KR20010108139A - 히드록시메틸글루타릴 코에이 환원효소 저해제의 제조방법 - Google Patents

히드록시메틸글루타릴 코에이 환원효소 저해제의 제조방법 Download PDF

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KR20010108139A
KR20010108139A KR1020017009457A KR20017009457A KR20010108139A KR 20010108139 A KR20010108139 A KR 20010108139A KR 1020017009457 A KR1020017009457 A KR 1020017009457A KR 20017009457 A KR20017009457 A KR 20017009457A KR 20010108139 A KR20010108139 A KR 20010108139A
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미조구찌히로시
하시모토신이찌
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오자키아키오
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히라타 다다시
교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
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Abstract

본원발명은Bacillus속에 속하는 미생물 유래이며 일반식(I-a)인 화합물[이하, '화합물(I-a)'라 함] 또는 그 폐환락톤체[이하, '화합물(I-b)'라 함]를 수산화하는 활성을 가지는 동시에 포자형성능을 나타내지 않는 균사상으로 생육하지 않는 미생물 그 미생물의 배양물 또는 배양물의 처리물을 효소원으로 화합물(I-a)또는 화합물(I-b)에 수성매체 중에서 작용시키고 그 수성매체로 부터 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)의 수산화물[이하, '화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)'라 함]을 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)의 제조방법에 관한 것이다.

Description

히드록시메틸글루타릴 코에이 환원효소 저해제의 제조방법{Process for Producing HMG-CoA Reductase Inhibitor}
일반식(VI-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(VI-a)'라 함] 또는 일반식(VI-b)로 표시되는 화합물 (VI-a)의 락톤체[이하, '화합물(VI-b)'라 함]는 HMG-CoA 환원효소를 저해하고, 혈청 콜레스테롤의 저하작용 등을 보이는 것이 알려져 있다(참조: The Journal of Antibiotics, 29:1346, 1976).
미생물에 의해 일반식(V-a)[이하, '화합물(V-b)'라 함]라 표시되는 화합물(V-a)의 락톤체로 부터 화합물(VI-a) 또는 화합물(VI-b)를 생성하는 방법에 관하여서는 이미 몇몇의 보고가 있다.
상기 식에서,
R1은 수소원자, 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 알칼리 금 속이다.
즉, 특개소 57-50894에는 사상균을 이용한 방법이, 특개평 7-184670 및, WO96/40863에서는 방선균을 이용한 방법이, 또한 특허 제 2672551호에서는 유전자 조작 방선균을 이용한 방법이 서술되어 있다. 그러나, 잘 알려져 있는 바와 같이 사상균이나 방선균은 균사를 신장시켜 성장하기 때문에, 발효조에서 증식시키면 배양액의 점도가 상승한다.
이 때문에 배양액 중의 산소가 부족하기 쉬워지고, 또한 배양액이 불균일하게 되기 때문에 반응 효율의 저하를 초래하기 쉽다. 이 산소부족을 해소하고 배양액을 균일하게 보존하기 위하여 발효조의 교반속도를 상승시키지 않으면 안되나, 교반속도를 상승시키면 균사가 전단되고 미생물의 활성이 저하되기 쉽다[참조: 발효공학의 기초, 169~190 페이지, P.F. Stansbury, A. Whitaker저, 학회출판센터(1988)].
본원 발명은 히드록시메틸글루타릴 CoA(HMG-CoA) 환원효소를 저해하고, 혈청콜레스테롤의 저하작용을 가지는 화합물의 제조에 관한 DNA 및 전기 DNA를 이용한 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
본원발명의 목적은 새로운 수산화효소를 암호화하는 DNA, 및, 히드록시메틸글루타릴 CoA(HMG-CoA) 환원효소를 저해하고 혈청콜레스테롤의 저하작용 등을 가지는 화합물의 공업적으로 유리한 제조방법을 제공하는 것이다.
본원발명의 발명자들은 균사를 형성하지 않는 미생물에 의해 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)의 수산화를 행할 수 있다면, 균사형성에 의한 배양액의 불균일화에 수반되는 반응효율의 저하 등의 불리한 점을 피할 수 있고 공업적으로 유리한 점에 착안하여 예의 검토한 결과, 본원발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본원의 발명은 이하의 (1) 내지 (39)에 관한 것이다.
이하, 특별히 제한하지 않는 한 일반식에서, R1은 수소원자, 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 알칼리 금속이고; 및, R2는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는, 치환되거나 치환되지 않은 아릴기이다.
(1)Bacillus속에 속하는 미생물 유래의 단백질이며, 하기 일반식(I-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(I-a)'라 함] 또는 하기 일반식(I-b)로 표시되는 화합물(I-a)의 락톤체[이하, '화합물(I-b)'라 함]로 부터 하기 일반식(II-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(II-a)'라 함] 또는 하기 일반식(II-b)로 표시되는 화합물(II-a)의 락톤체[이하, '화합물(II-b)'라 함]을 생성하는 활성을 가지는 단백질.
(2)Bacillus속에 속하는 미생물 유래의 단백질이며, 하기 일반식(III-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(III-a)'라 함] 또는 하기 일반식(III-b)로 표시되는 화합물(III-a)의 락톤체[이하, '화합물(III-b)'라 함]로 부터 하기 일반식(IV-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(IV-a)'라 함] 또는 하기 일반식(IV-b)로 표시되는 화합물(IV-a)의 락톤체[이하, '화합물(IV-b)'라 함]를 생성하는 활성을 가지는 단백질.
(3)Bacillus속에 속하는 미생물 유래의 단백질이며, 하기 일반식(V-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(V-a)'라 함]이고 또는 하기 일반식(V-b)로 표시되는 화합물(V-a)의 락톤체[이하, '화합물(V-b)'라 함]로 부터 하기 일반식(VI-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(VI-a)'라 함] 또는 하기 일반식(VI-b)로 표시되는 화합물(VI-a)의 락톤체[이하, '화합물(VI-b)'라 함]를 생성하는 활성을 가지는 단백질.
(4)Bacillus속에 속하는 미생물 유래의 단백질이며, 하기 일반식(VII-a)으로 표시되는 화합물[이하, '화합물(VII-a)'라 함] 또는 하기 일반식(VII-b)으로 표시되는 화합물(VII-a)의 락톤체[이하, '화합물(VII-b)'라 함]로 부터 하기 일반식(VIII-a)으로 표시되는 화합물[이하, '화합물(VIII-a)'라 함] 또는 하기 일반식(VIII-b)으로 표시되는 화합물(VIII-a)의 락톤체[이하, '화합물(VIII-b)'라 함]를 생성하는 활성을 가지는 단백질.
(5)Bacillus속에 속하는 미생물이B.subtilis,B. megaterium,B. laterosporus,B. sphaericus,B. pumilus,B. stearothermophilus,B. cereus,B. badius,B. brevis,B. alvei,B. circulans및,B. macerans로 부터 선택되어지는 미생물인 상기 (1) 내지 (4)의 어느 하나에 기재된 단백질.
(6)Bacillus속에 속하는 미생물은B.subtilisATCC6051주,B. megateriumATCC10778주,B. megateriumATCC11562주,B. megateriumATCC13402주,B. megateriumATCC15177주,B. megateriumATCC15450주,B. megateriumATCC19213주,B. megateriumIAM1032주,B. laterosporusATCC4517주,B. pumilusFERM BP-2064주,B.badiusATCC14574주,B. brevisNRRL B-8029주,B. alveiATCC6344주,B. circulansNTCT-2610주, 및,B. maceransNCIMB-9368주로 부터 선택되어지는 미생물인 상기 (1) 내지 (5)의 어느 하나에 기재된 단백질.
(7)Bacillus속에 속하는 미생물이Bacillussp. FERM BP-6029주 및,Bacillussp. FERM BP-6030주로 부터 선택되어지는 미생물인 상기 (1) 내지 (5)의 어느 하나에 기재된 단백질.
(8) 서열번호 1에 기재된 아미노산서열을 가지는 단백질.
(9) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 활성을 가지는 단백질.
(10) 단백질이 서열번호 42 또는 45에 기재된 아미노산 서열을 가지는 상기 (9)의 단백질.
(11) 화합물(I-a)가 화합물(III-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(III-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(IV-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(IV-b)인 상기 (9)의 단백질.
(12) 화합물(I-a)가 화합물(V-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(V-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(VI-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(IV-b)인 상기 (9)의 단백질.
(13) 화합물(I-a)가 화합물(VII-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(VII-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(VIII-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(VIIIs-b)인 상기 (9)의 단백질.
(14) 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 분리된 DNA.
(15) 상기 (14)의 DNA와 엄격한(stringent) 조건하에서 교잡하고, 동시에 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 분리된 DNA.
(16) DNA가 서열번호 41, 43 및 44에 기재된 염기서열으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되어지는 염기서열을 가지는 상기 (15)의 DNA.
(17) 상기 (1) 내지 (12)의 어느 한 항에 기재된 단백질을 암호화하는 분리된 DNA.
(18) 화합물(I-a)가 화합물(III-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(III-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(IV-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(IV-b)인 상기 (15)의 DNA.
(19) 화합물(I-a)가 화합물(V-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(V-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(VI-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(IV-b)인 상기 (15)의 DNA.
(20) 화합물(I-a)가 화합물(VII-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(VII-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(VIII-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(VIII-b)인 상기 (15)의 DNA.
(21) 상기 (14) 내지 (20)의 어느 하나에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 DNA벡터.
(22) 상기 (21)에 기재된 재조합 DNA벡터를 숙주세포에 도입하여 얻을 수 있는 형질전환체.
(23) 형질전환체가Escherichia속,Bacillus속,Corynebacterium속 및Streptomyces속으로 부터 선택되어지는 미생물에 속하는 상기 (22)의 형질전환체.
(24) 형질전환체가Escherichia coli,Bacillus subtilis,Bacillus megaterium,Corynebacterium glutamicum,Corynebacterium ammoniagenes,Corynebacterium callunae및Streptomyces lividans으로 부터 선택되어지는 미생물에 속하는 미생물인 상기 (22) 또는 (23)의 형질전환체.
(25) 상기 (22) 내지 (24)의 어느 하나에 기재된 형질전환체, 전기 형질전환체의 배양물 또는 배양물의 처리물을 효소원으로 이용하고, 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)를 수성매체 중에 넣어 전기 수성매체 중에서 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성, 축적시킨 다음, 전기 수성매체로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)의 제조방법.
(26) 상기 (22) 내지 (24)의 어느 하나에 기재된 형질전환체, 그 형질전환체의 배양물 또는 그 배양물의 처리물을 효소원으로 이용하고, 화합물(III-a) 또는 화합물(III-b)를 수성매체 중에 넣어 전기 수성매체 중에 화합물(IV-a) 또는 화합물(IV-b)를 생성, 축적시킨 다음, 전기 수성매체로 부터 화합물(IV-a) 또는 화합물(IV-b)를 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물(IV-a) 또는 화합물(IV-b)의 제조방법.
(27) 상기 (22) 내지 (24)의 어느 하나에 기재된 형질전환체, 전기 형질전환체의 배양물 또는 그 배양물의 처리물을 효소원으로 이용하고, 화합물(V-a) 또는 화합물(V-b)를 수성매체 중에 넣어 전기 수성매체 중에서 화합물(VI-a) 또는 화합물(VI-b)를 생성, 축적시킨 다음, 전기 수성매체로 부터 화합물(VI-a) 또는 화합물(VI-b)를 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물(VI-a) 또는 화합물(VI-b)의 제조방법.
(28) 상기 (22) 내지 (24)의 어느 하나에 기재된 형질전환체, 그 형질전환체의 배양물 또는 그 배양물의 처리물을 효소원으로 이용하고, 화합물(VII-a) 또는 화합물(VII-b)를 수성매체 중에 넣어 전기 수성매체 중에 화합물(VIII-a) 또는 화합물(VIII-b)를 생성, 축적시킨 다음, 전기 수성매체로 부터 화합물(VIII-a) 또는 화합물(VIII-b)를 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물(VIII-a) 또는 화합물(VIII-b)의 제조방법.
(29) 화합물(II-b)가 화합물(II-a)에서 락톤을 형성시켜 수득되는 화합물(II-b)인 상기 (25)의 제조방법.
(30) 화합물(II-a)가 화합물(II-b)에서 락톤을 개환시켜 수득되는 화합물(II -a) 인 상기 (25)의 제조방법.
(31) 화합물(IV-b)가 화합물(IV-a)에서 락톤을 형성시켜 수득되는 화합물(IV-b)인 상기 (25)의 제조방법.
(32) 화합물(IV-a)가 화합물(IV-b)에서 락톤을 개환시켜 수득되는 화합물(IV-a)인 상기 (26)의 제조방법.
(33) 화합물(VI-b)가 화합물(VI-a)에서 락톤을 형성시켜 수득되는 화합물(VI-b)인 상기 (27)의 제조방법.
(34) 화합물(VI-a)가 화합물(VI-b)에서 락톤을 개환시켜 수득되는 화합물(VI-a)인 상기 (27)의 제조방법.
(35) 화합물(VIII-b)가 화합물(VIII-a)에서 락톤을 형성시켜 수득되는 화합물(VIII-b)인 상기 (28)의 제조방법.
(36) 화합물(VIII-a)가 화합물(VIII-b)에서 락톤을 개환시켜 수득되는 화합물(VIII-a)인 상기 (28)의 제조방법.
(37) 형질전환체의 배양물의 처리물이 배양균체, 전기 균체의 건조물, 동결건조물, 계면활성제 처리물, 효소처리물, 초음파처리물, 기계적 마쇄물, 용매처리물 등의 균체 처리물, 균체의 단백분획물, 균체 및 균체 처리물의 고정화물로 부터 선택되어지는 처리물인 상기 (25) 내지 (28) 어느 한 항에 기재된 제조방법.
(38) 상기 (22) 내지 (24)의 어느 하나에 기재된 형질전환체를 배지에 배양하고 배양물 중에 상기 (1) 내지 (12)의 어느 한 항에 기재된 단백질을 생성하고축적시키며 그 배양물로 부터 전기 단백질을 수득하는 것을 특징으로 하는 전기 단백질의 제조방법.
(39) 서열번호 2, 41, 43 및 44에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹으로 부터 선택되어지는 염기서열 중의 연속된 5 내지 60 염기의 서열에 상당하는 올리고뉴클레오티드 또는 전기 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열에 상당하는 올리고뉴클레오티드.
이하에서 본원발명을 상세하게 설명한다.
I. yjiB 유전자의 수득
이미 알려져 있는 고초균의 염색체의 염기서열 정보 [참조: http://www.pasteur.fr/Bio/SubtiList.html] 및, 전기 염기서열에 의해 추정된 고초균 yjiB 유전자정보를 이용하고 본원발명의 DNA를 PCR법[참조: Science, 230: 1350, 1985]에 의해 클로닝하고 수득할 수 있다.
구체적으로는 이하의 방법에 의해 수득할 수 있다.
고초균, 예를 들면,B.subtilisATCC15563주를 고초균에 적합한 배지, 예를 들면 LB 액체배지[박토트립톤(Difco사제) 10g, 효모엑기스(Difco사제) 5g, NaCl 5g을 물 1L에 넣고 pH 7.2에 조정한 배지]를 이용하여 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 배양한다. 배양후 배양물을 원심분리하여 균체를 수득한다.
수득한 균체에서 공지된 방법(예를 들면 Molecular Cloning 제 2판)에 따라염색체 DNA를 분리한다.
서열번호 2에 기재된 염기서열 정보를 이용하고, 본원발명의 단백질을 암호화하는 DNA영역에 대응하는 염기서열을 함유하는 센스프라이머 및 안티센스프라이머를 DNA합성기를 이용하여 합성한다.
PCR법에 의해 증폭 후, 전기 증폭된 DNA단편을 플라스미드에 도입할 수 있게 하기 위해 센스프라이머 및 안티센스프라이머의 5'말단에 적절한 제한효소 사이트, 예를 들면BamHI,EcoRI 등의 제한효소 사이트를 부가시키는 것이 바람직하다.
전기 센스프라이머, 안티센스프라이머의 조합으로는 서열번호 13 및 14의 조합의 염기서열을 가지는 DNA 등을 예로 들 수 있다.
염색체 DNA를 주형으로 하여 이들의 프라이머, TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2(타카라주조사제) 또는 Expand TM High-Fidelity PCR System(베링거맨하임사제)등을 이용하고 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Japan사제)로 PCR을 행한다.
PCR을 행하는 경우는, 예를 들면 이하와 같은 방법을 이용할 수 있다.
즉, 상기 프라이머가 2kb 이하의 DNA단편의 경우에는 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초 내지 1분간, 72℃에서 2분간의 반응공정을 1사이클로 한다. 상기 프라이머가 2kb를 초과하는 DNA단편의 경우에는 98℃에서 20초간, 68℃에서 3분간의 반응공정을 1사이클로 한다. 어느 경우이든 30사이클을 행한 후 72℃에서 7분간 반응시키는 조건하에서 행한다.
증폭된 DNA단편을 상기 프라이머에 부여된 제한효소사이트와 동일 사이트로 절단 후 아가로스 전기영동, 슈크로스밀도 구배 초원심분리 등의 방법에 의해 DNA단편을 분획·회수한다.
전기 회수 DNA단편을 이용하여 당업계의 공지된 통상의 방법, 예를 들면 [Molecular Cloning 제 2판], [Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1~38], [John Wiley & Sons(1987~1997)(이하, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 로 약함)], [DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press(1995)] 등에 기재된 방법, 또는 시판되는 키트, 예를 들면 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(Life Technologies사제)나 ZAP-cDNA Synthesis Kit[Stratagene사제]를 이용하여 클로닝벡터를 작제하고 작제된 클로닝벡터를 이용하여 대장균, 예를 들면E. coliDH5α주(동양방에서 구입가능)를 형질전환한다.
대장균을 형질전환하기 위한 클로닝 벡터는 대장균K12주 중에서 자율복제할 수 있는 것이면 파지 벡터, 플라스미드 벡터 등 어느 것이든 사용할 수 있고, 대장균의 발현용 벡터를 클로닝 벡터로 이용하여도 무방하다. 구체적으로는 ZAP Express[스트라타진사제, Strategies, 5:58, 1992], pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17:9494, 1989], Lambda ZAP II(스트라타진사제), λgt10, λgt11[DNA Cloning, A Practical Approach, 1:49, 1985], λTriplEx(클론테크사제), λExCell(파마시아사제), pT7T318U(파마시아사제), pcD2(H. Okayama and P.Berg; Mol. Cell. Biol., 3:280, 1983), pMW218(화광순약사제), pUC118, pSTV28(타카라주조사제), pEG400(J. Bac., 172:2392, 1990), pHMV1520(MoBiTec사제), pQE-30(QIAGEN사제)등을 들 수 있다.
수득된 형질전환주로 부터 목적으로 하는 DNA를 포함한 플라스미드를 당업계의 공지된 통상의 방법, 예를 들면 [Molecular Cloning 제 2판], [Current Protocols in Molecular Biology Supplement, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press(1995)] 등에 기재된 방법에 의해 수득 할 수 있다.
전기 방법에 따라, 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 반응을 촉매하는 단백질을 암호화하는 DNA를 포함한 플라스미드를 수득할 수 있다.
전기 플라스미드로는 후술하는 pSyjiB를 예로 들 수 있다.
상기의 방법과는 별도로, 적당한 벡터를 이용해서 대장균을 숙주로 고초균의 염색체 라이브러리를 작성하고, 이 라이브러리의 각 주에 대해 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 활성을 조사하는 방법으로도, 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 반응을 촉매하는 단백질을 암호화하는 DNA를 포함한 플라스미드를 수득할 수 있다.
상기에 의해 수득된 유전자의 염기서열 등을 이용하여, 다른 원핵생물 또는 식물로 부터 전기 DNA의 상동성을 상술한 방법에 의해 수득할 수 있다.
상술한 방법으로 수득된 본 발명의 DNA 및 DNA절편을 이용하여 당업계의 공지된 통상의 방법에 의해 본 발명의 DNA의 일부의 서열을 가지는 안티센스올리고뉴클레오티드, 센스 올리고뉴클레오티드 등의 올리고뉴클레오티드, 또는 RNA를 포함한 올리고뉴클레오티드를 작제할 수 있다. 또한, 상기에서 수득된 DNA서열 정보에 기초하여, 상기의 DNA합성기를 이용하여 이들 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다.
전기 올리고뉴클레오티드로는 상기 DNA가 존재하는 염기서열 중의 연속한 5 내지 60염기와 동일 서열을 가지는 DNA 또는 DNA와 상보적인 서열을 가지는 DNA를 들 수 있다. 또한, 이들 DNA와 상보적인 서열을 가지는 RNA도 본 발명의 올리고뉴클레오티드이다.
전기 올리고뉴클레오티드로는 예를 들면 서열번호 2, 41, 43 또는 44로 나타내어지는 염기서열 중의 연속된 5 내지 60 염기와 동일 서열을 가지는 DNA 또는 전기 DNA와 상보적인 서열을 가지는 DNA를 들 수 있다.
센스프라이머 및 안티센스프라이머로 이용하는 경우에는, 양자의 융해온도(Tm) 및 염기수가 극단적으로 변하는 것이 없는 상기 기재의 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 구체적으로는, 서열번호 3 내지 39에 표시된 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 예로 들 수 있다.
또한, 이들 올리고뉴클레오티드 유도체(이하, "올리고뉴클레오티드 유도체"라 함)도 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 이용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 유도체로는 올리고뉴클레오티드 중 인산 디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 인산 디에스테르 결합이 N3'-P5' 포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보스와 인산 디에스테르결합이 펩티드 핵산결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중 우라실이 C-5 프로피닐우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드유도체, 올리고뉴클레오티드 중 우라실이 C-5 티아졸 우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중 시토신이 C-5 프로피닐시토신으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중 시토신이 페녹사진으로 수식된 시토신(phenoxazine-modified cytosine)으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중 리보스가 2'-0-프로필리보스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 또는 올리고뉴클레오티드 중 리보스가 2'-메톡시에톡시리보스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다(참조: 세포공학, 16:1463, 1997).
II. 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 반응을 촉매하는 단백질의 제조방법.
상술한 바와 같이 하여 수득된 DNA를 숙주세포 중에 발현시키기 위해서는 우선 목적으로 하는 전기 DNA단편을 제한효소류 또는 DNA분해 효소류로 전기 유전자를 포함한 적당한 길이의 DNA단편으로 만든 후, 발현벡터 중의 프로모터의 하류에 삽입한 발현벡터를 발현벡터의 사용에 적합한 숙주세포 중에 도입한다.
숙주 세포는 세균, 효모, 동물세포, 곤충세포 등 목적으로 하는 유전자를 발현할 수 있는 것은 모두 이용할 수 있다.
발현벡터는 상기 숙주세포에 있어서 자가복제가능 내지 염색체 중에의 조합이 가능하고, 상기 목적으로 하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 포함하고 있는 것을 이용할 수 있다.
세균 등의 원핵생물을 숙주세포로 이용하는 경우에는 상기 DNA를 발현시키기 위한 발현벡터는 전기 세포 중에서 자가복제 가능한 동시에, 프로모터, 리보솜 결합서열, 상기 DNA 및 전사종결서열으로 부터 구성된 재조합 벡터가 바람직하다. 프로모터를 제어하는 유전자가 포함되어 있어도 무방하다.
발현벡터로는, 예를 들면 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(모두 베링거맨하임사에서 시판), pKK233-2(Pharmacia사제), pSE280(Invitrogen사제), pGEMEX-1(Promega사제), pQE-8(QIAGEN사제), pQE-30(QIAGEN사제), pKYP10(특개소25-110600), pKYP200(참조: Agricultural Biological Chemistry, 48:669, 1984), pLSA1(참조: Agric. Biol. Chem., 53:277, 1989), pGEL1(참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:4306, 1985), pBluescriptII SK(+), pBluescriptII SK(-)(Stratagene사제), pTrS30(FERM BP-5407), pTrS32(FERM BP-5408), pGEX(Pharmacia사제), pET-3(Novagen사제), pTerm2(참조: US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pUC18(참조: Gene, 33:103, 1985), pUC19(참조: Gene, 33:103, 1985), pSTV28(타카라주조사제), pSTV29(타카라주조사제), pUC118(타카라주조사제), pPA1(참조: 특개소63-233798), pEG400(참조: J. Bacteriol., 172:2392, 1990), pQE-30(QIAGEN사제), PHY300(타카라주조사제), pHW1520(MoBiTec사제) 등을 예시할 수 있다.
프로모터로는 숙주세포 중에서 발현될 수 있는 것이면 어느것이든 무방하다.예를 들면, trp프로모터(Ptrp), lac프로모터(Plac), PL프로모터, PR프로모터, PSE프로모터 등의 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터, SP01프로모터, SP02프로모터, penP프로모터 등을 들 수 있다. 또한, Ptrp를 두개 직렬시키는 프로모터(Ptrpx 2),tac프로모터,letI프로모터,lacT7프로모터와 같은 인위적으로 설계된 프로모터 등도 이용할 수 있다. 또한,Bacillus속 세균 중에서 발현시키기 위한xylA프로모터나Corynebacterium속 세균 중에서 발현시키기 위한 P54-6프로모터 등도 이용할 수 있다.
리보솜 결합서열로는 숙주세포 중에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이든 무방하나 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열과 개시 코돈과의 사이 적당한 거리(예를 들면, 6 내지 18염기)에 조절한 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하다.
전사, 번역을 효율적으로 행하기 위해서는, 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 반응을 촉매하는 단백질의 N말단 또는 그 일부를 결실한 단백질과 발현벡터를 암호화하는 단백질의 N말단부분을 융합시킨 단백질을 발현시키는 것도 무방하다. 이러한 예로, 후술하는 pWyjiB를 들 수 있다.
목적으로 하는 DNA의 발현에는 전사종결서열이 반드시 필요한 것은 아니지만, 구조유전자 바로 아래에서 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다.
원핵생물로는Escherichia속,Corynebacterium속,Brevibacterium속,Bacillus속,Microbacterium속,Serratia속,Pseudomonas속,Agrobacterium속,Alicyclobacillus속,Anabaena속,Anacystis속,Arthrobacter속,Azotobacter속,Chromatium속,Erwinia속,Methylobacterium속,Phormidium속,Rhodobacter속,Rhodopseudomonas속,Rhodospirillum속,Streptomyces속,Synechococcus속,Zymomonas속 등에 속하는 미생물을 들 수 있고, 바람직하게는Escherichia속,Corynebacterium속,Brevibacterium속,Bacillus속,Pseudomonas속,Agrobacterium속,Alicyclobacillus속,Anabaena속,Anacystis속,Arthrobacter속,Azotobacter속,Chromatium속,Erwinia속,Methylobacterium속,Phormidium속,Rhodobacter속,Rhodopseudomonas속,Rhodospirillum속,Streptomyces속,Synechococcus속,Zymomonas속에 속하는 미생물 등을 들 수 있다.
전기 미생물의 구체예로는 예를 들면,Escherichia coliXL1-Blue,Escherichia coliXL2-Blue,Escherichia coliDH1,Escherichia coliDH5α,Escherichia coliMC1000,Escherichia coliKY3276,Escherichia coliW1485,Escherichia coliJM109,Escherichia coliHB101,Escherichia coliNo. 49,Escherichia coliW3110,Escherichia coliNY49,Escherichia coliMP347,Escherichia coliNM522,Bacillus subtilisATCC33712,Bacillus megaterium, Bacillussp. FERM BP-6030,Bacillus amyloliquefacines,Brevibacterium ammoniagenes,Brevibacterium immariophilumATCC14068,Brevibacterium saccharolyticumATCC14066,Brevibacterium flavumATCC14067,Brevibacterium lactofermentumATCC13869,Corynebacterium glutamicumATCC13032,Corynebacterium glutamicumATCC14297,Corynebacterium acetoacidophilumATCC13870,Corynebacterium callunaeATCC15991,Microbacterium ammoniaphilumATCC15354,Serratia ficaria,Serratia fonticola,Serratia liquefaciens,Serratia marcescens,Pseudomonassp. D-0110,Agrobacterium radiobacter,Agrobacterium rhizogenes,Agrobacterium rubi,Anabaena cylindrica,Anabaena doliolum,Anabaena flos-aquae,Arthrobacter aurescens,Arthrobacter citreus,Arthrobacter globiformis,Arthrobacter hydorcarboglutamicus,Arthrobacter mysorens,Arthrobacter nicotianae,Arthrobacter paraffineus,Arthrobacter protophormiae,Arthrobacter roseoparaffinus,Arthrobacter sulfureus,Arthrobacter ureafaciens,Chromatium buderi,Chromatium tepidum,Chromatium vinosum,Chromatium warmingii,Chromatium fluviatile,Erwinia uredovora,Erwinia carotovora,Erwinia ananas,Erwinia herbicola,Erwinia punctata,Erwinia terreus,Methylobacterium rhodesianum,Methylobacterium extorquens,Phormidiumsp. ATCC29409,Rhodobacter capsulatus,Rhodobacter sphaeroides,Rhodopseudomonas blastica,Rhodopseudomonas marina,Rhodopseudomonas palustris,Rhodospirillum rubrum,Rhodospirillum salexigens,Rhodospirillum salinarum,Streptomyces ambofaciens,Streptomyces aureofaciens,Streptomyces aureus,Streptomyces fungicidicus,Streptomyces griseochromogenes,Streptomyces griseus,Streptomyces lividans,Streptomyces olivogriseus,Streptomyces rameus,Streptomyces tanashiensis,Streptomyces vinaceus,Zymomonas mobilis등을 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로는, 상기 숙주세포에의 DNA를 도입하는 방법이면어느 것이든 이용할 수 있다. 예를 들면, 칼슘이온을 이용하는 방법(참조: Proc. Natl. Acad., U.S.A., 69:2110, 1972), 프로토플라스트법(참조: 특개소 63-248394), 일렉트로포레이션법 또는 [Gene, 17:107, 1982]나, [Molecular & General Genetics, 168:111, 1979]에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
효모를 숙주세포로 이용하는 경우에는, 발현벡터로 예를 들면 YEp13(ATCC37115), YEp24(ATCC37051), YCp50(ATCC37419), pHS19, pHS15 등을 예시 할 수 있다.
프로모터로는 효모 중에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이든 무방하고, 예를 들면 PH05프로모터, PGK프로모터, GAP프로모터, ADH프로모터, gal 1프로모터, gal 10프로모터, 히트쇼크(heat shock)단백질 프로모터, MFα1프로모터, CUP1프로모터 등의 프로모터를 들 수 있다.
효모 균주로는Saccharomyces cerevisiae,Schizosaccharomyces pombe,Kluyveromyces lactis,Trichosporon pullulans,Schwanniomyces alluvius등을 예로 들 수 있다.
재조합 벡터의 도입방법으로는, 효모에 DNA를 도입하는 방법이면 어느 것이든 이용할 수 있고, 예를 들면 일렉트로포레이션법(참조: Methods. Enzymol., 194:182, 1990), 스페로플라스트법(참조: Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 75:1929, 1978), 초산리튬법(참조: J. Bacteriol., 153:163, 1983; Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 75:1929, 1978) 등을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주세포로 이용하는 경우에는, 발현벡터로 예를 들면 pcDNAI,pcDM8(후나코시사에서 시판), pAGE107(참조: 특개평 3-22979; Cytotechnology, 3:133, 1990), pAS3-3(참조: 특개평 2-227075), pCDM8(참조: Nature, 329:840, 1987), pcDNAI/Amp(Invitrogen사제), pREP4(Invitrogen사제), pAGE103(참조: J. Biochem., 101:1307, 1987), pAGE210 등을 들 수 있다.
프로모터로는 동물 세포 중에서 발현될 수 있는 것이면 어느 것이든 이용할 수 있고, 예를 들면, 사이토메칼로바이러스(사람 CMV)의 IE(immediate early) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인프로모터, 히트쇼크프로모터, SRα프로모터 등을 들 수 있다. 또한 사람 CMV의 IE유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 이용하여도 무방하다.
동물 세포로는 나말바세포, HBT5637(특개소63-299), COS1세포, COS7세포, CHO세포 등을 들 수 있다.
동물세포에의 재조합 벡터의 도입법은 동물 세포에 DNA를 도입할 수 있는 어떠한 방법이라도 이용할 수 있다. 예를 들면, 일렉트로포레이션법(참조: Cytotechnology, 3:133, 1990), 인산칼슘법(참조: 특개평 2-227075), 리포펙션법(참조: Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 84:7413, 1987; Virology, 52:456, 1973)에 기재된 방법 등을 들 수 있다. 형질전환체의 수득 및 배양은 특개평 2-227075호 공보 또는 특개평 2-257891호 공보에 기재되어 있는 방법에 준하여 수행할 수 있다.
곤충세포를 숙주로 이용하는 경우는, 예를 들면 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Current Protocols in Molecular BiologySupplement 1~38(1987~1997); Bio/Technology 6:47, 1988] 등에 기재되어 있는 방법에 의해 단백질을 발현할 수 있다.
즉, 재조합 유전자 도입벡터 및 Baculovirus를 곤충세포에 함께 도입하여 곤충 세포배양 상층 중에서 재조합 바이러스를 수득한 후, 재조합 바이러스를 곤충세포에 감염시키고 단백질을 발현시킬 수 있다.
전기 방법에 있어서 이용될 수 있는 유전자 도입 벡터는 예를 들면 pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII(모두 Invitrogen사제) 등을 들 수 있다.
Baculovirus는 예를 들면 야도아과곤충에 감염하는 바이러스인 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus 등을 이용할 수 있다.
곤충세포로는Spodoptera frugiperda의 난소세포인 Sf9, Sf21(참조: Baculovirus ezpression vectors Laboratory manual, W.H. Freeman and Company, New York, 1992),Trichoplusia ni의 난소세포인 High 5(Invitrogen사제) 등을 이용할 수 있다.
재조합 바이러스를 작제하기 위해 곤충 세포에의 상기 재조합 유전자 도입벡터와 상기 Baculovirus를 함께 도입하는 방법으로는 인산 칼슘법(참조: 특개평 2-227075), 리포펙션(참조: Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 84:7413, 1987) 등을 예로 들 수 있다.
유전자의 발현방법은 직접발현 이외에, Molecular Cloning 제 2판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여 분비생산, 융합단백질 발현 등을 행할 수 있다.
효모, 동물세포 또는 곤충세포에 의해 발현시키는 경우는 당 또는 당쇄가 부가된 단백질을 수득 할 수 있다.
이상과 같이 수득되어진 형질전환체를 배지에 배양하고 배양물 중에서 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 반응을 촉매하는 단백질을 생성하고 축적시키고 전기 배양물에 의해 전기 단백질을 수득함에 의해 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 반응을 촉매하는 단백질을 조제할 수 있다.
본원발명의 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 반응을 촉매하는 단백질 조제용의 형질전환체를 배지에 배양하는 방법은 형질전환체의 숙주의 배양에 이용될 수 있는 통상의 방법을 이용할 수 있다.
본원발명의 형질전환체는 대장균 등의 원핵생물, 효모균 등의 진핵생물인 경우, 이들 미생물을 배양하는 배지는 그 미생물이 자화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류등을 함유하고, 형질전환체의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면 천연배지, 합성배지 어느 것이든 무방하다.
탄소원은 각각의 미생물이 자화할 수 있는 것이면 무방하고, 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 이것을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분가수분해물 등의 탄수화물, 초산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알콜류를 이용할 수 있다.
질소원은 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄 등의 각종 무기산이나 유기산의 암모늄염, 그 외 함질소화합물 및 펩톤, 고기엑기스, 효모엑기스, 콘스팁리커, 카제인 가수분해물, 대두분 및 대두분가수분해물, 각종 발효균체 및 그 소화물 등을 이용할 수 있다.
무기물로는 인산 제 1칼륨, 인산 제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산 마그네슘, 염화나트륨, 황산 제 1철, 황산 망간, 황산동, 탄산칼슘 등을 이용할 수 있다.
배양은 진탕배양 또는 심부 통기교반 배양 등의 호기적 조건하에서 행한다.
배양온도는 15 내지 50℃가 바람직하고, 배양시간은 통상 16시간 내지 7일간이다.
배양중의 pH는 3.0 내지 9.0에 유지한다. pH는 무기 또는 유기의 산, 알칼리용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 이용하여 조정할 수 있다.
또한, 배양 중 필요에 따라, 암피실린이나 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가하여도 무방하다.
프로모터로 유도성의 프로모터를 이용한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때는 필요에 의해 유도물질(inducer)을 배지에 첨가하여도 무방하다. 예를 들면,lac프로모터를 이용한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는, 이소프로필-β-D-티오칼락토피라노시드(IPTG) 등을,trp프로모터를 이용한 발현벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산(IAA) 등을, xylA프로모터를 이용한 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양할 때에는 크실로스를 각각 배지에 첨가하여도 무방하다.
동물 세포를 숙주세포로 하여 수득된 형질전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용된 RPMI1640배지(참조: The Journal of the American Medical Association 199:519, 1967), Eagle의 MEM배지(참조: Science, 122:501, 1952), DMEM배지(참조: Virology, 8:396, 1959), 199배지(참조: Proceeding of theSociety for the Biological Medicine, 73:1, 1950) 또는 이들 배지에 소태아혈청 등을 첨가한 배지 등을 이용할 수 있다. 배양은 통상 pH 6 내지 8, 30 내지 40℃, 5% CO2존재하 등의 조건하에서 1 내지 7일간 행한다. 또는, 배양 중 필요에 따라 카나마이신, 페니실린 등의 항생물질을 배지에 첨가하여도 무방하다.
곤충세포를 숙주세포로 수득된 형질전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되는 TNM-FH배지(Pharmingen사제), Sf-900II SFM배지(GIBCO BRL사제), ExCell400, ExCell405(모두 JRH Biosciences사제), Grace's Insect Medium(참조: Grace, T.C.C., Nature, 195:788, 1962) 등을 이용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6 내지 7, 25 내지 30℃ 등의 조건하에서 1 내지 5일간 행한다.
또한, 배양 중 필요에 따라 겐타마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가하여도 무방하다.
화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 반응을 촉매하는 단백질은 본원발명의 형질전환체의 배양물로 부터 통상의 효소 분리정제방법을 이용하여 분리하면 된다.
예를 들면, 본원발명의 단백질이 세포내에서 용해상태로 발현된 경우에는 배양종료 후, 세포를 원심분리하여 회수하고 수계완충액에 현탁 후, 초음파파쇄기, 프렌치프레스, 맨톤가우린호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하고 무세포추출액을 수득한다. 이 무세포 추출액을 원심분리하여 수득되는 상층으로 통상의 효소의 분리정제방법, 즉, 용매추출법, 황산암모니아 등에 의한 염석법. 탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미쯔비시카세이사제) 등의 수지를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(Pharmacia사제) 등의 수지를 이용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로스, 페닐세파로스 등의 수지를 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자크기를 이용한 겔여과법, 친화성크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점전기영동 등의 전기 영동법 등의 방법을 단독 또는 조합하여 이용하여 정제된 표준물질을 수득 할 수 있다.
또한, 전기 단백질이 세포내에 불용체를 형성하여 발현된 경우, 마찬가지로 세포를 회수후 파쇄하고 원심분리를 행하여, 수득된 침전분획으로 통상의 방법에 따라 전기 단백질을 회수한다. 회수된 전기 단백질의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 전기 가용화액을 단백질 변성제를 함유하지 않는, 또는 단백질 변성제의 농도가 단백질을 변성시키지 않을 정도로 희박한 용액에 희석 또는 투석하고 전기 단백질을 정상 입체구조로 재구성시킨 후, 상술한 분리정제방법에 의하여 정제된 표준물질을 수득할 수 있다.
본원발명의 단백질 또는 그 당수식체 등의 유도체가 세포 외에서 분비된 경우, 배양상층에서 부터 단백질 또는 그의 당쇄부가 등의 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 전기 배양액을 상기와 동일한 원심분리 등의 방법으로 처리하여 가용성 분획을 수득하고, 그 가용성 분획으로 부터 상기와 동일한 분리정제방법을 이용하여 정제된 표준물질을 수득할 수 있다.
이와 같이 수득된 단백질로서는 서열번호 1, 42 또는 45에 표시된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 예로 들 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 발현시킨 단백질을 Fmoc법(피올레닐 메틸옥시카보닐법), tBoc법(t-부틸 옥시카보닐법) 등의 화학합성법에 의해서도 작제할 수 있다. 또한, 전기 단백질은 상화무역(미국 Advanced chemTech사제), Perkin-Elmer Japan(미국 Perkin-Elmer사제), 파마시아 바이오테크(스웨덴 Pharmacia Biotech사제), 아로카(미국 Protein Technology Instrument사제) 크라보우(미국 Synthecell-Vega사제), 일본 PerSeptive 리미티드(미국 PerSeptive사제), 시마쯔제작소 등의 펩티드합성기를 이용하여 합성해서 수득할 수 있다.
III. 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)의 제조
상기 II에서 수득된 형질전환체를 상기 II의 방법에 준하여 배양하여 수득된 세포, 전기 세포의 배양물, 전기 배양물의 처리물, 또는 전기 세포로 부터 추출한 효소 등을 효소원으로 이용하여 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)를 수성매체 중에 넣어, 전기 수성매체 중에서 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성, 축적시킨 다음, 전기 수성매체 중에서부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 수득하여 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 제조할 수 있다.
세포의 배양물의 처리물로는 전기 세포의 건조물, 동결건조물, 계면활성제 처리물, 효소처리물, 초음파파쇄물, 기계적 마쇄물, 용매처리물 등의 세포처리물,전기 세포의 단백질 분획물, 전기 세포 및 전기 세포처리물의 고정화물 등을 예로 들 수 있다.
화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)에의 변환방법은 (a) 세포를 배양하는 배지에 미리 화합물(I-a) 또는 (I-b)를 첨가하는 방법, (b) 배양 중에 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)를 첨가하는 방법 중, 어느 방법이든 이용할 수 있다. 또한, 세포를 배양하여 수득된 효소원을 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)에 수성매체 중에서 작용시키는 방법을 이용하여도 무방하다.
화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)를 세포를 배양하는 배지 중에 첨가하는 경우, 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)는 배지 1ml당 0.1 내지 10mg, 바람직하게는 0.2 내지 1mg을 배양의 시작 또는 배양의 도중에 첨가한다. 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)는 물 또는 메틸알콜, 에틸알콜 등의 유기용매에 용해한 후, 배지에 첨가하는 것도 바람직하다.
세포를 배양하여 수득된 효소원을 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)에 수성매체 중에서 작용시키는 방법을 이용하는 경우, 이용하는 효소원의 양은 효소원의 비활성 등에 의해 다르다. 예를 들면, 효소원으로 세포의 배양물, 세포 또는 이들의 처리물을 이용하는 경우는 전기 효소원을 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b) 1mg당 5 내지 1000mg, 바람직하게는 10 내지 400mg을 첨가한다. 반응은 수성매체 중 20 내지 50℃에서 행하는 것이 바람직하고, 특히 25 내지 37℃에서 행하는 것이 바람직하다. 반응시간은 이용하는 효소원의 양 및 비활성 등에 의해 다르지만 통상 2 내지 150시간, 바람직하게는 6 내지 120시간이다.
수성매체로는 물, 인산완충액, HEPES(N-2-히드록시 에틸 피페라딘-N-에탄술폰산)완충액, 트리스[트리스(히드록시메틸)아미노메탄]염산완충액 등의 완충액을 예로 들 수 있다. 반응을 저해하지 않으면 전기 완충액에 유기용매를 첨가하여도 무방하다.
화합물(I-b) 및 화합물(II-b)는 하기에 예시하는 락톤의 개환방법에 의해 용이하게 화합물(I-a) 및, 화합물(II-a)로 각각 변환할 수 있다. 또한, 화합물(I-a) 및 화합물(II-a)는 하기에 예시하는 락톤의 생성방법에 의해 용이하게 화합물(I-b) 및, 화합물(II-b)로 각각 변환할 수 있다.
락톤의 개환방법으로는 화합물(I-b) 또는 화합물(II-b)를 수성매체에 용해하고 산 또는 알칼리를 첨가하는 방법을 예로 들 수 있다. 수성매체로는 예를 들면 물, 인산완충액, 트리스완충액 등 반응을 저해하지 않는 염류를 포함하는 수용액을 예로 들 수 있다. 전기 수용액 중에는 반응을 저해하지 않는 농도의 메탄올, 에탄올, 초산에테르 등의 유기용매를 포함하고 있어도 무방하다. 산으로는 초산, 염산, 황산 등의 산을 예로 들 수 있고, 알칼리로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 등을 예로 들 수 있다.
락톤의 생성방법으로는, 화합물(I-a) 또는 화합물(II-a)를 비수계의 용매에 용해하고 산 또는 염기용매를 첨가하는 방법을 예로 들 수 있다. 비수계의 용매로는 실질적으로 물을 포함하지 않는 유기용매로 화합물(I-a) 또는 화합물(II-a)를 용해할 수 있는 것이라면 어떤 것이든 이용할 수 있다. 비수계의 용매로는, 디클로로메탄, 초산에틸 등을 예로 들 수 있다. 촉매는 락톤화 반응을 촉매하고 기질이나 반응산물에서 락톤화 이외의 작용에 영향을 미치지 않으면, 어느 것이라도 이용할 수 있다. 전기 촉매로는 트리플루오로초산이나 파라톨루엔술폰산등을 예로 들 수 있다. 반응 온도는 특별히 제한되지 않으나, 0 내지 100℃가 바람직하고, 20 내지 80℃가 특히 바람직하다.
반응용액으로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)의 수득은 통상의 유기합성화학에서 이용할수 있는 방법, 예를 들면 유기용매에 의한 추출, 결정화, 박층크로마토그래피, 고속액체크로마토그래피 등에 의해 행할 수 있다.
본원발명에 의해 얻어질 수 있는 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)의 확인이나 정량 방법은 화합물(II-a) 및/또는 화합물(II-b)를 확인이나 정량할 수 있는 방법이면 어떤 방법이라도 이용할 수 있다. 예를 들면,13C-NMR스펙트럼,1H-NMR스펙트럼, 매스스펙트럼, 고속액체크로마토그래피(HPLC) 등의 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 화합물(I-a), 화합물(I-b), 화합물(II-a) 및 화합물(II-b) 중에서 광학이성체 등의 입체이성체가 존재하는 것도 있으나, 본 발명은 그것들을 포함하여 모든 가능한 이성체 및 그것들의 혼합물을 포함한다.
화합물(I-a)로는 화합물(III-b)가 바람직하고, 화합물(V-a)가 보다 바람직하고, 화합물(VII-a)가 특히 바람직하다.
화합물(I-b)로는 화합물(III-b)가 바람직하고, 화합물(V-b)가 보다 바람직하고, 화합물(VII-b)가 특히 바람직하다.
화합물(II-a)로는 화합물(IV-a)가 바람직하고, 화합물(VI-a)가 보다 바람직하고, 화합물(VIII-a)가 특히 바람직하다.
화합물(II-b)로는 화합물(IV-b)가 바람직하고, 화합물(VI-b)가 보다 바람직하고, 화합물(VIII-b)가 특히 바람직하다.
알킬기로는 직쇄 또는 분지상의 탄소수 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6의 알킬이고, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert--부틸, 펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 4,4-디메틸펜틸, 옥틸, 2,2,4-트리메틸펜틸, 노닐, 데실, 이들의 각종 분지쇄 이성체 등을 들 수 있다.
아릴로는 페닐, 나프틸 등을 들 수 있다.
치환알킬에 있어서 치환기는 동일하거나 다른 1 내지 3의 할로겐, 히드록시, 아미노, 알콕시, 아릴 등을 들 수 있다.
치환아릴에 있어서 치환기는 동일하거나 다른 1 내지 3의 할로겐, 히드록시, 아미노, 알킬, 알콕시 등을 들 수 있다.
알콕시에 있어서 알킬부분은 상술한 알킬과 동일하다.
알칼리금속은 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘, 프란슘의 각 원소이다.
이하에서 본원발명의 실시예를 나타내지만, 본원발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:화합물(VII-a) 또는 화합물(VII-b)로 부터 화합물(VIII-a) 또는 화합물(VIII-b)를 생성하는 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA의 수 득
화합물(VII-b)(Sigma사제) 100mg을 9.5ml의 메탄올에 용해한 후, 1mol/l수산화나트륨 0.5ml을 가하여 실온에서 1시간 진탕하였다. 수득된 용액을 건고하고 탈이온수 5ml을 가하여 용해한 다음, 1mol/l 염산 약 0.1ml로 pH를 약 7에 조정하고 다시 탈이온수 4.9ml을 가하여 최종농도가 10mg/ml의 화합물(VII-a)(R은 나트륨인 화합물)을 10ml 수득하였다.
Bacillus subtilisMarburg 168주(ATCC 15563주) 1백금이를 10ml의 LB 액체 배지에 접종하고 30℃에서 하루밤 배양하였다. 배양 후, 수득된 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하였다.
전기 균체에서 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 염색체 DNA를 분리 정제하였다.
서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10, 서열번호 11 및 12, 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16의 염기서열의 조합을 가지는 센스프라이머 및 안티센스프라이머를 DNA합성기를 이용하여 합성하였다.
염색체 DNA을 주형으로 하여 이들 프라이머와 TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2(타카라주조사제), Expand TM High-Fidelity PCR System(베링거맨하임사제) 또는 Taq DNA polymerase(베링거맨하임사제)를 이용하여 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Japan사제)로 PCR을 수행하였다.
PCR은 2kb 이하의 DNA단편은 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분간의 반응공정을 1사이클로, 2kb를 초과하는 DNA단편은 98℃에서 20초간, 68℃에서 3분간의 반응공정을 1사이클로 하여 30사이클을 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건하에서 행하였다.
PCR에 의해 증폭된 DNA단편 중 서열번호 3과 4의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(bioI유전자 포함)은 제한효소EcoRI과 제한효소SalI으로, 서열번호 5와 6의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(cypA유전자 포함)은 제한효소XbaI과 제한효소SmaI으로, 서열번호 7과 8의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(cypX유전자 포함)은 제한효소SmaI과 제한효소SalI으로, 서열번호 9와 10의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(pksS유전자 포함)은 제한효소EcoRI과 제한효소SalI으로, 서열번호 11과 12의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(yet0유전자 포함)은 제한효소XbaI과 제한효소BglII로, 서열번호 13과 14의 프라이머의 조합으로 증폭된 증폭된 DNA단편(yjiB유전자 포함)은 제한효소XbaI과 제한효소SmaI으로, 서열번호 15와 16(yrhJ유전자 포함)의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편은 제한효소XbaI과 제한효소SmaI으로 각각 절단하였다.
절단 후, 이들 제한효소 처리 DNA단편을 아가로스겔 전기영동하여 각 제한효소 처리 DNA단편을 수득하였다.
벡터플라스미드 pUC119(타카라주조사제)를 제한효소SalI및EcoRI으로 절단 후, 아가로스겔 전기영동을 하여SalI-EcoRI처리 pUC119단편을 수득하였다. 마찬가지로, 벡터플라스미드 pUC119를 제한효소SalI 및SmaI으로 절단 후, 아가로스전기영동을 하여SalI-SmaI처리 pUC119단편을 수득하였다.
pSTV28(타카라주조사제)를 제한효소XbaI 및SmaI으로 절단 후, 아가로스겔 전기영동으로XbaI-SmaI처리 pSTV28단편을 수득하였다. 마찬가지로, 벡터플라스미드 pSTV28을 제한효소XbaI 및BamHI으로 절단 후, 아가로스겔 전기영동으로XbaI-BamHI 처리 pSTV28을 수득하였다.
상기에서 수득된EcoRI-SalI처리 DNA단편(서열번호 3과 4의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)은SalI-EcoRI처리 pUC119단편과,XbaI-SmaI처리 DNA단편(서열번호 5와 6의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)은XbaI-SmaI처리 pSTV28단편과,SmaI-SalI처리 DNA단편(서열번호 7과 8의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)은SalI-SmaI처리 pUC119단편과,EcoRI-SalI처리 DNA단편(서열번호 9와 10의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)은SalI-EcoRI처리 pUC119단편과,XbaI-BglII처리 DNA단편(서열번호 11과 12의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)은XbaI-BamHI처리 pSTV28단편과,XbaI-SmaI처리 DNA단편(서열번호 15와 16의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)은XbaI-SmaI처리 pSTV28단편과 각각 혼합시킨 후, 에탄올 침전을 하고 수득된 DNA 침전물을 5μl의 증류수에 용해하고 라이게이션 반응을 행하여 재조합체 DNA를 각각 수득하였다. 재조합체 DNA를 이용하여E.coli(동양방에서 구입) DH5α주를 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 형질전환시킨 후, 전기 형질전환체를 pUC119를 벡터플라스미드로 이용하는 경우는 암피실린 100μg/ml을 함유한 LB 한천[1L 중에 박토트립톤(Difco사제) 10g, 박토이스트익스트랙트(Difco사제) 5g, NaCl을 함유, 1mol/l NaOH로 pH 7.4에 조정, 한천을 1.5%가 되도록 첨가]배지에, pSTV28을 벡터플라스미드로 이용하는 경우는 클로람페니콜 25μg/ml을 포함한 LB 한천배지에 각각 도포하고 25℃에서 2일간 배양하였다.
생육된 암피실린 내성 또는 클로람페니콜 내성의 형질전환체의 콜로니를 수개 선택하고 암피실린 100μg/ml 또는 클로람페닐콜 25μg/ml을 포함한 LB액체 배지[1L중에 박토트립톤(Difco사제) 10g, 박토이스트익스트랙트(Difco사제) 5g, NaCl 5g을 포함하고 1mol/l NaOH로 pH7.4에 조정] 10ml에 접종한 후, 25℃에서 2일간 진탕배양하였다.
수득된 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하였다.
전기 균체에서 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 플라스미드를 분리하였다. 분리된 플라스미드를 각종 제한효소로 절단하여 구조를 조사하고 염기서열을 결정한 결과, 전기 플라스미드 중에 목적하는 DNA단편이 삽입되어 있는 것을 확인하였다.EcoRI-SalI처리 DNA단편(서열번호 3과 4의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)과SalI-EcoRI처리 pUC119단편을 연결하여 수득된 플라스미드를 pUbioI,XbaI-SmaI처리 DNA단편(서열번호 5와 6의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)과XbaI-SmaI처리 pSTV28단편을 연결하여 수득된 플라스미드를 pScypA,SmaI-SalI처리 DNA단편(서열번호 7과 8의 프라이머 조합으로 PCR 증폭)과SalI-SmaI처리 pUC119단편을 연결하여 수득된 플라스미드를 pUcypX,EcoRI-SalI처리 DNA단편(서열번호 9와 10의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)과SalI-EcoRI처리 pUC119단편을 연결하여 수득된 플라스미드를 pUpksS,XbaI-BglII처리 DNA단편(서열번호 11과 12의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)과XbaI-BamHI처리 pSTV28단편을 연결해서 수득된 플라스미드를pSyetO,XbaI-SmaI처리 DNA단편(서열번호 13과 14의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)과XbaI-SmaI처리 pSTV28단편을 연결하여 수득된 플라스미드를 pSyjiB,XbaI-SmaI처리 DNA단편(서열번호 15와 16의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)과XbaI-SmaI처리 pSTV28단편을 연결하여 수득된 플라스미드를 pSyrhJ라 각각 명명하였다.
이와 같이 수득된 플라스미드를 함유하는 대장균 DH5α, pUC119 또는 pSTV28을 함유하는 대장균 DH5α 및 플라스미드를 가지지 않는 대장균 DH5α를 각각 LB 액체 배지 3ml(벡터플라스미드를 가지는 약제내성유전자에 대응하는 약제를 첨가)에 접종하고 28℃에서 12시간 진탕배양하였다. 이 배양액 0.5ml을 글루코스 1%, CaCO31%를 포함한 LB 액체배지(약제내성 유전자에 대응하는 약제를 첨가)에 접종하고 28℃에서 12시간 진탕배양하였다. 이 배양액 1ml을 어시스트튜브(어시스트사제)에 넣은 다음, 글루코스와 전기 수득된 화합물(VII-a)(R1은 나트륨 화합물)을 각각 최종농도 1% 및 100mg/l가 되도록 첨가하고 28℃에서 24시간 진탕하였다. 반응종료후 원심분리에 의해 균체를 제거하고, 수득된 반응상층에 동량의 초산에틸을 가하여 충분히 진탕하였다. 전기 용액을 원심분리하여 상층의 전기 초산에틸층을 분리하고 초산에틸층을 원심증발기에 의해 건고하였다. 전기 건고물을 최초의 배양상층의 1/5량의 메탄올에 용해하고 HPLC 분석[칼럼: Inertsil ODS-2(5μm, 4X250mm, 디엘사이언스사제), 칼럼 온도: 60℃, 이동상: 아세토니트릴:물:인산=55:45:0.05, 유속: 0.9ml/분, 검출파장: 237nm]을 행하고 화합물(VIII-a)(식에서, R1은 나트륨인 화합물)의 검출, 정량을 행하고, 그 결과를 표1에 나타내었다.
표 1
플라스미드 화합물(VIII-a)(mg/l)
없음 0
pUC119 0
pSTV28 0
pUbioI 0
pScypA 0
pUcypX 0
pUpksS 0
pSyetO 0
pSyjiB 0.6
pSyrhJ 0
실시예 2:고초균을 숙주로 하는 yjiB유전자의 발현 및 전기 유전자에 의 해 암호화된 단백질 활성의 확인
서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20, 서열번호 21 및 22, 서열번호 23 및 24, 서열번호 25 및 26, 서열번호 27 및 28, 서열번호 29 및 30의 염기서열의 조합을 가지는 센스프라이머 및 안티센스프라이머를 DNA 합성기를 이용하여 합성하였다.
실시예 1에서 수득된 고초균 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이들 프라이머와 TaKaRa LA-PCR TM Kit Ver.2(타카라주조사제), Expand TM High-Fidelity PCR System(베링거맨하임사제) 또는 Taq DNA polymerase(베링거사제)를 이용하여 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Japan사제)를 이용하여 PCR을 행하였다.
PCR은 2kb 이하의 DNA단편은 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초, 72℃에서 2분간의 반응 공정을 1 사이클로 하고, 2kb를 초과하는 DNA 단편은 98℃에서 20초간,68℃에서 3분간의 반응공정을 1 사이클로하여 30사이클 행한 후, 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 행하였다.
PCR에 의해 증폭된 DNA 단편 중, 서열번호 17과 18의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(bioI 유전자 포함)은 제한효소SpeI과 제한효소BamHI으로, 서열번호 19와 20의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(cypA 유전자 포함)은 제한효소SpeI과 제한효소BamHI으로, 서열번호 21과 22의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(cypX 유전자 포함)는 제한효소SpeI과 제한효소NruI으로, 서열번호 23과 24의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(pksS 유전자 포함)은 제한효소SpeI과 제한효소BamHI으로, 서열번호 25와 26의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(yetO유전자 포함)는 제한효소SpeI과 제한효소BamHI으로, 서열번호 27과 28의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편(yjiB 유전자 포함)는 제한효소SpeI와 제한효소BamHI으로, 서열번호 29와 30(yrhJ 유전자 포함)의 프라이머의 조합으로 증폭된 DNA단편은 제한효소SpeI과 제한효소BamHI으로 각각 절단하였다.
절단 후, 이들 제한효소 처리 DNA단편을 아가로스겔 전기영동하고 각 제한효소처리 DNA단편을 수득하였다.
벡터플라스미드 pWH1520(MoBiTec사제)를 제한효소SpeI및BamHI으로 절단 후, 아가로스겔 전기영동을 행하고,SpeI-BamHI처리 pWH1520단편을 수득하였다. 마찬가지로, 벡터플라스미드 pWH1520을 제한효소SpeI및NruI으로 절단 후, 아가로스겔 전기영동을 행하여SpeI-NruI처리 pWH1520단편을 수득하였다.
상기에서 수득된SpeI-BamHI처리 DNA단편(서열번호 17과 18, 19와 20, 23과24, 25와 26, 27과 28, 및, 29와 30의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)은SpeI-BamHI처리 pWF1520단편과,SpeI-NruI처리 DNA단편(서열번호 21과 22의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭)은SpeI-NruI처리 pWF1520단편과 각각 혼합한 후, 에탄올 침전을 행하고 수득된 DNA침전물을 5μl의 증류수에 용해하고 라이게이션 반응을 행하여 재조합체 DNA를 각각 수득하였다.
전기 재조합체 DNA를 이용하여E.coli(동양방에서 구입) DH5α주를 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 형질전환시킨 후, 테트라사이클린 10μg/ml을 포함한 LB 한천배지에 도포하고 25℃에서 2일간 배양하였다. 수득된 배양액을 원심분리하여 균체를 수득하였다.
전기 균체에서 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 플라스미드를 분리하였다.
전기 방법에 의해 분리된 플라스미드를 각종 제한효소로 절단하여 구조를 조사하고, 염기서열을 결정하여 전기 플라스미드는 목적 DNA단편이 삽입되어 있는 플라스미드인 것을 확인하였다. 서열번호 17과 18의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭한 DNA단편을 pWH1520에 연결하여 수득된 플라스미드를 pWbioI, 서열번호 19와 20의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭한 DNA단편을 pWH1520에 연결하여 수득된 플라스미드를 pWcypA, 서열번호 21과 22의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭한 DNA단편을 pWH1520에 연결하여 수득된 플라스미드를 pWcypX, 서열번호 23과 24의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭한 DNA단편을 pWH1520에 연결하여 수득된 플라스미드를 pWpksS, 서열번호 25과 26의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭한 DNA단편을 pWH1520에 연결하여 수득된 플라스미드를 pWyetO, 서열번호 27과 28의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭한 DNA단편을 pWH1520에 연결하여 수득된 플라스미드를 pWyjiB, 서열번호 29와 30의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭한 DNA단편을 pWH1520에 연결하여 수득된 플라스미드를 pWyrhJ라 각각 명명하였다.
이와 같이 수득된 플라스미드 및 벡터 플라스미드 pWH1520을 창(S. Chang)과 코헨(S.N. Cohen) 등의 방법을 따라Bacillus subtilisATCC33712주에 도입하였다(참조: S.Chang and S.N. Cohen: Mol. Gen. Genet., 168:111, 1979).
즉, ATCC33712주를 5ml의 Pen배지(Difco Antibiotic medium No.3 1.75g을 물 100ml에 용해하고 고압멸균한 것)를 담은 굵은 시험관에 접종하고 37℃에서 하루밤 진탕배양한 후, Pen배지 100ml을 담은 300ml의 삼각플라스크에 하루밤 배양한 균체를 전량 접종하고 37℃에서 3시간 진탕배양하여 대수증식기 중기까지 생육시켰다. 전기 배양액을 무균조건 하에서 5000rpm, 10분간 원심분리하고 균체를 침전시켰다. 상층을 버린 후, 4.5ml의 SMMP[X2 SMMP(슈크로스 34.2g, 말레인산 0.464g, 염화마그네슘·6수화물 0.813g을 물에 용해하고 수산화나트륨으로 pH 6.5에 조정 후, 100ml로 하여 고온고압 멸균한 것)과 X4 Pen배지(Difco Antibiotic medium No. 3.7g을 물 100ml에 용해하고 고온고압 멸균한 것)의 동량혼합물]에 현탁하고 리조튬 용액[리조튬(생화학공업) 10mg을 0.5ml의 SMMP에 용해시키고 포어사이즈 0.45μm의 밀리포아필터로 필터 멸균한 것]을 0.5ml을 가하고 37℃에서 천천히 2시간 진탕하였다. 현미경으로 90% 이상의 세포가 프로토플라스트화되어 있는 것을 확인한 후, 3000rpm, 20분간 원심분리하여 프로토플라스트를 침전시켰다. 상층을제거하고 수득된 프로토플라스트를 5ml의 SMMP에 재현탁하였다. 재차 3000rpm, 20분간 원심분리하여 프로토플라스트를 회수하여, SMMP 2ml에 현탁하고, 형질전환의 수용균의 프로토플라스트 현탁액으로 하였다.
플라스미드 DNA 약 1μg을 SMMP에 용해하고 프로토플라스트 현탁액 0.5ml로 충분히 혼합하였다. 혼합하여 곧 40% 폴리에틸 글리콜액[폴리에틸글리콜 6000(나카라이테스크) 40g을 X2 SMMP에 용해하고 물로 100ml로 맞춘 후, 고온고압 멸균한 것] 1.5ml을 가하고 충분히 혼합하였다. 실온에서 2분간 방치한 후, 5ml의 SMMP를 가하여 혼합하고 3000rpm, 20분간 원심분리 하였다. 상층을 제거한 후 침전된 프로토플라스트에 1ml의 SMMP를 가하여 현탁하고 30℃에서 3시간 천천히 진탕하였다. SMMP로 적당히 희석한 후, 약제(테트라사이클린의 경우 10μg/ml이 되도록 가하였다)에 들어있는 DM3배지[박토아가(Difco사제) 80g/L를 45ml, 카자민산 50g/L를 50ml, 숙신산나트륨6수화물 338g/L pH 7.3을 250ml, 인산완충액(인산수소2칼륨 35g/L,인산2수소칼륨 15g/L)을 50ml, 효모엑기스 100g/L를 25ml, 염화마그네슘·6수화물 203g/L를 10ml, 글루코스 100g/L를 25ml 각각 고온고압 멸균한 후, 혼합하고 0.45μm의 밀리포아필터로 필터멸균한 소혈청알부민 20mg/ml을 3.5ml 가한 것]에 도포하였다. 37℃에서 1 내지 2일간 배양하여 형질전환체를 수득할 수 있었다.
이러한 방법으로 상기 각 플라스미드를 가지는B.subtilisATCC33712주를 수득하였다.
수득된 형질전환체 및 플라스미드를 도입하지 않은 ATCC33712주를 각각 LB 액체배지 3ml(플라스미드 보유주에 대해서는 테트라사이클린 10mg/L를 첨가)에 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하였다. 이 배양액 0.25ml를 TB배지[박토트립톤(Difco사제) 1.4%, 박토이스트익스트랙트(Difco사제) 2.4%, KH2PO40.231%, K2HPO41.251% 1mol/l 수산화나트륨으로 pH 7.4에 조정] 5ml을 담은 시험관에 접종하고 30℃에서 3시간 진탕배양하였다. 3시간 후에 배양액 1ml을 어시스트 튜브 No.60.540S(어시스트사제)에 옮기고 멸균한 50% 크실로스용액을 40μl를 첨가하고 다시 3시간 진탕배양한 후, 실험예 1에서 수득된 화합물(VII-a)(R은 나트륨인 화합물)을 최종농도가 0.2mg/ml이 되도록 각각의 시험관에 첨가하고, 다시 16시간 30℃에서 진탕하여 반응을 행하였다.
반응종료 후, 반응액을 pH 3.5에 조정하였다. 이 반응액 0.5ml에 초산에틸 1ml을 가하고 1시간 진탕하였다. 진탕후, 3000rpm, 5분간 원심분리하여 반응액을 두 층으로 분리, 상층의 초산에틸층을 회수하고 원심증발기로 용매를 제거한 후 잔사를 메탄올 0.5ml에 용해하였다.
이 메탄올 용액의 일부를 이용하여 실시예 1과 마찬가지로 HPLC 분석을 행하고, 화합물(VIII-a)(R1은 나트륨인 화합물)의 검출, 정량을 행하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.
표 2
플라스미드 화합물(VIII-a)(mg/l)
없음 0.5
pWH1520 0.5
pWbioI 0.5
pWcypA 0.5
pWcypX 0.5
pWpksS 0.5
pWyetO 0.5
pWyjiB 24.6
pWyrhJ 0.5
실험예 1, 2의 결과에 의해, yjiB유전자는 화합물(VII-a) 또는 화합물(VII-b)로 부터 화합물(VIII-a) 또는 화합물(VIII-b)를 생성하는 활성이 암호화되어 있는 것이 명백하다.
즉, 상기 서열번호 27과 28의 프라이머의 조합으로 PCR 증폭된 DNA단편에는 서열번호 2에 기재된 염기서열이 포함되어 있고, 전기 염기서열 중에는 서열번호 1에 기재된 아미노산서열을 가지는 단백질을 암호화하는 염기서열이 포함되어 있다.
실시예 3: Bacillus megaterium을 숙주로하는 yjiB유전자의 발현 및 화합물(VIII-a)의 생산
실시예 2에서 제작된 pWyjiB를 실시예 2에 기재된 고초균의 형질전환법과 마찬가지 방법으로Bacillus megaterium(MoBiTec사제) 및,Bacillussp. FERM BP-6030에 도입하였다.
수득된 형질전환체 및 플라스미드를 가지지 않는 숙주를 실시예 2와 마찬가지로 배양, 반응하고, 생성된 화합물(VIII-a)의 양을 측정하여, 그 결과는 표 3에나타내었다.
표 3
숙주 플라스미드 화합물(VIII-a)(mg/l)
B.megaterium 없음 2.0
" pWyjiB 27.2
FERM BP-6030 없음 4.5
" pWyjiB 30.3
실시예 4:코리네형 세균으로 화합물(VIII-a)를 생성하는 단백질을 발현시키기 위한 플라스미드의 조성
실시예 1에서 수득된 yjiB유전자를 코리네형 세균 중에서 효율적으로 발현시키기 위해 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39에 기재된 염기서열을 가지는 DNA를 DNA 합성기를 이용하여 합성하였다.
코리네형 세균으로 발현하는 프로모터 서열 p54-6(GenBank AJ132582)를 가지고, 서열번호 40에 기재된 염기서열을 가지는 DNA단편을 플라스미드 벡터 pCS299P(특원평 11-110437)의 Sse83837-BamHI부위에 삽입된 플라스미드 pRI109 DNA를 이 플라스미드로 형질전환시킨E.coliNM522주로 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 조제하였다.
실시에 2에서 수득된 pWyjiB DNA를 주형으로 하여 서열번호 31 및 32의 염기서열을 가지는 DNA프라이머와 Taq DNA polymerase(타카라주조사제)를 이용하여, DNA Thermal Cycler 480(Perkin-Elmer Japan사제)로 PCR을 행하였다.
PCR은 96℃에서 30초간, 50℃에서 45초간, 72℃에서 3분간의 반응공정을 1사이클로 하여 25사이클 반응시키는 조건으로 행하였다.
PCR에 의해 증폭된 DNA단편을SalI과BamHI으로 절단한 후, 아가로스겔 전기영동을 행하여 약 1.2kb의 DNA단편을 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 정제하고SalI-BamHI처리 DNA단편을 수득하였다.
상기에서 수득된 플라스미드 pRI109 DNA를 제한효소SalI과BamHI으로 절단 후, 아가로스겔 전기영동을 행하여 6kb의 DNA단편을 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 정제하고SalI-BamHI처리 pRI109단편을 수득하였다.
상기에서 수득된SalI-BamHI처리 DNA단편과SalI-BamHI 처리 pRI109단편을 혼합한 후, 라이게이션시켜 재조합체 DNA를 수득하였다.
전기 재조합체 DNA를 이용하여E.coliDH5α(동양방사에서 구입)을 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 형질전환시킨 후, 카나마이신 20μg/ml을 포함한 LB한천배지에 도포하고 30℃에서 1일간 배양하여 형질전환체를 수득하였다.
전기 형질전환체에서 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 플라스미드를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 서열번호 33, 34, 35, 36, 37의 염기서열을 가지는 DNA를 각각 프라이머로 이용하고, DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystem사제) 및 373A Sequencer(Applied Biosystem사제)를 이용하여 삽입된 DNA단편의 염기서열을 결정하고 서열번호 41의 염기서열이 pRI109의SalI-BamHI부위간에 삽입되어 있는 플라스미드를 pRIyjiB라고 명명하였다.
서열번호 41에 기재된 염기서열에는 서열번호 42에 기재된 아미노산 서열을가지는 단백질을 암호화하는 염기서열이 포함되어 있다.
실시예 1에서 수득된Bacillus subtilisMarburg 168주(ATCC 15563주)의 염색체 DNA를 주형으로, 서열번호 38 및 39의 염기서열을 가지는 DNA 프라이머와 LA-Taq polymerase(타카라주조사제)를 이용하여, Thermal Cycler 480(Perkin-Elmer Japan사제)로 PCR을 행하였다.
PCR은 96℃에서 30초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 2분간의 반응공정을 1사이클로 하여 30사이클 행한 후 72℃에서 7분간 반응시키는 조건으로 행하였다.
PCR에 의해 증폭된 DNA단편을 pT7Blue(타카라주조사에서 구입)와 혼합한 후, 라이게이션반응을 행하여 재조합체 DNA를 수득하였다.
전기 재조합체 DNA를 이용하여E.coliDH5α(동양방사에서 구입)을 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 형질전환시킨 후, 암피실린 100μg/ml을 포함하는 LB 한천배지에 도포하고 30℃에서 1일간 배양하여 형질전환체를 수득하였다.
전기 형질전환체에서 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 플라스미드를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 각종 제한효소로 절단하여 구조를 조사하고 목적 DNA단편이 삽입되어 있는 플라스미드가 있는 것을 확인하고, pTSYN2-72라고 명명하였다.
pTSYN2-72 DNA를XhoI과BamHI으로 절단한 후, 아가로스 겔 전기 영동을 행하고 약 1.2kb의 DNA단편을 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 정제하여XhoI-BamHI처리 DNA단편을 수득하였다.
플라스미드 pRI109 DNA를 제한효소SalI과BamHI으로 절단한 후, 아가로스겔전기영동을 행하고 약 6kb의 DNA단편을 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 정제하고SalI-BamHI처리 pRI109단편을 수득하였다.
상기에서 수득된XhoI-BamHI처리 DNA단편과SalI-BamHI처리 pRI109단편을 혼합시킨 후, 라이게이션시켜 재조합체 DNA를 수득하였다.
상기 재조합체 DNA를 이용하여E.coliDH5α(동양방사에서 구입)을 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 형질전환시킨 후, 카나마이신 20μg/ml을 포함한 LB 한천배지에 도포하고 30℃에서 1일간 배양하여 형질전환체를 수득하였다.
전기 형질전환체에서 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 플라스미드를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 서열번호 33, 34, 35, 37, 37의 염기서열을 가지는 DNA를 각각 프라이머로 이용하여 DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystem사제) 및 373A Sequencer(Applied Biosystem사제)로, 삽입된 DNA단편의 염기서열을 결정하고 서열번호 43의 서열이 pRI109의SalI-BamHI부위간에 삽입되어 있는 플라스미드를 pSYN2-72라고 명명하였다.
서열번호 43에 기재된 염기서열 중에는, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 염기서열이 포함되어 있다.
실시예 2에서 수득된 pWyjiB DNA를 주형으로 하여 서열번호 38 및 39의 염기서열을 가지는 DNA프라이머와 Z-Taq DNA polymerase(타카라주조사제)를 이용하여 DNA Thermal Cycler 480(Perkin-Elmer Japan사제)으로 PCR을 행하였다.
PCR은 98℃에서 20초간, 55℃에서 20초간, 72℃에서 30분간의 반응공정을 1사이클로 하여 25사이클 반응시키는 조건에서 행하였다.
PCR에 의해 증폭된 DNA단편을XhoI와BamHI으로 절단한 후, 아가로스겔 전기영동을 행하고 약 1.2kb의 DNA단편을 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 정제하고XhoI-BamHI처리 DNA단편을 수득하였다.
플라스미드 pRI109 DNA를 제한효소SalI과BamHI으로 절단한 후, 아가로스겔 전기영동을 행하고 약 6kb의 DNA단편을 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 정제하여SalI-BamHI처리 pRI109단편을 수득하였다.
상기에서 수득된XhoI-BamHI처리 DNA단편과SalI-BamHI처리 pRI109단편을 혼합한 후, 라이게이션시켜 재조합체 DNA를 수득하였다.
전기 재조합체 DNA를 이용하여E.coliDH5(동양방사에서 구입)를 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 형질전환 후, 카나마이신 20μg/ml을 포함한 LB 한천배지에 도포하고 30℃에서 1일간 배양하여 형질전환체를 수득하였다.
전기 형질전환체에서 당업계의 공지된 통상의 방법에 따라 플라스미드를 분리하였다. 분리한 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 서열번호 33, 34, 35, 36, 37의 염기서열을 가지는 DNA를 각각 프라이머로 이용하여 DyeTerminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystem사제) 및 373A Sequencer(Applied Biosystem사제)를 이용하여 삽입된 DNA단편의 염기서열을 결정하고 서열번호 44에 기재된 염기서열이 pRI109의SalI-BamHI부위간에 삽입되어 있는 플라스미드를 pSYN2-39라 명명하였다.
서열번호 44에 기재된 염기서열 중에는 서열번호 45에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 염기서열이 포함되어 있다.
실시예 5: C.glutamicumATCC130132주에 플라스미드 도입과 활성평가
ATCC13032주를 8ml의 부이용(Bouillon)배지[통상 부이용배지(극동제약공업사제) 20g/l, Bacto Yeast Extract(Difco사제) 5g/l]가 들어 있는 시험관에 접종하고, 30℃에서 하루밤 진탕배양하고 부이용배지 250ml가 든 2l삼각플라스크(차단기 부착)에 하루밤 배양한 균체를 5ml 접종하고 30℃에서 4시간 진탕배양하였다. 수득된 배양액을 원심분리하여 균체를 침전시켰다. 상층을 제거한 후, 빙냉시킨 30ml의 EPB[250mmol/l Sucrose, 15%(v/v) glycerol]에 현탁하고 원심분리하여 재차 균체를 침전시켰다. 마찬가지로 다시 EPB에 현탁시키고, 원심분리하여 균체를 분리한 후, 2ml의 EPB에 균체를 현탁하였다. 수득된 균체 현탁액을 0.5ml 튜브에 0.1ml씩 분주한 후, 드라이아이스를 이용하여 급속 동결하고 형질전환용 균체현탁액을 수득하여 수득된 균체는 -80℃에서 보존하였다.
동결된 형질전환용 균체현탁액 0.1ml을 빙상에서 용해하고 43.5℃에서 10분간 유지한 후, 다시 빙상으로 옮겼다. 약 2μg의 pRI109 DNA를 포함한 수용액 2μl를 첨가한 후, 미리 빙냉한E.coliGenePulser 큐벳(BioRad사제)에 이동시키고, GenePulser(BioRad사제)를 이용한 전기천공법에서 25μF, 200Ω, 1.5kV의 조건에서 균체 내에 DNA를 도입하였다. 전기천공법 후, 곧 균체현탁액 전량을 1ml의 부이용배지가 들어 있는 15ml 테스트 튜브에 옮기고, 30℃에서 1시간 진탕배양하였다.
수득된 배양액을 3,500rpm, 10분간 원심분리하여 균체를 침전시켰다. 상층을 제거한 후, 다시 0.1ml의 부이용배지를 첨가하여 균체를 현탁시킨 후, 현탁액을 카나마이신 20μg/ml을 담은 부이용 한천배지[2% Difco Agar로 고형화시킨 부이용배지]에 도포하고, 30℃에서 2일간 배양하여 형질전환체를 수득하였다.
이렇게 하여 pRI109를 가지는C.glutamicumATCC13032주를 수득하였다.
상기와 마찬가지로, 실시예 4에서 수득된 pRIyjiB, pSYN2-72, pSYN2-39 각 플라스미드를 가지는C.glutamicumATCC13032주를 수득하였다.
수득된 형질전환체를 각각 카나마이신 100μg/ml을 포함한 부이용배지 3ml을 넣은 시험관에 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하였다. 배양액 0.2ml을 카나마이신 100μg/ml을 포함한 LMC배지[고온고압 멸균한 pre-LMC배지(NH4Cl 1g/l, KH2PO41g/l, K2HPO43g/l, Difco Yeast Extract 0.2g/l, Urea 1g/l, Biotin 0.05mg/l, Thiamin 0.5mg/l, Corn Steep Liquor 10g/l, pH 7.2)에 각각 멸균한 Glucose, MgSO4, FeSO4, MnSO4를 각각 최종농도 30g/l, 0.1g/l, 2mg/l, 2mg/l가 되도록 첨가] 2ml을 넣은 시험관에 옮기고 30℃에서 5시간 진탕배양하였다. 화합물(VII-a)(식에서, R은 나트륨인 화합물)를 최종농도 300mg/l가 되도록 첨가하고 다시 30℃에서 16시간 진탕반응하였다.
반응액 0.5ml을 1.5ml 튜브에 옮기고 15,000rpm, 2분간 원심분리하여 균체를 분리 하였다. 수득된 상층 부분을 메탄올으로 5 내지 20배로 희석하고 15,000rpm, 2분간 원심분리한 후, 그 일부로 실시예 1과 마찬가지로 HPLC 분석을 행하고 화합물(VIII-a)(R1은 나트륨인 화합물)의 검출, 정량을 행하였다. 정량 결과를 기준으로 산출한 반응액 중의 화합물(VIII-a)의 농도를 표 4에 나타내었다.
표 4
플라스미드 화합물(VIII-a)(mg/l)
pRI109 0.3
pSYN2-72 30
pRIyjiB 61
pSYN2-39 104
실시예 6:코리네형 세균에의 플라스미드 도입과 활성평가
실시예 4에서 수득된 pRIyjiB DNA를 실시예 5에 기재된 ATCC13032주의 형질전환법과 마찬가지 방법으로,C.callunaeATCC15991,C.ammoniagenesATCC6872,B.flavumATCC14067에 도입시켜 각각의 균주로 부터 형질전환주를 수득하였다.
수득된 형질전환체를 각각 카나마이신 100μg/ml을 포함한 부이용배지 3ml을 넣은 시험관에 접종하고, 30℃에서 24시간 진탕배양하였다.
배양액 0.5ml을 카나마이신 100μg/ml, Glucose 10g/l를 포함한 TB배지[Bacto Trypton(Difco사제) 14g, Bacto Yeast Extract 24g(Difco사제)를 900ml의 물에 용해하고 고온고압 멸균하고 다른 고온고압 멸균된 PB(KH2PO423.1g/l, K2HPO4125.1g/l)를 100ml첨가한 것] 5ml을 넣은 시험관 시험관에 옮기고, 30℃에서 5시간 진탕배양하였다. 이 배양액 1ml을 어시스트 튜브(어시스트사제)에옮기고 화합물(VII-a)(R은 나트륨인 화합물)을 최종농도가 300mg/l가 되도록 첨가하고 다시 30℃에서 16시간 진탕반응하였다.
반응종료 후, 실시예 2에 기재된 방법으로 반응액 중의 화합물(VIII-a)(R1은 나트륨인 화합물)의 검출, 정량을 행하였다. 정량결과를 기준으로 검출된 배양액 중의 화합물(VIII-a)의 농도를 표 5에 나타내었다.
표 5
숙주 플라스미드 화합물(VIII-a)(mg/l)
C.callunae ATCC15991(KY3510) pRIyjiB 22
C.ammoniagenes ATCC6872(KY3454) pRIyjiB 12
B.flavum ATCC(KY10122) pRIyjiB 23
본원발명에 의해 새로운 수산화효소를 암호화하는 DNA 및 히드록시메틸글루타릴CoA(HMG-CoA) 환원효소를 저해하고 혈청콜레스테롤의 저하작용을 가지는 화합물을 효율적으로 제조할 수 있다.
[서열표의 프리텍스트]
서열번호 3: 합성 DNA
서열번호 4: 합성 DNA
서열번호 5: 합성 DNA
서열번호 6: 합성 DNA
서열번호 7: 합성 DNA
서열번호 8: 합성 DNA
서열번호 9: 합성 DNA
서열번호 10: 합성 DNA
서열번호 11: 합성 DNA
서열번호 12: 합성 DNA
서열번호 13: 합성 DNA
서열번호 14: 합성 DNA
서열번호 15: 합성 DNA
서열번호 16: 합성 DNA
서열번호 17: 합성 DNA
서열번호 18: 합성 DNA
서열번호 19: 합성 DNA
서열번호 20: 합성 DNA
서열번호 21: 합성 DNA
서열번호 22: 합성 DNA
서열번호 23: 합성 DNA
서열번호 24: 합성 DNA
서열번호 25: 합성 DNA
서열번호 26: 합성 DNA
서열번호 27: 합성 DNA
서열번호 28: 합성 DNA
서열번호 29: 합성 DNA
서열번호 30: 합성 DNA
서열번호 31: 합성 DNA
서열번호 32: 합성 DNA
서열번호 33: 합성 DNA
서열번호 34: 합성 DNA
서열번호 35: 합성 DNA
서열번호 36: 합성 DNA
서열번호 37: 합성 DNA
서열번호 38: 합성 DNA
서열번호 39: 합성 DNA
서열번호 40: 합성 DNA

Claims (39)

  1. Bacillus속에 속하는 미생물 유래의 단백질이며, 하기 일반식(I-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(I-a)'라 함] 또는 하기 일반식(I-b)로 표시되는 화합물(I-a)의 락톤체[이하, '화합물(I-b)'라 함]로 부터 하기 일반식(II-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(II-a)'라 함] 또는 하기 일반식(II-b)로 표시되는 화합물(II-a)의 락톤체[이하, '화합물(II-b)'라 함]을 생성하는 활성을 가지는 단백질;
    상기 식에서,
    R1은 수소원자, 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 알칼리금속 이고; 및,
    R2는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 치환되거나 치환되지 않은 아릴이다.
  2. Bacillus속에 속하는 미생물 유래의 단백질이며, 하기 일반식(III-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(III-a)'라 함]이고, 또는 하기 일반식(III-b)로 표시되는 화합물(III-b)의 락톤체[이하, '화합물(III-b)'라 함]로 부터 하기 일반식(IV-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(IV-a)'라 함] 또는 하기 일반식(IV-b)로 표시되는 화합물(IV-a)의 락톤체[이하, '화합물(IV-b)'라 함]를 생성하는 활성을 가지는 단백질;
    상기 식에서,
    R1은 수소원자, 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 알칼리 금속이고; 및,
    R2는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 치환되거나 치환되지 않은 아릴이다.
  3. Bacillus속에 속하는 미생물 유래의 단백질이며, 하기 일반식(V-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(V-a)'라 함]이고, 또는 하기 일반식(V-b)로 표시되는 화합물(V-a)의 락톤체[이하, '화합물(V-b)'라 함]로 부터 하기 일반식(VI-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(VI-a)'라 함] 또는 하기 일반식(VI-b)로 표시되는 화합물(VI-a)의 락톤체[이하, '화합물(VI-b)'라 함]을 생성하는 활성을 가지는 단백질;
    상기 식에서,
    R1은 수소원자, 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 알칼리 금 속이다.
  4. Bacillus속에 속하는 미생물 유래의 단백질이며, 하기 일반식(VII-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(VII-a)'라 함] 또는 하기 일반식(VII-b)로 표시되는 화합물(VII-a)의 락톤체[이하, '화합물(VII-b)'라 함]로 부터 하기 일반식(VIII-a)로 표시되는 화합물[이하, '화합물(VIII-a)'라 함] 또는 하기 일반식(VIII-b)로 표시되는 화합물(VIII-a)의 락톤체[이하, '화합물(VIII-b)'라 함]를 생성하는 활성을 가지는 단백질;
    상기 식에서,
    R1은 수소원자, 치환되거나 치환되지 않은 알킬 또는 알칼리 금 속이다.
  5. 제 1 내지 4항의 어느 한 항에 있어서,
    Bacillus속에 속하는 미생물은B.subtilis,B.megaterium,B.laterosporus,B.sphaericus,B.pumilus,B.stearothermophilus,B.cereus,B.badius,B.brevis,B.alvei,B.circulans및,B.macerans로 부터 선택되는 미생물인
    단백질.
  6. 제 1 내지 5항의 어느 한 항에 있어서,
    Bacillus속에 속하는 미생물은B.subtilisATCC6051주,B.megateriumATCC10778주,B.megateriumATCC11562주,B.megateriumATCC13402주,B.megateriumATCC15177주,B.megateriumATCC15450주,B.megateriumATCC19213주,B.megateriumIAM1032주,B.laterosporusATCC4517주,B.pumilusFERM BP-2064주,B.badiusATCC14574주,B.brevisNRRL B- 8029주,B.alveiATCC6344주,B.circulansNTCT-2610주, 및,B.maceransNCIMB-9368주로 부터 선택되는 미생물인
    단백질.
  7. 제 1 내지 5항의 어느 한 항에 있어서,
    Bacillus속에 속하는 미생물은Bacillussp. FERM BP-6029주 및Bacillussp. FERM BP-6030주로 부터 선택되는 미생물인
    단백질.
  8. 서열번호 1에 기재된 아미노산 배열을 가지는 단백질.
  9. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며, 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 활성을 가지는 단백질.
  10. 제 9항에 있어서,
    단백질이 서열번호 42 또는 45에 기재된 아미노산 서열을 가지는
    단백질.
  11. 제 9항에 있어서,
    화합물(I-a)가 화합물(III-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(III-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(IV-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(IV-b)인
    단백질.
  12. 제 9항에 있어서,
    화합물(I-a)가 화합물(V-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(V-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(VI-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(VI-b)인
    단백질.
  13. 제 9항에 있어서,
    화합물(I-a)가 화합물(VII-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(VII-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(VIII-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(VIII-b)인
    단백질.
  14. 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 분리된 DNA.
  15. 제 14항에 기재된 DNA와 엄격한(stringent) 조건하에서 교잡하고, 동시에 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성하는 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 분리된 DNA.
  16. 제 15항에 있어서,
    DNA가 서열번호 41, 43 및 44에 기재된 염기서열으로 이루어지는 그 룹으로 부터 선택되는 염기서열을 가지는
    DNA.
  17. 제 1 내지 12항의 어느 한 항에 기재된 단백질을 암호화하는 분리된 DNA.
  18. 제 15항에 있어서,
    화합물(I-a)가 화합물(III-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(III-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(IV-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(IV-b)인
    DNA.
  19. 제 15항에 있어서,
    화합물(I-a)가 화합물(V-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(V-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(VI-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(VI-b)인
    DNA.
  20. 제 15항에 있어서,
    화합물(I-a)가 화합물(VII-a)이고, 화합물(I-b)가 화합물(VII-b)이며, 화합물(II-a)가 화합물(VIII-a)이고, 화합물(II-b)가 화합물(VIII-b) 인
    DNA.
  21. 제 14 내지 20항의 어느 한 항에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 DNA벡터.
  22. 제 21항에 기재된 재조합 DNA벡터를 숙주세포에 도입시켜 수득할 수 있는 형질전환체.
  23. 제 22항에 있어서,
    형질전환체가Escherichia속,Bacillus속,Corynebacterium속 및Streptomyces속으로 부터 선택되는 미생물에 속하는
    형질전환체.
  24. 제 22 또는 23항에 있어서,
    형질전환체가Escherichia coli,Bacillus subtilis,Bacillus megaterium,Corynebacterium glutamicum,Corynebacterium ammoniagenes,Corynebacterium callunae및,Streptomyces lividans으로 부터 선택되는 미생물에 속하는 미생물인
    형질전환체.
  25. 제 22 내지 24항의 어느 한 항에 기재된 형질전환체, 전기 형질전환체의 배양물 또는 배양물의 처리물을 효소원으로 이용하고, 화합물(I-a) 또는 화합물(I-b)를 수성매체 중에 넣어 전기 수성 매체 중에서 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 생성, 축적시킨 다음, 전기 수성매체로 부터 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)를 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물(II-a) 또는 화합물(II-b)의 제조방법.
  26. 제 22 내지 24의 어느 한 항에 기재된 형질전환체, 전기 형질전환체의 배양물 또는 배양물의 처리물을 효소원으로 이용하고, 화합물(III-a) 또는 화합물(III-b)를 수성매체 중에 넣어 전기 수성 매체 중에서 화합물(IV-a) 또는 화합물(IV-b)를 생성, 축적시킨 다음, 전기 수성매체로 부터 화합물(IV-a) 또는 화합물(IV-b)를 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물(VI-a) 또는 화합물(VI-b)의 제조방법.
  27. 제 22 내지 24항의 어느 한 항에 기재된 형질전환체, 전기 형질전환체의 배양물 또는 배양물의 처리물을 효소원으로 이용하고, 화합물(V-a) 또는 화합물(V-b)를 수성매체 중에 넣어 전기 수성 매체 중에서 화합물(VI-a) 또는 화합물(VI-b)를 생성, 축적시킨 다음, 전기 수성매체로 부터 화합물(VI-a) 또는 화합물(VI-b)를 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물(VI-a) 또는 화합물(VI-b)의 제조방법.
  28. 제 22 내지 24항의 어느 한 항 기재된 형질전환체, 전기 형질전환체의 배양물 또는 배양물의 처리물을 효소원으로 이용하고, 화합물(VII-a) 또는 화합물(VII-b)를 수성매체 중에 넣어 전기 수성 매체 중에서 화합물(VIII-a) 또는 화합물(VIII-b)를 생성, 축적시킨 다음, 전기 수성매체로 부터 화합물(VIII-a) 또는 화합물(VIII-b)를 수득하는 것을 특징으로 하는 화합물(VIII-a) 또는 화합물(VIII-b)의 제조방법.
  29. 제 25항에 있어서,
    화합물(II-b)가 화합물(II-a)에서 락톤을 형성시켜 수득되는 화합물(II-b)인
    제조방법.
  30. 제 25항에 있어서,
    화합물(II-a)가 화합물(II-b)에서 락톤을 개환시켜 수득되는 화합물(II-a)인
    제조방법.
  31. 제 26항에 있어서,
    화합물(IV-b)가 화합물(IV-a)에서 락톤을 형성시켜 수득되는 화합물(IV-b)인
    제조방법.
  32. 제 26항에 있어서,
    화합물(VI-a)가 화합물(VI-b)에서 락톤을 개환시켜 수득되는 화합물(VI-a)인
    제조방법.
  33. 제 27항에 있어서,
    화합물(VI-b)가 화합물(VI-a)에서 락톤을 형성시켜 수득되는 화합물(VI-b)인
    제조방법.
  34. 제 27항에 있어서,
    화합물(VI-a)가 화합물(VI-b)에서 락톤을 개환시켜 수득되는 화합물(VI-a)인
    제조방법.
  35. 제 28항에 있어서,
    화합물(VIII-b)가 화합물(VIII-a)에서 락톤을 형성시켜 수득되는 화합물(VIII-b)인
    제조방법.
  36. 제 28항에 있어서,
    화합물(VIII-a)가 화합물(VIII-b)에서 락톤을 개환시켜 수득되는 화합물(VIII-a)인
    제조방법.
  37. 제 25 내지 28항의 어느 한 항에 있어서,
    형질전환체의 배양물의 처리물이 배양균체, 전기 균체의 건조물, 동결 건조물, 계면활성제 처리물, 효소처리물, 초음파처리물, 기계적 마 쇄물, 용매처리물 등의 균체 처리물, 균체의 단백분획물, 균체 및 균 체 처리물의 고정화물로 부터 선택되는 처리물인
    제조방법.
  38. 제 22 내지 24항의 어느 한 항에 기재된 형질전환체를 배지에 배양하고 배양물 중에 제 1 내지 12항의 어느 한 항에 기재된 단백질을 생성하고 축적시켜 전기 배양물로 부터 단백질을 수득하는 것을 특징으로 하는 전기 단백질의 제조방법.
  39. 서열번호 2, 41, 43 및 44에 기재된 염기서열로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 염기서열 중의 연속된 5 내지 60 염기의 서열에 상당하는 올리고뉴클레오티드 또는 전기 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열에 상당하는 올리고뉴클레오티드.
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