CN102787152A - 用氧结合蛋白提高多杀菌素产生 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用氧结合蛋白提高多杀菌素产生。本发明描述了将多核苷酸整合至可用于产生杀虫剂的刺糖多孢菌(S.spinosa)菌种的染色体DNA中，其整合体，以及该整合体的用途。本发明包括氧结合蛋白VHb的稳定整合和表达，所述稳定整合和表达导致提高的多杀菌素产生。

Description

用氧结合蛋白提高多杀菌素产生

优先权要求

本申请要求2011年5月3日提交的美国专利申请序列号13/100,202“用氧结合蛋白提高多杀菌素产生(ENHANCING SPINOSYN PRODUCTIONWITH OXYGEN BINDING PROTEINS)”的申请日的权益。

技术领域

本发明用于分子遗传学技术领域，其中可将基因整合至刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)的染色体中。一种代谢工程方法包括氧结合蛋白诸如血红蛋白基因在染色体DNA区内的整合和表达，所述整合和表达导致提高的多杀菌素产生，同时不对刺糖多孢菌的生长或者其它期望代谢特征产生负面影响。

背景技术

如美国专利5,362,634所披露，发酵产品A83543是由刺糖多孢菌产生的相关化合物的家族。该家族的已知成员已被称为因子或组分，并且各自给予标识字母代号。这些化合物在下文中称为多杀菌素A、B等。多杀菌素化合物可用于控制蜘蛛、线虫和昆虫，具体为鳞翅目(Lepidoptera)和双翅目(Diptera)物种。这些化合物被认为是环境友好的，具有吸引人的毒理学概貌(toxicological profile)。

天然产生的多杀菌素化合物是由21碳四环内酯组成的大环内酯类，其包括两个脱氧糖的附接：中性糖(鼠李糖)和氨基糖(福乐糖胺)(参见Kirst等人，(1991)。若不存在所述氨基糖，则将所述化合物称为假甙元A、D(pseudoaglycone of A,D)等；而若不存在所述中性糖，则将所述化合物称为逆假甙元A、D(reverse pseudoaglycone of A,D)等。更优选的命名为将这些假甙元称为多杀菌素A 17-Psa、多杀菌素D 17-Psa等，而将这些逆假甙元称为多杀菌素A 9-Psa、多杀菌素D 9-Psa等。

天然产生的多杀菌素化合物可经发酵由刺糖多孢菌菌株NRRL 18395,18537,18538,18539,18719,18720,18743和18823以及它们衍生物制备。这些培养物已经进行保藏，并成为美国北方农业研究所保藏中心(the MidwestArea Northern Regional Research Center,Agricultural Research Service,UnitedStates Department of Agriculture,1815 North University Street,Peoria,Ill.,61604)的原种培养物保藏的一部分。

美国专利5,362,634及对应的欧洲专利0375316B1涉及多杀菌素A、B、C、D、E、F、G、H和J。这些化合物据称通过培养选自NRRL 18395、NRRL18537、NRRL 18538和NRRL 18539的新型微生物刺糖多孢菌的菌株产生。

WO 93/09126涉及多杀菌素L、M、N、Q、R、S和T。其中还讨论了两种产生多杀菌素J的菌株：NRRL 18719和NRRL 18720，以及产生多杀菌素Q,R,S和T的菌株：NRRL 18823。

WO 94/20518和美国专利5,6704,486涉及多杀菌素K、O、P、U、V、W和Y以及它们的衍生物。其中还讨论了产生多杀菌素K的菌株NRRL18743。

产生多杀菌素化合物的挑战来自需要鉴定和验证刺糖多孢菌基因组内的中性位点，其中含有基因表达盒的多核苷酸可进行整合和稳定表达。引入的基因表达盒可含有生物合成基因，该生物合成基因提供一种产生可具有不同的杀虫活性谱的多杀菌素新型衍生物的方法，或者除了会赋予现有的多杀菌素产生菌株新的有益特性的其它基因表达盒之外，还能提高多杀菌素的滴度水平的基因表达盒。

鉴定和引入导致多杀菌素化合物的产生提高的基因会是有利的。

发明内容

本发明涉及将多核苷酸整合至可用于产生杀虫剂的刺糖多孢菌菌种的染色体DNA中的方法，其整合体，以及该整合体的用途。

本发明还提供含有多杀菌素增强基因的遗传修饰的宿主细胞，所述多杀菌素增强基因整合至刺糖多孢菌基因组中，这导致多杀菌素产生的提高。如此，刺糖多孢菌滴度水平导致摇瓶发酵中A/D产生或J/L产生的改善。

本发明还提供用于将氧结合基因整合在刺糖多孢菌内的方法。本发明的一种具体实施方案利用VHb基因编码的多杀菌素增强性质，其中VHb基因表达盒携带在刺糖多孢菌的染色体上。VHb基因的表达导致改善和提高的多杀菌素产生。同样，刺糖多孢菌的摇瓶发酵中的A/D多杀菌素产生得以提高。

附图说明

图1描述包含977bp合成DNA片段和pJ201的质粒pDAB109000。

图2描述将血红蛋白基因表达盒克隆至pIJ773中得到的质粒pDAB109001。

具体实施方式

在刺糖多孢菌的染色体内的整合基因存在多种用途。天然或异源的克隆基因可用于改善多杀菌素的产率以及产生新的多杀菌素。改善的产率可通过将在该菌株中任何限速的酶的基因的复制拷贝整合至该菌株的基因组中得到。在生物合成途径在特定突变体菌株中由于缺乏所需的酶而阻断的情形中，期望的多杀菌素的产生可通过整合所需基因的拷贝得到恢复。在生物合成途径破坏的情形中，可生成不同的前体菌株。

本申请示例说明了在刺糖多孢菌中透明颤菌属(Vitreoscilla)血红蛋白基因序列(在下文中称为“VHb”)的过表达导致多杀菌素产生的提高。对于刺糖多孢菌菌株的改善，通过将基因表达盒整合至刺糖多孢菌的基因组中进行多核苷酸的稳定转化。基因的整合通过利用一部分染色体DNA和插入元件的同源重组完成。可将染色体DNA插入刺糖多孢菌基因组中。基于该重组以及其应用的结果，将aac(3)IV和VHb基因表达盒分别在遮蔽蛋白聚酮合成酶(obscurin polyketide synthase)(PKS)基因座处整合至刺糖多孢菌的染色体中，导致天然基因obsA的失活。

本文中采用下面定义，这些定义应该用于解释权利要求和说明书。

本申请在本发明的要素或组分前所用的不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”意在关于该要素或组分的发生(即，出现)次数而言是非限制性的。因此，"一个"或"一种"应理解为包括一或者至少一个(种)，并且所述要素或者组分的单数形式也包括复数，除非数字明显是指单数的。

本申请所用的术语“包含”和“包括”是指存在如权利要求中所述的特性、整数、步骤或者组分，但是它并不排除存在或者加入一种或多种其它特性、整数、步骤、组分或它们的组。这意味着“包含”或“包括”一列要素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或者装置不仅仅限于这些要素，而是可包括未清楚列出的或者其固有的其它要素。本申请所用的“或”是指兼取的和择一的“或者”。例如，下面任一种满足A或B：A为是(或存在)而B为否(或不存在)，A为否(或不存在)而B为是(或存在)，以及A和B均为是(或存在)。

本申请所用术语"约"修饰本发明的或者所使用的成分或反应物的数量，其是指，例如通过在现实世界中用于配制浓缩物或者使用溶液的典型的测量和液体处理步骤；通过这些操作中非故意的失误；通过在用于制备组合物或实施方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等等可出现的数量差异。术语"约"还涵盖因由具体初始混合物得到的组合物的不同平衡条件引起的不同的量。不论被术语"约"修饰与否，权利要求都包括这些数量的等价物。

本申请所用术语"发明"或"本发明"是非限制性术语，其意在涵盖所有如说明书所描述和权利要求所述的可能的变体。

本申请所用的术语"多肽"和"肽"可互换使用，指两个或更多个氨基酸通过肽键连接在一起的聚合物。一方面，该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化，等等。包括在该定义内的是例如，包含一个或多个氨基酸类似物或者标记氨基酸的肽以及肽模拟物。肽可包含L-氨基酸。

本申请所用的术语"感兴趣的肽"、"POI"、"基因产物"、"目标基因产物"和"目标编码区基因产物"是指通过重组表达的外源基因编码的所期望的异源肽/蛋白质产物。感兴趣的肽可包括任何肽/蛋白质产物，包括但不限于蛋白质、融合蛋白、酶、肽、多肽和寡肽。感兴趣的肽的大小为2~398个氨基酸。

本申请所用术语"遗传构建体"是指可用于调节生物体的基因型或表型的一系列连续的核酸。遗传构建体的非限制性实例包括但不限于核酸分子，以及开放阅读框架、基因、表达盒、载体、质粒等。

本申请所用术语"内源基因"是指在生物体的基因组中处于其天然位置的天然基因。

本申请所用"外源基因"是指通常不见于宿主生物体中的基因，但是其通过基因转移引入宿主生物体中。外源基因可包括插入非天然生物体中的天然基因，或者嵌合基因。

本申请在具体的生物体/基因组中针对序列的术语"异源"表示该序列源于外源物种，或者若源于相同的物种则通过故意的人工干预从其天然形式进行了组成和/或基因组基因座的实质性修饰。因此，例如，异源基因表达是指来自一种生物体/基因组的基因通过将其置于不同的生物体/基因组的基因组中进行表达的过程。

本申请所用术语"重组体"是指人工组合两种本来是分开的(otherwiseseparated)序列片段，例如，通过化学合成或者通过用遗传工程技术对分离的核酸片段进行操作。"重组体"还涉及通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者如此修饰的细胞衍生得到的细胞，但是不涵盖因自然发生事件(例如，自发突变、天然转化、天然转导、天然转座)而改变的细胞或载体，诸如那些未经故意的人为干预而发生改变的细胞或载体。

术语"遗传工程(化)的"或者"遗传改变的"是指在活的生物体中的遗传物质结构的科学改变。它涉及产生和使用重组体DNA。更具体而言，它用于描述从天然存在的生物体区分的遗传工程化或修饰的生物体。遗传工程化可通过本领域已知的多种技术诸如例如基因置换，基因扩增，基因破坏，转染，转化使用质粒、病毒或其它载体实现。遗传修饰的生物体例如遗传修饰的微生物也常常称之为重组生物，例如重组微生物。

本申请所用术语“破坏的”或“破坏”在涉及基因时是指经遗传工程化或者经改变基因活性的天然原因而经过操作或改变。所述基因活性可提高或降低。此外，所述破坏可消除蛋白质的功能。为了促进这样的下降，可减少基因拷贝数，例如通过基因的表达不足或破坏。如果所述基因的转录水平与野生型基因相比下降，那么该基因被认为是"表达不足的"。这可通过例如Northern印迹分析(其对作为基因表达指标的mRNA进行定量)测量。如本申请中所使用的，若与野生型基因产生的mRNA的量相比产生的mRNA的量下降了至少1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%，则基因是表达不足的。或者，弱的启动子可用于引导多核苷酸的表达。在另一实施方案中，该基因上游的核糖体结合位点、调节区和/或启动子可发生改变以实现降低的表达。所述表达也可通过缩短信使RNA的相对半寿期而降低。在另一实施方案中，多肽本身的活性可通过利用多肽氨基酸序列中的一个或多个降低活性的突变得到降低。例如，改变多肽对其相应底物的亲和力可导致降低的活性。同样地，可缩短多肽的相对半寿期。无论是基因表达降低还是活性降低的任一情形中，所述降低可通过改变细胞培养基的组成和/或培养所用方法来实现。本申请所用的"降低的表达"或"降低的活性"是指与野生型蛋白质、多核苷酸、基因；或者在多核苷酸或多肽减少之前存在的蛋白质的活性和/或浓度相比，减少至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%。VHb蛋白的活性也可通过使该蛋白与其活性的特异性或一般性抑制剂接触来降低。术语"降低的活性"、"减少或消除的活性"在本申请中可互换使用。

在另一实施方案中，该基因上游的核糖体结合位点、调节区和/或启动子可发生改变以实现提高的表达。过表达也可通过增加信使RNA的相对半寿期而降低。在另一实施方案中，多肽本身的活性可通过利用多肽氨基酸序列中的一个或多个提高活性的突变来提高。例如，改变多肽对其相应底物的亲和力可导致活性提高。同样地，可增加多肽的相对半寿期。在基因过表达或活性提高的任一情形中，所述提高可通过改变细胞培养基的组成和/或培养所用的方法来实现。本申请所用的"过表达"或"提高的活性"是指与野生型蛋白质、多核苷酸、基因；或者在多核苷酸或多肽减少之前存在的蛋白质的活性和/或浓度相比，提高至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超过500%。VHb蛋白的活性也可通过使该蛋白与其活性的特异性或一般性抑制剂接触来提高。术语"过表达"和"提高的活性"在本申请中可互换使用。

表述"调控序列"通指启动子序列、核糖体结合位点、转录终止序列、上游调节域、增强子，等等，它们共同提供编码序列在宿主细胞中的转录和翻译。并不需要所有的这些调控序列总是存在于重组体载体中，只要所期望的基因能转录和翻译即可。

"重组"是指在两个DNA或RNA分子之间DNA或RNA序列片段的再分配(reassortment)。"同源重组"发生在依靠各自DNA分子中存在的同源或互补核苷酸序列杂交的两个DNA分子之间。

术语"严格条件"或者"在严格条件下杂交"是指在该条件下探针会优先与其靶亚序列杂交，而较少程度或者根本不与其它序列杂交。在核酸杂交实验例如Southern杂交和Northern杂交的上下文中，"严格杂交"和"严格杂交洗涤条件"是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下不同。核酸杂交的广泛指导参见Tssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,Elsevier,New York。一般而言，高严格杂交和洗涤条件选择为比特异性序列在指定的离子强度和pH下的热解链点(T_m)低约5°C。T_m是在指定的离子强度和pH下50%的靶序列杂交至完美匹配的探针的温度。非常严格条件选择为等于针对具体探针的T_m。

在Southern或Northern印迹中在滤纸上具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交的严格杂交条件的一个实例是50%甲酰胺与1mg肝素在42°C，其中杂交进行过夜。高严格洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl，在72°C达约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是在65°C用0.2xSSC洗涤持续15分钟(参见Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning--A LaboratoryManual(2nd ed.)Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborPress,NY，就SSC缓冲液描述而言)。常常，在高严格洗涤之前进行低严格洗涤以除去背景探针信号。用于例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格洗涤的一个实例是在45°C用1xSSC持续15分钟。用于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格洗涤的一个实例是在40°C用4-6xSSC持续15分钟。一般而言，在具体的杂交测定中观察到相对于不相关探针的2x(或更高)的信噪比表明检测到特异性杂交。如果核酸编码的多肽是基本上相同的，那么在严格条件下未彼此杂交的核酸仍然是基本上相同的。这发生在例如，核酸的拷贝是使用遗传编码所允许的最大密码子简并产生的时。

本发明还涉及分离的多核苷酸，其可在严格条件下，优选在高严格条件下，与本发明的多核苷酸杂交。

本申请所用术语"杂交"意在描述用于杂交和洗涤的条件，在该条件下彼此至少约50%、至少约60%、至少约70%、更优选至少约80%、甚至更优选至少约85%~90%、最优选至少95%同源的核苷酸序列通常保持彼此杂交。

在一种实施方案中，本发明核酸是与本申请所示的核酸序列或其互补物至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同源的。

严格杂交条件的另一个非限制性实例是在约45°C在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在1xSSC,0.1%SDS中在50°C、优选在55°C、更优选在60°C且甚至更优选在65°C进行一次或多次洗涤。

高严格条件可包括使用标记的DNA探针诸如地高辛(DIG)标记的DNA探针，在42°C温育几天诸如2~4天的时间，然后进行一次或多次在2xSSC,0.1%SDS中在室温的洗涤以及一次或多次在0.5xSSC,0.1%SDS或者0.1xSSC,0.1%SDS中在65-68°C的洗涤。具体地，高严格条件包括例如2小时至4天的在42°C的温育，其中使用DIG标记的DNA探针(例如通过使用DIG标记系统制备；Roche Diagnostics GmbH,68298 Mannheim,Germany)，在溶液诸如包含或者不含100μg/ml鲑精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnostics GmbH)，或者包含50%甲酰胺、5xSSC (150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02%十二烷基硫酸钠、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封闭剂的溶液(Roche Diagnostics GmbH)中，然后在2xSSC和0.1%SDS中在室温洗涤滤纸两次持续5~15分钟，接着在0.5xSSC和0.1%SDS或者0.1xSSC和0.1%SDS中在65-68°C洗涤两次持续15~30分钟。

在一些实施方案中，在高严格条件下与本发明核苷酸序列杂交的本发明的分离的核酸分子可对应于天然存在的核酸分子。本申请所用的"天然存在的"核酸分子是指具有自然界中存在的核苷酸序列(例如，编码天然蛋白质)的RNA或DNA分子。

技术人员会知道就严格和高严格杂交条件而言适用什么条件。关于所述条件的另外指导在本领域中是易于得到的，例如在Sambrook等人，1989,Molecular Cloning，A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,N.Y.；以及Ausubel等人，(eds.),1995,Current Protocols in Molecular Biology,(John Wiley&Sons,N.Y.)中。

常规命名在本申请中用于描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端是5′端，双链多核苷酸序列的左手方向称为5′方向。5′到3′添加核苷酸至新生RNA转录物的方向称为转录方向。具有与mRNA相同的序列的DNA链称为"编码链"；在DNA链上具有与由该DNA转录的mRNA相同的序列的并且位于RNA转录物的5′端的5′的序列称为"上游序列"；在DNA链上具有与RNA相同的序列的并且位于编码RNA转录物的3′端的3′的序列称为"下游序列"。

包含用于多杀菌素生物合成酶的基因的DNA的克隆片段使编码在产生多杀菌素中的限速酶的基因得以复制。这可在编码活性中的一种限制期望的多杀菌素合成的任一情形中用于提高产量。在与多杀菌素聚酮合成酶连锁的基因通过将包含其的粘粒整合至刺糖多孢菌中得以复制时，观察到多杀菌素A/D的产量提高(Madduri等人，2001)。在另一实例中，这种类型的产量提高在新霉素链霉菌(Streptomyces fradiae)发酵中通过复制编码将大菌素(macrocin)转化成泰乐菌素(tylosin)的限速甲基转移酶的基因得以实现(Baltz等人，1997)。

特异性中间体(或其天然衍生物)可通过其中编码用于多杀菌素生物合成的酶的某些基因已经被破坏的刺糖多孢菌突变菌株合成。所述菌株可通过经同源重组整合包含目标基因的内在片段的诱变质粒产生。在质粒整合后，形成生物合成基因的两个不完全拷贝，由此消除其编码的酶功能。该酶的底物或其一些天然衍生物应在突变菌株发酵时积聚。这样的策略有效地用于生成产生新型6-去氧红霉素衍生物的红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)菌株(Weber&McAlpine,1992)。

所述菌株可通过下面方法生成：经双交换同源重组将目标区与包含在目标区两侧的未突变序列之间的新片段的诱变质粒进行对换。该杂交基因可产生具有改变功能(缺乏活性或者从事新的酶转化)的蛋白质。新的衍生物可在突变菌株的发酵时积聚。这样的策略已用于生成产生新型脱水红霉素衍生物的红色糖多孢菌菌株(Donadio等人，1993)。

克隆多杀菌素生物合成基因及相关的ORF，并确定各自的DNA序列。克隆的基因和ORF在下文中指定为spnA、spnB、spnC、spnD、spnE、spnF、spnG、spnH、spnI、spnJ、spnK、spnL、spnM、spnN、spnO、spnP、spnQ、spnR、spnS、ORFL15、ORFL16、ORFR1、ORFR2、刺糖多孢菌gtt、刺糖多孢菌gdh、刺糖多孢菌epi和刺糖多孢菌kre。

刺糖多孢菌产生9种紧密相关的化合物的混合物，通称为“多杀菌素”。在该混合物中，多杀菌素A和D(称为多杀霉素(spinsoad))是主要组分并且对关键昆虫目标具有最高活性。多杀菌素J和L(多杀菌素混合物中的两种次要组分)是乙基多杀菌素(spinetoram)(第二代多杀菌素杀虫剂)的前体。

多杀菌素(Spinosad)是Dow AgroSciences(Indianapolis,Ind.)生产的杀虫剂，其主要包含约85%多杀菌素A和约15%多杀菌素D。多杀菌素A和D是刺糖多孢菌发酵产生的天然产物，如美国专利5,362,634中所披露。多杀菌素是几种可从Dow AgroSciences商购的杀虫制剂的活性成分，所述杀虫制剂包括TRACER^TM、SUCCESS^TM、SPINTOR^TM和CONSERVE^TM昆虫控制产品。例如，TRACER产品由约44%~约48%的多杀菌素(w/v)或者约4磅多杀菌素/加仑构成。呈颗粒和液体制剂形式的多杀菌素化合物对于控制蜘蛛、线虫和昆虫(具体为鳞翅目、缨翅目(Thysanopetera)和双翅目物种)具有确定的效用。多杀菌素A和D在本申请中也称为多杀菌素A/D。

乙基多杀菌素是5,6-二氢-3′-乙氧基多杀菌素J(主要组分)和3′-乙氧基多杀菌素L的混合物，其由Dow AgroSciences生产。该混合物可通过下面方法制备：乙氧基化多杀菌素J和多杀菌素L的混合物，然后氢化。多杀菌素J及其3′-乙氧基衍生物的5,6双键的氢化比多杀菌素L及其3′-乙氧基衍生物的5,6双键的氢化容易得多，这是由于在多杀菌素L及其3′-乙氧基衍生物中C-5的甲基的空间位阻。参见美国专利6,001,981。多杀菌素J和L在本申请中也称为多杀菌素J/L。

在本申请中已经证实VHb的过表达在刺糖多孢菌中导致多杀菌素产生的提高。氧载体蛋白VHb的表达导致在含氧量低的生长条件下同二聚体血红蛋白水平的升高(Zhang等人，2007)。在血红蛋白中，VHb具有平均的氧结合速率常数和相当高的氧解离速率常数(高于其它血红蛋白数百倍)。这表明VHb能比所有其它血红蛋白更容易地释放结合的氧(Zhang等人，2007)。已有显示，透明颤菌属血红蛋白基因在异源宿主中的表达常常在氧有限条件下提高细胞生长和蛋白质产生(Khosla&Bailey,1988；Khosla等人，1990)。

VHb在几种放线菌(Actinomyces)菌株中的表达导致抗生素产生的提高，包括金霉素、莫能菌素、红霉素和放线菌紫素(Zhang等人，2007；Magnolo等人，1991)。表达VHb的重组天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)菌株在低DO水平下(DO低于空气饱和度的5%)比野生型菌株多产生十倍的放线菌紫素(Magnolo等人，1991)。此外，由表达VHb的重组菌株进行的放线菌紫素产生较少受通气条件影响。尽管红霉素产生一般不被认为是DO水平敏感的(只要该DO水平高于生长所需的最低水平即可)，但是VHb在工业上生产红霉素的菌株中的表达显著地提高了红霉素滴度(从4.25g/L至7.25g/L)同时在10-15升规模的分批补料生物反应器发酵条件下降低了生物质积聚(Brünker等人，1997；1998；Minas等人，1998)。

本发明的实施方案提供遗传修饰的宿主细胞，其含有整合至刺糖多孢菌基因组中的多杀菌素增强基因。所述增强基因可编码氧结合蛋白。而且，该氧结合蛋白可以是任何与氧结合的蛋白质，具体是那些与氧可逆结合的蛋白质诸如珠蛋白。优选的氧结合蛋白是那些能在刺糖多孢菌中提高多杀菌素产生的氧结合蛋白。

可用于本发明的氧结合蛋白包括但不限于透明颤菌属血红蛋白(VHb)、富养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)黄素血红素蛋白(flavohemoprotein)、马心肌红蛋白、大肠杆菌血红素蛋白、枯草芽孢杆菌血红素蛋白、酵母黄素血红蛋白、大豆豆血红蛋白、羽扇豆豆血红蛋白和抹香鲸肌红蛋白。如上所指出，所述氧结合蛋白也可以是对于产生多杀菌素的生物体而言内源性的氧结合蛋白。

编码多种多样的氧结合蛋白的基因已经被克隆并且它们的序列得到确定。例如，已知的可用于本发明的珠蛋白的多核苷酸序列包括但不限于那些编码蓝细菌肌红蛋白(Potts等人，1992,Science 256:1690-1692)、不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis)血红蛋白(Gambacurta等人，1993,FΕBS Lett.330:90-94)、Aplysia limacina肌红蛋白(Cutruzzola等人，1996,Biochem.J.314:83-90)、蛔虫(Ascaris)血红蛋白(Sherman等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:11696-11700)、伪新地线虫(Pseudoterranova decipiens)血红蛋白(Dixon等人，1991,Natl.Acad.Sci.USA 88:5655-5659和Dixon等人，1992,J.Mol.Εvol.35:131-136)、尾草履虫(Paramecium caudatum)血红蛋白(Yamauchi等人，1992,Biochem.Biophvs.Res.Commun.182:195-200)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)血红素蛋白(David等人，1988,Cell 54:671-683)以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Shimada等人，1989,J.Biochem.105:417-422)的多核苷酸序列。尤其适用于本发明的是那些具有相对高的k_off速率的氧结合蛋白诸如VHb(k_off 5600s^-1；Orii and Webster,1986,J.Biol.Chem.261:3544-3547)或者具有相对低的氧亲和力的氧结合蛋白诸如马心肌红蛋白(KD 0.79μM；Wittenberg等人，1985,in nitrogen fixation research progress.H.J.Εvand等人，Eds.Martinus Nijhoff Publishers,Dordrecht,p.354)。因此，优选的氧结合蛋白可以是那些针对氧的k_off速率大于10s^-1、更优选大于100s^-1的蛋白质，或者针对氧的K_D大于0.5μM的蛋白质，尽管本领域技术人员会理解速率常数在这些参数之外的氧结合蛋白也是可用的。如前面所指出，那些优选的氧结合蛋白包括珠蛋白诸如血红蛋白、肌红蛋白和豆血红蛋白。许多种氧结合蛋白(包括珠蛋白)的性质在文献中已有披露。此外，确定蛋白质诸如珠蛋白的氧结合性质的技术是本领域技术人员所熟知的，且无需过度实验就可进行。

如前面所指出，一种用于本发明的这样的氧结合蛋白是VHb(如本申请中通过实施例描述)。VHb基因的完整序列描述在美国专利5,049,493中。与氧结合的VHb突变体也在本发明的范围内。

突变体包括但不限于"功能多态性"，在本申请中使用的"功能多态性"是指基因的碱基对序列的变化，该变化导致由该基因编码的蛋白质的活性的定性或定量变化(例如，活性特异性的变化；活性水平的变化)。术语"功能多态性"包括突变、缺失和插入。

一般而言，检测感兴趣的多态性的步骤可通过如下方法进行：从来源收集包含DNA的生物样品，然后确定在该生物样品中包含所感兴趣的多态性的DNA的存在或缺失。

确定编码具体突变的DNA的存在或缺失可借助用合适的可检测基团标记的寡核苷酸探针和/或通过扩增反应诸如聚合酶链式反应或连接酶链式反应(该扩增反应的产物然后可用标记的寡核苷酸探针或者多种其它技术检测)进行。多种不同的寡核苷酸探针测定形式是已知的，其可用于实施本发明。参见例如，Wahl等人的美国专利4,302,204；Falkow等人的美国专利4,358,535；Ranki等人的美国专利4,563,419；以及Stavrianopoulos等人的美国专利4,994,373。

扩增选定或目标核酸序列可通过任何适宜方式进行。总体参见Kwoh等人，Am.Biotechnol.Lab.8,14-25(1990)。适宜的扩增技术的实例包括但不限于聚合酶链式反应、连接酶链式反应、链置换扩增(总体参见G.Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,392-396(1992)；G.Walker等人，Nucleic AcidsRes.20,1691-1696(1992))、基于转录的扩增(参见D.Kwoh等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 86,1173-1177(1989))、自动维持序列复制(或"3SR")(参见J.Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1874-1878(1990))、Qβ复制酶系统(参见P.Lizardi等人，BioTechnology 6,1197-1202(1988))、基于核酸序列的扩增(或"NASBA")(参见R.Lewis,Genetic Engineering News 12(9),1(1992))、修复链反应(或"RCR")(参见R.Lewis,supra)以及自返式DNA扩增(或"BDA")(参见R.Lewis,supra)。聚合酶链式反应通常是优选的。

聚合酶链式反应(PCR)可根据已知的技术进行。例如参见美国专利4,683,195；4,683,202；4,800,159和4,965,188。一般而言，PCR涉及，首先针对待检测特异性序列的每条链用一种寡核苷酸引物在杂交条件下处理核酸样品(例如，在热稳定的DNA聚合酶存在下)，从而合成与各核酸链互补的各引物的延伸产物，其中各引物和与其杂交的特异性序列的各链是充分互补的，从而由各引物合成的延伸产物当与其互补物分离时可用作其它引物的延伸产物的合成用模板，然后如果存在待检测的序列，则在变性条件下处理样品以将引物延伸产物与其模板分离。这些步骤循环重复直至达到所期望的扩增度。扩增序列的检测可通过如下方法进行：向反应产物中加入能与该反应产物杂交的寡核苷酸探针(例如，本发明的寡核苷酸探针)，该探针携带可检测的标记，然后根据已知技术或者通过直接在凝胶上显影检测该标签。所述探针可以是5~500个核苷酸长，优选5~250个，更优选5~100个或5~50个核酸。当PCR条件允许所有的等位基因类型的扩增时，所述类型可通过用等位基因特异性探针进行杂交、通过限制内切核酸酶消化、通过在变性梯度凝胶上电泳或者其它技术来区分。

连接酶链式反应(LCR)也可根据已知技术进行。例如，参见R.Weiss,Science 254,1292(1991)。一般而言，该反应用两对寡核苷酸探针进行：一对与待检测序列的一条链结合；另一对与待检测序列的另一条链结合。每对一起与其对应的链完全重叠。该反应如下进行：首先，变性(例如，分开)待检测序列的各链，然后使各链与两对寡核苷酸探针在热稳定的连接酶存在下反应从而使各对寡核苷酸探针连接在一起，而后分离反应产物，接着循环重复该过程直至序列扩增至所期望的程度。然后检测可与上面针对PCR描述类似的方式进行。

DNA扩增技术诸如前述技术可涉及使用一个探针、一对探针或者两对探针，所述探针与包含功能多态性的DNA特异性结合，但是不与不含功能多态性的DNA特异性结合。或者，所述探针或者探针对既可与包含又可与不包含功能多态性的DNA结合，但是产生或者扩增其中可检测差异可得到确定的产物(例如，延伸产物)(例如，较短产物，其中功能多态性是缺失突变)。所述探针可根据标准技术由与VHb连锁的基因中的或与所述基因相关的已知DNA序列或者由可根据标准技术由所述基因产生的序列得到。

会理解的是本申请所描述的检测步骤可以直接或间接地进行。间接测定等位基因类型的其它方式包括测量与具体的功能多态性相关联的多态标志，如VNTR (数目可变的串联重复)所示例说明的。

分子生物学包括分析核酸和蛋白质序列的广泛多样的技术。这些技术和方法中的许多种构成临床诊断测定和试验的基础。这些技术包括核酸杂交分析、限制酶分析、遗传序列分析以及核酸和蛋白质的分离和纯化(参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2Ed.,Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)。

这些技术中的大多数涉及对大量样品进行多个操作(例如，移液、离心和电泳)。它们常常是复杂和耗时的，并且通常要求高度的准确性。多种技术因缺乏灵敏度、特异性或重现性而限制了其应用。

核酸杂交分析通常涉及用过量探针DNA在相对大量的复杂非靶核酸中检测非常少量的特异性靶核酸(DNA或RNA)。样品中核酸复杂性的降低有助于检测低拷贝数(即10,000~100,000)的核酸靶标。DNA复杂性的降低通过扩增靶核酸序列在某种程度上得以实现。(参见M.A.Innis等人，PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,1990,Spargo等人，1996,Molecular&Cellular Probes，关于SDA扩增)。这是因为靶核酸的扩增导致靶核酸序列相对于非靶序列的巨大数量，从而改善后续的靶杂交步骤。

杂交步骤涉及将制备的DNA样品与特异性报道探针在设定的对于靶DNA序列和探针之间发生杂交最优的条件下接触。杂交可以以多种形式中的任一种进行。例如，多样品核酸杂交分析已经以多种滤纸和固体支持物形式进行(参见Beltz等人，Methods in Enzymology,Vol.100,Part等人，Eds.,Academic Press,New York,Chapter 19,pp.266-308,1985)。一种形式(所谓的“点印迹”杂交)涉及将靶DNA非共价连接至滤纸，然后后续杂交至放射性同位素标记的探针。在过去二十年，"点印迹"杂交得到广泛应用，在这段时间开发了多种版本(参见Anderson and Young,in Nucleic Acid Hybridization-APractical Approach,Hames and Higgins,Eds.,IRL Press,Washington,D.C.Chapter 4,pp.73-111,1985)。例如，点印迹方法得到发展用于基因组突变的多重分析(Nanibhushan等人的EPA 0228075)以及用于检测重叠克隆和构建基因组图谱(Evans的美国专利5,219,726)。

进行多样品核酸杂交分析的另外技术包括微形式化多路或者矩阵装置(例如，DNA芯片)(参见M.Barinaga,253Science,pp.1489,1991；W.Bains,10Bio/Technology,pp.757-758,1992)。这些方法通常将特异性DNA序列连接到固体支持物的非常小的特异性区，诸如DNA芯片的微孔。这些杂交形式是常规的"点印迹"和"夹心"杂交系统的微量版。

微形式化杂交可用于进行"通过杂交测序"(SBH)(参见M.Barinaga,253Science,pp.1489,1991；W.Bains,10Bio/Technology,pp.757-758,1992)。SBH使用所有可能的n-核苷酸寡聚物(n-聚体)来鉴定未知DNA样品中的n-聚体，随后通过算法分析进行比对排列来产生DNA序列(参见Drmanac美国专利5,202,231)。

存在两种进行SBH的形式。第一形式涉及在支持物上生成所有可能的n-聚体的阵列，其随后用所有靶序列进行杂交。第二种形式涉及将靶序列连接至支持物上，其随后用可能的n-聚体探查。Southern (英国专利申请GB8810400,1988；E.M.Southern等人，13Genomics 1008,1992)提议使用第一形式来分析或者测序DNA。Southern使用PCR扩增的基因组DNA鉴定出已知的单点突变。Southern还描述在用于SBH的固体支持物上合成寡核苷酸阵列的方法。Drmanac等人(260Science 1649-1652,1993)使用第二形式来对几种短的(116bp)DNA序列测序。将靶DNA与膜支持物连接("点印迹"形式)。各滤纸用272标记的10聚体和1聚体寡核苷酸顺序地杂交。范围广泛的严格条件用于实现针对各种n-聚体探针的特异性杂交。使用0°C~16°C的温度，洗涤时间从5分钟至过夜不等。大多数探针需要在16°C的3小时的洗涤。滤纸必须暴露2~18小时以检测杂交信号。

一般而言，多种方法可用于检测和分析杂交事件。取决于用于标记DNA探针的报道基团(荧光团、酶、放射性同位素等)，检测和分析以荧光、量热、或放射自显影方式进行。通过观察和测量发出的辐射诸如荧光辐射或颗粒发射，可得到关于杂交事件的信息。即使当检测方法具有非常高的固有灵敏度时，杂交事件的检测由于非特异性结合物质的背景存在而是困难的。因此，杂交事件的检测依赖于如何能够进行特异性和灵敏性杂交。关于遗传分析，已经开发了几种试图提高特异性和灵敏度的方法。

遗传分析的一种形式是以说明单核酸多态性或("SNPs")为中心的分析。偏好使用SNP的因素是它们在人基因组中的高丰度(尤其与短串联重复(STR)相比)，它们常常位于基因的编码区或调节区内(其可影响蛋白质结构或者表达水平)，以及它们在从一代传至下一代时的稳定性(Landegren等人，GenomeResearch,Vol.8,pp.769-776,1998)。

SNP定义为存在于两个变体中并且最常见变体出现的机会小于99%的基因组中的任意位置。为了将SNP用作广泛的遗传标志，能容易、快速、准确、划算地对它们进行基因分型是关键。目前有多种技术可用于分型SNP(对于综述，参见Landegren等人，Genome Research,Vol.8,pp.769-776,(1998)，所有这些都需要靶扩增。它们包括直接测序(Carothers等人，BioTechniques,Vol.7,pp.494-499,1989)、单链构象多态性(Orita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.86,pp.2766-2770,1989)、等位基因特异性扩增(Newton等人，Nucleic Acid Research,Vol.17,pp.2503-2516,1989)、限制消化(Day and Humphries,Analytical Biochemistry,Vol.222,pp.389-395,1994)、以及杂交测定。在其最基础的形式中，杂交测定通过相对于匹配和错配的靶甄别短的寡核苷酸报道子而发挥作用。已经开发了多种针对基础方案的改编。这些包括连接酶链式反应(Wu and Wallace,Gene,Vol.76,pp.245-254,1989)和迷你测序(Syvanen等人，Genomics,Vol.8,pp.684-692,1990)。其它提高包括使用Taq DNA聚合酶的5'-核酸酶活性(Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.88,pp.7276-7280,1991)、分子信标(Tyagi and Kramer,Nature Biotechnology,Vol.14,pp.303-308,1996)、热变性曲线(Howell等人，Nature Biotechnology,Vol.17,pp.87-88,1999)和DNA"芯片"(Wang等人，Science,Vol.280,pp.1077-1082,1998)。

可用于区别SNP的另一现象是源自多靶特异性探针与单一靶的杂交的核酸相互作用能或者碱基堆积能(参见R.Ornstein等人，"An OptimizedPotential Function for the Calculation of Nucleic Acid Interaction Energies",Biopolymers,Vol.17,2341-2360(1978)；J.Norberg and L.Nilsson,BiophysicalJournal,Vol.74,pp.394-402,(1998)；以及J.Pieters等人，Nucleic AcidResearch,Vol.17,no.12,pp.4551-4565(1989))。在本发明中以独特形式使用该碱基堆积现象来提供高度敏感的Tm差异，从而允许直接检测核酸样品中的SNP。

其它方法也已经用于区分相关生物体中的核酸序列或者用于测序DNA。例如，Hogan等人的美国专利5,030,557披露单链靶核酸的二级和三级结构除了受到"探针"寡核苷酸的影响之外还可受到结合"辅助"寡核苷酸的影响，导致探针与靶核酸之间显示较高的Tm。然而，该应用在其方法上限制于将杂交能仅用于改变自退火RNA链的二级和三级结构，其若未改变则往往阻碍探针杂交至靶。

关于DNA测序，例如K.Khrapko等人，Federation of EuropeanBiochemical Societies Letters,Vol.256,no.1,2,pp.118-122(1989)披露了连续堆积杂交导致双链体稳定化。此外，J.Kieleczawa等人，Science,Vol.258,pp.1787-1791(1992)披露了使用六聚体的连续串来引发DNA合成，其中该连续串表现出使引发稳定。类似地，L.Kotler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.90,pp.4241-4245,(1993)披露了在通过使用六聚体和五聚体寡核苷酸模块的DNA测序反应引发中的序列特异性。此外，S.Parinov等人，Nucleic AcidResearch,Vol.24,no.15,pp.2998-3004,(1996)披露了将碱基堆积寡聚物用于与被动DNA测序微芯片相关的DNA测序。此外，G.Yershov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.93,pp.4913-4918(1996)披露了SBH中的碱基堆积能在被动微芯片上的应用。在Yershov的示例中，10-聚体DNA探针锚定在微芯片的表面上，并杂交至与另外的短探针结合的靶序列，其组合似乎稳定了探针的结合。在该形式中，核酸序列的短片段可针对DNA测序得到阐明。Yershov还注意到在它们的系统中错配的去稳定化作用因使用较短的探针(例如，5-聚体)而提高。在DNA测序中使用上述短探针提供了沿着探查中的序列辨别错配存在的能力，而不是仅仅辨别在探针/靶杂交复合体的一个具体位置处的单一错配的能力。使用较长探针(例如，8-聚体、10-聚体和13-聚体寡聚物)就上述目的而言是较不实用的。

在核酸分析中使用碱基堆积的方法学的其它实例包括Lane等人的美国专利5,770,365，其中披露了一种捕获核酸的方法，该方法使用具有单链环和双链区的单分子捕获探针，所述探针与结合靶一起发挥作用从而通过堆积能稳定化双链体形成。

核苷酸序列可便利地通过根据常规方法的位点定向诱变进行修饰。或者，核苷酸序列可通过化学合成制备，包括但不限于通过使用寡核苷酸合成仪，其中寡核苷酸是基于期望的多肽的氨基酸序列设计的，并且优选地选择那些在将生成该重组多肽的宿主细胞中偏好的密码子。

新型多杀菌素也可在产生多杀菌素的生物体中通过克隆基因的诱变以及突变基因取代其未突变的对应物来产生。诱变可包括，例如：1)酮还原酶、脱水酶或烯酰还原酶(KR、DH或ER)域的缺失或失活，从而将这些功能中的一种或多种阻断并且该菌株产生具有带双键、羟基或酮基的内酯核的多杀菌素(双键、羟基或酮基不存在于多杀菌素A的核中)(参见Donadio等人，1993)；2)置换AT域从而将不同的羧酸引入内酯核中(参见Ruan等人，1997)；3)将KR、DH或ER域加入现有的PKS模块中，从而该菌株产生带饱和键、羟基或双键的内酯核的多杀菌素(所述饱和键、羟基或双键不存在于多杀菌素A的核中)；或者4)增加或减去完整的PKS模块，从而该环状内酯核具有较多或较少的碳原子数。杂交PKS可通过用异源PKS装载代替多杀菌素PKS装载来生成。例如，参见美国专利7,626,010。进一步注意到多杀菌素经由修饰与多杀菌素内酯主链相连的糖类，可包括鼠李糖和/或福乐糖胺部分的修饰或不同脱氧糖类的连接。西班牙的Salas小组证实了新型聚酮化合物可通过用不同糖分子取代现有的糖分子来产生。Rodriguez等人，J.Mol.MicrobiolBiotechnol.2000 Jul;2(3):271-6。本申请下文中的实施例有助于示例说明诱变用于产生具有修饰官能度的多杀菌素的用途。

来自多杀菌素基因簇区的DNA可用作鉴定同源序列的杂交探针。因此，此处克隆的DNA可用于从刺糖多孢菌基因文库中定位其它质粒，其与此处描述的区重叠并且还包括来自刺糖多孢菌的基因组中相邻区的先前未克隆DNA。此外，来自在此克隆的区的DNA可用于在其它生物体中鉴定不同但类似的序列。杂交探针通常是至少约20个碱基长并且是经标记的以允许检测。

出于多种目的，可在本发明中使用多种诱变。它们包括但不限于定位诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或者其他递归突变方法、嵌合构建、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用带缺口的双链体DNA的诱变，等等，或者它们的任意组合。其他合适的方法包括点错配修复、使用修复缺失型宿主菌株的诱变、限制-选择和限制-纯化、缺失诱变、通过全基因合成的诱变、双链断裂修复，等等。包括但不限于涉及嵌合构建的诱变也包括在本发明中。在一种实施方案中，诱变可通过天然存在的分子或者改变或突变的天然存在分子的已知信息指导，包括但不限于测序、序列比较、物理性质、晶体结构，等等。

本申请中存在的文本和实例描述了这些方法。补充信息可参见下面的出版物以及其中引用的参考文献：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis:an overview，Anal Biochem.254(2):157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioatemethod,Methods Mol.Biol.57:369-374(1996)；Smith,In vitro mutagenesis,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985)；Botstein和Shortle,Strategies and applications ofin vitro mutagenesis,Science 229:1193-1201(1985)；Carter,Site-directedmutagenesis,Biochem.J.237:1-7(1986)；Kunkel,The efficiency ofoligonucleotide directed mutagenesis,in Nucleic Acids和Molecular Biology(Eckstein,F.and Lilley,D.M.J.eds.,Springer Verlag,Berlin)(1987)；Kunkel,Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficientsite-specific mutagenesis without phenotypic selection,Methods in Enzymol.154,367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trp repressors with new DNA-bindingspecificities,Science 242:240-245(1988)；Methods in Enzymol.100:468-500(1983)；Methods in Enzymol.154:329-350(1987)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors:an efficientand general procedure for the production of point mutations in any DNAfragment,Nucleic Acids Res.10:6487-6500(1982)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors,Methods in Enzymol.100:468-500(1983)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis:a simple method using twooligonucleotide primers and a single-stranded DNA template,Methods inEnzymol.154:329-350(1987)；Taylor等人，The use ofphosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to preparenicked DNA,Nucl.Acids Res.13:8749-8764(1985)；Taylor等人，The rapidgeneration of oligonucleotide-directed mutations at high frequency usingphosphorothioate-modified DNA,Nucl.Acids Res.13:8765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein,Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage byphosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directedmutagenesis,Nucl.Acids Res.14:9679-9698(1986)；Sayers等人，Y-TExonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res.16:791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage ofphosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases inthe presence of ethidium bromide,(1988)Nucl.Acids Res.16:803-814；Kramer等人，The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutationconstruction,Nucl.Acids Res.12:9441-9456(1984)；Kramer和FritzOligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA,Methods in Enzymol.154:350-367(1987)；Kramer等人，Improved enzymatic invitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations,Nucl.Acids Res.16:7207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutations:a gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vitro,Nucl.Acids Res.16:6987-6999(1988)；Kramer等人，Point Mismatch Repair,Cell38:879-887(1984)；Carter等人，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors,Nucl.Acids Res.13:4431-4443(1985)；Carter,Improvedoligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors,Methods in Enzymol.154:382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff，Use of oligonucleotides togenerate large deletions,Nucl.Acids Res.14:5115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state ofsubtilisin,Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317:415-423(1986)；Nambiar等人，Totalsynthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein,Science223:1299-1301(1984)；Sakamar和Khorana,Total synthesis and expression of agene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-bindingprotein(transducin),Nucl.Acids Res.14:6361-6372(1988)；Wells等人，Cassettemutagenesis:an efficient method for generation of multiple mutations at definedsites,Gene 34:315-323(1985)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directedmutagenesis by microscale `shot-gun`gene synthesis,Nucl.Acids Res.13:3305-3316(1985)；Mandecki,Oligonucleotide-directed double-strand breakrepair in plasmids of Escherichia coli:a method for site-specific mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986)；Arnold,Protein engineeringfor unusual environments,Current Opinion in Biotechnology 4:450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology,19:456-460(2001).W.P.C.Stemmer,Nature370,389-91(1994)；以及I.A.Lorimer,I.Pastan,Nucleic Acids Res.23,3067-8(1995)。多种以上方法的其他具体细节可参见Methods in Enzymology Volume154，其还描述了用于各种诱变方法的故障诊断问题的有用对照。

术语"同源性"或"百分比同一性"在本申请中可互换使用。就本发明目的而言，在此定义：为了确定两个氨基酸序列或者两个核酸序列的百分比同一性，将序列就最佳比较目的进行比对(例如，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入缺口用于与第二氨基酸或核酸序列的最佳比对)。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列中的位置由与第二序列中对应位置上相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则各分子在该位置上的是相同的。两个序列之间的百分比同一性是所述序列共享相同位置的数目的函数(即，%同一性=相同位置数/总位置数(即，重叠位置x100)。优选地，两个序列具有相同的长度。

本领域技术人员会注意到下面的事实，几种不同的计算机程序可用于确定两个序列之间的同源性。例如，在两个序列之间比较序列和确定百分比同一性可使用数学算法完成。在一种优选的实施方案中，两个氨基酸序列之间的百分比同一性使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法确定，其已经纳入GCG软件包中的GAP程序(可在互联网上在accelrys网站获得，更具体为http://www.accelrys.com)，其中使用Blossom 62矩阵或者PAM250矩阵，以及缺口权重16、14、12、10、8、6或4，和长度权重1、2、3、4、5或6。本领域技术人员会理解当使用不同算法时所有这些不同参数会导致略为不同的结果，但是两个序列的总体百分比同一性不显著变化。

在又一实施方案中，两个核苷酸序列之间的百分比同一性使用在GCG软件包中的GAP程序来确定(可在互联网上在accelrys网站获得，更具体为http://www.accelrys.com)，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵和缺口权重40、50、60、70或80以及长度权重1、2、3、4、5或6。在另一实施方案中，两个氨基酸或核苷酸序列之间的百分比同一性使用E.Meyers和W.Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989)确定，该算法被纳入ALIGN程序(2.0版)中(可在互联网上在vega网站获得，更具体为ALIGN-IGH Montpellier，或者更具体在http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi)，其中使用PAM120权重剩余表(weight residue table)，缺口长度罚分12和缺口罚分4。

本发明的核酸和蛋白质序列可进一步用作"查询序列"来进行对公共数据库的检索，例如，以鉴定出其他家族成员或相关序列。所述检索可使用Altschul,等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸检索可使用BLASTN程序进行(得分=100，字长=12)以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可使用BLASTX程序(得分=50，字长=3)进行以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带缺口比对，可使用如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可采用各程序(例如，BLASTX和BLASTN)的缺省参数(可在互联网上在ncbi网站获得，更具体为www.ncbi.nlm.nih.gov)。

适用于本发明的表达载体包括原核生物载体和真核生物载体(例如，质粒、噬菌粒、或噬菌体)，包括哺乳动物载体和植物载体。适宜的原核生物载体包括质粒，诸如，但不限于那些常用于放线菌属中DNA操作的质粒(例如pSET152、pOJ260、pIJ101、pJV1、pSG5、pHJL302、pSAM2、pKC1250)。所述质粒在Kieser等人，(“Practical Streptomyces Geneics”,2000)中有披露。其他适宜的载体可包括质粒，诸如那些能在大肠杆菌中复制的质粒(例如pBR322、ColE1、pSC101、PACYC 184、itVX、pRSET、pBAD(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)等)。所述质粒被Sambrook披露(参见"Molecular Cloning:ALaboratory Manual,"第二版,编者Sambrook,Fritsch,&Maniatis,Cold SpringHarbor Laboratory,(1989))，并且许多这样的载体是可商购的。芽孢杆菌属(Bacillus)质粒包括pC194、pC221、pT127等，并被Gryczan披露(参见:TheMolecular Biology of the Bacilli,Academic Press,NY(1982),pp.307-329)。适宜的链霉菌属(Streptomyces)质粒包括pli101(Kendall等人，J.Bacteriol.169:4177-4183,1987)，并且链霉菌噬菌体包括但不限于诸如ψC31(Chater等人，参见Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology,AkademiaiKaido,Budapest,Hungary(1986),pp.45-54)。假单胞菌属(Pseudomonas)质粒由John等人综述(Re v.Infect.Dis.8:693-704,1986)和Izaki(Jpn.J.Bacteriol.33:729-742,1978)。

特定基因表达的抑制对于研究以及对于开发更适于具体目的的遗传工程化生物体是一种重要的手段。基因沉默可如下实现：引入对应于感兴趣基因的转基因，以相对于其启动子的反义方向(参见，例如，Sheehy等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 85:88058808(1988)；Smith等人，Nature 334:724726(1988))，或者以相对于其启动子的正义方向(Napoli等人，Plant Cell 2:279289(1990)；van der Krol等人，Plant Cell 2:291299(1990)；美国专利5,034,323；美国专利5,231,020以及美国专利5,283,184)，这二者都导致转基因以及内源基因的表达降低。

转录后基因沉默已经被报道伴随着反义RNA的小(20~25个核苷酸)片段的积聚，其可由RA模板合成并代表该过程的特异性和移动性决定子(Hamilton&Baulcombe,Science 286:950952(1999))。已经变得清楚的是，在一定范围的生物体中引入dsRNA(双链RNA)是导致基因沉默的重要组分(Fire等人，Nature 391:806811(1998)；Timmons&Fire,Nature 395:854(1998)；WO99/32619；Kennerdell&Carthew,Cell 95:10171026(1998)；Ngo等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 95:1468714692(1998)；Waterhouse等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 95:1395913964(1998)；WO99/53050；Cogoni&Macino,Nature 399:166169(1999)；Lohmann等人，Dev.Biol.214:211214(1999)；Sanchez-Alvarado&Newmark,Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 96:50495054(1999))。在细菌中，受抑制的基因无需是内源细菌基因，因为报道转基因和病毒基因二者均受到引入的转基因造成的转录后基因沉默(English等人，Plant Cell 8:179188(1996)；Waterhouse等人，同上)。然而，在所有的上述情形中，在引入的转基因与受到抑制的基因之间一定的序列相似性可能是优选的。

下面阐述实施例以示例说明本发明，并且不理解为对其的限制。

实施例

构建血红蛋白基因表达盒

血红蛋白基因表达盒设计为包含下述关键特征：i)在刺糖多孢菌中有功能的阿泊拉霉素耐受基因(最初来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，GenBank登记号X99313；Kieser等人，2001)启动子(aac3(IV)启动子)；ii)密码子优化的透明颤菌属血红蛋白基因VHb(表1)，其使用刺糖多孢菌密码子优选表和GeneDesigner软件(DNA 2.0,Menlo Park,California)设计；以及iii)aph转录终止子序列(Pulido和Jiménez,1987)。这些基因元件的选择和排列确保稳定的VHb转录和最优的蛋白质表达，从而提供血红蛋白的鲁棒表达。血红蛋白基因表达盒(SEQ ID NO:1)由DNA 2.0(Menlo Park,CA)合成。将所得的977bp合成的侧翼为HinDIII的片段克隆至pJ201载体(图1)中，由DNA2.0测序以在出货之前确认序列准确性。得到的质粒指定为pDAB109000。

表1：对于在刺糖多孢菌中的最优表达，比较透明颤菌属血红蛋白基因(VHb)密码子与合成血红蛋白基因优选密码子。合成VHb密码子在刺糖多孢菌中是优选的，并选择其用于代替来自透明颤菌属血红蛋白基因的优选密码子，其中使用GeneDesigner软件。

将血红蛋白基因表达盒引入粘粒克隆1E3中

选择遮蔽蛋白(obscurin)基因簇作为血红蛋白基因表达盒整合的位点，因为遮蔽蛋白基因簇的破坏不减少多杀菌素的产生。将血红蛋白基因表达盒克隆至粘粒1E3(其包含基因组DNA部分遮蔽蛋白基因簇)中。将该粘粒工程化以促进血红蛋白基因表达盒在刺糖多孢菌基因组的遮蔽蛋白基因簇中的稳定整合。

将血红蛋白基因表达盒首先经常规克隆方法克隆至载体pIJ773(JohnInnes Centre,Norwich,UK)中。除了阿泊拉霉素耐受基因和以FRT重组序列为侧翼的oriT之外，然后还经PCR寻靶将该表达盒克隆至粘粒1E3中(Gust等人，2002)。简而言之，血红蛋白基因表达盒首先通过使用pDAB109000作为模板和如下引物即aac3-VHb正向(SEQ ID NO:25’-CGCTGAAAAGCTTCTGACGCCG-3’)和aac3-VHb反向(SEQ ID NO:35’-CAACCCGTACCACGGCCTCT-3’)进行扩增。扩增的PCR片段用HindIII/KpnI消化产生两个片段：864bp HindIII/KpnI片段和83bpHindIII/KpnI片段。凝胶纯化携带包括转录终止子的血红蛋白基因表达盒的864bp HindIII/KpnI片段，并将其克隆至已经用HindIII/KpnI消化的载体pIJ773中。选择生长在含50μg/mL阿泊拉霉素的Luria-Bertani培养基(LB)上的总共38个转化体用于进一步分析和确认。在含有50μg/mL阿泊拉霉素的液体LB中过夜生长之后，通过在微量离心机中13,000RPM离心2分钟收获细胞。

携带对照质粒pDAB109000的细胞沉淀略带红色，这表明存在血红蛋白。然而，重组克隆中仅7个产生可见的微红色细胞沉淀，呈浅红色至较深的红色。选择这7个克隆并推进至下一步，该步骤包括质粒DNA分离和限制酶消化。基于使用下列酶NdeI、HindIII/KpnI和NdeI/KpnI的限制酶分析，这7个克隆中的两个(克隆22和克隆30)产生了期望的限制酶切样式。对这两个克隆的血红蛋白基因区和携带该血红蛋白基因表达盒的PCR片段进行测序。对克隆22的血红蛋白基因区和所述PCR片段进行完全测序，序列数据确认了所期望的合成血红蛋白基因无任何错误地得到扩增并且克隆至pIJ773(图2)中。所得的质粒标记为pDAB109001。

将FRT::aac3(IV)基因表达盒::oriT::FRT::合成血红蛋白基因表达盒整合至粘粒克隆1E3中如所述那样通过改进的PCR寻靶方案进行(Gust等人，2002)。将下述改进引入该方案中：i)用于引入携带血红蛋白基因表达盒的重组粘粒克隆的宿主大肠杆菌是大肠杆菌BW25141/pKD78，其从耶鲁大学的The Coli Genetic Stock Center(CGSC)获得；ii)λ红色重组酶表达质粒pKD78，其源于pKD46(Datsenko and Wanner,2000)；以及iii)设计和使用了下面的PCR引物，即obsA Internal Strep茎环(SEQ ID NO:45’-GAAGAAGGCGGCGTCGAACTGGTCGACCTCGGTGAGGAAGGTACCTCCGACCGCACGGC-3’)和obsA 5’FRT aac3(SEQ ID NO:55’-GGCAATGCGCAGAGTTCGTAGTGCGGGAGCCATTTGATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’)。所得的扩增在粘粒克隆1E3中产生了由(FRT::aac3(IV)::oriT::FRT::VHb)组成的2216bp片段。

将在粘粒克隆1E3内的整合设计为发生在obsA的5’端，导致600bp的obsA编码序列的除去。这确保了在遮蔽蛋白基因簇内第一聚酮合成酶的完全破坏。一旦整合，则血红蛋白基因表达盒就以这样的方式定向，即其编码序列与obsA编码序列的取向相反。该方向性避免了从推定的obsA启动子的转录通读，所述转录通读可能潜在地导致不期望的转录。将携带所述(FRT::aac3(IV)::oriT::FRT::VHb)片段的推定重组克隆分离并通过限制分析确认。用BamHI的限制消化表明：与亲代粘粒克隆1E3相比，携带血红蛋白基因盒的重组粘粒克隆具有不同的限制酶样式。此外，意在再生合成血红蛋白基因编码序列的使用NdeI和ClaI的限制消化显示，仅仅三个重组克隆产生了携带合成血红蛋白基因的完整编码区的444bp片段。

将(FRT::aac3(IV)::oriT::FRT::VHb)基因表达盒接合至刺糖多孢菌菌株中

完成了供体菌株大肠杆菌S17(其在粘粒1E3中包含FRT::aac3(IV)基因表达盒::oriT::FRT::合成血红蛋白基因表达盒)和多杀菌素产生菌株DAS-2之间的菌丝体接合。供体菌株和受体刺糖多孢菌菌株之间的菌丝体接合根据Matsushima等人，(1994)所述的方法进行。将起初在接合培养基上鉴定为阿泊拉霉素和萘啶酸抗性的菌落贴至含50μg/mL阿泊拉霉素和25μg/mL萘啶酸的Brain Heart Infusion琼脂培养基(BHI)上，以确认菌落的抗生素抗性表型。将具有期望的抗生素抗性表型的菌落认为是包含整合至遮蔽蛋白基因簇的obsA基因座内的FRT::aac3(IV)::oriT::FRT::VHb盒。为了确认存在阿泊拉霉素抗性基因aac3(IV)，使用PURELUTE^TM细菌基因组试剂盒(EdgeBioSystems,Gaithersburg,MD)根据制造商的说明分离出推定转接合子的基因组DNA。将该基因组DNA(gDNA)用作模板以供使用FAILSAFE^TM PCR系统(Epicentre Biotechnologies,Madison,WI)的对785bp aac3(IV)DNA片段的PCR扩增大小确认。

确认在转接合子中存在血红蛋白基因

为了确认合成血红蛋白基因存在于转接合子中，分离出选定数量的转接合子的基因组DNA(通过PURELUTE^TM细菌基因组试剂盒)并将其用作PCR扩增血红蛋白基因的模板(通过FAILSAFE^TM PCR系统)。重组菌株产生了395bp的PCR产物，对应于意图进行扩增的血红蛋白基因编码区的大小。将PCR片段纯化和完成两条链的DNA测序，从而进一步确认存在VHb基因。源于该PCR片段的序列与由DNA2.0合成的合成血红蛋白基因序列的比对表明这些重组菌株携带具有与设计的DNA序列相同的序列的血红蛋白基因。

在发酵条件下的血红蛋白基因表达

确定在发酵条件下合成血红蛋白基因在携带所述血红蛋白基因表达盒的重组菌株中的表达。将包含VHb表达盒的重组菌株在摇瓶发酵条件下培养，并将相应的全RNA样品通过RIBOPURE^TM细菌试剂盒(Ambion,Austin,TX)分离并制备以供作为RT-PCR测定的模板使用。双交换突变体的发酵在Burns等人，(WO 2003070908)所述条件下进行。就多杀菌素因子的存在对发酵培养液进行的分析在Baltz等人(美国专利6,143,526)所述条件下进行。为了确认在上清液中存在多杀菌素因子，将发酵培养液的提取物在SpeedVac中过夜干燥沉降(dry down)，然后使残余物在水和醚之间分配。醚层通过在N₂流下蒸发干燥。然后将样品溶于丙酮-d₆中并转移至NMR管用于1D质子NMR采集。将NMR谱与多杀菌素标准品的进行比较。

在根据制造商的说明书进行RNA提纯之后，立即用DNaseI (Ambion,Austin,TX)处理总RNA制备物。使用分离出的总RNA进行的对合成血红蛋白基因的RT-PCR，利用OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)根据制造商的指示进行。用于扩增合成血红蛋白基因编码区的引物为SynHemo正向(SEQ ID NO:65’-CAGACGATCAACATCATCAAGGCG-3’)和SynHemo反向(SEQ ID NO:75’-ACCTGGATGAACACGTCCGC-3’)。包含VHb表达盒的重组菌株产生了395bp的特异性片段，该片段对应于意图扩增的血红蛋白基因编码区。在相同的测定中，从非重组体对照菌株中分离出的总RNA不产生在大小上对应于合成血红蛋白基因的PCR片段。这些结果确认了合成血红蛋白基因(其为阿泊拉霉素抗性基因启动子所驱动)在刺糖多孢菌中在发酵条件下进行了转录和表达。

血红蛋白基因表达对多杀菌素产生的作用

血红蛋白基因表达对多杀菌素(A/D)产生的影响通过如上所述在摇瓶发酵条件下培养重组菌株进行评价。将发酵结果与在各自的亲本菌株(其不携带血红蛋白基因)中产生的多杀菌素A/D水平比较。选择用于在摇瓶中进行评价的重组菌株的数目基于可用于测试的转接合子数以及获得可确定合成血红蛋白基因的表达是否导致多杀菌素A/D水平提高的数据的愿望。

测试了七个源于DAS-2的重组菌株。所有这七个在多杀菌素产生方面都胜过亲本菌株DAS-2。亲本菌株在预期的范围内积聚多杀菌素。对于包含VHb基因的菌株，多杀菌素A/D产生的统计显著提高在4.6%~12.9%范围内(表2)。在摇瓶发酵条件下的多杀菌素产生中重组菌株之间在胜过对照菌株方面的一致性导致多杀菌素A/D滴度的显著的百分比提高。这种多杀菌素滴度的提高表明：由于在基因组中存在合成血红蛋白基因，重组菌株在整体上获得了增强的多杀菌素产生能力。合成血红蛋白基因在摇瓶发酵条件下的表达表明血红蛋白基因表达提高了多杀菌素产生。

表2：DAS-2和包含染色体整合的VHb基因的DAS-2VHb重组菌株在多杀菌素产生方面的比较。

基于以上报道的发酵结果，使用旺盛生长营养培养物(actively growingvegetative culture)将下述重组菌株即DAS-2VHb7和DAS-2VHb8低温保存在20%甘油中。进行专用的摇瓶发酵研究以：i)评价低温保存的菌株；ii)确保发酵结果的重现性；以及iii)为选定菌株的进步提供证据以供将来的工作。在该研究中对照菌株产生了预期水平的多杀菌素，并且整个研究在没有任何出乎预料的与操作方案的偏差下进行。各重组菌株在发酵周期中以及在发酵周期结束时胜过两种对照菌株，这确认了摇瓶发酵研究的初始观察结果。来自重组菌株的多杀菌素水平相对于对照菌株的提高是统计显著的。

将遮蔽蛋白聚酮合成酶基因簇用于密码子优化的血红蛋白基因在刺糖多孢菌菌株DAS-2中的整合和表达。该血红蛋白基因的整合和表达导致在刺糖多孢菌DAS-2的摇瓶发酵中改善的A/D产生。

上面示例说明了本发明，并不意在限制本发明。本发明由所附权利要求限定，所述权利要求的等价物包括在本发明内。

Claims (15)

1.一种将多杀菌素滴度提高至少4.6%的方法，包括：

a)将氧结合蛋白整合至多杀菌素产生菌株中。

2.权利要求1的方法，其中所述氧结合蛋白是透明颤菌血红蛋白或其机能性多态。

3.一种提高多杀菌素产生的方法，该方法包括：

a)在适于多杀菌素产生的条件下培养多杀菌素产生生物，所述多杀菌素产生生物表达编码氧结合蛋白的异源基因；以及

b)从表达编码氧结合蛋白的异源基因的多杀菌素产生生物的培养物中收集多杀菌素。

4.权利要求3的方法，其中所述异源基因是整合至细胞染色体中的。

5.将氧结合蛋白整合至刺糖多孢菌菌种的菌株的染色体DNA中的方法，其包括下述步骤：

a)创建噬菌体文库以鉴定基因组基因座；

b)从所述基因组基因座中克隆两个基因组DNA片段，其中将一个基因组片段克隆至多核苷酸的上游，第二基因组片段克隆至所述多核苷酸的下游；

c)通过转化将所述基因组片段引入刺糖多孢菌的菌株；

d)得到转接合子；以及

e)对所述转接合子就所述多核苷酸的存在进行筛选。

6.权利要求5的方法，其中所述多核苷酸含有基因表达盒。

7.权利要求6的基因表达盒，其中所述基因表达盒含有抗生素选择标志。

8.权利要求6的基因表达盒，其中所述基因表达盒含有多杀菌素增强基因表达盒。

9.权利要求5的方法，其中选择的染色体DNA是遮蔽蛋白聚酮合成酶簇。

10.一种多杀菌素产生生物，其中所述生物还表达异源氧结合蛋白。

11.权利要求1、3或10的方法或生物，其中所述生物是刺糖多孢菌。

12.权利要求1、5或10的方法或生物，其中所述氧结合蛋白是珠蛋白。

13.权利要求12的方法或生物，其中所述珠蛋白选自下组：透明颤菌属(Vitreoscilla)血红蛋白、富养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)黄素血红蛋白、马心肌红蛋白、大肠杆菌血红素蛋白、枯草芽孢杆菌血红素蛋白、酵母黄素血红蛋白、大豆豆血红蛋白、羽扇豆豆血红蛋白和抹香鲸肌红蛋白，或者它们的功能等价物。

14.权利要求1、5或10的方法或生物，其中所述多杀菌素选自下组：多杀菌素A+D、多杀菌素J+L、多杀菌素A和多杀菌素J。

15.权利要求12的方法或生物，其中所述珠蛋白是透明颤菌属血红蛋白或其功能多态性。

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