JP4162848B2 - ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤の製造法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクタ−ゼ（以下、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ−ゼと略記する。）を阻害し、血清コレステロールの低下作用等を有する化合物の製造法に関する。
背景技術
一般式（ＶＩ−ａ）
（式中、Ｒ１は水素原子またはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（ＶＩ−ａ）という］または一般式（ＶＩ−ｂ）
で表される、化合物（ＶＩ−ａ）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（ＶＩ−ｂ）という］は、ＨＭＧ−ＣＯＡレダクタ−ゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を示すことが知られている［ザ・ジャーナル・オブ・アンチビオチクス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）２９，１３４６（１９７６）］。
一般式（Ｖ−ａ）
（式中、Ｒ１は水素原子またはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（Ｖ−ａ）という］または一般式（Ｖ−ｂ）
で表される、化合物（Ｖ−ａ）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（Ｖ−ｂ）とういう］から化合物（ＶＩ−ａ）または化合物（ＶＩ−ｂ）を生成させる能力を有する微生物としては、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、カニンガメラ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ）属、シンセファラスポラム（Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｐｏｒｕｍ）属およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物（特開昭５７−５０８９４号公報）、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フィコミセス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）属、リゾパス（Ｒｈｙｚｏｐｕｓ）属、シンセファラストラム（Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ）属、ザイゴラインチュス（Ｚｙｇｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）属、ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）属、リゾクトニア（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ）属およびノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属する微生物［ザ・ジャーナル・オブ・アンチビオチクス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ），３６，８８７（１９８３）］、アミコラータ（Ａｍｙｃｏｌａｔａ）属、サッカロポリスポーラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属およびサッカロスリックス（Ｓａｃｃｈａｒｏｔｈｒｉｘ）属に属する微生物（特開平７−１８４６７０号公報）並びにアクチノマデュラ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ）属に属する微生物（ＷＯ９６／４０８６３）が知られている。
上記の微生物は放線菌または糸状菌に属している。本発明のごとく、細菌に属し、上記化合物（Ｖ−ａ）または化合物（Ｖ−ｂ）からそれぞれ、化合物（ＶＩ−ａ）または化合物（ＶＩ−ｂ）を生成する能力を有する微生物は知られていない。放線菌や糸状菌は細菌に比べて増殖が遅いため、反応に必要な菌体量を取得するのに時間がかかるという欠点がある。また、放線菌や糸状菌は発酵槽での培養管理が難しいという問題点もある。放線菌や糸状菌は菌糸を伸ばして増殖するため、発酵槽で増殖させると培養液の粘度が上昇する。このため酸素が不足しやすく、培養液が不均一になるため反応効率の低下を招きやすい。この酸素不足を解消し、培養液を均一に保つためには、発酵槽の攪拌速度を上げなければならないが、攪拌速度を上げると菌糸が剪断され、微生物の活性が低下しやすい［発酵工学の基礎、ｐ１６９〜１９０，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｓｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋａｅｒ著、学会出版センター（１９８８）］。このように放線菌や糸状菌は培養を行なう上で問題があるが、細菌は菌糸を形成しないため、培養液の粘度は上がりにくく、通気不足や培養液が不均一になることは少なく、培養管理が容易である。
遺伝子組換え技術で、遺伝子を大腸菌等の細菌で発現させることはよく行われているが、放線菌や糸状菌の遺伝子はアミノ酸を規定するコドンが大腸菌等の細菌と大きく異なるため、効率よく発現することは一般に難しい。
放線菌で遺伝子を高発現するためのベクター、プロモーター等の材料は限られており、遺伝子を高発現し、より効率よく反応を行なうためにはベクター、プロモーター等が数多く利用できる細菌を用いることが望ましい。細菌の遺伝子であれば容易に細菌で高発現することができる。
発明の開示
本発明の目的は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ−ゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を有する化合物の製造法を提供することにある。
本発明は、バチルス属に属する微生物由来でかつ、一般式（Ｉ−ａ）
（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（Ｉ−ａ）という］または一般式（Ｉ−ｂ）
（式中、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される、化合物（Ｉ−ａ）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（Ｉ−ｂ）という］から、一般式（ＩＩ−ａ）
（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（ＩＩ−ａ）という］または一般式（ＩＩ−ｂ）
（式中、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される、化合物（ＩＩ−ａ）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（ＩＩ−ｂ）という］を生成する活性を有する酵素源を、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）に反応液中で作用させ、反応液中に化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を生成させ、該反応液から化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を採取することを特徴とする化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）の製造法に関する。
アルキルとしては、直鎖または分岐状の、炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のアルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、これら各種分岐鎖異性体等があげられる。
アリールとしては、フェニル、ナフチル等があげられる。
置換アルキルにおける置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アリール等があげられる
置換アリールにおける置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ等があげられる。
アルコキシにおけるアルキル部分は上述のアルキルと同義である。
アルカリ金属とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウムの各元素を表す。
本発明で用いられる酵素源は、バチルス属に属する微生物由来であって、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）から、それぞれ化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を生成する活性を有する酵素源であれば、バチルス属に属し、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）から、化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を生成する活性を有する微生物、該微生物の培養物もしくは菌体またはそれらの処理物、該微生物から抽出した酵素等いずれでも用いられる。
バチルス属に属し、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）から、化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を生成する活性を有する微生物としては、例えば、バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）バチルス・アルベイ（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する微生物等があげられる。
さらに具体的には、バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＡＴＣＣ４５１７株、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）ＡＴＣＣ１４５７４株、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＮＲＲＬ Ｂ−８０２９株、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−６株、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−７株、バチルス・アルベイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）ＡＴＣＣ６３４４株、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＮＴＣＴ−２６１０株、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）ＮＣＩＢ−９３６８株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１０７７８株、バチルス・メガテリウム ＡＴＣＣ１１５６２株、バチルス・メガテリウム ＡＴＣＣ１３４０２株、バチルス・メガテリウム ＡＴＣＣ１５１７７株、バチルス・メガテリウム ＡＴＣＣ１５４５０株、バチルス・メガテリウム ＡＴＣＣ１９２１３株、バチルス・メガテリウム ＩＡＭ１０３２株、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−２０６４株またはバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣ０６０５１株等の微生物があげられる。
また、これらの微生物の継代培養体、突然変異体もしくは誘導体、遺伝子組換え技術により製造した組み換え体等も用いられる。バチルス・エスピーＰＶ−６株及びＰＶ−７株は、本発明者によって土壌より新たに分離された菌株であり、それらの菌学的性質は以下の通りである。
ＰＶ−６株
（Ａ）形態的性質
１．細胞の形；桿状、大きさ；０．８〜１．２×２．０〜４．０μｍ
２．細胞の多形性の有無；無
３．運動性の有無；無
４．胞子の有無；観察されない
（Ｂ）培養的性質
肉汁寒天平板培地及び肉汁液体培地における培養的性質を以下に示す。
１．肉汁寒天平板培養（１〜２日間培養）
１）生育の様相；良好
２）色；クリーム
３）光沢；有
４）拡散性色素；無
２．肉汁液体培養（１〜２日間培養）
１）表面生育；無
２）濁度；有
３．肉汁ゼラチン穿刺培養
１）生育の状態；良好
２）ゼラチンの液化；有
４．リトマス−ミルク反応
１）反応；アルカリ
２）凝固；無
３）液化；無
（Ｃ）生理学的性質
１．グラム染色性；陽性あるいは陰性
２．硝酸塩の還元；陰性
３．脱窒反応；陽性
４．ＭＲテスト；陰性
５．ＶＰテスト；陰性
６．インドールの生成；陰性
７．硫化水素の生成；陽性
８．デンプンの加水分解；陰性
９．クエン酸の利用；陽性
１０．無機窒素源の利用
１）硝酸塩；陰性
２）アンモニウム塩；陽性
１１．色素の生成；無
１２．ウレアーゼ；陽性
１３．オキシダーゼ；陰性
１４．カタラーゼ；陽性
１５．生育の範囲
１）生育ｐＨ範囲；ｐＨ６〜ｐＨ９（最適生育ｐＨ７付近）
２）生育温度範囲；６℃〜４０℃（最適生育温度；３０℃付近）
１６．酸素に対する態度；好気性
１７．Ｏ−Ｆテスト；酸化的
１８．酸の生成（好気的条件）
＋は生成することを、−は生成しないことをそれぞれ示す。
（１）Ｌ−アラビノース；−
（２）Ｄ−キシロース；−
（３）Ｄ−グルコース；＋
（４）Ｄ−マンノース；−
（５）Ｄ−フラクトース；＋
（６）Ｄ−ガラクトース；−
（７）マルトース；−
（８）シュークロース；−
（９）ラクトース；−
（１０）トレハロース；−
（１１）Ｄ−ソルビトール；−
（１２）Ｄ−マンニトール；＋
（１３）イノシトール；−
（１４）グリセリン；＋
（１５）デンプン；−
（Ｄ）化学分類学的性質
１．ＤＮＡの塩基組成（Ｇ＋Ｃ ｍｏｌ％）；３９．１
２．菌体脂質：
主要キノン；ＭＫ−７
主要脂肪酸；ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、ｉＳＯ−Ｃ１５：０
３．細胞壁ペプチドグリカン ジアミノ酸組成；ｍｅｓｏ−Ａ２ｐｍ
本菌株は、陽性あるいは陰性のグラム染色性を示す好気性桿状細菌で、内生胞子を形成し、運動性はなく、カタラーゼ活性は陽性をオキシダーゼ活性は陰性を示し、ウレアーゼ活性が陽性で、グルコースから酸を生成した。１０℃で生育したが５０℃以上では生育しなかった。化学分類学的性質として、主要キノンはメナキノン−７で、主要脂肪酸はアンテイソＣ１５：０とイソＣ１５：０であり、細胞壁ペプチドグリカンのジアミノ酸組成はメソジアミノピメリン酸で、ＤＮＡのＧＣ含量は３９．１ｍｏｌ％であった。
以上の微生物学的性質を有する菌株の分類学的位置について、パージェイズ・マニュアル・システマテイック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｌ．２、（１９８６）の記載と照合した結果、本菌株は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属関連細菌と推定された。さらに、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属とその関連属の塩基配列を対照にして近隣結合法により分子系統解析を行なった結果、本菌は図１に示すように、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）群にクラスタリングされた。以上の結果より、本菌株をバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌と同定し、バチルス・エスピーＰＶ−６株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＰＶ−６）と命名した。
ＰＶ−７株
（Ａ）形態的性質
１．細胞の形；桿状、大きさ；１．０×２．０〜３．０μｍ
２．細胞の多形性の有無；無
３．運動性の有無；無
４．胞子の有無；有
（Ｂ）培養的性質
肉汁寒天平板培地及び肉汁液体培地における培養的性質を以下に示す。
１．肉汁寒天平板培養（１〜２日間培養）
１）生育の様相；良好
２）色；アイボリー
３）光沢；無
４）拡散性色素；無
２．肉汁液体培養（１〜２日間培養）
１）表面生育；有
２）濁度；有
３．肉汁ゼラチン穿刺培養
１）生育の状態；良好
２）ゼラチンの液化；有
４．リトマス−ミルク反応
１）反応；アルカリ
２）凝固；無
３）液化；無
（Ｃ）生理学的性質
１．グラム染色性；陽性あるいは陰性
２．硝酸塩の還元；コハク酸培地で陽性
３．脱窒反応；陰性
４．ＭＲテスト；陰性
５．ＶＰテスト；陰性
６．インドールの生成；陰性
７．硫化水素の生成；疑わしい
８．デンプンの加水分解；陰性
９．クエン酸の利用；陽性
１０．無機窒素源の利用
１）硝酸塩；陽性
２）アンモニウム塩；陽性
１１．色素の生成；無
１２．ウレアーゼ；陽性
１３．オキシダーゼ；陰性
１４．カタラーゼ；陽性
１５．生育の範囲
１）生育ｐＨ範囲；ｐＨ６〜ｐＨ１０（最適生育ｐＨ７付近）
２）生育温度範囲；１１℃〜４７℃（最適生育温度；３０℃付近）
１６．酸素に対する態度；好気性
１７．Ｏ−Ｆテスト；酸化的
１８．酸の生成（好気的条件）
＋は生成することを、−は生成しないことを、Ｗは弱く生成することをそれぞれ示す。
（１）Ｌ−アラビノース；＋
（２）Ｄ−キシロース；ｗ
（３）Ｄ−グルコース；＋
（４）Ｄ−マンノース；ｗ
（５）Ｄ−フラクトース；ｗ
（６）Ｄ−ガラクトース；−
（７）マルトース；ｗ
（８）シュークロース；＋
（９）ラクトース；−
（１０）トレハロース；ｗ
（１１）Ｄ−ソルビトール；＋
（１２）Ｄ−マンニトール；＋
（１３）イノシトール；ｗ
（１４）グリセリン；＋
（１５）デンプン；ｗ
（Ｄ）化学分類学的性質
１．ＤＮＡの塩基組成（Ｇ＋Ｃ ｍｏｌ％）；３７．９
２．菌体脂質：
主要キノン；ＭＫ−７
主要脂肪酸；ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０
３．細胞壁ペプチドグリカン ジアミノ酸組成；ｍｅｓｏ−Ａ２ｐｍ
本菌株は、陽性あるいは陰性のグラム染色性を示す好気性桿状細菌で、内生胞子を形成し、運動性はなく、カタラーゼ活性は陽性を、オキシダーゼ活性は陰性を示し、ウレアーゼ活性が陽性で、グルコースから酸を生成した。１１℃で生育したが４７℃以上では生育しなかった。化学分類学的性質として、主要キノンはメナキノン−７で、主要脂肪酸はアンテイソ−Ｃ１５：０とアンテイソ−Ｃ１７：０であり、細胞壁ペプチドグリカンのジアミノ酸組成はメソジアミノピメリン酸で、ＤＮＡのＧＣ含量は３７．９ｍｏｌ％であった。以上の微生物学的性質を有する菌株の分類学的位置について、バージェイズ・マニュアル・システマテイック・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）ｖｏｌ．２、（１９８６）の記載と照合した結果、本菌株は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属関連細菌と推定された。
さらに、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属とその関連属の塩基配列を対照にして近隣結合法により分子系統解析を行った結果、本菌は図１に示すように、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）群にクラスタリングされた。以上の結果より、本菌株をバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌と同定し、バチルス・エスピーＰＶ−７株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＰＶ−７）と命名した。
バチルス・エスピーＰＶ−６株およびＰＶ−７株は、平成９年７月３０日付けで日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−６０２９およびＦＥＲＭ ＢＰ−６０３０として寄託されている。
本発明に用いられる微生物の培養に用いられる培地は、本発明の微生物が資化することができる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の微生物の培養を効率的に行なえる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられる。培地中の炭素源の具体例としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、マルトース、スターチ、サッカロース、酢酸、クエン酸等の有機酸、糖蜜等があげられる。
窒素源の具体例としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆ミール、ファーマメディア、魚ミール、各種発酵菌体およびその消化物等があげられる。
無機物の具体例としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等があげられる。
また、必要に応じてチアミン、ビオチン等のビタミン類、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸、アデニン、グアニン等の核酸関連物質等を添加してもよい。
本発明に用いられる微生物の培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。通気撹拌培養の場合は、発泡を防ぐため消泡剤を適量添加するのが好ましい。培養は通常２０〜４０℃、好ましくは２８〜３４℃で、８〜１２０時間行う。培養中ｐＨは６．０〜１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．０に保持する。ｐＨの調整は無機酸あるいは有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
このようにして得られる微生物、該微生物の培養物もしくは菌体またはそれらの処理物、該微生物から抽出した酵素等を本発明の酵素源として用いる。処理物としては、菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的磨砕処理物、溶媒処理物等の菌体処理物、菌体の蛋白分画物、菌体及び菌体処理物の固定化物等があげられる。
化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）から化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）への変換方法は、微生物を培養する培地に予め化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）を添加する方法を用いてもよいし、培養中に化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）を添加する方法を用いてもよい。また、微生物を培養して得られた酵素源を、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）に反応液中で作用させる方法を用いてもよい。
化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）を微生物を培養する培地中に添加する場合、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）は培地１ｍｌ当たり０．１〜３ｍｇ、好ましくは０．２〜１ｍｇを培養の初発または途中に添加する。化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）は、水またはメチルアルコール、エチルアルコール等の有機溶媒に溶解したのち培地に添加することが望ましい。
微生物を培養して得られた酵素源を、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）に反応液中で作用させる方法を用いる場合、用いる酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なる。例えば、酵素源として微生物の培養物もしくは菌体またはそれらの処理物を用いる場合は、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）１ｍｇ当たり５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。反応は、反応液中２０〜４０℃で行うことが好ましく、とくに２８〜３４℃で行うことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、通常２〜１５０時間、好ましくは、７２〜１２０時間である。
反応液としては、水もしくは水性媒体、有機溶媒または、水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等が用いられる。有機溶媒または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液は、例えば化合物（Ｉ−ｂ）を用いる場合好ましく用いられる。
化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）を反応液に添加する場合、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）を溶解することができる水もしくは水性媒体、有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液に溶解し、反応液に添加する。有機溶媒としては、反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等が用いられる。
化合物（Ｉ−ｂ）および化合物（ＩＩ−ｂ）は下記に例示するラクトンの開環方法により、容易に化合物（Ｉ−ａ）および化合物（ＩＩ−ａ）にそれぞれ変換することができる。また、化合物（Ｉ−ａ）および化合物（ＩＩ−ａ）は下記に例示するラクトンの生成方法により容易に化合物（Ｉ−ｂ）および化合物（ＩＩ−ｂ）に変換することができる。
ラクトンの開環方法としては、化合物（Ｉ−ｂ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を水性媒体に溶解し、酸またはアルカリを添加し開環する方法があげられる。水性媒体としては、例えば水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液など反応を阻害しない塩類を含む水溶液があげられる。該水溶液中には、反応を阻害しない濃度のメタノール、エタノール、酢酸エチルなどの有機溶媒を含んでいてもよい。酸としては酢酸、塩酸、硫酸などの酸があげられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどがあげられる。
ラクトンの生成方法としては、化合物（Ｉ−ａ）または化合物化合物（ＩＩ−ａ）を非水系の溶媒に溶解し、酸または塩基触媒を添加しラクトンを形成せる方法があげられる。非水系の溶媒としては実質的に水を含まない有機溶媒で化合物（Ｉ−ａ）または化合物（ＩＩ−ａ）を溶解できるものならばいかなるものでも用いることができる。溶媒としては、たとえばジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルなどがあげられる。触媒としては、ラクトン化反応を触媒し、基質や反応産物にラクトン化以外の作用をおよぼさないものならば、どのようなものでも使用できる。該触媒としては、トリフルオロ酢酸やパラトルエンスルホン酸などがあげられる。反応温度は特に制限はないが、０〜１００℃が好ましく、２０〜８０℃が特に好ましい。
本発明において化合物（ＩＩ−ａ）は、化合物（Ｉ−ａ）に上述の酵素源を作用させて得ることができるが、化合物（Ｉ−ｂ）を上述のラクトンの開環方法を行い化合物（Ｉ−ａ）に変換した後上述の酵素源を作用させて得ることもできるし、また、化合物（Ｉ−ｂ）に上述の酵素源を作用させて化合物（ＩＩ−ｂ）を生成させた後上述のラクトンの開環方法を行うことで得ることもできる。
同様に、化合物（ＩＩ−ｂ）は、化合物（Ｉ−ｂ）に上述の酵素源を作用させて得ることができるが、化合物（Ｉ−ａ）を上述のラクトンの生成方法を行い化合物（Ｉ−ｂ）に変換した後上述の酵素源を作用させて得ることもできるし、また、化合物（Ｉ−ａ）に上述の酵素源を作用させて化合物（ＩＩ−ａ）を生成させた後上述のラクトンの生成方法を行うことで得ることもできる。
反応溶液からの化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）の採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
本発明により得られる化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）の確認または定量方法は、化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を確認または定量できる方法であれば、いずれの方法でも用いられるが、例えば、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マススペクトル、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の方法により行うことができる。
本発明において、化合物（Ｉ−ａ）、化合物（Ｉ−ｂ）、化合物（ＩＩ−ａ）および化合物（ＩＩ−ｂ）の中には、光学異性体等の立体異性体が存在し得るものもあるが、本発明は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
化合物（Ｉ−ａ）としては、一般式（ＩＩＩ−ａ）
（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（ＩＩＩ−ａ）という］が好ましく、一般式（Ｖ−ａ）
（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（Ｖ−ａ）という］がより好ましく、一般式（ＶＩＩ−ａ）
（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（ＶＩＩ−ａ）という］が特に好ましい。
化合物（Ｉ−ｂ）としては、一般式（ＩＩＩ−ｂ）
（式中、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（ＩＩＩ−ｂ）という］が好ましく、一般式（Ｖ−ｂ）
で表される化合物［以下、化合物（Ｖ−ｂ）という］がより好ましく、一般式（ＶＩＩ−ｂ）
で表される化合物［以下、化合物（ＶＩＩ−ｂ）という］が特に好ましい。
化合物（ＩＩ−ａ）としては、一般式（ＩＶ−ａ）
（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（ＩＶ−ａ）という］が好ましく、一般式（ＶＩ−ａ）
（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（ＩＶ−ａ）という］がより好ましく、一般式（ＶＩＩＩ−ａ）
（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（ＶＩＩＩ−ａ）という］が特に好ましい。
化合物（ＩＩ−ｂ）としては、一般式（ＩＶ−ｂ）
（式中、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（ＩＶ−ｂ）という］が好ましく、一般式（ＶＩ−ｂ）
で表される化合物［以下、化合物（ＶＩ−ｂ）という］がより好ましく、一般式（ＶＩＩＩ−ｂ）
で表される化合物［以下、化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）という］が特に好ましい。
以下に本発明の実施例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１
化合物（ＶＩＩ−ｂ）（シグマ社製）１００ｍｇを９．５ｍｌのメタノールに溶解した後、１Ｎ水酸化ナトリウム０．５ｍｌを加えて室温で１時間振とうした。得られた反応液を乾固し脱イオン水５ｍｌを加えて溶解し１Ｎ塩酸約０．１ｍｌでｐＨを約６．５〜７．５に調整し、さらに脱イオン水４．９ｍｌを加えることにより最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌの化合物（ＶＩＩ−ａ−１）［式（ＶＩＩ−ａ）中、Ｒ１がナトリウムである化合物］を１０ｍｌ得た。
バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＡＴＣＣ４５１７株、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）ＡＴＣＣ１４５７４株、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＮＲＲＬ Ｂ−８０２９株、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−６株、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−７株をそれぞれ寒天培地［ペプトン（極東製薬工業製）１％、肉エキス（極東製薬工業製）０．７％、ＮａＣｌ（ナカライデスク社製）０．３％、バクトアガー（ディフコ社製）２％、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整］に塗布し、３０℃で２４時間培養した。寒天培地上に生育した菌株各々一白金耳をｐＨ７．５に調整したＣ培地［グルコース（ナカライテスク社製）２％、肉エキス（極東製薬工業製）１％、イーストエキストラクト（オリエンタル酵母社製）１％、ペプトン（極東製薬工業製）０．１％］３ｍｌを含むＡ−スピッチ管に植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養後の培養液０．０６ｍｌを、ｐＨ７．５に調整したＣ培地３ｍｌを含む１５ｍｌ Ａ−スピッチ管（１６．５×１１５ｍｍ、井内盛栄堂製）に植菌し３０℃で振とう培養した。２４時間培養後、上記で得られた化合物（ＶＩＩ−ａ−１）を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌになるようにそれぞれのＡ−スピッチ管に添加し、添加後２４時間目と７２時間目にグルコースをそれぞれ最終濃度１％になるように添加して計１２０時間反応を行なった。
反応終了後、反応液を酢酸（ナカライテスク社製）でｐＨ４に調整した。この反応液１ｍｌに酢酸エチル（ナカライテスク社製）２ｍｌを加え、１時間振とうした。振どう後、遠心分離機（日立工機製０５Ｐ−２１型）を用いて３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清の酢酸エチル層を回収し、遠心エバポレーター（トミー精工社製ＣＣ−１０１型）で溶媒を除去した後、残渣をメタノール１ｍｌに溶解した。このメタノール溶液の一部を用いてＨＰＬＣ分析［カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（５μｍ，４×２５０ｍｍ，ジーエルサイエンス社製）、カラム温度；６０℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝５５：４５：０．０５、流速：０．９ｍｌ／分、検出波長；２３７ｎｍ］を行った結果、そのリテンションタイムから化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）［式（ＶＩＩＩ−ａ）中、Ｒ１がナトリウムである化合物］の生成が確認された。本条件において、化合物（ＶＩＩ−ａ−１）のリテンションタイムは２．３６分、化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）のリテンションタイムは６．５１分である。実験に用いた全ての菌株で化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）に相当するピークが認められ、例えばバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＮＲＲＬ Ｂ−８０２９株による反応生成物は、２．３６分と６．４７分にピークを認めた。
得られた化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）の量は、バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＡＴＣＣ４５１７株を用いた場合１６．８ｍｇ／ｌ、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）ＡＴＣＣ１４５７４株を用いた場合１０．３ｍｇ／ｌ、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＮＲＲＬＢ−８０２９株を用いた場合１．４ｍｇ／ｌ、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−６株を用いた場合７．３ｍｇ／ｌ、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−７株を用いた場合４２．０ｍｇ／ｌであった。
実施例２
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−７株を実施例１と同様の寒天培地に塗布し、３０℃で２４時間培養し、寒天培地上に生育した菌株を一白金耳をとり、ｐＨ７．５に調整したＣ培地３ｍｌを含む１５ｍｌ Ａ−スピッチ管（１６．５×１１５ｍｍ、井内盛栄堂製）２本に植菌して３０℃で２４時間振とう培養した。培養後の培養液０．０６ｍｌを、ｐＨ７．５に調整したＣ培地３ｍｌを含む１５ｍｌ Ａ−スピッチ管６０本各々に植菌し、３０℃で振とうしながら培養を行なった。培養開始後２４時間目に、実施例１と同様にして得られた化合物（ＶＩＩ−ａ−１）を最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌになるように添加し、培養開始後２４時間目と７２時間目にそれぞれグルコースを最終濃度１％になるように添加し、計１２０時間培養を行った。培養終了後、培養液を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し上清を分取した。この上清のｐＨを酢酸を用いて４．０に調整し、３６０ｍｌの酢酸エチルを添加して３０℃で１時間振とうした。振とう後、静置して上清を回収し、この上清に脱イオン水９０ｍｌを添加して３０℃で３０分振とうして再度上清を回収した。この上清に飽和食塩水９０ｍｌを添加し３０℃で３０分振とうして上清を回収した。
次に、この上清に無水Ｎａ２ＳＯ４を４．５ｇ添加して室温で１５分間放置して脱水した後、減圧下乾固した。得られた残査を脱イオン水５ｍｌに溶解して水酸化ナトリウムでｐＨを９．０に調整し、１００ｍｌのＨＰ−２０カラム（３５×１００ｍｍ、三菱化学製）に通塔した。カラムは３００ｍｌの脱イオン水で洗浄した後、４５％のアセトン水溶液１２０ｍｌで溶出した。分取した画分はＨＰＬＣ分析［分析カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（５μｍ，４×２５０ｍｍ，ジーエルサイエンス社製）、カラム温度；６０℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝５５：４５：０．０５、流速：０．９ｍｌ／分、検出波長；２３７ｎｍ］を行い、化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）を含む画分を回収した。この画分を減圧下でアセトニトリルを除去した後、ｐＨを酢酸を用いて４．０に調整し、３６０ｍｌの酢酸エチルを添加して３０℃で１時間振とうした。振とう後、静置して上清を回収し、この上清に脱イオン水９０ｍｌを添加して３０℃で３０分振とうして再度上清を回収した。この上清に飽和食塩水９０ｍｌを添加し３０℃で３０分振とうして上清を回収した。
次にこの上清に無水Ｎａ２ＳＯ４ ４．５ｇを添加して室温で１５分保持して脱水して減圧下乾固し、得られた残査をジクロルメタンに溶解し、１％のトリフルオロ酢酸を加えてラクトン化した後、分取用ＨＰＬＣ［カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５（２０×２５０ｍｍ、野村化学製）、カラム温度；４０℃、溶媒；５５％メタノール、流量；２０ｍｌ／分、検出波長；２３７ｎｍ］を用いて精製を行なった結果、化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）が５．１ｍｇ得られた。
得られた化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）のマススペクトルおよび１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析の結果は以下の通りである。
マススペクトル
日本電子製ＪＭＳ−ＨＸ／ＨＸ１１０Ａ質量分析計を用い、マトリックスにｍ−ニトロベンジルアルコールを使用してポジティブモードで測定した。その結果、ｍ／ｚ ４０７に擬似分子イオンピーク（［Ｍ＋Ｈ］＋）を与え、化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）の構造および分子量（４０６）から期待される数値に一致した。
１ Ｈ−ＮＭＲ スペクトル
日本電子製ＪＮＭ−α４００型スペクトロメータを用い、重クロロホルム中、内部標準にＴＭＳを使用し４００ＭＨｚで測定した。その結果を以下に示す。このスペクトルデータは化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）の公知のデータ［三共研究所年報，３７，１４７（１９８５）］と一致した。
δｐｐｍ（ＣＤＣｌ３）：６．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），５．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５，５．９Ｈｚ），５．５８（１Ｈ，ｍ），５．４１（１Ｈ，ｍ），４．６０（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１０．６，７．３，５．４，２．８Ｈｚ），４．４０（１Ｈ，ｍ），４．３８（１Ｈ，ｍ），２．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．６，５．１Ｈｚ），２．６１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１７．６，３．７，１．５Ｈｚ），２．５９（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１３．１，６．０，４．８，１．５Ｈｚ），２．４０（１Ｈ，ｍ），２．３６（１Ｈ，ｍ），２．３４（１Ｈ，ｍ），１．９５（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１４．４，３．７，２．９，１．７Ｈｚ），１．８６（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１２．５，１２．３，７．３，４．３Ｈｚ），１．６９（１Ｈ，ｍ），１．６８（１Ｈ，ｍ），１．６４（１Ｈ，ｍ），１．５７（１Ｈ，ｍ），１．５〜１．４（２Ｈ，ｍ），１．４３（１Ｈ，ｍ），１．３０（１Ｈ，ｍ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）
実施例３
実施例１と同様にして、化合物（ＶＩＩ−ａ−１）［式（ＶＩＩ−ａ）中、Ｒ１がナトリウムである化合物］を得た。
バチルス・アルベイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）ＡＴＣＣ６３４４株、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＮＴＣＴ−２６１０株、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）ＮＣＩＢ−９３６８株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１０７７８株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１１５６２株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１３４０２株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１５１７７株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１５４５０株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１９２１３株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３２株、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−２０６４株、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６０５１株をそれぞれ寒天培地［ペプトン（極東製薬工業製）１％、肉エキス（極東製薬工業製）０．７％、ＮａＣｌ（ナカライテスク社製）０．３％、バクトアガー（ディフコ社製）２％、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整］に塗布し、３０℃で２４時間培養した。寒天培地上に生育した菌株各々一白金耳をｐＨ７．４に調整したしＢＧ培地［グルコース（ナカライテスク社製）２％、バクトトリプトン（ディフコ社製）１％、イーストエキストラクト（ディフコ社製）０．５％、ＮａＣｌ（ナカライテスク社製）０．５％］３ｍｌを含む試験管（１３×１６５ｍｍ）に植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養後の培養液０．２ｍｌを、ｐＨ７．４に調整したＬＢＧＣａ培地［グルコース（ナカライテスク社製）２％、バクトトリプトン（ディフコ社製）１％、イーストエキストラクト（ディフコ社製）０．５％、ＮａＣｌ（ナカライテスク社製）０．５％、炭酸カルシウム（国産化学社製）０．５％］１０ｍｌを含む試験管（２１×２００ｍｍ）に植菌し３０℃で振とう培養した。２４時間培養後、培養液１ｍｌを１３ｍｌ容ポリプロピレンチューブ（ＳＡＲＳＴＥＤＴ社製、輸入元アシスト社、Ｎｏ．６０ ５４０Ｓ）にとり、化合物（ＶＩＩ−ａ−１）を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌ、グルコースを最終濃度１％になるようにそれぞれ添加して４８時間反応を行なった。
反応終了後、反応液を酢酸（ナカライテスク社製）でｐＨ４に調整した。この反応液１ｍｌに酢酸エチル（ナカライテスク社製）２ｍｌを加え、１時間振とうした。振とう後、遠心分離機（日立工機製０５Ｐ−２１型）を用いて３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清の酢酸エチル層を回収し、遠心エバポレーター（トミー精工社製ＣＣ−１０１型）で溶媒を除去した後、残渣をメタノール１ｍｌに溶解した。このメタノール溶液の一部を用いてＨＰＬＣ分析［カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（５μｍ，４×２５０ｍｍ，ジーエルサイエンス社製）、カラム温度；６０℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝５５：４５：０．０５、流速：０．９ｍｌ／分、検出波長；２３７ｎｍ］を行った結果、そのリテンションタイムから化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）［式（ＶＩＩＩ−ａ）中、Ｒ１がナトリウムである化合物］の生成が確認された。
得られた化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）の量はバチルス・アルベイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）ＡＴＣＣ６３４４株を用いた場合０．１８ｍｇ／ｌ、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＮＴＣＴ−２６１０株を用いた場合０．１８ｍｇ／ｌ、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）ＮＣＩＢ−９３６８株を用いた場合０．３２ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１０７７８株を用いた場合８．４ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１１５６２株を用いた場合０．３１ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１３４０２株を用いた場合１．３０ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１５１７７株を用いた場合１．６０ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１５４５０株を用いた場合０．５８ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１９２１３株を用いた場合０．１６ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３２株を用いた場合９．２０ｍｇ／ｌ、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−２０６４株を用いた場合０．１７ｍｇ／ｌ、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６０５１株を用いた場合１．１１ｍｇ／ｌであった。
実施例４
バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＡＴＣＣ４５１７株を実施例１と同様の寒天培地に塗布し、３０℃で２４時間培養し、寒天培地上に生育した菌株を一白金耳をとり、ｐＨ７．５に調整したＣ培地３ｍｌを含む１５ｍｌ Ａ−スピッチ管（１６．５×１１５ｍｍ、井内盛栄堂製）２本に植菌して３０℃で２４時間振とう培養した。培養後の培養液０．０６ｍｌを、ｐＨ７．５に調整したＣ培地３ｍｌを含む１５ｍｌ Ａ−スピッチ管６０本各々に植菌し、３０℃で振とうしながら培養を行なった。培養開始後２４時間目に、実施例１と同様にして得られた化合物（ＶＩＩ−ａ−１）を最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌになるように添加し、培養開始後２４時間目と７２時間目にそれぞれグルコースを最終濃度１％になるように添加し、計１２０時間振とうしながら培養を行った。培養終了後、培養液を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し上清を分取した。この上清のｐＨを１Ｎ塩酸を用いて３．０に調整し、３６０ｍｌの酢酸エチルを添加して振とうした後、静置して上清を回収する操作を３回行った。この上清に脱イオン水９０ｍｌを添加して振とうした後、上清を回収した。この上清に飽和食塩水９０ｍｌを添加して振とうした後、上清を回収した。
次に、この上清に無水Ｎａ２ＳＯ４を４．５ｇ添加して室温で１５分間放置して脱水した後、減圧下乾固した。得られた残査を脱イオン水５ｍｌに溶解して水酸化ナトリウムでｐＨを９．０に調整し、５０ｍｌのＨＰ−２０カラム（２５×１００ｍｍ、三菱化学製）に通塔した。カラムは１５０ｍｌの脱イオン水で洗浄した後、アセトン含量２０％、３０％、４０％のアセトン水溶液１００ｍｌで段階的に溶出した。分取した画分はＨＰＬＣ分析［分析カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（５μｍ，４×２５０ｍｍ，ジーエルサイエンス社製）、カラム温度；６０℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝５５：４５：０．０５、流速：０．９ｍｌ／分、 ｂ検出波長；２３７ｎｍ］を行い、リテンションタイムから化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）を含む両分を回収した。この両分を減圧下でアセトニトリルを除去した後、ｐＨを１Ｎ塩酸を用いて３．０に調整し、３６０ｍｌの酢酸エチルを添加して振とうした。振とう後、静置して上清を回収し、この上清に脱イオン水９０ｍｌを添加して振とうして再度上清を回収した。この上清に飽和食塩水９０ｍｌを添加し振とうして上清を回収した。
次にこの上清に無水Ｎａ２ＳＯ４４．５ｇを添加して室温で１５分間保持して脱水して減圧乾固し、得られた残査をジクロルメタンに溶解し、１％のトリフルオロ酢酸を加えてラクトン化した後、分取用ＴＬＣ［シリカゲル板；Ｎｏ．１．０５７４４（２００×２００ｍｍ，０．５ｍｍ厚）ＭＥＲＣＫ社製、展開溶媒；酢酸エチル、発色液；１２．５％リンモリブデン酸・１％硫酸セリウム／１０％硫酸溶液］を用いて精製を行なった結果、化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）が０．８ｍｇ得られた。得られた化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）のマススペクトルおよび１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析の結果は以下の通りである。
マススペクトル
日本電子製ＪＭＳ−ＨＸ／ＨＸ１１０Ａ質量分析計を用い、マトリックスにｍ−ニトロベンジルアルコールを使用してポジティブモードで測定した。その結果、ｍ／ｚ ４０７に擬似分子イオンピーク（［Ｍ＋Ｈ］＋）を与え、化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）の構造および分子量（４０６）から期待される数値に一致した。
また、高分解能ＦＡＢ ＭＳ測定の結果、ｍ／ｚ ４０７．２４４０に擬似分子イオンピーク（［Ｍ＋Ｈ］＋）を与え、化合物の分子式（Ｃ２３Ｈ３４Ｏ６）から期待される計算値（ｍ／ｚ ４０７．２４３４：Ｃ２３Ｈ３５Ｏ６）に測定誤差範囲内で一致した。
１ Ｈ−ＮＭＲスペクトル
日本電子製ＪＮＭ−ＬＡ３００型核磁気共鳴装置を用い、重クロロホルム中、内部標準にクロロホルム（δ ７．２６ｐｐｍ）を使用し、３００ＭＨｚで測定した。その結果を以下に示す。このスペクトルデータは化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）の公知のデータ［三共研究所年報，３７，１４７（１９８５）］と一致した。
δｐｐｍ（ＣＤＣｌ３）：６．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），５．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７，５．７Ｈｚ），５．５８（１Ｈ，ｍ），５．４１（１Ｈ，ｍ），４．６１（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１０．９，７．８，５．１，２．９Ｈｚ），４．４５−４．３５（１Ｈ，ｍ），４．３８（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝５．０，３．９Ｈｚ），２．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．６，５．０Ｈｚ），２．６２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１７．６，３．９，１．７Ｈｚ），２．５９（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１３．５，６．６，４．８，１．６Ｈｚ），２．４５−２．３５（１Ｈ，ｍ），２．３６（１Ｈ，ｓｅｘ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．４０−２．３０（１Ｈ，ｍ），１．９５（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１４．４，３．９，２．９，１．７Ｈｚ），１．９０−１．８０（１Ｈ，ｍ），１．７５−１．６０（１Ｈ，ｍ），１．６８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．４，１０．９，３．９Ｈｚ），１．６５（１Ｈ，ｄｑｕ，Ｊ＝１３．６，７．５Ｈｚ），１．６５−１．５０（１Ｈ，ｍ），１．４３（１Ｈ，ｄｑｕ，Ｊ＝１３．６，７Ｈｚ），１．５０−１．３５（２Ｈ，ｍ），１．３５−１．２５（１Ｈ，ｍ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）
産業上の利用可能性
本発明によりＨＭＧ−ＣＯＡレダクタ−ゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を有する化合物を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、１６ＳｒＲＮＡ塩基配列を元にしたバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−６株およびバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−７菌株の近隣結合法による分子系統解析を示す。
本発明は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクタ−ゼ（以下、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ−ゼと略記する。）を阻害し、血清コレステロールの低下作用等を有する化合物の製造法に関する。
背景技術
一般式（ＶＩ−ａ）
一般式（Ｖ−ａ）
上記の微生物は放線菌または糸状菌に属している。本発明のごとく、細菌に属し、上記化合物（Ｖ−ａ）または化合物（Ｖ−ｂ）からそれぞれ、化合物（ＶＩ−ａ）または化合物（ＶＩ−ｂ）を生成する能力を有する微生物は知られていない。放線菌や糸状菌は細菌に比べて増殖が遅いため、反応に必要な菌体量を取得するのに時間がかかるという欠点がある。また、放線菌や糸状菌は発酵槽での培養管理が難しいという問題点もある。放線菌や糸状菌は菌糸を伸ばして増殖するため、発酵槽で増殖させると培養液の粘度が上昇する。このため酸素が不足しやすく、培養液が不均一になるため反応効率の低下を招きやすい。この酸素不足を解消し、培養液を均一に保つためには、発酵槽の攪拌速度を上げなければならないが、攪拌速度を上げると菌糸が剪断され、微生物の活性が低下しやすい［発酵工学の基礎、ｐ１６９〜１９０，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｓｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋａｅｒ著、学会出版センター（１９８８）］。このように放線菌や糸状菌は培養を行なう上で問題があるが、細菌は菌糸を形成しないため、培養液の粘度は上がりにくく、通気不足や培養液が不均一になることは少なく、培養管理が容易である。
遺伝子組換え技術で、遺伝子を大腸菌等の細菌で発現させることはよく行われているが、放線菌や糸状菌の遺伝子はアミノ酸を規定するコドンが大腸菌等の細菌と大きく異なるため、効率よく発現することは一般に難しい。
放線菌で遺伝子を高発現するためのベクター、プロモーター等の材料は限られており、遺伝子を高発現し、より効率よく反応を行なうためにはベクター、プロモーター等が数多く利用できる細菌を用いることが望ましい。細菌の遺伝子であれば容易に細菌で高発現することができる。
発明の開示
本発明の目的は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクタ−ゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を有する化合物の製造法を提供することにある。
本発明は、バチルス属に属する微生物由来でかつ、一般式（Ｉ−ａ）
アルキルとしては、直鎖または分岐状の、炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のアルキルであり、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、これら各種分岐鎖異性体等があげられる。
アリールとしては、フェニル、ナフチル等があげられる。
置換アルキルにおける置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシ、アリール等があげられる
置換アリールにおける置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、アルキル、アルコキシ等があげられる。
アルコキシにおけるアルキル部分は上述のアルキルと同義である。
アルカリ金属とは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウムの各元素を表す。
本発明で用いられる酵素源は、バチルス属に属する微生物由来であって、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）から、それぞれ化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を生成する活性を有する酵素源であれば、バチルス属に属し、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）から、化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を生成する活性を有する微生物、該微生物の培養物もしくは菌体またはそれらの処理物、該微生物から抽出した酵素等いずれでも用いられる。
バチルス属に属し、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）から、化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を生成する活性を有する微生物としては、例えば、バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）バチルス・アルベイ（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する微生物等があげられる。
さらに具体的には、バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＡＴＣＣ４５１７株、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）ＡＴＣＣ１４５７４株、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＮＲＲＬ Ｂ−８０２９株、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−６株、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−７株、バチルス・アルベイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）ＡＴＣＣ６３４４株、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＮＴＣＴ−２６１０株、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）ＮＣＩＢ−９３６８株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１０７７８株、バチルス・メガテリウム ＡＴＣＣ１１５６２株、バチルス・メガテリウム ＡＴＣＣ１３４０２株、バチルス・メガテリウム ＡＴＣＣ１５１７７株、バチルス・メガテリウム ＡＴＣＣ１５４５０株、バチルス・メガテリウム ＡＴＣＣ１９２１３株、バチルス・メガテリウム ＩＡＭ１０３２株、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−２０６４株またはバチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣ０６０５１株等の微生物があげられる。
また、これらの微生物の継代培養体、突然変異体もしくは誘導体、遺伝子組換え技術により製造した組み換え体等も用いられる。バチルス・エスピーＰＶ−６株及びＰＶ−７株は、本発明者によって土壌より新たに分離された菌株であり、それらの菌学的性質は以下の通りである。
ＰＶ−６株
（Ａ）形態的性質
１．細胞の形；桿状、大きさ；０．８〜１．２×２．０〜４．０μｍ
２．細胞の多形性の有無；無
３．運動性の有無；無
４．胞子の有無；観察されない
（Ｂ）培養的性質
肉汁寒天平板培地及び肉汁液体培地における培養的性質を以下に示す。
１．肉汁寒天平板培養（１〜２日間培養）
１）生育の様相；良好
２）色；クリーム
３）光沢；有
４）拡散性色素；無
２．肉汁液体培養（１〜２日間培養）
１）表面生育；無
２）濁度；有
３．肉汁ゼラチン穿刺培養
１）生育の状態；良好
２）ゼラチンの液化；有
４．リトマス−ミルク反応
１）反応；アルカリ
２）凝固；無
３）液化；無
（Ｃ）生理学的性質
１．グラム染色性；陽性あるいは陰性
２．硝酸塩の還元；陰性
３．脱窒反応；陽性
４．ＭＲテスト；陰性
５．ＶＰテスト；陰性
６．インドールの生成；陰性
７．硫化水素の生成；陽性
８．デンプンの加水分解；陰性
９．クエン酸の利用；陽性
１０．無機窒素源の利用
１）硝酸塩；陰性
２）アンモニウム塩；陽性
１１．色素の生成；無
１２．ウレアーゼ；陽性
１３．オキシダーゼ；陰性
１４．カタラーゼ；陽性
１５．生育の範囲
１）生育ｐＨ範囲；ｐＨ６〜ｐＨ９（最適生育ｐＨ７付近）
２）生育温度範囲；６℃〜４０℃（最適生育温度；３０℃付近）
１６．酸素に対する態度；好気性
１７．Ｏ−Ｆテスト；酸化的
１８．酸の生成（好気的条件）
＋は生成することを、−は生成しないことをそれぞれ示す。
（１）Ｌ−アラビノース；−
（２）Ｄ−キシロース；−
（３）Ｄ−グルコース；＋
（４）Ｄ−マンノース；−
（５）Ｄ−フラクトース；＋
（６）Ｄ−ガラクトース；−
（７）マルトース；−
（８）シュークロース；−
（９）ラクトース；−
（１０）トレハロース；−
（１１）Ｄ−ソルビトール；−
（１２）Ｄ−マンニトール；＋
（１３）イノシトール；−
（１４）グリセリン；＋
（１５）デンプン；−
（Ｄ）化学分類学的性質
１．ＤＮＡの塩基組成（Ｇ＋Ｃ ｍｏｌ％）；３９．１
２．菌体脂質：
主要キノン；ＭＫ−７
主要脂肪酸；ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、ｉＳＯ−Ｃ１５：０
３．細胞壁ペプチドグリカン ジアミノ酸組成；ｍｅｓｏ−Ａ２ｐｍ
本菌株は、陽性あるいは陰性のグラム染色性を示す好気性桿状細菌で、内生胞子を形成し、運動性はなく、カタラーゼ活性は陽性をオキシダーゼ活性は陰性を示し、ウレアーゼ活性が陽性で、グルコースから酸を生成した。１０℃で生育したが５０℃以上では生育しなかった。化学分類学的性質として、主要キノンはメナキノン−７で、主要脂肪酸はアンテイソＣ１５：０とイソＣ１５：０であり、細胞壁ペプチドグリカンのジアミノ酸組成はメソジアミノピメリン酸で、ＤＮＡのＧＣ含量は３９．１ｍｏｌ％であった。
以上の微生物学的性質を有する菌株の分類学的位置について、パージェイズ・マニュアル・システマテイック・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、ｖｏｌ．２、（１９８６）の記載と照合した結果、本菌株は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属関連細菌と推定された。さらに、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属とその関連属の塩基配列を対照にして近隣結合法により分子系統解析を行なった結果、本菌は図１に示すように、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）群にクラスタリングされた。以上の結果より、本菌株をバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌と同定し、バチルス・エスピーＰＶ−６株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＰＶ−６）と命名した。
ＰＶ−７株
（Ａ）形態的性質
１．細胞の形；桿状、大きさ；１．０×２．０〜３．０μｍ
２．細胞の多形性の有無；無
３．運動性の有無；無
４．胞子の有無；有
（Ｂ）培養的性質
肉汁寒天平板培地及び肉汁液体培地における培養的性質を以下に示す。
１．肉汁寒天平板培養（１〜２日間培養）
１）生育の様相；良好
２）色；アイボリー
３）光沢；無
４）拡散性色素；無
２．肉汁液体培養（１〜２日間培養）
１）表面生育；有
２）濁度；有
３．肉汁ゼラチン穿刺培養
１）生育の状態；良好
２）ゼラチンの液化；有
４．リトマス−ミルク反応
１）反応；アルカリ
２）凝固；無
３）液化；無
（Ｃ）生理学的性質
１．グラム染色性；陽性あるいは陰性
２．硝酸塩の還元；コハク酸培地で陽性
３．脱窒反応；陰性
４．ＭＲテスト；陰性
５．ＶＰテスト；陰性
６．インドールの生成；陰性
７．硫化水素の生成；疑わしい
８．デンプンの加水分解；陰性
９．クエン酸の利用；陽性
１０．無機窒素源の利用
１）硝酸塩；陽性
２）アンモニウム塩；陽性
１１．色素の生成；無
１２．ウレアーゼ；陽性
１３．オキシダーゼ；陰性
１４．カタラーゼ；陽性
１５．生育の範囲
１）生育ｐＨ範囲；ｐＨ６〜ｐＨ１０（最適生育ｐＨ７付近）
２）生育温度範囲；１１℃〜４７℃（最適生育温度；３０℃付近）
１６．酸素に対する態度；好気性
１７．Ｏ−Ｆテスト；酸化的
１８．酸の生成（好気的条件）
＋は生成することを、−は生成しないことを、Ｗは弱く生成することをそれぞれ示す。
（１）Ｌ−アラビノース；＋
（２）Ｄ−キシロース；ｗ
（３）Ｄ−グルコース；＋
（４）Ｄ−マンノース；ｗ
（５）Ｄ−フラクトース；ｗ
（６）Ｄ−ガラクトース；−
（７）マルトース；ｗ
（８）シュークロース；＋
（９）ラクトース；−
（１０）トレハロース；ｗ
（１１）Ｄ−ソルビトール；＋
（１２）Ｄ−マンニトール；＋
（１３）イノシトール；ｗ
（１４）グリセリン；＋
（１５）デンプン；ｗ
（Ｄ）化学分類学的性質
１．ＤＮＡの塩基組成（Ｇ＋Ｃ ｍｏｌ％）；３７．９
２．菌体脂質：
主要キノン；ＭＫ−７
主要脂肪酸；ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１５：０、ａｎｔｅｉｓｏ−Ｃ１７：０
３．細胞壁ペプチドグリカン ジアミノ酸組成；ｍｅｓｏ−Ａ２ｐｍ
本菌株は、陽性あるいは陰性のグラム染色性を示す好気性桿状細菌で、内生胞子を形成し、運動性はなく、カタラーゼ活性は陽性を、オキシダーゼ活性は陰性を示し、ウレアーゼ活性が陽性で、グルコースから酸を生成した。１１℃で生育したが４７℃以上では生育しなかった。化学分類学的性質として、主要キノンはメナキノン−７で、主要脂肪酸はアンテイソ−Ｃ１５：０とアンテイソ−Ｃ１７：０であり、細胞壁ペプチドグリカンのジアミノ酸組成はメソジアミノピメリン酸で、ＤＮＡのＧＣ含量は３７．９ｍｏｌ％であった。以上の微生物学的性質を有する菌株の分類学的位置について、バージェイズ・マニュアル・システマテイック・バクテリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）ｖｏｌ．２、（１９８６）の記載と照合した結果、本菌株は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属関連細菌と推定された。
さらに、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属とその関連属の塩基配列を対照にして近隣結合法により分子系統解析を行った結果、本菌は図１に示すように、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）群にクラスタリングされた。以上の結果より、本菌株をバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌と同定し、バチルス・エスピーＰＶ−７株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＰＶ−７）と命名した。
バチルス・エスピーＰＶ−６株およびＰＶ−７株は、平成９年７月３０日付けで日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４６）通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にそれぞれＦＥＲＭ ＢＰ−６０２９およびＦＥＲＭ ＢＰ−６０３０として寄託されている。
本発明に用いられる微生物の培養に用いられる培地は、本発明の微生物が資化することができる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の微生物の培養を効率的に行なえる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも用いられる。培地中の炭素源の具体例としては、グルコース、フラクトース、グリセロール、マルトース、スターチ、サッカロース、酢酸、クエン酸等の有機酸、糖蜜等があげられる。
窒素源の具体例としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆ミール、ファーマメディア、魚ミール、各種発酵菌体およびその消化物等があげられる。
無機物の具体例としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等があげられる。
また、必要に応じてチアミン、ビオチン等のビタミン類、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸、アデニン、グアニン等の核酸関連物質等を添加してもよい。
本発明に用いられる微生物の培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。通気撹拌培養の場合は、発泡を防ぐため消泡剤を適量添加するのが好ましい。培養は通常２０〜４０℃、好ましくは２８〜３４℃で、８〜１２０時間行う。培養中ｐＨは６．０〜１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜７．０に保持する。ｐＨの調整は無機酸あるいは有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
このようにして得られる微生物、該微生物の培養物もしくは菌体またはそれらの処理物、該微生物から抽出した酵素等を本発明の酵素源として用いる。処理物としては、菌体の乾燥物、凍結乾燥物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機械的磨砕処理物、溶媒処理物等の菌体処理物、菌体の蛋白分画物、菌体及び菌体処理物の固定化物等があげられる。
化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）から化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）への変換方法は、微生物を培養する培地に予め化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）を添加する方法を用いてもよいし、培養中に化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）を添加する方法を用いてもよい。また、微生物を培養して得られた酵素源を、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）に反応液中で作用させる方法を用いてもよい。
化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）を微生物を培養する培地中に添加する場合、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）は培地１ｍｌ当たり０．１〜３ｍｇ、好ましくは０．２〜１ｍｇを培養の初発または途中に添加する。化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）は、水またはメチルアルコール、エチルアルコール等の有機溶媒に溶解したのち培地に添加することが望ましい。
微生物を培養して得られた酵素源を、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）に反応液中で作用させる方法を用いる場合、用いる酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なる。例えば、酵素源として微生物の培養物もしくは菌体またはそれらの処理物を用いる場合は、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）１ｍｇ当たり５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。反応は、反応液中２０〜４０℃で行うことが好ましく、とくに２８〜３４℃で行うことが好ましい。反応時間は用いる酵素源の量および比活性等により異なるが、通常２〜１５０時間、好ましくは、７２〜１２０時間である。
反応液としては、水もしくは水性媒体、有機溶媒または、水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等が用いられる。有機溶媒または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液は、例えば化合物（Ｉ−ｂ）を用いる場合好ましく用いられる。
化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）を反応液に添加する場合、化合物（Ｉ−ａ）または化合物（Ｉ−ｂ）を溶解することができる水もしくは水性媒体、有機溶媒、または水もしくは水性媒体と有機溶媒との混合液に溶解し、反応液に添加する。有機溶媒としては、反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えば、アセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メチルアルコール、エチルアルコール、ブタノール等が用いられる。
化合物（Ｉ−ｂ）および化合物（ＩＩ−ｂ）は下記に例示するラクトンの開環方法により、容易に化合物（Ｉ−ａ）および化合物（ＩＩ−ａ）にそれぞれ変換することができる。また、化合物（Ｉ−ａ）および化合物（ＩＩ−ａ）は下記に例示するラクトンの生成方法により容易に化合物（Ｉ−ｂ）および化合物（ＩＩ−ｂ）に変換することができる。
ラクトンの開環方法としては、化合物（Ｉ−ｂ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を水性媒体に溶解し、酸またはアルカリを添加し開環する方法があげられる。水性媒体としては、例えば水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液など反応を阻害しない塩類を含む水溶液があげられる。該水溶液中には、反応を阻害しない濃度のメタノール、エタノール、酢酸エチルなどの有機溶媒を含んでいてもよい。酸としては酢酸、塩酸、硫酸などの酸があげられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどがあげられる。
ラクトンの生成方法としては、化合物（Ｉ−ａ）または化合物化合物（ＩＩ−ａ）を非水系の溶媒に溶解し、酸または塩基触媒を添加しラクトンを形成せる方法があげられる。非水系の溶媒としては実質的に水を含まない有機溶媒で化合物（Ｉ−ａ）または化合物（ＩＩ−ａ）を溶解できるものならばいかなるものでも用いることができる。溶媒としては、たとえばジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチルなどがあげられる。触媒としては、ラクトン化反応を触媒し、基質や反応産物にラクトン化以外の作用をおよぼさないものならば、どのようなものでも使用できる。該触媒としては、トリフルオロ酢酸やパラトルエンスルホン酸などがあげられる。反応温度は特に制限はないが、０〜１００℃が好ましく、２０〜８０℃が特に好ましい。
本発明において化合物（ＩＩ−ａ）は、化合物（Ｉ−ａ）に上述の酵素源を作用させて得ることができるが、化合物（Ｉ−ｂ）を上述のラクトンの開環方法を行い化合物（Ｉ−ａ）に変換した後上述の酵素源を作用させて得ることもできるし、また、化合物（Ｉ−ｂ）に上述の酵素源を作用させて化合物（ＩＩ−ｂ）を生成させた後上述のラクトンの開環方法を行うことで得ることもできる。
同様に、化合物（ＩＩ−ｂ）は、化合物（Ｉ−ｂ）に上述の酵素源を作用させて得ることができるが、化合物（Ｉ−ａ）を上述のラクトンの生成方法を行い化合物（Ｉ−ｂ）に変換した後上述の酵素源を作用させて得ることもできるし、また、化合物（Ｉ−ａ）に上述の酵素源を作用させて化合物（ＩＩ−ａ）を生成させた後上述のラクトンの生成方法を行うことで得ることもできる。
反応溶液からの化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）の採取は、通常の有機合成化学で用いられる方法、例えば、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
本発明により得られる化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）の確認または定量方法は、化合物（ＩＩ−ａ）または化合物（ＩＩ−ｂ）を確認または定量できる方法であれば、いずれの方法でも用いられるが、例えば、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マススペクトル、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の方法により行うことができる。
本発明において、化合物（Ｉ−ａ）、化合物（Ｉ−ｂ）、化合物（ＩＩ−ａ）および化合物（ＩＩ−ｂ）の中には、光学異性体等の立体異性体が存在し得るものもあるが、本発明は、これらを含め、全ての可能な異性体およびそれらの混合物を包含する。
化合物（Ｉ−ａ）としては、一般式（ＩＩＩ−ａ）
化合物（Ｉ−ｂ）としては、一般式（ＩＩＩ−ｂ）
化合物（ＩＩ−ａ）としては、一般式（ＩＶ−ａ）
化合物（ＩＩ−ｂ）としては、一般式（ＩＶ−ｂ）
以下に本発明の実施例を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例１
化合物（ＶＩＩ−ｂ）（シグマ社製）１００ｍｇを９．５ｍｌのメタノールに溶解した後、１Ｎ水酸化ナトリウム０．５ｍｌを加えて室温で１時間振とうした。得られた反応液を乾固し脱イオン水５ｍｌを加えて溶解し１Ｎ塩酸約０．１ｍｌでｐＨを約６．５〜７．５に調整し、さらに脱イオン水４．９ｍｌを加えることにより最終濃度が１０ｍｇ／ｍｌの化合物（ＶＩＩ−ａ−１）［式（ＶＩＩ−ａ）中、Ｒ１がナトリウムである化合物］を１０ｍｌ得た。
バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＡＴＣＣ４５１７株、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）ＡＴＣＣ１４５７４株、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＮＲＲＬ Ｂ−８０２９株、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−６株、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−７株をそれぞれ寒天培地［ペプトン（極東製薬工業製）１％、肉エキス（極東製薬工業製）０．７％、ＮａＣｌ（ナカライデスク社製）０．３％、バクトアガー（ディフコ社製）２％、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整］に塗布し、３０℃で２４時間培養した。寒天培地上に生育した菌株各々一白金耳をｐＨ７．５に調整したＣ培地［グルコース（ナカライテスク社製）２％、肉エキス（極東製薬工業製）１％、イーストエキストラクト（オリエンタル酵母社製）１％、ペプトン（極東製薬工業製）０．１％］３ｍｌを含むＡ−スピッチ管に植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養後の培養液０．０６ｍｌを、ｐＨ７．５に調整したＣ培地３ｍｌを含む１５ｍｌ Ａ−スピッチ管（１６．５×１１５ｍｍ、井内盛栄堂製）に植菌し３０℃で振とう培養した。２４時間培養後、上記で得られた化合物（ＶＩＩ−ａ−１）を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌになるようにそれぞれのＡ−スピッチ管に添加し、添加後２４時間目と７２時間目にグルコースをそれぞれ最終濃度１％になるように添加して計１２０時間反応を行なった。
反応終了後、反応液を酢酸（ナカライテスク社製）でｐＨ４に調整した。この反応液１ｍｌに酢酸エチル（ナカライテスク社製）２ｍｌを加え、１時間振とうした。振どう後、遠心分離機（日立工機製０５Ｐ−２１型）を用いて３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清の酢酸エチル層を回収し、遠心エバポレーター（トミー精工社製ＣＣ−１０１型）で溶媒を除去した後、残渣をメタノール１ｍｌに溶解した。このメタノール溶液の一部を用いてＨＰＬＣ分析［カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（５μｍ，４×２５０ｍｍ，ジーエルサイエンス社製）、カラム温度；６０℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝５５：４５：０．０５、流速：０．９ｍｌ／分、検出波長；２３７ｎｍ］を行った結果、そのリテンションタイムから化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）［式（ＶＩＩＩ−ａ）中、Ｒ１がナトリウムである化合物］の生成が確認された。本条件において、化合物（ＶＩＩ−ａ−１）のリテンションタイムは２．３６分、化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）のリテンションタイムは６．５１分である。実験に用いた全ての菌株で化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）に相当するピークが認められ、例えばバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＮＲＲＬ Ｂ−８０２９株による反応生成物は、２．３６分と６．４７分にピークを認めた。
得られた化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）の量は、バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＡＴＣＣ４５１７株を用いた場合１６．８ｍｇ／ｌ、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）ＡＴＣＣ１４５７４株を用いた場合１０．３ｍｇ／ｌ、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＮＲＲＬＢ−８０２９株を用いた場合１．４ｍｇ／ｌ、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−６株を用いた場合７．３ｍｇ／ｌ、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−７株を用いた場合４２．０ｍｇ／ｌであった。
実施例２
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−７株を実施例１と同様の寒天培地に塗布し、３０℃で２４時間培養し、寒天培地上に生育した菌株を一白金耳をとり、ｐＨ７．５に調整したＣ培地３ｍｌを含む１５ｍｌ Ａ−スピッチ管（１６．５×１１５ｍｍ、井内盛栄堂製）２本に植菌して３０℃で２４時間振とう培養した。培養後の培養液０．０６ｍｌを、ｐＨ７．５に調整したＣ培地３ｍｌを含む１５ｍｌ Ａ−スピッチ管６０本各々に植菌し、３０℃で振とうしながら培養を行なった。培養開始後２４時間目に、実施例１と同様にして得られた化合物（ＶＩＩ−ａ−１）を最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌになるように添加し、培養開始後２４時間目と７２時間目にそれぞれグルコースを最終濃度１％になるように添加し、計１２０時間培養を行った。培養終了後、培養液を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し上清を分取した。この上清のｐＨを酢酸を用いて４．０に調整し、３６０ｍｌの酢酸エチルを添加して３０℃で１時間振とうした。振とう後、静置して上清を回収し、この上清に脱イオン水９０ｍｌを添加して３０℃で３０分振とうして再度上清を回収した。この上清に飽和食塩水９０ｍｌを添加し３０℃で３０分振とうして上清を回収した。
次に、この上清に無水Ｎａ２ＳＯ４を４．５ｇ添加して室温で１５分間放置して脱水した後、減圧下乾固した。得られた残査を脱イオン水５ｍｌに溶解して水酸化ナトリウムでｐＨを９．０に調整し、１００ｍｌのＨＰ−２０カラム（３５×１００ｍｍ、三菱化学製）に通塔した。カラムは３００ｍｌの脱イオン水で洗浄した後、４５％のアセトン水溶液１２０ｍｌで溶出した。分取した画分はＨＰＬＣ分析［分析カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（５μｍ，４×２５０ｍｍ，ジーエルサイエンス社製）、カラム温度；６０℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝５５：４５：０．０５、流速：０．９ｍｌ／分、検出波長；２３７ｎｍ］を行い、化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）を含む画分を回収した。この画分を減圧下でアセトニトリルを除去した後、ｐＨを酢酸を用いて４．０に調整し、３６０ｍｌの酢酸エチルを添加して３０℃で１時間振とうした。振とう後、静置して上清を回収し、この上清に脱イオン水９０ｍｌを添加して３０℃で３０分振とうして再度上清を回収した。この上清に飽和食塩水９０ｍｌを添加し３０℃で３０分振とうして上清を回収した。
次にこの上清に無水Ｎａ２ＳＯ４ ４．５ｇを添加して室温で１５分保持して脱水して減圧下乾固し、得られた残査をジクロルメタンに溶解し、１％のトリフルオロ酢酸を加えてラクトン化した後、分取用ＨＰＬＣ［カラム；Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５（２０×２５０ｍｍ、野村化学製）、カラム温度；４０℃、溶媒；５５％メタノール、流量；２０ｍｌ／分、検出波長；２３７ｎｍ］を用いて精製を行なった結果、化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）が５．１ｍｇ得られた。
得られた化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）のマススペクトルおよび１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析の結果は以下の通りである。
マススペクトル
日本電子製ＪＭＳ−ＨＸ／ＨＸ１１０Ａ質量分析計を用い、マトリックスにｍ−ニトロベンジルアルコールを使用してポジティブモードで測定した。その結果、ｍ／ｚ ４０７に擬似分子イオンピーク（［Ｍ＋Ｈ］＋）を与え、化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）の構造および分子量（４０６）から期待される数値に一致した。
１ Ｈ−ＮＭＲ スペクトル
日本電子製ＪＮＭ−α４００型スペクトロメータを用い、重クロロホルム中、内部標準にＴＭＳを使用し４００ＭＨｚで測定した。その結果を以下に示す。このスペクトルデータは化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）の公知のデータ［三共研究所年報，３７，１４７（１９８５）］と一致した。
δｐｐｍ（ＣＤＣｌ３）：６．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．５Ｈｚ），５．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．５，５．９Ｈｚ），５．５８（１Ｈ，ｍ），５．４１（１Ｈ，ｍ），４．６０（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１０．６，７．３，５．４，２．８Ｈｚ），４．４０（１Ｈ，ｍ），４．３８（１Ｈ，ｍ），２．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．６，５．１Ｈｚ），２．６１（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１７．６，３．７，１．５Ｈｚ），２．５９（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１３．１，６．０，４．８，１．５Ｈｚ），２．４０（１Ｈ，ｍ），２．３６（１Ｈ，ｍ），２．３４（１Ｈ，ｍ），１．９５（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１４．４，３．７，２．９，１．７Ｈｚ），１．８６（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１２．５，１２．３，７．３，４．３Ｈｚ），１．６９（１Ｈ，ｍ），１．６８（１Ｈ，ｍ），１．６４（１Ｈ，ｍ），１．５７（１Ｈ，ｍ），１．５〜１．４（２Ｈ，ｍ），１．４３（１Ｈ，ｍ），１．３０（１Ｈ，ｍ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）
実施例３
実施例１と同様にして、化合物（ＶＩＩ−ａ−１）［式（ＶＩＩ−ａ）中、Ｒ１がナトリウムである化合物］を得た。
バチルス・アルベイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）ＡＴＣＣ６３４４株、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＮＴＣＴ−２６１０株、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）ＮＣＩＢ−９３６８株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１０７７８株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１１５６２株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１３４０２株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１５１７７株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１５４５０株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１９２１３株、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３２株、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−２０６４株、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６０５１株をそれぞれ寒天培地［ペプトン（極東製薬工業製）１％、肉エキス（極東製薬工業製）０．７％、ＮａＣｌ（ナカライテスク社製）０．３％、バクトアガー（ディフコ社製）２％、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整］に塗布し、３０℃で２４時間培養した。寒天培地上に生育した菌株各々一白金耳をｐＨ７．４に調整したしＢＧ培地［グルコース（ナカライテスク社製）２％、バクトトリプトン（ディフコ社製）１％、イーストエキストラクト（ディフコ社製）０．５％、ＮａＣｌ（ナカライテスク社製）０．５％］３ｍｌを含む試験管（１３×１６５ｍｍ）に植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。培養後の培養液０．２ｍｌを、ｐＨ７．４に調整したＬＢＧＣａ培地［グルコース（ナカライテスク社製）２％、バクトトリプトン（ディフコ社製）１％、イーストエキストラクト（ディフコ社製）０．５％、ＮａＣｌ（ナカライテスク社製）０．５％、炭酸カルシウム（国産化学社製）０．５％］１０ｍｌを含む試験管（２１×２００ｍｍ）に植菌し３０℃で振とう培養した。２４時間培養後、培養液１ｍｌを１３ｍｌ容ポリプロピレンチューブ（ＳＡＲＳＴＥＤＴ社製、輸入元アシスト社、Ｎｏ．６０ ５４０Ｓ）にとり、化合物（ＶＩＩ−ａ−１）を最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌ、グルコースを最終濃度１％になるようにそれぞれ添加して４８時間反応を行なった。
反応終了後、反応液を酢酸（ナカライテスク社製）でｐＨ４に調整した。この反応液１ｍｌに酢酸エチル（ナカライテスク社製）２ｍｌを加え、１時間振とうした。振とう後、遠心分離機（日立工機製０５Ｐ−２１型）を用いて３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上清の酢酸エチル層を回収し、遠心エバポレーター（トミー精工社製ＣＣ−１０１型）で溶媒を除去した後、残渣をメタノール１ｍｌに溶解した。このメタノール溶液の一部を用いてＨＰＬＣ分析［カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（５μｍ，４×２５０ｍｍ，ジーエルサイエンス社製）、カラム温度；６０℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝５５：４５：０．０５、流速：０．９ｍｌ／分、検出波長；２３７ｎｍ］を行った結果、そのリテンションタイムから化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）［式（ＶＩＩＩ−ａ）中、Ｒ１がナトリウムである化合物］の生成が確認された。
得られた化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）の量はバチルス・アルベイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｖｅｉ）ＡＴＣＣ６３４４株を用いた場合０．１８ｍｇ／ｌ、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＮＴＣＴ−２６１０株を用いた場合０．１８ｍｇ／ｌ、バチルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）ＮＣＩＢ−９３６８株を用いた場合０．３２ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１０７７８株を用いた場合８．４ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１１５６２株を用いた場合０．３１ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１３４０２株を用いた場合１．３０ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１５１７７株を用いた場合１．６０ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１５４５０株を用いた場合０．５８ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１９２１３株を用いた場合０．１６ｍｇ／ｌ、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＩＡＭ１０３２株を用いた場合９．２０ｍｇ／ｌ、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）ＦＥＲＭ ＢＰ−２０６４株を用いた場合０．１７ｍｇ／ｌ、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６０５１株を用いた場合１．１１ｍｇ／ｌであった。
実施例４
バチルス・ラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）ＡＴＣＣ４５１７株を実施例１と同様の寒天培地に塗布し、３０℃で２４時間培養し、寒天培地上に生育した菌株を一白金耳をとり、ｐＨ７．５に調整したＣ培地３ｍｌを含む１５ｍｌ Ａ−スピッチ管（１６．５×１１５ｍｍ、井内盛栄堂製）２本に植菌して３０℃で２４時間振とう培養した。培養後の培養液０．０６ｍｌを、ｐＨ７．５に調整したＣ培地３ｍｌを含む１５ｍｌ Ａ−スピッチ管６０本各々に植菌し、３０℃で振とうしながら培養を行なった。培養開始後２４時間目に、実施例１と同様にして得られた化合物（ＶＩＩ−ａ−１）を最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌになるように添加し、培養開始後２４時間目と７２時間目にそれぞれグルコースを最終濃度１％になるように添加し、計１２０時間振とうしながら培養を行った。培養終了後、培養液を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し上清を分取した。この上清のｐＨを１Ｎ塩酸を用いて３．０に調整し、３６０ｍｌの酢酸エチルを添加して振とうした後、静置して上清を回収する操作を３回行った。この上清に脱イオン水９０ｍｌを添加して振とうした後、上清を回収した。この上清に飽和食塩水９０ｍｌを添加して振とうした後、上清を回収した。
次に、この上清に無水Ｎａ２ＳＯ４を４．５ｇ添加して室温で１５分間放置して脱水した後、減圧下乾固した。得られた残査を脱イオン水５ｍｌに溶解して水酸化ナトリウムでｐＨを９．０に調整し、５０ｍｌのＨＰ−２０カラム（２５×１００ｍｍ、三菱化学製）に通塔した。カラムは１５０ｍｌの脱イオン水で洗浄した後、アセトン含量２０％、３０％、４０％のアセトン水溶液１００ｍｌで段階的に溶出した。分取した画分はＨＰＬＣ分析［分析カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−２（５μｍ，４×２５０ｍｍ，ジーエルサイエンス社製）、カラム温度；６０℃、移動相；アセトニトリル：水：リン酸＝５５：４５：０．０５、流速：０．９ｍｌ／分、 ｂ検出波長；２３７ｎｍ］を行い、リテンションタイムから化合物（ＶＩＩＩ−ａ−１）を含む両分を回収した。この両分を減圧下でアセトニトリルを除去した後、ｐＨを１Ｎ塩酸を用いて３．０に調整し、３６０ｍｌの酢酸エチルを添加して振とうした。振とう後、静置して上清を回収し、この上清に脱イオン水９０ｍｌを添加して振とうして再度上清を回収した。この上清に飽和食塩水９０ｍｌを添加し振とうして上清を回収した。
次にこの上清に無水Ｎａ２ＳＯ４４．５ｇを添加して室温で１５分間保持して脱水して減圧乾固し、得られた残査をジクロルメタンに溶解し、１％のトリフルオロ酢酸を加えてラクトン化した後、分取用ＴＬＣ［シリカゲル板；Ｎｏ．１．０５７４４（２００×２００ｍｍ，０．５ｍｍ厚）ＭＥＲＣＫ社製、展開溶媒；酢酸エチル、発色液；１２．５％リンモリブデン酸・１％硫酸セリウム／１０％硫酸溶液］を用いて精製を行なった結果、化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）が０．８ｍｇ得られた。得られた化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）のマススペクトルおよび１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析の結果は以下の通りである。
マススペクトル
日本電子製ＪＭＳ−ＨＸ／ＨＸ１１０Ａ質量分析計を用い、マトリックスにｍ−ニトロベンジルアルコールを使用してポジティブモードで測定した。その結果、ｍ／ｚ ４０７に擬似分子イオンピーク（［Ｍ＋Ｈ］＋）を与え、化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）の構造および分子量（４０６）から期待される数値に一致した。
また、高分解能ＦＡＢ ＭＳ測定の結果、ｍ／ｚ ４０７．２４４０に擬似分子イオンピーク（［Ｍ＋Ｈ］＋）を与え、化合物の分子式（Ｃ２３Ｈ３４Ｏ６）から期待される計算値（ｍ／ｚ ４０７．２４３４：Ｃ２３Ｈ３５Ｏ６）に測定誤差範囲内で一致した。
１ Ｈ−ＮＭＲスペクトル
日本電子製ＪＮＭ−ＬＡ３００型核磁気共鳴装置を用い、重クロロホルム中、内部標準にクロロホルム（δ ７．２６ｐｐｍ）を使用し、３００ＭＨｚで測定した。その結果を以下に示す。このスペクトルデータは化合物（ＶＩＩＩ−ｂ）の公知のデータ［三共研究所年報，３７，１４７（１９８５）］と一致した。
δｐｐｍ（ＣＤＣｌ３）：６．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），５．９０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．７，５．７Ｈｚ），５．５８（１Ｈ，ｍ），５．４１（１Ｈ，ｍ），４．６１（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１０．９，７．８，５．１，２．９Ｈｚ），４．４５−４．３５（１Ｈ，ｍ），４．３８（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝５．０，３．９Ｈｚ），２．７３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．６，５．０Ｈｚ），２．６２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１７．６，３．９，１．７Ｈｚ），２．５９（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１３．５，６．６，４．８，１．６Ｈｚ），２．４５−２．３５（１Ｈ，ｍ），２．３６（１Ｈ，ｓｅｘ，Ｊ＝６．９Ｈｚ），２．４０−２．３０（１Ｈ，ｍ），１．９５（１Ｈ，ｄｄｄｄ，Ｊ＝１４．４，３．９，２．９，１．７Ｈｚ），１．９０−１．８０（１Ｈ，ｍ），１．７５−１．６０（１Ｈ，ｍ），１．６８（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１４．４，１０．９，３．９Ｈｚ），１．６５（１Ｈ，ｄｑｕ，Ｊ＝１３．６，７．５Ｈｚ），１．６５−１．５０（１Ｈ，ｍ），１．４３（１Ｈ，ｄｑｕ，Ｊ＝１３．６，７Ｈｚ），１．５０−１．３５（２Ｈ，ｍ），１．３５−１．２５（１Ｈ，ｍ），１．１２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．９１（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）
産業上の利用可能性
本発明によりＨＭＧ−ＣＯＡレダクタ−ゼを阻害し、血清コレステロールの低下作用等を有する化合物を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、１６ＳｒＲＮＡ塩基配列を元にしたバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−６株およびバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＰＶ−７菌株の近隣結合法による分子系統解析を示す。
Claims (9)
- バチルス属に属しかつ、遺伝子組み換えすることなく一般式（III-a）
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（III-a）という］または一般式（III-b）
（式中、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルカリまたはアリールを表す）で表される化合物（III-a）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（III-b）という］から、一般式（IV-a）
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表し、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルキルまたはアリールを表す）で表される化合物［以下、化合物（IV-a）という］または一般式（IV-b）
（式中、Ｒ２は置換もしくは非置換のアルカリまたはアリールを表す）で表される、化合物（IV-a）の閉鎖ラクトン体［以下、化合物（IV-b）という］を生成する活性を有する微生物由来の酵素源を、化合物（III-a）または化合物（III-b）に反応液中で作用させ、反応液中に化合物(IV-a)または化合物（IV-b）を生成させ、該反応液から化合物(IV-a)または化合物（IV-b）を採取することを特徴とする化合物(IV-a)または化合物（IV-b）の製造法。 - 化合物（III-a）が一般式（VII-a）
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で表される化合物［以下、化合物（VII-a）という］であり、化合物（III-b）が一般式（VII-b）
で表される化合物［以下、化合物（VII-b）という］であり、化合物（IV-a）が一般式（VIII-a）
（式中、Ｒ1は水素原子、置換もしくは非置換のアルキルまたはアルカリ金属を表す）で
表される化合物［以下、化合物（VIII-a）という］であり、化合物（IV-b）が一般式（VIII-b）
で表される化合物［以下、化合物（VIII-b）という］である請求項１記載の製造法。 - 酵素源が、化合物（III-a）または化合物（III-b）から、化合物(IV-a)または化合物（IV-b）を生成する活性を有する微生物、該微生物の培養物もしくは菌体またはそれらの処理物、または該微生物から抽出した酵素である請求項１記載の製造法。
- 酵素源が、化合物（VII-a）または化合物（VII-b）から、化合物(VIII-a)または化合物（VIII-b）を生成する活性を有する微生物、該微生物の培養物もしくは菌体またはそれらの処理物、または該微生物から抽出した酵素である請求項２記載の製造法。
- バチルス属に属する微生物がバチルス・ラテロスポラス（Bacillus laterosporus）、バチルス・バディウス（Bacillus badius）、バチルス・アルベイ（Bacillus alvei）、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・マセランス(Bacillus macerans)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)またはバチルス・サチルス （Bacillus subtilis）に属する微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
- バチルス属に属する微生物が、バチルス・ラテロスポラス（Bacillus laterosporus）ATCC4517株、バチルス・バディウス（Bacillus badius）ATCC14574株、バチルス・アルベイ(Bacillus alvei) ATCC6344株、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans) NCTC-2610株、バチルス・マセランス(Bacillus macerans) NCIB-9368株、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)ATCC10778株、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ATCC11562 株、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ATCC13402株、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ATCC15177株、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ATCC15450 株、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ATCC19213 株、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）IAM1032株、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)FERM BP-2064株またはバチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ATCC6051株である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
- バチルス属に属する微生物がバチルス・エスピー(Bacillus sp.) PV-6株（FERM BP-6029）またはバチルス・エスピー(Bacillus sp.) PV-7株（FERM BP-6030）である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。
- バチルス・エスピー(Bacillus sp.) PV-6株（FERM BP-6029）。
- バチルス・エスピー(Bacillus sp.) PV-7株（FERM BP-6030）。
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