展自旋系统(63ppm)的一个甲川基的杂峰，以及属于172ppm的酰胺羰基的杂峰。该羰基的其他杂峰来自于另一个甲川基(4.1ppm)，和提示含有2个氮原子的6元环的其他亚甲基之一(在3.5和3.2ppm共振)。由于存在属于连接甲基化氮原子的两个甲川基的杂峰，由化学位移推断硫酯，确定该亚甲基还桥接回环。一旦确定了这一环系统，则易于实现分子其余部分的装配。 
表1.Spinactin在MeOH中的NMR谱 
Figure BSA00000865196300141
使用X射线晶体学的方法，验证Spinactin分子的结构。图2中显示了结构的ORTEP(Oak Ridge Thermal Ellipsoid Plot Program)模型。用Nonius Kappa CCD X射线衍射仪(Bruker-Noninus，Madison，WI)上的Mo Ka辐射，照射大小为0.50x0.8x0.06mm的Spinactin单晶体(MP79℃)。收集到共计7801次反射(其中2276次是唯一的)。使用标准方法和利用数据分析程序SHELXS97和SIR97，提炼和解析数据。 
实施例2鉴定和表征Spinactin生物合成基因簇 
基于Spinactin的2-羟基苯基噁唑啉部分与分枝杆菌生长素的2-羟基苯基噁唑啉部分结构相似性，假设两种分子都是通过相似的生物合成通路产生的。Quadri等人(1998)Chemistry&Biology15：631-45中表征了分枝杆菌生长素生物合成基因簇和苯基噁唑啉合成酶mbtB基因(mbtB)参与分枝杆菌生长素的2-羟基苯基噁唑啉部分的生物合成。使用来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)菌株02_1987的分枝杆菌生长素生物合成基因簇的苯基噁唑啉合成酶mbtB的氨基酸序列(登录号：ZP_06505539)在计算机上筛选从刺糖多孢菌野生型菌株(NRRL18395)获得的基因组序列。所获得的BLAST检索鉴定了刺糖多孢菌基因组中存在假定的基因序列，所述序列编码与MbtB具有相似性的氨基酸序列。刺糖多孢菌基因组中的NRPS1基因 与结核分枝杆菌基因簇中的mbtB基因在氨基酸水平享有约46％同一性。该基因的鉴定导致后续鉴定了含有其他基因的刺糖多孢菌基因簇，提示所述其他基因参与Spinactin的生物合成。使用计算机程序FgenesB(Cambridge University，UK)标注刺糖多孢菌Spinactin基因簇的这些基因序列。图3显示了对重叠群261的多核苷酸序列的标注，其中，重叠群261含有刺糖多孢菌基因组序列的NRPS1基因序列，其多核苷酸序列如SEQ ID NO：1列举。NRPS1的多核苷酸序列如SEQ ID NO：2列举。 
实施例3从刺糖多孢菌基因组粘粒文库中筛选和鉴定含有Spinactin基因簇的粘粒克隆 
筛选刺糖多孢菌的基因组粘粒文库(美国专利申请号13/100202)，鉴定含有噻唑啉酰亚胺还原酶基因的粘粒克隆。噻唑啉酰亚胺还原酶基因位于NRPS1基因的下游，并被为表征Spinactin基因簇的假设成员，编码对多杀菌素A/D的生物合成非关键性的酶。使用该基因，鉴定能被缺失含有Spinactin基因簇的7.6Kb片段的修饰的粘粒克隆。然后，所获得的粘粒克隆用于产生刺糖多孢菌敲除菌株。 
用PCR异羟基洋地黄毒甙元(DIG)标记试剂盒制备噻唑啉酰亚胺还原酶基因的412bp片段。使用正向引物(SEQ ID NO：4)和反向引物(SEQ ID NO：5)PCR扩增412bp片段。在42℃下，在商业供应的杂交缓冲液(Roche)中完成杂交过夜。在严谨条件下洗涤尼龙膜，所述严谨条件为室温下，2xSSC，0.1％SDS中洗涤2次，每次5分钟；在68℃下，0.1x SSC，0.1％SDS中洗涤2次，每次15分钟。使用DIG Luminescent Detection KitTM(Roche)，进行化学发光标记和检测。通过使用T3和T7测序引物对粘粒插入物末端测序，鉴定和验证了3个阳性粘粒克隆(2C14、3E11和4G15)。图4概括了3个鉴定的粘粒克隆的细节，及其相应的片段插入物大小和与重叠群261和刺糖多孢菌基因组中的噻唑啉酰亚胺还原酶基因的412bp片段对应的位置。 
实施例4：构建具有attB连接位点的安普霉素抗性基因盒，用于部分缺失Spinactin基因簇 
通过将attB序列克隆到安普霉素抗性基因盒中，完成构建安普霉素-attB盒。通过第三方服务供应商(Integrated DNATechnologies，Coralville，IA)合 成浅青紫链霉菌放线菌噬菌体
Figure BSA00000865196300171
连接位点序列(attB；登录号：X60952)。为了有利于克隆合成的attB片段，分别在5’和3’端添加BamHI和NdeI位点(SEQ ID NO：6)。将含有合成的attB序列的载体标记为pIDTSMART。 
使用正向引物2(SEQ ID NO：7)和反向引物2(SEQ ID NO：8)PCR扩增模板质粒pIJ773(登录号：AX657063)，所述模板质粒含有安普霉素抗性基因盒aac(3)-IV(登录号：X99313)和质粒RP4的oriT(登录号：L27758)，侧翼是FRT位点。按生产商的规程，将PCR片段克隆到pCR8/GW/TOPOTM载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，通过限制性酶切消化和测序，验证插入的安普霉素盒的存在和完整性。 
用BamHI和NdeI消化pIDTSMART的attB片段，使用QIAquich Gel Extraction KitTM(Qiagen，Valencia，CA)凝胶纯化所获得的300bp DNA片段。使用标准的分子生物学技术，将纯化的attB片段克隆到pCR8/GW/TOPOTM载体中，所述载体在NdeI和BamHI限制性位点处含有安普霉素抗性基因盒。通过限制性酶切消化和测序，验证含有attB连接位点的新安普霉素抗性基因盒的构建。图5提供了构建的pCR8/GW/TOPO_aac(3)-attB质粒图和序列(SEQ ID NO：9)。 
实施例5：生成含有部分缺失的Spinactin基因簇的刺糖多孢菌敲除菌株 
使用Redirect Recombineering TechnologyTM(Gust等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci USA100(4)：1541-6)，通过用安普霉素-attB盒靶向噻唑啉酰亚胺还原酶区域，实现Spinactin基因簇的7.6kb缺失。设计引物组用于扩增安普霉素-attB盒，使用正向引物3(SEQ ID NO：10)和反向引物3(SEQ ID NO：11)。设计这些引物含有与Spinactin基因簇享有同源性的5’序列。按Redirect Recombineering规程，将获得的PCR产物整合到粘粒克隆4G15中。通过双交换获得在粘粒克隆4G15中敲除Spinactin基因簇，其中安普霉素-attB盒取代了粘粒克隆4G15的天然DNA序列。通过对连接区的DNA测序，验证了所获得的缺失。SEQ ID NO：12提供了连接的核苷酸序列，其中缺失了Spinactin基因簇的7.6kb片段。 
分离修饰的4G15粘粒DNA，并转化到E.coli的供体菌株S17-1中，用于与刺糖多孢菌菌株NRRL18538的接合实验。按经过修饰包括ISP4培养基的规程(Matsushima等人(1994)Gene146(1)：39-45)完成接合。通过用安普霉 素(50μg/ml)和萘啶酸(25μg/ml)淹没接合培养基平板，选择转化接合子。将来自接合平板的转化接合子补片至补充了20mM CaCl2和安普霉素(50μg/ml)和萘啶酸(25μg/ml)的ISP2琼脂培养基上。在含有50μg/ml安普霉素的ISP2琼脂培养基上选择双交换敲除子(抗安普霉素并对卡那霉素抗生素敏感)。 
选择了5个独立的敲除菌株(标记为538-M2、538-M4、538-M6、538-M7和538-M10)。通过PCR扩增分子确认了这些敲除菌株Spinactin基因簇的7.6kb缺失。PCR反应产生了预期大小的片段，提示从刺糖多孢菌菌株NRRL18538的基因组中缺失了7.6kb片段(参见图6)。通过表型和基因型测定验证了刺糖多孢菌NRRL18538敲除菌株，以摇瓶发酵培养增殖菌株，定量多杀菌素A和D的生产滴度。 
实施例6：刺糖多孢菌菌株NRRL18538敲除菌株中的多杀菌素A和D的生产和消除了Spinactin生产的验证 
以6天和10天摇瓶发酵培养增殖源自刺糖多孢菌菌株NRRL18538的敲除菌株，生成的所述敲除菌株含有部分缺失的Spinactin基因簇。敲除菌株产生的多杀菌素A和D的水平可与含有完整的Spinactin基因簇的对照菌株相比。此外，在刺糖多孢菌NRRL18538敲除菌株中，Spinactin不可检测或检测到非常低水平的Spinactin。这些结果提示，去除次级代谢物Spinactin对多杀菌素A和D的产生和生物合成没有有害的影响。 
使用LC-UV-MS方法，分析野生型刺糖多孢菌菌株NRRL18538和刺糖多孢菌菌株NRRL18538敲除菌株的发酵肉汤的甲醇提取物的Spinactin产生。完成甲醇提取物规程，其中在室温下孵育一份发酵肉汤和三份甲醇过夜。使用Agilent Eclipse Plus C18(100x3mm；1.8μm)柱，层析甲醇提取物的样品，以0.5mL/min使用线性梯度在40℃洗脱，所述线性梯度为A∶B50∶50(0min)至5∶95(12min)，其中A＝25mM醋酸铵，B＝乙腈-甲醇(80∶20)。通过227nm的UV吸收，或通过选择性离子监控质谱(SIM-MS)监控m/z437.2的离子，检测约在8.8分钟时洗脱的Spinactin。使用外部标准方法，用Spinactin的纯样品建立的校正曲线实施定量。在野生型刺糖多孢菌菌株NRRL18538和刺糖多孢菌菌株NRRL18538敲除菌株中，当存在高于约2mg/L的Spinactin时，使用UV方法定量Spinactin，而当化合物以约0.02-2mg/L的范围存在时，使用SIM-MS方法。 
表2概括了从野生型刺糖多孢菌菌株NRRL18538和刺糖多孢菌菌株NRRL18538敲除菌株的发酵肉汤中获得的多杀菌素A和D和Spinactin的滴度。这些数据证实，相比野生型刺糖多孢菌菌株NRRL18538，在Spinactin基因簇中的部分基因缺失对刺糖多孢菌菌株NRRL18538敲除菌株中的多杀菌素产生的滴度没有影响。 
表2：野生型刺糖多孢菌菌株NRRL18538(列为“538”)和刺糖多孢菌菌株NRRL18538敲除菌株(列为“538-M2”、“538-M4”、“538-M6”、“538-M7”和“538-M10”)的6天和10天发酵肉汤的甲醇提取物的HPLC分析概述 
缺失了Spinactin生物合成基因簇编码序列的约7.6kb片段，包括噻唑啉酰亚胺还原酶基因，从而消除了刺糖多孢菌菌株NRRL18538的Spinactin产生。之后发酵敲除菌株，获得水平可与剌糖多孢菌对照菌株比较的多杀菌素A和D的生物合成。因此，从刺糖多孢菌菌株NRRL18538的Spinactin生物合成基因簇缺失7.6kb片段导致在对多杀菌素A和D的产生和生物合成没有有害影响的条件下，从发酵培养物中去除了次级代谢物Spinactin。 
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Figure ISA00000865196500351

Claims (32)

1.产生多杀菌素生产菌株(spinosyn producing strain)的方法，包括通过导入、突变、缺失、替代或失活下述核酸序列来修饰编码Spinactin的核酸分子，所述核酸序列编码一种或多种由所述核酸分子编码的活性，其中此类导入的、突变的、缺失的、替代的或失活的序列导致编码下述多杀菌素的核酸分子，所述多杀菌素合成与从天然的多杀菌素生产菌株合成的聚酮(polyketide)不同的聚酮。
2.根据权利要求1的方法，其中Spinactin是SEQ ID NO：2或包含与SEQID NO：2具有至少90％同一性的核苷酸序列的分离的多核苷酸。
3.根据权利要求1的方法，其中所述多杀菌素生产菌株产生多杀菌素A和D。
4.根据权利要求1的方法，其中多杀菌素生产菌株产生多杀菌素J和L。
5.包含编码修饰的多杀菌素的核酸分子的宿主细胞，其中所述分子是通过权利要求1的方法获得的。
6.制备修饰的聚酮的方法，其导致通过权利要求1的方法获得的核酸分子在宿主细胞中表达。
7.根据权利要求6的方法，还包括纯化所述聚酮。
8.通过权利要求7的方法获得的修饰的聚酮。
9.根据权利要求1的方法，其中所述突变、缺失、替代或失活序列包括：
i)提供核酸文库，所述核酸包括一个或多个与至少一种转录调节序列可操作地连接的多核苷酸区段；
ii)将所述核酸文库导入受体细胞群体或胞内细胞器，从而所述核酸使得Spinactin生产不能进行，同时维持多杀菌素生产；和
iii)鉴定具有理想表型的至少一个受体细胞、胞内细胞器或包含受体细胞的生物体，从而控制多杀菌素生产菌株。
10.产生修饰的刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)生物体的方法，所述方法包括：
提供包含刺糖多孢菌的Spinactin生物合成基因簇内的核苷酸序列的核酸；
突变所述核苷酸序列；和
将包含所述突变的核苷酸序列的核酸导入宿主刺糖多孢菌生物体中，使得所述核酸稳定整合入所述宿主刺糖多孢菌生物体的基因组DNA中，由此产生修饰的刺糖多孢菌生物体，其中Spinactin生物合成基因簇内的基因不再表达功能性蛋白质。
11.根据权利要求10的方法，其中突变所述核苷酸序列包括导入缺失、突变或终止密码子。
12.根据权利要求10的方法，其中所述核苷酸序列包含在选自下组的基因内：ABC转运蛋白底物结合蛋白、氨基酸ABC转运蛋白通透酶、EmrBQacA家族药物抗性转运蛋白、单加氧酶、NRPS1、NRPS2、位于刺糖多孢菌基因组中的NRPS1和NRPS2之间的基因、噻唑啉酰亚胺还原酶、硫酯酶、甲基转移酶、pabAB、转录调节子、酰基CoA合酶、N-甲基转移酶、吡哆胺5’-磷酸氧化酶、2，3-二氢苯甲酸-AMP连接酶和氨基转移酶。
13.根据权利要求12的方法，其中包含在噻唑啉酰亚胺还原酶基因中的核苷酸序列与SEQ ID NO：3至少80％相同。
14.根据权利要求10的方法，其中所述修饰的刺糖多孢菌生物体产生比导入所述核酸前的所述宿主刺糖多孢菌生物体中所产生的更少的Spinactin。
15.根据权利要求14的方法，其中所述修饰的刺糖多孢菌生物体不产生Spinactin。
16.根据权利要求10的方法，其中所述修饰的刺糖多孢菌生物体产生：
与导入所述核酸前的宿主刺糖多孢菌生物体中产生的多杀菌素A的量基本上相同的量的多杀菌素A；
与导入所述核酸前的宿主刺糖多孢菌生物体中产生的多杀菌素D的量基本上相同的量的多杀菌素D；和
与导入所述核酸前的宿主刺糖多孢菌生物体中产生的Spinactin的量相比更少量的Spinactin。
17.产生多杀菌素的混合物的方法，所述方法包括：
提供至少一种包含用于破坏Spinactin合成的手段的刺糖多孢菌生物体的培养物；
在发酵条件下培养所述至少一种刺糖多孢菌生物体；和
从刺糖多孢菌发酵培养物获得多杀菌素的混合物。
18.根据权利要求17的方法，其中破坏Spinactin合成包括失活Spinactin基因簇的基因。
19.根据权利要求17的方法，其中失活基因包括突变Spinactin基因簇中的基因。
20.根据权利要求17的方法，其中从所述刺糖多孢菌发酵培养物获得的多杀菌素的混合物包含多杀菌素A和多杀菌素D中的至少一种。
21.根据权利要求17的方法，其中从所述刺糖多孢菌发酵培养物获得的多杀菌素的混合物不包含Spinactin。
22.根据权利要求17的方法，其中所述Spinactin基因簇的基因是噻唑啉酰亚胺还原酶基因。
23.通过根据权利要求10的方法产生的修饰的刺糖多孢菌生物体。
24.根据权利要求23的修饰的刺糖多孢菌生物体，其中所述生物体包含参与多杀菌素生物合成的转基因。
25.根据权利要求24的修饰的刺糖多孢菌生物体，其中所述参与多杀菌素生物合成的转基因稳定整合入生物体的基因组DNA中稳定整合所述核酸的位点上。
26.产生多杀菌素的方法，所述方法包括：
提供权利要求23的修饰的刺糖多孢菌生物体；和
在发酵条件下培养所述生物体，
由此产生至少一种多杀菌素。
27.修饰的刺糖多孢菌生物体，其包含破坏Spinactin生物合成的手段，其中所述生物体能够在不产生显著量的Spinactin的条件下产生多杀菌素A和/或多杀菌素D。
28.产生多杀菌素的方法，所述方法包括：
提供权利要求27的修饰的剌糖多孢菌生物体；和
在发酵条件下培养所述生物体，
由此产生至少一种多杀菌素。
29.具有式(I)的化合物：
Figure FSA00000865196200041
或其盐或N-氧化物。
30.权利要求29的化合物，其中化合物在甲醇中包含具有与表1所列那些基本上相同的特征的NMR谱。
31.分离权利要求29的化合物的方法，所述方法包括：
在发酵条件下培养刺糖多孢菌菌株NRRL18395；
从刺糖多孢菌发酵培养物获得包含次级代谢物的技术材料，在包含等量(1∶1)甲醇和水的溶液中形成所述技术材料的浆；
并且过滤所述浆，从而形成包含富集量的所述化合物的滤液；然后通过制备型液相层析从多杀菌素因子分离化合物(I)。
32.分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同一性的核苷酸序列，能够与SEQ ID NO：2杂交的核苷酸序列，它们的补体(complement)，和它们的反向补体(reverse complement)。
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