RU2188867C2 - Микробный способ получения хиральных производных бензилового спирта - Google Patents

Микробный способ получения хиральных производных бензилового спирта Download PDF

Info

Publication number
RU2188867C2
RU2188867C2 RU97102763/13A RU97102763A RU2188867C2 RU 2188867 C2 RU2188867 C2 RU 2188867C2 RU 97102763/13 A RU97102763/13 A RU 97102763/13A RU 97102763 A RU97102763 A RU 97102763A RU 2188867 C2 RU2188867 C2 RU 2188867C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
formula
microbacterium
hydrogen
chiralic
atcc
Prior art date
Application number
RU97102763/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU97102763A (ru
Inventor
Мишель М. ШАРТРЭН (FR)
Мишель М. ШАРТРЭН
Ших-Шунг Том ЧЕН (US)
Ших-Шунг Том ЧЕН
Джордж М. ГЭРРИТИ (US)
Джордж М. ГЭРРИТИ
Брайен ХЕЙМБУШ (US)
Брайен ХЕЙМБУШ
Кристофер РОБЕРЖ (US)
Кристофер РОБЕРЖ
Али ШАФИ (US)
Али ШАФИ
Original Assignee
Мерк Энд Ко., Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мерк Энд Ко., Инк. filed Critical Мерк Энд Ко., Инк.
Publication of RU97102763A publication Critical patent/RU97102763A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2188867C2 publication Critical patent/RU2188867C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/185—Heterocyclic compounds containing sulfur atoms as ring hetero atoms in the condensed system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу стереоселективного восстановления фенилалкилкетонов до их соответствующих (S)-гидроксисоединений и новому штамму. Для осуществления хирального восстановления используют новый штамм микроорганизма Microbacterium sp. MB 5614, который депонирован АТСС под инвентарным номером АТСС 55557. Способ является менее трудоемким и более экономичен по сравнению со способом химического хирального восстановления соответствующих соединений. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 1 табл.

Description

Лейкотриены составляют группу локально действующих гормонов, продуцируемых в живых системах из арахидоновой кислоты. Основными лейкотриенами являются лейкотриен В4 (сокращенно LTB4), LTC4, LTD4 и LTE4. Биосинтез этих лейкотриенов начинается с воздействия фермента 5-липоксегиназы на арахидоновуи кислоту с продуцированном эпоксида, известного как лейкотриен A4(LTA4), который последующими ферментативными стадиями превращается в другие лейкотриены. Детали биосинтеза также, как и метаболизм лейкотриенов, излагаюся в книге Leukotrienes and Lipoxygenases, ed. J. Rokach. Elsevier, Amsterdam (1989). Действие лейкотриенов в живых системах и их участие в различных болезненных состояниях также обсуждаются в книге под ред. J. Rokach.
В патенте СШA 5270324 сообщается о классе антагонистов лейкотриенов хинолинового типа, подгруппой являются соединения, имеющие общую формулу (I)
Figure 00000001

в которой Ra, Rb, в частности, представляют собой водород или галоген: и Rc может представлять собой CO2Rd, CORd или C(Re)2-OH: Rd может представлять собой водород или низший алкил, и Re может представлять собой низший алкил: и ALK представляет собой, например, циклопропил-1,1-(бис)-метилен, изопропил и т.п.
В опубликованной заявке на европейский патент 604114 также описываются антагонисты лейкотриенов, к которым относятся соединения, имеющие общую формулу (II)
Figure 00000002

в которой Ra, Rb, Rc и AlК имеют вышеупомянутые значения.
(S)-Гидроксисоединения формулы (III) (см. ниже) являются промежуточными соединениями при синтезе соединений формулы (I) и формулы (II). Соединения формулы (III) могут быть получены из соответствующих кетонов формулы (IV) (см. ниже) при использовании хирального восстановителя, такого как диизопинокамфенилхлорборан. Химическое хиральное восстановление, как правило, требует применения дорогостоящих хиральных восстановителей; следовательно, существует необходимость в альтернативном способе получения хиральных соединений формулы (III), который может быть более экономичным и/или более удобным, чем химический способ.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к стереоселективному способу восстановления фенилалкилкетона до соответствующего (S)-гидроксипроизводного, который включает контактирование упомянутого фенилалкилкетона с Microbacterium MB5614, депонированного как AТСС 55557 или с его мутантом или его вариантом. Настоящее изобретение также относится к биологически чистой культуре Microbacterium MB 5614 (АTCC 55557), или его мутанта или его варианта.
Подробное описание изобретения
С одной стороны, настоящее изобретение относится к стереоселективному способу восстановления фенилалкилкетона до соответствующего (S)-гидроксипроизводного, который включает приведение в контакт упомянутого фенилалкилкетона с Microbacterium MB 5614, депонированного как ATCC 55557.
Конкретнее, настоящее изобретение относится к способу получения соединения формулы (III)
Figure 00000003

который включает реакцию соединения формулы (IV)
Figure 00000004

с Microbacterium MB 5614, имеющего определяющие признаки AТСС 55557,
где A представляет собой -СН=СН-СН=СН;
R1 и R2, независимо, представляют собой водород или галоген;
R3 представляет собой СО2R6, COR6 или C(R7)2-O-R8;
R6 представляет собой водород или низший алкил;
R7 представляет собой низший алкил: и
R8 представляет собой водород или группу, защищающую гидроксильную группу.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения А представляет собой -СН= СН-СН= СН-, один из R1 и R2 представляет собой водород, а другой представляет собой галоген, и R3 представляет собой CO2R6.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения A представляет собой -СН=СН-СН=СН-, один из R1 и R2 представляет собой водород, а другой представляет собой: хлор, и R3 представляет собой CO2CH3.
С другой стороны, настоящее изобретение относится к биологический чистой культуре микроорганизма Microbacterium MB 5614, имеющего определяющие признаки AТСС 55557.
Аббревиатуры и определения
В настоящей заявке, если нет иных указаний, употребляются аббревиатуры и определения, перечисленные ниже.
FAB-МS - масс-спектрометрия при бомбардировке быстрыми атомами;
ВЭЖХ (HPLC) - высокоэффективная (высокого давления) жидкостная хроматография:
МES - N-морфолиноэтансульфоновая кислота;
MSG - мононатрийглутамат;
ЯМР - ядерный магнитный резонанс;
ТХС - тонкослойная хроматография;
УФ - ультрафиолет.
"Aлкил" обозначает линейные, разветвленные и циклические структуры и их сочетания.
"Низший алкил" означает алкильные группы, содержащие 1-7 атомов углерода. Примерами низших алкильных групп являются метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор- и трет-бутил, пентил, гексил, гептил, циклопропил, циклобутил, циклопентилметил, циклогексил и подобные группы.
"Галоген" включает фтор, хлор, бром и иод.
"Группа, защищающая гидроксильную группу", может представлять собой, например, простую эфирную группу, такую как метоксиметил, тетрагидропиранил, этоксиэтил, трихлорэтил, трет-бутил, аллил, бензил, триметилсилилэтил, дифенилметил и трифенилметил; простую силильную эфирную группу, такую как триметилсилил, диметилизопропилсилил, трет-бутилдиметилсилил и трет-бутилдифенилсилил; сложную эфирную группу, такую как формил, трихлорацетил, бензоил и трифторацетил; карбонатную группу, такую как трихлорэтил, бензил и аллил. Другие группы, подходящие для защиты гидроксильной группы, можно найти в известной литературе, например в Protective Groups in Organic Synthesis, Green and Wuts, Eds., 1991, John Wiley & Sons, Inc., NY.
Полезность
Соединения формулы (III) являются промежуточными соединениями при получении антагонистов лейкотриенов формул (I) и (II); получение таких антагонистов лейкотриенов с использованием таких промежуточных соединений описывается в патенте СШA 5270324 и в опубликованной заявке на европейский патент 604114, а также в находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявке в СШA с регистрационным номером 08/174931. Соединения формул (I) и (II) пригодны в качестве противоастматических, противоаллергических, противовоспалительных и защитных для клеток лечебных средств.
Получение субстрата
В способе настоящего изобретения для микробного хирального восстановления кетонов субстраты для Microbacterium - соединения формулы (IV) - могут быть получены в соответствии со способами, известными в технике. Так, получение соединений формулы (IV), в которых A представляет собой -СН=СН-СН=СН-, описывается в патенте США 5270324.
Описание микроорганизма
Microbacterium MB 5614 выделяли из образцов почвы, собранных на поле в мемориальном парке Санта-Роза, пров. Гуанакасте, Коста-Рика. Поле подвергалось огневой очистке за 48 часов до отбора образцов. Образец культуры депонирован по Будапештскому соглашению в Американской коллекции типовых культур, Роквилл. Мэриленд, как AТСС 55557, и в коллекции культур ресурсов микроорганизмов. Мерк (Merk Microbial Resources Culture Collection), Rahway, Нью- Джерси, как MB 5614.
В следующем далее описании наблюдения за ростом и основными признаками культур осуществлялись так, как описано в Cure и Keddie, 1969, Methods For Morphological Examination of Aerobic Coryneform Bacteria, в Board and Lovelock (editors), Samplind-Microbiological Monitoring of Environments, Academic Press, London, pp. 123-135. Утилизацию источников углерода проводят в соответствии с описанием Kamagata и Suzuki, 1986, в Sneath, P.H., N.S. Mair, M. E. Sharpe, and J.G. Holt (editors). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, U.II, pp. 1314. Другие физиологические испытания проводят так, как описано в Jones, 1975, A Numerical Taxonomic Study of Coryneform and Related Bacteria. J. Gen. Microbiol. 87: 52-96. Анализ клеточных стенок осуществляют, используя методы Lechevalier и Lechevalier, 1980, The Chemotaxonomy of Actinomicetes, в Dietz. A., and D.W. Thayer (editors), Actinomyces Тaxonom, Society for Inductrial Microbiology, Arlington, UA. pp. 225-291; и Uchida и Aida, 1984, An Improved Method For The Glycolate Test For Simple Identification of Acyl Type of Bacterial Cell Walls, J. Gen. Appl. Microbiol. 30: 131-134. Анализ менахинонов проводят по методу Hiraishi et al., 1992, Rapid Profiling of Bacterial Quinones By Two-Dimtnsional Thin-Layer Chromatography, Letter in Aрр1. Microbiol. 14: 170-173. Анализ жирных кислот осуществляют по методу Miller и Berger, 1985, Hewlett-Packard Application Note, pp. 228-241, Hewlett-Packard Co., Palo Alto, СA.
Морфология клетки. Неподвижная, грамположительная, плеоморфная "палочка" (1,14•0,38 мкм) с булавовидной морфологией. Первичное ветвление происходит во время цикла роста, но без продуцирования мицелиев. Не происходит четкого цикла развития палочка-кокк. Эндоспоры не продуцируются.
Культуральные и физиологические признаки. Мезофильный, причем рост происходит при 28oС и 37oС. Условия культивирования - рН может колебаться между 5,0 и 9,0 с оптимумом в районе рН 7. Строгий аэроб, каталазоположительный, оксидазоотрицательный. Метаболизм, главным образом, газовый; хотя он может быть также ферментативным. Кислота продуцируется на целлобиозы, фруктозы, галактозы, D-глюкозы, глицерина, маннозы, мальтозы, D-рибозы, сахарозы, трегалозы и D-ксилозы, но не из D-арабинозы, инозита, лактозы, мелибиозы, D-рафинозы, рамнозы, растворимого крахмала, D-сорбита, L-сорбозы или L-ксилозы. Желатин гидролизуется в малой степени, но хитин, крахмал, казеин, мочевина или целлюлоза не гидролизуются. Питание комплексное, причем рост происходит на средах на основе пептона. На средах на основе пептона колонии составляют 1-3 мм в диаметре, желтые по цвету, прозрачные, растут и имеют неповрежденный край. Поверхность блестит, а текстура мукоидная. Пигменты, способные диффундировать, не продуцируются.
Химия клеточных стенок. Диаминокислотой в клеточной стенке является лизин. Такие присутствуют глицин, аланин и глутаминовая кислота. Тип клеточных стенок более всего подобен Вlа. Основным сахаром клеточных стенок является рамноза,наряду с маннозой, рибозой и неидентифицированным сахаром (Rгалактоза= 0,75), которые все присутствуют в более низких концентрациях. Основными менахинонами являются МК10 и МК11. Основными жирными кислотами являются 15:0 антеизо, 17:0 антеизо и 16:0 изо.
Хемотаксономические исследования показывают, что MB 5614 принадлежит к роду Microbacterium; однако сравнение признаков роста и типов углеводного бровения не дает совпадения с шестью признанными на сегодняшний день видами этого рода (таблица). На основании этого предполагается этот штамм располоиить как новый вид Microbacterium campoguemadoensis.
Описание способа
Штамм Microbacterium может быть выращен в обычной среде, содержащей известные источники питания для роста бактерий, т.е. усвояемые источники углерода и азота, с добавлением необязательных неорганических солей и других известных факторов роста. Культуру выращивают предпочтительно в аэробных условиях при погружении; однако для культивирования в небольших масштабах можно такие использовать поверхностные культуры и микробиологические матрасы. Обычные процедуры, применяемые для выращивания других бактерий, применимы в настоящем изобретении.
Питательная среда, используемая для культивирования Microbacterium, должна содержать соответствующий усвояемый источник углерода, такой как глюкоза, фруктоза, сахароза и целлюлоза. В качестве источника азота могут использоваться хлорид аммония, сульфат аммония, мочевина, нитрат аммония, нитрат натрия, глутамат натрия и т.п., либо по отдельности, либо в сочетании с органическими источниками азота, такими как пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, соевая мука, хлопковое масло и т.п. При необходимости также могут добавляться питательные неорганические соли, чтобы обеспечить источники натрия, калия, кальция, аммония, фосфата, сульфата, хлорида, бромида, карбоната, цинка, магния, марганца, кобальта, железа и подобных составляющих.
Microbacterium можно выращивать при любой температуре, подходящей для удовлетворительного роста, например при 25-40oС, и наиболее удобно осуществлять процесс при температуре 27-32oС. Если ферментация должна осуществляться в бродильных чанах, желательно использовать растительный инокулят в питательном бульоне из культуры на косячке агара или лиофилизованной культуры. После получения активного инокулята таким способом его стерильно переносят в сбраживаемую среду в бродильный чан. Возбуждение в бродильном чане обеспечивается перемешиванием, а аэрация может быть осуществлена путем подачи воздуха или кислорода в перемешиваемую смесь.
В одном из вариантов осуществления настоящего способа кетонный субстрат (IV) приводят в контакт с Microbacterium, выращиваемым в водной питательной среде. Кетон может быть добавлен к культуре Microbacterium в любое время; но предпочтительно субстрат добавляют, когда образуется достаточная биомасса микрорганизма. Концентрацию биомассы можно легко контролировать, например, путем измерения поглощения света образцом культуры, при 660 нм с использованием спектрофотометра. Как правило, максимум биомассы достигается через 3-5 суток после инокуляции. Процесс биоконверсии можно проконтролировать обычными способами, такими как ВЭЖХ, с последующим контролем спектров. Уровень стереоселективного восстановления продукта достигает максимального значения через 3-4 суток после добавления субстрата. Биоконверсия кетонного субстрата до соответствующего (S)-гидроксисоединения может быть осуществлена непрерывно, например, в течение периода до 500 часов, при периодическом добавлении кетона. Полученное таким образом нужное (S)-гидроксисоединение может быть извлечено из ферментативного бульона любым способом, подходящим для такого извлечения и отделения; примерами такого способа являются экстракция, преципитания, хроматография и другие известные в технике традиционные методы.
В другом варианте осуществления настоящего способа кетонный субстрат приводят в контакт с Microbacterium на стадии покоя. Стадия покоя здесь означает, что микроорганизм не растет активно, но способен к нужному функционированию в буферном растворе в отсутствии факторов, поддерживающих рост. Покоящиеся клетки Microbacterium получают, собирая растущие клетки Microbacterium, например, путем центрифугирования; собранные клетки также могут быть лиофилизованы и затем сохранены при -80oС для будущего применения. Покоящиеся клетки используют в виде клеточной суспензии в соответствующем буферном растворе, таком как фосфатный буферный раствор или трис-буфер (рН 6-8). Кетон добавляют к клеточной суспензии, и смесь инкубируют при температуре от 20 до 40oС, чтобы осуществить восстановление. К клеточной суспензии, необязательно, можно добавлять глюкозу, чтобы улучшить эффективность биоконверсии. Клетки, иммобилизованные на подлодке физической адсорбцией или захватом, также могут использоваться для способа хирального восстановления. Иммобилизации клеток можно достичь, используя обычные способы, например способ, описанный в Karsten, G. , and Simon, H., Appl. Microb. Biotechnol., 1993, 38:441-446, и способы, описанные в цитированных здесь ссылках.
Следует иметь в виду, что для осуществления биотрансформации настоящее изобретение не ограничивается конкретным микроорганизмом, упомянутым выше, но включает использование его вариантов и мутантов, которые сохраняют способность восстанавливать кетоны. Такие варианты и мутанты могут быть продуцированы из родительского штамма с помощью различных средств, таких как рентгеновское излучение, УФ-облучение, и химические мутанты, такие как N-метил-N'-нитро-Н-нитрозогуанидин.
Приведенные ниже примеры даются для более полной иллюстрации настоящего изобретения, и не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом обьем настоящего изобретения.
Пример 1. Посевная культура Microbacterium MB 5614
Дают возможность 1,5-мл ампуле с замороженным Microbacterium MB 5614 в среде SG (состав приводится ниже в примере 4) оттаивать при комнатной температуре, и затем переносят в колбу Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащую 50 мл среды КЕ, содержащей (на литр среды)
10 г декстрина,
5 г ардамина рН,
5 г амина NZ типа Е,
3 г дрожжевого экстракта,
1 г декстрозы,
0,37 г К2НРО4,
0,05 г MgSO4•7Н2O,
деионизованную воду. q.v., до 1 л,
NaOH до рН 7,1,
0,5 г СаСО3.
Колбу инкубируют при 28oС в течение 24 час на круговой качалке при 220 об/мин. Аликвоту культуры из колбы в 1,0 мл затем используют для инокулирования 2,0 -л колбы Эрленмейера, содержащей 500 мл среды КЕ. Колбу емкостью 2 л инкубируют в течение 24 час при 28oС на круговой качалке при 220 об/мин.
Пример 2. Биоконверсия метил-2-(3-(3-(2-(7-хлор-2-хинолинил)этенил)фенил)-3-оксопропил)бензоата (далее называемого кетоэфиром) до метил-2-(3-(3-(2-(7-хлор-2-хинолинил)этенил)фенил)-3(S)-гидроксипропил)бензоата (далее называемого гидроксиэфиром) (способ A)
Аликвоту в 2 мл посевной культуры примера 1 переносят в колбу с перегородками емкостью 250 мл, содержащую 50 мл биоконверсионной среды, в состав которой входят (на литр среды):
20 г глюкозы,
5 г соевой муки,
5 г дрожжевого экстракта,
5 г NaCl,
9,8 г N-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES).
деионизованная вода, q.v.. до 1 л;
рН доводят до 7,0.
Добавляют к среде раствор кетоэфира (5 мг) в ацетоне (0,5 мл) и колбу инкубируют при 27oC С на качалке при 220 об/мин, в темноте. Биоконверсию контролируют следующим образом. Отбирают из колбы в различное время образцы по 1 мл и смешивают с 1 мл изопропанола. Получающуюся в результате смесь после интенсивного перемешивания центрифугируют и аликвоту супернатанта проверяют ВЭЖХ (аналитическая колонка ODS-3, Whatman Partisil 10: элюент - линейный градиент ацетонитрила в воде (55% - 95% за 30 минут); скорость потока 1 мл/мин; температура колонки 45oС).
Пример 3. Выделение и исследование гидроксиэфира
После инкубации в течение 48 часов соединяют бульон от биотрансформации из 4 колб (всего 200 мл) и доводят рН до 6,0. Бульон центрифугируют (20 мин при 3700 об/мин), и извлекают супернатант. Осадок затем суспендируют в 150 мл метанола и перемешивают в течение 30 мин в темноте. Полученную таким образом суспензию центрифугируют, как упоминалось выше, и снова извлекают супернатант. Осадок экстрагируют еще раз и супернатант присоединяют к супернатантам, извлеченным ранее.
Объединенный экстракт смешивают с равным объемом метиленхлорида и после энергичного встряхивания извлекают метиленхлоридную фазу и сушат при пониженном давлении. Высушенный остаток наносят на полупрепаративную силикагелевую пластину и пластину проявляют в системе растворителя - метиленхлориде. Проявленную ТХС-пластину проверяют под УФ-светом, и сосредотачиваются на основной полосе УФ-поглошения с величиной Rf ниже, чем у субстрата. Соскребаит силикагель с этой площади и тщательно экстрагируют метиленхлоридом. Экстракт концентрируют при пониженном давлении и фильтруют.
Фильтрованный экстракт затем очищают несколькими впрыскиваниями в полупрепаративную колонку ODS-3 (9,4 мм •25 см). Whatman Partisil 10. Эту колонку проявляют, используя обычные условия для аналитической колонки, за исключением того, что скорость потока составляет 3 мл/мин (см. пример 2). Объединяют очищенные ВЭЖХ фракции и тщательно экстрагируют их метиленхлоридом. Метиленхлоридный экстракт сушат над Na2SO4 и концентрируют досуха в атмосфере азота, получают 3,5 мг сухого конечного продукта (прямое количественное определение ВЭЖХ субстрата и продукта показывает конверсии в 30-40% по отношению ко времени сбора культуры). ЯМР и спектральный анализ FAB-MS показывают, что продукт представляет собой метил-2-(3(S)-(2-(7-хлор-2-хинолинил)этенил)фенил)-3-гидрокси)пропил)-бензоат, и хиральная хроматография фракции, очищенной ВЭЖХ, на колонке Chiralcel OD (элюент 90% гексана/изопропанол; скорость потока 2 мл/мин; время удержания 17,9 мин для (S)-гидроксиэфира, 19,8 мин для (R)-гидроксиэфира) показывает избыток энантиомера в 95%.
Пример 4. Биоконверсия кетоэфира в гидроксиэфир (способ Б)
Используют 10-мл аликвоту посевной культуры примера 1 для инокуляции колбы Эрленмейера емкостью 2,0 л, содержащей 500 мл производственной питательной среды (среда SG), в состав которой входят (на литр среды)
0,5 г FeCl3•6H2O,
30 г декстрозы,
20 г мононатрийглутамата (MSG),
9,8 г MES.
5 г дрожжевого экстракта.
5 г NaCl,
деионизованная вода, q.v., до 1 л (рН 7,0, NaOH).
Колбу инкубируют при 28oС на круговой качалке при 200 об/мин.
После инкубации производственной культуры в течение 5 суток добавляют кетоэфир (250 г, в виде раствора 25 мг/мл в диметилсульфоксиде). На 8 и 9 сутки после инокуляции добавляют дополнительные порции кетоэфира (каждая по 250 мг). Биоконверсию до гидроксиэфира контролируют, проверяя концентрации кетоэфира и гидроксиэфира в культуре. Коротко, аликвоту культурального бульона экстрагируют двумя объемами этилацетата. Затем экстракт сушат в атмосфере азота и ресуспендируют в ацетонитриле, и раствор хроматографируит на ВЭЖХ-колонке Zorbax RX-C8 (подвивная фаза - ацетонитрил в воде 10-90%, обе подкислены 0,1% Н3РО4; скорость потока 1,5 мл/мин). Время удержания (кетоэфир)= 5 мин; время удержания (гидроксиэфир)=12 мин. Биоконверсия при этих условиях продуцирует приблизительно 500 мг/л гидроксиэфира на 10 сутки после инокуляции, при скорости во время реакции приблизительно 100 мг/(1 сутки).
Пример 5. Биоконверсия кетоэфира до гидроксиэфира с помощью покоящихся клеток Microbacterium MB 5614
Культуру Microbacterium MB 5614 выращивают по методике, описанной в примерах 1 и 2. Культуру в среде для биоконверсии инкубируют в течение 44 час при 28oС на круговой качалке при 220 об/мин, клетки собирают центрифугированием при 15000 об/мин в течение 120 мин. Получающийся в результате осадок промывают три раза 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,2, лиофилизуют и хранят при -80oС.
Клетки оттаивают, суспендируют в буфере, 4:5, г/обьем, и к клеточной суспензии добавляют кетоэфир (5 мг/0,5 мл ДМСО). Смесь инкубируют при 27oС. Биоконверсию проверяют так, как описано выше. После инкубации в течение 40 часов наблюдают конверсию более 50% (при определении ВЭЖХ).
Добавление глюкозы (0,1 М) к клеточной суспензии дает в результате конверсию приблизительно 60% после 40-часовой инкубации.

Claims (9)

1. Способ получения хирального соединения бензилового спирта формулы (III)
Figure 00000005

в которой А представляет собой -СН= СН-СН= СН-;
R1 и R2 независимо представляют собой водород или галоген;
R3 представляет собой СО2R6, COR6 или C(R7)2-O-R8, R6 представляет собой водород или низший алкил, R7 представляет собой низший алкил, и R8 представляет собой водород или группу, защищающую гидроксильную группу,
который включает в себя контактирование соединения формулы (IV)
Figure 00000006

в которой A, R1, R2 и R3 принимают те же значения, которые определены для формулы (III),
со штаммом Microbacterium sp. MB 5614, депонированным как АТСС 55557.
2. Способ по п. 1, при котором один из R1 и R2 представляет собой водород, а другой представляет собой галоген, и R3 представляет собой CO2R6.
3. Способ по п. 1, при котором один из R1 и R2 представляет собой водород, а другой представляет собой хлор, и R3 представляет собой СO2СН3.
4. Способ по п. 1, при котором упомянутый в п. 1 штамм культивируют в водной питательной среде, содержащей способные к ассимиляции источники углерода и азота.
5. Способ по п. 1, при котором упомянутый в п. 1 штамм находится в состоянии покоя.
6. Способ по п. 4, при котором упомянутая питательная среда дополнительно содержит FеСl3.
7. Способ по п. 4, при котором упомянутая питательная среда дополнительно содержит мононатрий-глутамат.
8. Способ по п. 4, при котором упомянутая питательная среда дополнительно содержит FеСl3 и мононатрий-глутамат.
9. Штамм Microbacterium MB 5614, депонированный как АТСС 55557, который способен согласно п. 1 конвертировать соединение формулы (IV) в соединение формулы (III).
RU97102763/13A 1994-07-20 1995-07-14 Микробный способ получения хиральных производных бензилового спирта RU2188867C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US227728 1988-08-03
US277,728 1994-07-20
US08/277,728 US5491077A (en) 1994-07-20 1994-07-20 Microbial method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU97102763A RU97102763A (ru) 1999-06-27
RU2188867C2 true RU2188867C2 (ru) 2002-09-10

Family

ID=23062121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU97102763/13A RU2188867C2 (ru) 1994-07-20 1995-07-14 Микробный способ получения хиральных производных бензилового спирта

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5491077A (ru)
CN (1) CN1078249C (ru)
AU (1) AU3582595A (ru)
BR (1) BR9508320A (ru)
CZ (1) CZ16997A3 (ru)
FI (1) FI970183A0 (ru)
RO (1) RO119235B1 (ru)
RU (1) RU2188867C2 (ru)
SK (1) SK282257B6 (ru)
UA (1) UA47410C2 (ru)
WO (1) WO1996002657A1 (ru)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5534422A (en) * 1995-05-19 1996-07-09 Merck & Co., Inc. Bioconversion of beta keto-ester to (R) hydroxyester
AR007739A1 (es) * 1996-07-22 1999-11-10 Merck & Co Inc Un proceso para la preparacion de n-(r)-(2-hidroxi-2-piridina-3-il-etil) -2-(4-nitro-fenil)-acetamida
US5846791A (en) * 1996-07-22 1998-12-08 Merck & Co., Inc. N-(R)-(2-hydroxy-2-pyridine-3-yl-ethyl)-2-(4-nitro-phenyl)-acetamide
US6898164B2 (en) * 2001-01-25 2005-05-24 Dphi Acquisitions, Inc. Close tracking algorithm in a digital tracking servo system
JP2009526047A (ja) * 2006-02-09 2009-07-16 テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミティド モンテルカストナトリウムの安定な医薬製剤
US7879585B2 (en) 2006-10-02 2011-02-01 Codexis, Inc. Ketoreductase enzymes and uses thereof
ATE518946T1 (de) 2007-02-08 2011-08-15 Codexis Inc Ketoreduktasen und anwendungen davon
US7977078B2 (en) 2007-08-24 2011-07-12 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of (R)-3-hydroxythiolane
KR101586503B1 (ko) 2007-09-13 2016-01-18 코덱시스, 인코포레이티드 아세토페논의 환원을 위한 케토리덕타제 폴리펩티드
KR20100061571A (ko) * 2007-09-28 2010-06-07 코덱시스, 인코포레이티드 케토리덕타제 폴리펩티드 및 이의 용도
JP5646328B2 (ja) * 2007-10-01 2014-12-24 コデクシス， インコーポレイテッド アゼチジノンの生産のためのケトレダクターゼポリペプチド
US8426178B2 (en) * 2008-08-27 2013-04-23 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of a 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
US8288141B2 (en) * 2008-08-27 2012-10-16 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
CN102186972B (zh) 2008-08-29 2014-08-20 科德克希思公司 用于立体选择性生产(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-4-苯基-1，3-噁唑烷-2-酮的酮还原酶多肽
SG10201405022PA (en) 2009-08-19 2014-10-30 Codexis Inc Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine
CN101899406B (zh) * 2010-04-27 2012-02-22 北京大学 一种去除多环芳烃和/或降解多环芳烃的菌株及其应用
HUE026367T2 (en) 2010-05-04 2016-06-28 Codexis Inc Biocatalysts of ezetimibe synthesis
RU2705286C2 (ru) 2011-07-25 2019-11-06 Монсанто Текнолоджи, Ллс Штамм mycosphaerella sp., композиции и способы для борьбы с фузариозом

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4943528A (en) * 1988-11-22 1990-07-24 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Process for the production of optically active (R)-(-)-3-halo-1,2-propanediol
US5270324A (en) * 1992-04-10 1993-12-14 Merck Frosst Canada, Inc. Fluorinated hydroxyalkylquinoline acids as leukotriene antagonists
CA2111372C (en) * 1992-12-22 2007-01-16 Robert N. Young Diaryl 5,6-fusedheterocyclic acids as leukotriene antagonists

Also Published As

Publication number Publication date
CN1153534A (zh) 1997-07-02
SK282257B6 (sk) 2001-12-03
FI970183A (fi) 1997-01-16
RO119235B1 (ro) 2004-06-30
US5491077A (en) 1996-02-13
CZ16997A3 (en) 1997-06-11
SK6697A3 (en) 1997-08-06
BR9508320A (pt) 1998-01-06
FI970183A0 (fi) 1997-01-16
WO1996002657A1 (en) 1996-02-01
AU3582595A (en) 1996-02-16
UA47410C2 (ru) 2002-07-15
CN1078249C (zh) 2002-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2188867C2 (ru) Микробный способ получения хиральных производных бензилового спирта
KR880002483B1 (ko) 3-히드록시-ml-236b 유도체의 제조방법
US5427933A (en) Reduction of phenylalkyl ketones to the corresponding (S)-hydroxy derivatives using mucor hiemalis IFO 5834
RU2235780C2 (ru) Гидроксилирование компактина до правастатина с помощью micromonospora
US5622846A (en) Biotechnological process for the preparation of cyclic-s-α-imino carboxylic acids and r-α-imino carboxamides
JPS59113896A (ja) ピロロキノリンキノンの製造方法
CA2085522A1 (en) Microbial process for the production of trans-4-hydroxy-l-proline
US4973552A (en) Staurosporine fermentation process
CA2028117C (en) Substance trehalostatin and process for the preparation thereof
US6451587B1 (en) Microbial asymmetric reduction of 2-chloro-1-[-6-(2,5-dimethyl-pyrrol-1-yl)-pyridin-3-yl]-ethanone
Goeke et al. Production of the Staurosporine Aglycon K-252c with a Blocked Mutant of the Staurosporine Producer Strain Streptomyces longisporoflavus and by Biotransformation of Staurosporine with Streptomyces medioddicm ATCC 13279
AU4455399A (en) Microbial production of actinol
Kim et al. Taxonomy, fermentation, isolation and characterization of a herbicidal compound, 3D5
US6465228B1 (en) Levodione reductase
JP4439079B2 (ja) プラバスタチンの製造方法
KR100214828B1 (ko) 6-히드록시피콜린산의 미생물학적 제조방법
KR100260837B1 (ko) 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법
JPH0378106B2 (ru)
MASUMA et al. Site of regulation of nanaomycin biosynthesis by inorganic phosphate
AU620595B2 (en) Process for the preparation of macrolide compounds
KR100386197B1 (ko) 올레아미드를 생산하는 스트렙토미세스 속 신균주 및 그균주로부터 올레아미드를 생산하는 방법
JPH0331195B2 (ru)
JP3327982B2 (ja) 新規な抗生物質ｍｉ４８１−４２ｆ４−ａ関連物質
JPH01311079A (ja) ノカルジア種（ＭＡ６４５５）によって産生されるＨＭＧ‐ＣｏＡ還元酵素阻害剤
JPS6322799B2 (ru)

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20040715