KR20010022408A - ＨＭＧ-ＣｏＡ 환원효소 저해제의 제조법 - Google Patents

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KR20010022408A
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오자끼아끼오
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Abstract

본 발명은 반응액 중에서 하기 화학식 (I-a):
[화학식 I-a]
(식 중, R1은 수소, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속이고; R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴임)의 화합물, 또는 고리 폐쇄를 통하여 그로부터 유래되는 락톤 (I-b)로부터 하기 화학식 (II-a):
[화학식 II-a]
(식 중, R1및 R2는 각각 상기한 바와 같음)의 화합물, 또는 고리 폐쇄를 통하여 그로부터 유래되는 락톤 (II-b)를 생성하는 활성을 갖는 바실루스 (Bacillus)속 유래의 효소원을 사용하여 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)를 처리하여 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)를 생성시키고, 상기 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)를 반응액으로부터 회수하는 것으로 이루어진, 상기 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)의 제조 방법을 개시한다.

Description

ＨＭＧ-ＣｏＡ 환원효소 저해제의 제조법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF HMG-CoA REDUCTASE INHIBITORS}
하기 화학식 (VI-a):
(식 중, R1은 수소 원자 또는 알칼리 금속을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (VI-a)라 함), 및 하기 화학식 (VI-b):
의 화합물 (VI-a)의 폐쇄 락톤체 (이하, 화합물 (VI-b)라 함)가 HMG-CoA 환원효소를 저해하며 혈청 콜레스테롤 수준을 저하시키는 등의 활성을 나타낸다는 것이 공지되어 있다 [The Journal of Antibiotics, 29, 1346 (1976)].
몇몇 미생물은 하기 화학식 (V-a):
(식 중, R1은 수소 원자 또는 알칼리 금속을 나타냄)로 나타내어지는 화합물 (이하, 화합물 (V-a)라 함), 또는 하기 화학식 (V-b):
로 나타내어지는 화합물 (V-a)의 폐쇄 락톤체 (이하, 화합물 (V-b)라 함)를 화합물 (VI-a) 또는 화합물 (VI-b)로 전환시키는 능력을 가지고 있음이 공지되어 있다. 그러한 미생물로는 압시디아(Absidia)속, 쿤닝가멜라 (Cunninghamella)속, 신세팔라스포룸 (Syncephalasporum)속 또는 스트렙토마이세스 (Streptomyces)속에 속하는 미생물 (일본 특허 공개 공보 제(소)57-50894호), 악티노무코르 (Actinomucor)속, 시르시넬라 (Circinella)속, 곤그로넬라 (Gongronella)속, 모르티에렐라 (Mortierella)속, 무코르 (Mucor)속, 피코마이세스 (Phycomyces)속, 리조푸스 (Rhyzopus)속, 신세팔라스트룸 (Syncephalastrum)속, 자이고린쿠스 (Zygorhynchus)속, 피크노포루스 (Pycnoporus)속, 리족토니아 (Rhizoctonia)속 또는 노카르디아 (Nocardia)속에 속하는 미생물 [The Journal of Antibiotics, 36, 887 (1983)], 아미콜라타 (Amycolata)속, 사카로폴리스포라 (Saccharopolyspora)속, 아미콜라톱시스 (Amycolatopsis)속 또는 사카로트릭스 (Saccharothrix)속에 속하는 미생물 (일본 특허 공개 공보 제(평)7-184670호), 및 악티노마두라 (Actinomadura)속에 속하는 미생물 (WO96/40863)이 있다.
상기 미생물은 방선균 또는 사상균에 속한다. 본 발명의 미생물과 마찬가지로, 세균에 속하고, 상기 화합물 (V-a) 또는 화합물 (V-b)로부터 각각 화합물 (VI-a) 또는 화합물 (VI-b)를 생성하는 능력을 갖는 미생물은 지금까지 알려져 있지 않았다. 방선균 및 사상균은 세균과 비교하여 증식률이 작아 반응에 필요한 균체량을 수득하는 데에 더 많은 시간이 걸리는 결점이 있다. 또한 방선균 및 사상균은 발효조에서의 배양 관리가 어려운 문제점이 있다. 방선균 및 사상균은 균사를 연장하여 증식하기 때문에 발효조에서 증식시킬 때 배양액의 점도가 상승한다. 이 때문에 종종 산소가 부족해지고 배양액이 불균일하게 되어 반응 효율이 저하된다. 이러한 산소 부족 문제를 해소하고, 배양액을 균일하게 유지하기 위해서, 발효조의 교반 속도를 상승시켜야 하지만, 교반 속도를 상승시킬 경우 균사가 절단되어 미생물의 활성이 저하되기 쉽다 [Fundamentals of Fermentation Technology, 169-190페이지, P.F. Stansbury, A. Whitakaer, Gakkai Shuppan Center (1988)]. 방선균 및 사상균의 배양은 이러한 문제를 포함한다. 반면, 균사를 형성하지 않는 세균의 배양에서는, 배양액의 점도가 거의 상승하지 않고, 통기가 부족해지거나 배양액이 불균일하게 되는 것이 적기 때문에 배양 관리가 용이하다.
유전자 재조합 기술에서는 대개 대장균 등의 세균에서 유전자를 발현시킨다. 그러나 방선균 및 사상균의 유전자를 효율적으로 발현시키는 것은 일반적으로 어려운데, 이는 이들 방선균 및 사상균의 아미노산을 코딩하는 코돈이 대장균 등의 세균과 크게 다르기 때문이다.
방선균에서 유전자를 효율적으로 발현시키기 위한 벡터 및 프로모터 등의 재료는 단지 한정적으로 입수할 수 있다. 따라서, 유전자를 고수준으로 발현시키고 반응을 더 효율적으로 수행하기 위하여 여러 벡터, 프로모터 등이 이용될 수 있는 세균을 사용하는 것이 바람직하다. 세균의 유전자는 세균에서 고수준으로 용이하게 발현시킬 수 있다.
발명의 개시
본 발명의 목적은 HMG-CoA 환원효소를 저해하고, 혈청 콜레스테롤의 수준을 저하시키는 등의 작용을 갖는 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 바실루스 (Bacillus)속에 속하는 미생물로부터 유래된, 하기 화학식 (I-a):
(식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타내고, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (I-a)라 함), 또는 하기 화학식 (I-b):
(식 중, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (I-a)의 폐쇄 락톤체 (이하, 화합물 (I-b)라 함)로부터 하기 화학식 (II-a):
(식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타내고, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (II-a)라 함), 또는 하기 화학식 (II-b):
(식 중, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (II-a)의 폐쇄 락톤체 (이하, 화합물 (II-b)라 함)를 생성하는 활성을 갖는 효소원을, 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)에 반응액 중에서 작용시켜, 반응액 중에서 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)를 생성시키고, 상기 반응액으로부터 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)를 회수하는 것을 특징으로 하는 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)의 제조법에 관한 것이다.
알킬기의 예로는 탄소수 1 내지 10, 바람직하게는 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분지 알킬기, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 4,4-디메틸펜틸, 옥틸, 2,2,4-트리메틸펜틸, 노닐 및 데실과, 그의 분지쇄 이성질체가 있다.
아릴기의 예로는 페닐 및 나프틸이 있다.
치환 알킬기의 치환기의 예로는 할로겐, 히드록시, 아미노, 알콕시 및 아릴이 있다.
치환 아릴기의 치환기의 예로는 할로겐, 히드록시, 아미노, 알킬 및 알콕시가 있다.
알콕시의 알킬 부분은 상술한 알킬기와 동일한 의미를 가진다.
알칼리 금속은 리튬, 나트륨, 칼륨, 루비듐, 세슘 및 프란슘 원소를 의미한다.
본 발명에서는 바실루스속에 속하는 미생물에서 유래하고 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)를 각각 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)로 전환시키는 활성을 갖고 있기만 하다면 임의의 효소원이 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 효소원으로는 바실루스속에 속하고 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)를 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)로 전환시키는 활성을 갖는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 균체, 그의 처리물, 및 상기 미생물로부터 추출된 효소가 있다.
바실루스속에 속하고 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)를 각각 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)로 전환시키는 활성을 갖는 미생물의 예로는 바실루스 라테로스포루스 (Bacillus laterosporus), 바실루스 바디우스 (Bacillus badius), 바실루스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스 알베이 (Bacillus alvei), 바실루스 서큘란스 (Bacillus circulans), 바실루스 마세란스 (Bacillus macerans), 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실루스 푸밀루스 (Bacillus pumilus) 및 바실루스 서틸리스 (Bacillus subtilis)에 속하는 미생물이 있다.
더 구체적인 예로는 바실루스 라테로스포루스 ATCC 4517주, 바실루스 바디우스 ATCC 14574주, 바실루스 브레비스 NRRL B-8029주, 바실루스 종 (Bacillus sp.) PV-6주, 바실루스 종 PV-7주, 바실루스 알베이 ATCC 6344주, 바실루스 서큘란스 NTCT-2610주, 바실루스 마세란스 NCIB-9368주, 바실루스 메가테리움 ATCC 10778주, 바실루스 메가테리움 ATCC 11562주, 바실루스 메가테리움 ATCC 13402주, 바실루스 메가테리움 ATCC 15177주, 바실루스 메가테리움 ATCC 15450주, 바실루스 메가테리움 ATCC 19213주, 바실루스 메가테리움 IAM 1032주, 바실루스 푸밀루스 FERM BP-2064주 및 바실루스 서틸리스 ATCC 6051주가 있다.
또한 이들 미생물의 계대배양체, 돌연변이체 또는 유도체, 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 재조합체 등도 유용하다. 바실루스 종 PV-6주 및 바실루스 종 PV-7주는 본 발명자들에 의해 토양으로부터 새롭게 단리되었는데, 그의 미생물학적 특성이 하기에 기술되어 있다.
PV-6주
(A) 형태적 특성
1. 세포의 형태: 간상(rod상)
크기: 0.8-1.2 x 2.0-4.0 μm
2. 세포의 다형성의 유무: 무
3. 운동성의 유무: 무
4. 포자의 유무: 관찰되지 않음
(B) 배양적 특성
육즙 한천 평판 배지 및 육즙 액체 배지에서 배양할 경우의 배양적 특성을 이하에 기술한다.
1. 육즙 한천 평판 배양 (1 내지 2일간 배양)
1) 생육 양상: 양호
2) 색상: 크림색
3) 광택: 유
4) 확산성 색소: 무
2. 육즙 액체 배양 (1 내지 2일간 배양)
1) 표면 생육: 무
2) 탁도: 유
3. 육즙 젤라틴 천자(穿刺, stab) 배양
1) 생육 상태: 양호
2) 젤라틴의 액화: 유
4. 리트머스-밀크 반응
1) 반응: 알칼리
2) 응고: 무
3) 액화: 무
(C) 생리학적 특성
1. 그램 염색성: 양성 또는 음성
2. 질산염 환원: 음성
3. 탈질 반응: 양성
4. MR 시험: 음성
5. VP 시험: 음성
6. 인돌 생성: 음성
7. 황화수소의 생성: 양성
8. 전분의 가수분해: 음성
9. 시트르산의 이용: 양성
10. 무기 질소원의 이용
1) 질산염: 음성
2) 암모늄염: 양성
11. 색소의 생성: 무
12. 우레아제: 양성
13. 옥시다제: 음성
14. 카탈라제: 양성
15. 생육 범위
1) pH: 6-9 (최적 pH: 7 부근)
2) 온도: 6-40℃ (최적 온도: 30℃ 부근)
16. 산소에 대한 태도: 호기성
17. O-F 시험: 산화적
18. 산 생성 (호기적 조건);
+는 생성하는 것을 나타내고, -는 생성하지 않는 것을 나타낸다:
(1) L-아라비노스: -
(2) D-크실로스: -
(3) D-글루코스: +
(4) D-만노스: -
(5) D-프룩토스: +
(6) D-갈락토스: -
(7) 말토스: -
(8) 수크로스: -
(9) 락토스: -
(10) 트레할로스: -
(11) D-소르비톨: -
(12) D-만니톨: +
(13) 이노시톨: -
(14) 글리세린: +
(15) 전분: -
(D) 화학분류학적 특성
1. DNA 염기 조성 (G+C 몰%): 39.1
2. 균체 지질
주요 퀴논: MK-7
주요 지방산: 안테이소-C15:0, iso-C15:0
3. 세포벽 펩티도글리칸의 디아미노산 조성: meso-A2pm
본 균주는 양성 또는 음성의 그램 염색성을 나타내는 호기성 간상 세균으로서, 내생포자를 형성하고, 운동성은 없으며, 카탈라제 활성은 양성을 나타내고, 옥시다제 활성은 음성을 나타내며, 우레아제 활성은 양성이고, 글루코스로부터 산을 생성한다. 이 균주는 10℃에서 생육하지만, 50℃ 이상에서는 생육하지 않았다. 화학분류학적 특성은 하기와 같다: 주요 퀴논이 메나퀴논-7이고, 주요 지방산이 안테이소-C15:0및 이소-C15:0이며, 세포벽 펩티도글리칸의 디아미노산 조성이 메소디아미노피멜산이고, DNA의 GC 함량이 39.1 몰%이다.
이상의 미생물학적 특성을 갖는 균주의 분류학적 위치는 문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제2권 (1986)]에 기재된 것을 기초로 한 결과, 본 균주는 바실루스 속 관련 세균인 것으로 추정되었다. 또한 16S rRNA의 염기 배열을 바실루스 속 및 그의 관련 속의 염기 배열을 대조로 하여 근린결합법으로 분자계통해석을 행한 결과, 본 균은 도 1에 나타낸 바와 같이 바실루스 군에 클러스터링 (clustering)되었다. 따라서 본 균주를 바실루스 속에 속하는 세균으로 동정하고, 바실루스 종 PV-6으로 명명하였다.
PV-7주
(A) 형태적 특성
1. 세포의 형태: 간상
크기: 1.0 x 2.0-3.0 μm
2. 세포의 다형성의 유무: 무
3. 운동성의 유무: 무
4. 포자의 유무: 유
(B) 배양적 특성
육즙 한천 평판 배지 및 육즙 액체 배지에서 배양할 경우의 배양적 특성을 이하에 기술한다.
1. 육즙 한천 평판 배양 (1 내지 2일간 배양)
1) 생육 양상: 양호
2) 색상: 아이보리색
3) 광택: 무
4) 확산성 색소: 무
2. 육즙 액체 배양 (1 내지 2일간 배양)
1) 표면 생육: 유
2) 탁도: 유
3. 육즙 젤라틴 천자 배양
1) 생육 상태: 양호
2) 젤라틴의 액화: 유
4. 리트머스-밀크 반응
1) 반응: 알칼리
2) 응고: 무
3) 액화: 무
(C) 생리학적 특성
1. 그램 염색성: 양성 또는 음성
2. 질산염 환원: 숙신산 배지에서 양성
3. 탈질 반응: 음성
4. MR 시험: 음성
5. VP 시험: 음성
6. 인돌 생성: 음성
7. 황화수소의 생성: 명확하지 않음
8. 전분의 가수분해: 음성
9. 시트르산의 이용: 양성
10. 무기 질소원의 이용
1) 질산염: 음성
2) 암모늄염: 양성
11. 색소의 생성: 무
12. 우레아제: 양성
13. 옥시다제: 음성
14. 카탈라제: 양성
15. 생육 범위
1) pH: 6-10 (최적 pH: 7 부근)
2) 온도: 11-47℃ (최적 온도: 30℃ 부근)
16. 산소에 대한 태도: 호기성
17. O-F 시험: 산화적
18. 산 생성 (호기적 조건);
+는 생성하는 것을 나타내고, -는 생성하지 않는 것을 나타내며, w는 약하게 생성하는 것을 나타낸다:
(1) L-아라비노스: -
(2) D-크실로스: w
(3) D-글루코스: +
(4) D-만노스: w
(5) D-프룩토스: w
(6) D-갈락토스: -
(7) 말토스: w
(8) 수크로스: +
(9) 락토스: -
(10) 트레할로스: w
(11) D-소르비톨: +
(12) D-만니톨: +
(13) 이노시톨: w
(14) 글리세린: +
(15) 전분: w
(D) 화학분류학적 특성
1. DNA 염기 조성 (G+C 몰%): 37.9
2. 균체 지질
주요 퀴논: MK-7
주요 지방산: 안테이소-C15:0, 안테이소-C17:0
3. 세포벽 펩티도글리칸의 디아미노산 조성: meso-A2pm
본 균주는 양성 또는 음성의 그램 염색성을 나타내는 호기성 간상 세균으로서, 내생포자를 형성하고, 운동성은 없으며, 카탈라제 활성은 양성을 나타내고, 옥시다제 활성은 음성을 나타내며, 우레아제 활성은 양성이고, 글루코스로부터 산을 생성한다. 이 균주는 11℃에서 생육하지만, 47℃ 이상에서는 생육하지 않았다. 화학분류학적 특성은 하기와 같다: 주요 퀴논이 메나퀴논-7이고, 주요 지방산이 안테이소-C15:0및 안테이소-C17:0이며, 세포벽 펩티도글리칸의 디아미노산 조성이 메소디아미노피멜산이고, DNA의 GC 함량이 37.9 몰%이다. 이상의 미생물학적 특성을 갖는 균주의 분류학적 위치는 문헌 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 제2권 (1986)]에 기재된 것을 기초로 한 결과, 본 균주는 바실루스 속 관련 세균인 것으로 추정되었다. 또한 16S rRNA의 염기 배열을 바실루스 속 및 그의 관련 속의 염기 배열을 대조로 하여 근린결합법으로 분자계통해석을 행한 결과, 본 균은 도 1에 나타낸 바와 같이 바실루스 군에 클러스터링되었다. 따라서 본 균주를 바실루스 속에 속하는 세균으로 동정하고, 바실루스 종 PV-7로 명명하였다.
바실루스 종 PV-6주 및 바실루스 종 PV-7주는 1997년 7월 30일에 일본 305-8566 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1-쪼메 1-3 통상산업성 공업 기술원 생명공학 공업 기술 연구소에 각각 FERM BP-6029 및 FERM BP-6030으로 기탁되었다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지는, 본 발명의 미생물이 동화시킬 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 본 발명의 미생물이 효율적으로 배양되는 배지이기만 하다면, 천연 배지 또는 합성 배지 중 어느 것이라도 사용될 수 있다. 배지 중의 탄소원의 구체예로는 글루코스, 프룩토스, 글리세롤, 말토스, 전분, 다당류, 유기산 (예를 들어 아세트산 및 시트르산), 및 당밀이 있다.
질소원의 구체예로는 암모니아, 무기산 또는 유기산의 암모늄염 (예를 들어 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 질산암모늄 및 인산암모늄), 펩톤, 고기 추출물 (meat extract), 옥수수 침지액 (steep liquor), 카제인 가수분해물, 대두 밀(meal), 파마메디아 (Pharmamedia), 어류 밀, 각종 발효 균체 및 그의 소화물 등이 있다.
무기물의 구체예로는 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산구리 및 탄산칼슘 등이 있다.
또한, 필요할 경우 티아민, 바이오틴 등의 비타민류, 글루탐산 및 아스파르트산 등의 아미노산, 아데닌 및 구아닌 등의 핵산 관련 물질 등이 첨가될 수 있다.
본 발명에 이용되는 미생물의 배양은 진탕배양, 통기 교반 배양 등의 호기적 조건 하에서 행하는 것이 바람직하다. 통기 교반 배양의 경우는, 발포를 방지하기 위하여 소포제를 적당량 첨가하는 것이 바람직하다. 배양은 통상 20 내지 40℃, 바람직하게는 28 내지 34℃에서 8 내지 120 시간 행한다. 배양 중 pH는 6.0 내지 10.0, 바람직하게는 6.0 내지 7.0으로 유지한다. pH의 조정은 무기산 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼륨, 암모니아 등을 사용하여 행한다.
상기와 같이 수득된 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 균체 또는 그의 처리물, 상기 미생물로부터 추출된 효소 등을 본 발명의 효소원으로 이용한다. 처리물로는, 균체의 건조물, 동결건조물, 계면활성제 처리물, 효소 처리물, 초음파 처리물, 기계적 파쇄 처리물, 용매 처리물 등의 균체 처리물, 균체의 단백질 분획물, 균체 및 균체 처리물의 고정화물 등이 있다.
화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)를 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)로 전환시키기 위하여, 미생물을 배양하는 배지에 미리 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)를 첨가하거나, 배양 중에 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)를 첨가할 수 있다. 또한, 미생물을 배양하여 수득한 효소원을 반응액 중에서 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)에 작용시킬 수 있다.
화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)를 미생물을 배양하는 배지 중에 첨가하는 경우, 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)는 배지 1 ml 당 0.1 내지 3 mg, 바람직하게는 0.2 내지 1 mg을 배양 시작시 또는 배양 중에 첨가한다. 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)는 물 또는 메틸알콜, 에틸알콜 등의 유기 용매에 용해시킨 후 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.
미생물을 배양하여 수득한 효소원을 반응액 중에서 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)에 작용시키는 경우, 사용되는 효소원의 양은 상기 효소원의 비활성 등에 따라 달라진다. 예를 들어 효소원으로 미생물의 배양물 또는 균체 또는 그의 처리물을 사용할 경우, 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b) 1 mg 당 5 내지 1000 mg, 바람직하게는 10 내지 400 mg 첨가한다. 반응은, 반응액 중에서 20 내지 40℃, 특히 28 내지 34℃에서 행하는 것이 바람직하다. 반응 시간은 사용되는 효소원의 양 및 비활성 등에 따라 달라지지만, 통상 2 내지 150시간, 바람직하게는 72 내지 120시간이다.
반응액으로는 물 또는 수성 용매, 유기 용매, 또는 물 또는 수성 용매 및 유기 용매의 혼합액이 사용될 수 있다. 수성 용매로는 예를 들어 인산 완충액, HEPES (N-2-히드록시에틸피페라진-N-에탄술폰산) 완충액, 트리스[트리스(히드록시메틸)아미노메탄)염산 완충액이 있다. 유기 용매로는 반응을 저해하지 않는 것이라면 어느 것이라도 좋으며, 예를 들어 아세톤, 에틸 아세테이트, 디메틸 술폭시드, 크실렌, 메틸 알콜, 에틸 알콜 및 부탄올 등이 사용된다. 유기 용매 또는 물, 또는 수성 용매 및 유기 용매의 혼합액이 예를 들어 화합물 (I-b)가 사용되는 경우에 바람직하게 사용된다.
화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)를 반응액에 첨가하는 경우, 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)는 용해될 수 있는 물 또는 수성 용매, 유기 용매, 또는 물 또는 수성 용매 및 유기 용매의 혼합액에 용해시켜 반응액에 첨가한다. 유기 용매로는, 반응을 저해하지 않는 것이라면 어느 것이라도 좋으며, 예를 들어 아세톤, 에틸 아세테이트, 디메틸 술폭시드, 크실렌, 메틸 알콜, 에틸 알콜, 부탄올 등이 사용된다.
화합물 (I-b) 및 화합물 (II-b)는 하기에 예시되어 있는 락톤의 개환 방법에 의해, 각각 화합물 (I-a) 및 화합물 (II-a)로 용이하게 전환시킬 수 있다. 또, 화합물 (I-a) 및 화합물 (II-a)는 하기에 예시되어 있는 락톤의 생성 방법에 의해 화합물 (I-b) 및 화합물 (II-b)로 용이하게 전환시킬 수 있다.
락톤의 개환 반응은 예를 들어 화합물 (I-b) 및 화합물 (II-b)를 수성 매체에 용해시키고, 여기에 산또는 알칼리를 첨가함으로써 수행할 수 있다. 수성 매체로는 예를 들어 인산 완충액, 트리스 완충액 등 반응을 저해하지 않는 염류를 포함하는 수용액이 있다. 상기 수용액 중에는 반응을 저해하지 않는 농도의 메탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트 등의 유기 용매가 함유될 수 있다. 산으로는 아세트산, 염산, 황산 등의 산이 있으며, 알칼리로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 등이 있다.
락톤의 생성 방법으로는, 화합물 (I-a) 또는 화합물 (II-a)를 비수계 용매에 용해시키고, 산 또는 염기 촉매를 첨가하여 락톤을 형성시키는 방법이 있다. 비수계 용매로는 실질적으로 물을 포함하지 않는 유기 용매로서 화합물 (I-a) 또는 화합물 (II-a)를 용해시킬 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 용매로는 예를 들어 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸 아세테이트 등이 있다. 촉매로는 락톤화 반응을 촉매하고, 기질 및 반응산물에 락톤화 이외의 작용을 가지지 않는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 상기 촉매로는 트리플루오로아세트산 및 p-톨루엔술폰산 등이 있다. 반응 온도는 특히 제한되지는 않지만, 0 내지 100℃가 바람직하며 20 내지 80℃가 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서, 화합물 (II-a)는 화합물 (I-a)에 상기 효소원을 작용시켜 수득할 수 있지만, 화합물 (I-b)를 상기 락톤 개환 반응으로 화합물 (I-a)로 전환시킨 후 상기 효소원을 작용시켜 수득할 수도 있고, 또 화합물 (I-b)에 상기 효소원을 작용시켜 화합물 (II-b)를 생성시킨 후 상기 락톤 개환 반응을 행함으로써 수득할 수도 있다.
유사하게는, 화합물 (II-b)는 화합물 (I-b)에 상기 효소원을 작용시켜 수득할 수 있지만, 화합물 (I-a)를 상기 락톤 생성 반응으로 화합물 (I-b)로 전환시킨 후 상기 효소원을 작용시켜 수득할 수도 있고, 또 화합물 (I-a)에 상기 효소원을 작용시켜 화합물 (II-a)를 생성시킨 후 상기 락톤 생성 반응을 행함으로써 수득할 수도 있다.
반응 용액으로부터의 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)의 회수는 통상의 유기 합성 화학에서 이용되는 방법, 예를 들어 유기 용매에 의한 추출, 결정화, 박층 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피 등에 의해 행해질 수 있다.
본 발명에 의해 수득된 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)의 확인 또는 정량 방법은, 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)를 확인 또는 정량할 수 있는 방법이라면 어느 방법이라도 사용될 있다. 예를 들어13C-NMR 스펙트럼,1H-NMR 스펙트럼, 매스 스펙트럼, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 화합물 (I-a), 화합물 (I-b), 화합물 (II-a) 및 화합물 (II-b) 중에는 광학 이성질체 등의 입체 이성질체가 존재할 수 있다. 본 발명은 이러한 이성질체를 포함하여 모든 가능한 이성질체 및 그의 혼합물을 포함한다.
화합물 (I-a)로는 하기 화학식 (III-a):
(식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타내고, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (III-a)라 함)이 바람직하고, 하기 화학식 (V-a):
[화학식 V-a]
(식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (V-a)라 함)이 더 바람직하며, 하기 화학식 (VII-a):
(식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (VII-a)라 함)이 특히 바람직하다.
화합물 (I-b)로는 하기 화학식 (III-b):
(식 중, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (III-b)라 함)이 바람직하고, 하기 화학식 (V-b):
[화학식 V-b]
의 화합물 (이하, 화합물 (V-b)라 함)이 더 바람직하며, 하기 화학식 (VII-b):
의 화합물 (이하, 화합물 (VII-b)라 함)이 특히 바람직하다.
화합물 (II-a)로는 하기 화학식 (IV-a):
(식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타내고, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (IV-a)라 함)이 바람직하고, 하기 화학식 (VI-a):
[화학식 VI-a]
(식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (VI-a)라 함)이 더 바람직하며, 하기 화학식 (VIII-a):
(식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (VIII-a)라 함)이 특히 바람직하다.
화합물 (II-b)로는, 하기 화학식 (IV-b):
(식 중, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (IV-b)라 함)이 바람직하고, 하기 화학식 (VI-b):
[화학식 VI-b]
의 화합물 (이하, 화합물 (VI-b)라 함)이 더 바람직하며, 하기 화학식 (VIII-b):
의 화합물 (이하, 화합물 (VIII-b)라 함)이 특히 바람직하다.
본 발명은 히드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소 (이하, HMG-CoA 환원효소로 약칭함)를 저해하며, 혈청 콜레스테롤 수준을 저하시키는 등의 활성을 갖는 화합물의 제조법에 관한 것이다.
도 1은 16S rRNA 염기 배열을 기초로 하여 근린 결합법에 의한 바실루스 종 PV-6주 및 바실루스 종 PV-7 균주의 분자 계통적 해석을 예시한다.
이하에 본 발명의 실시예를 예시한다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
실시예 1
화합물 (VII-b) (Sigma Chemical Co. 제품) 100 mg을 메탄올 9.5 ml에 용해시킨 후, 1 N 수산화나트륨 0.5 ml을 가하여 실온에서 1시간 동안 진탕시켰다. 수득된 반응액을 농축 건조시키고, 탈이온수 5 ml을 첨가하여 용해시키고, 용액의 pH를 1 N 염산 약 0.1 ml을 첨가하여 약 6.5 내지 7.5로 조정하고, 탈이온수 4.9 ml을 첨가하여 최종 농도가 10 mg/ml인 화합물 (VII-a-1) (화학식 (VII-a) 중, R1이 나트륨인 화합물)의 용액 10 ml을 얻었다.
바실루스 라테로스포루스 ATCC 4517주, 바실루스 바디우스 ATCC 14574주, 바실루스 브레비스 NRRL B-8029주, 바실루스 종 PV-6 주, 바실루스 종 PV-7 주 각각을 한천 배지 (1% 펩톤 (Kyokuto Pharmaceutical Ind. Co., Ltd.), 0.7% 고기 추출물 (Kyokuto Pharmaceutical Ind. Co., Ltd.), 0.3% NaCl (Nacalai Tesque, Inc.) 및 2% 박토아가 (Difco Laboratories Inc.); 1 N 수산화나트륨으로 pH를 7.2로 조정함)에 도말하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 한천 배지 상에 생육한 각 균주 일백금니를 pH 7.5로 조정한 C 배지 (2% 글루코스 (Nacalai Tesque, Inc.), 1% 고기 추출물 (Kyokuto Pharmaceutical Ind. Co., Ltd.), 1% 효모 추출물 (Oriental Yeast Co., Ltd.), 및 0.1% 펩톤 (Kyokuto Pharmaceutical Ind. Co., Ltd.)) 3 ml을 포함하는 A-스피츠 (spitz) 튜브에 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 이어서 배양 후의 배양액 0.06 ml을, pH 7.5로 조정한 C 배지 3 ml을 포함하는 15 ml A-스피츠 튜브 (16.5 x 115 mm, Iuchi Seieido 제품)에 접종한 후 30℃에서 진탕 배양하였다. 배양을 시작한지 24시간 후에, 상기에서 수득한 화합물 (VII-a-1)을 최종 농도가 0.2 mg/ml이 되도록 A-스피츠 튜브에 첨가하고, 첨가 후 24시간 및 72시간째에 글루코스를 각각 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하여 총 120시간 동안 반응을 행하였다.
반응 완료 후, 반응액의 pH를 아세트산 (Nacalai Tesque, Inc. 제품)을 사용하여 4로 조정하였다. 수득된 반응액 1 ml에 에틸 아세테이트 (Nacalai Tesque, Inc. 제품) 2 ml을 첨가한 후 1시간 동안 진탕시켰다. 이어서, 이 혼합물을 원심분리기 (Hitachi Koki Co., Ltd., 05P-21)를 사용하여 3000 rpm에서 5분동안 원심분리하여 상청의 에틸 아세테이트층을 회수하였다. 원심 증발기 (Tommy Seiko Co., Ltd., CC-101)를 사용하여 상청액으로부터 용매를 제거하고, 잔류물을 메탄올 1 ml에 용해시켰다. 이어서, 상기 메탄올 용액의 일부를 HPLC 분석하였다 (컬럼: Inertsil ODS-2 (5 ㎛, 4 x 250 mm, GL Sciences 제품); 컬럼 온도: 60℃; 이동상: 55:45:0.05의 아세토니트릴:물:인산; 유속: 0.9 ml/분; 검출 파장: 237 nm). 그 결과, 체류 시간으로부터 화합물 (VIII-a-1) (화학식 (VIII-a) 중, R1이 나트륨인 화합물)의 생성을 확인하였다. 상기 조건 하에서 화합물 (VII-a-1)의 체류 시간은 2.36분이었고, 화합물 (VIII-a-1)의 체류 시간은 6.51분이었다. 화합물 (VIII-a-1)에 상응하는 피크가 실험에 사용된 모든 균주에서 관찰되었다. 예를 들어 바실루스 브레비스 NRRL B-8029주를 사용하여 수득한 반응 생성물은 2.36분 및 6.47분에서 피크를 나타내었다.
수득된 화합물 (VIII-a-1)의 양은, 바실루스 라테로스포루스 ATCC4517주를 사용한 경우 16.8 mg/ℓ, 바실루스 바디우스 ATCC 14574주를 사용한 경우 10.3 mg/ℓ, 바실루스 브레비스 NRRL B-8029주를 사용한 경우 1.4 mg/ℓ, 바실루스 종 PV-6주를 사용한 경우 7.3 mg/ℓ, 바실루스 종 PV-7주를 사용한 경우 42.0 mg/ℓ였다.
실시예 2
바실루스 종 PV-7주를 실시예 1과 동일한 한천 배지에 도말하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 한천 배지 상에 생육한 균주 일백금니를 pH 7.5로 조정한 C 배지 3 ml을 포함하는 15 ml A-스피츠 튜브 (16.5 x 115 mm, Iuchi Seieido 제품) 2개에 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 이어서 배양 후의 배양액 0.06 ml을 pH 7.5로 조정한 C 배지 3 ml을 포함하는 15 ml A-스피츠 튜브 60개에 각각 접종한 후 30℃에서 진탕 배양하였다. 배양 개시 후 24시간째에 실시예 1과 동일하게 수득한 화합물 (VII-a-1)을 최종 농도가 0.4 mg/ml이 되도록 첨가하고, 배양 개시 후 24시간 및 72시간 째에 각각 글루코스를 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하였다. 배양은 총 120시간 동안 수행하였다. 배양 완료 후, 배양액을 3000 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상청액을 분리하였다. 수득된 상청액의 pH를 아세트산을 사용하여 4.0으로 조정하고, 에틸 아세테이트 360 ml을 첨가한 후 30℃에서 1시간 동안 진탕하였다. 진탕 후 정치하여 상청액을 분리하였다. 수득된 상청액에 탈이온수 90 ml을 첨가한 후 30℃에서 30분 동안 진탕하였다. 이어서, 상청액을 다시 수득하고, 포화 식염수 90 ml을 첨가하여 30℃에서 30분 동안 진탕한 후 상청액을 분리하였다.
수득된 상청액에 무수 Na2SO44.5 g을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 15분 동안 방치하고, 탈수시키고, 이어서 감압 하에 농축 건조시켰다. 수득된 잔류물을 탈이온수 5 ml에 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 수산화나트륨을 사용하여 9.0으로 조정하고 이어서 HP-20 컬럼 (100 ml, 35 x 100 mm, Mitsubishi Chemical Corporation 제품)에 통과시켰다. 컬럼을 탈이온수 300 ml로 세척한 후, 45%의 아세톤 수용액 120 ml로 용출시켰다. 용출액을 분취하고 이 분획을 HPLC로 분석하여 (분석 컬럼: Inertsil ODS-2 (5 ㎛, 4 x 250 mm, GL Sciences 제품); 컬럼 온도: 60℃; 이동상: 55:45:0.05의 아세토니트릴:물:인산; 유속: 0.9 ml/분; 검출 파장: 237 nm) 화합물 (VIII-a-1)을 포함하는 분획을 수집하였다. 감압 하에 아세토니트릴을 제거한 후, 분획의 pH를 아세트산을 사용하여 4.0으로 조정하고, 에틸 아세테이트 360 ml을 첨가한 후 30℃에서 1시간 동안 진탕하였다. 생성된 혼합물을 정치하여 상청액을 분리하였다. 수득된 상청액에 탈이온수 90 ml을 첨가한 후 30℃에서 30분 동안 진탕시켰다. 이어서 상청액을 다시 수득하고, 포화 식염수 90 ml을 첨가하여 30℃에서 30분 동안 진탕시킨 후 상청액을 분리하였다.
수득된 상청액에 무수 Na2SO44.5 g을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 15분 동안 유지하고, 탈수시키고, 이어서 감압 하에 농축 건조시켰다. 수득된 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고, 1%의 트리플루오로아세트산을 첨가하여 락톤화한 후, 분취용 HPLC (컬럼: Develosil ODS-HG-5 (20 x 250 mm, Nomura Chemical Co., Ltd. 제품); 컬럼 온도: 40℃; 용매: 55% 메탄올; 유속: 20 ml/분, 검출 파장: 237 nm)를 사용하여 정제를 행한 결과, 화합물 (VIII-b) 5.1 mg을 수득하였다.
수득한 화합물 (VIII-b)의 매스 스펙트럼 및1H-NMR 스펙트럼 분석 결과를 하기에 나타내었다.
매스 스펙트럼
JEOL Ltd. 제 JMS-HX/HX110A 질량 분석계를 사용하여 매트릭스로서 m-니트로벤질 알콜을 사용하여 양성 모드로 측정하였다. 그 결과, m/z 407에서 유사 분자 이온 피크 ([M+H]+)를 관찰하였는데, 이것은 화합물 (VIII-b)의 구조 및 분자량 (406)으로부터 기대되는 수치와 일치하였다.
1H-NMR 스펙트럼
JEOL Ltd.제 JNM-α 400형 분광계를 사용하여 클로로포름-d 중에서 내부 표준으로 TMS를 사용하여 400 MHz에서 측정하였다. 그 결과는 이하에 나타내었다. 수득된 스펙트럼 데이터는 화합물 (VIII-b)의 공지의 데이터 [Annual Report of Research Laboratories of Sankyo Co., Ltd., 37, 147 (1985)]와 일치하였다.
실시예 3
실시예 1과 동일하게 화합물 (VII-a-1) [화학식 (VII-a) 중, R1이 나트륨인 화합물]을 수득하였다.
바실루스 알베이 ATCC 6344주, 바실루스 서큘란스 NTCT-2610주, 바실루스 마세란스 NCIB-9368주, 바실루스 메가테리움 ATCC 10778주, 바실루스 메가테리움 ATCC 11562주, 바실루스 메가테리움 ATCC 13402주, 바실루스 메가테리움 ATCC 15177주, 바실루스 메가테리움 ATCC 15450주, 바실루스 메가테리움 ATCC 19213주, 바실루스 메가테리움 IAM 1032주, 바실루스 푸밀루스 FERM BP-2064주 및 바실루스 서틸리스 (Bacillus subtilis) ATCC 6051주를 각각 한천 배지 (펩톤 (Kyokuto Pharmaceutical Ind. Co., Ltd. 제), 육즙 0.7% (Kyokuto Pharmaceutical Ind. Co., Ltd. 제), NaCl (Nacalai Tesque, Inc.제) 0.3% 및 박토아가 (Difco Laboratories Inc.제) 2%,; 1 N 수산화나트륨으로 pH 7.2로 조정)에 도말하고, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 한천 배지 상에 생육한 균주 각 일백금니를, pH를 7.4로 조정한 LBG 배지 (글루코스 (Nacalai Tesque, Inc.) 2%, 박토트립톤 (Difco Laboratories Inc.제) 1%, 효모 추출물 (Difco Laboratories Inc. 제) 0.5% 및 NaCl (Nacalai Tesque, Inc. 제) 0.5%) 3 ml을 포함하는 시험관 (13 x 165 mm)에 접종하고, 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후의 배양액 0.2 ml을, pH 7.4로 조정한 LBGCa 배지 (글루코스 (Nacalai Tesque, Inc. 제) 2%, 박토트립톤 (Difco Laboratories Inc.제) 1%, 효모 추출물 (Difco Laboratories Inc. 제) 0.5%, NaCl (Nacalai Tesque, Inc. 제) 0.5% 및 탄산칼슘 (Kokusan Chemical Works Co., Ltd.제 ) 0.5%) 10 ml을 포함하는 시험관 (21 x 200 mm)에 접종하여 30℃에서 진탕 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후 배양액 1 ml을 13 ml 폴리프로필렌 튜브 (SARSTEDT Co., Ltd 제, 수입원: Assist Co., Ltd., No. 60 540S)에 넣고, 화합물 (VII-a-1)을 최종 농도가 0.2 mg/ml이 되도록, 그리고 글루코스를 최종 농도가 1%가 되도록 각각 첨가하여 48시간 동안 반응시켰다.
반응 완료후, 아세트산 (Nacalai Tesque, Inc.제)으로 반응액의 pH를 4로 조정하였다. 이 반응액 1 ml에 에틸 아세테이트 (Nacalai Tesque, Inc.제) 2 ml을 첨가하고, 1시간 동안 진탕시켰다. 진탕 후, 원심 분리기 (Hitachi Koki Co., Ltd.,제 05P-21형)를 사용하여 3000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상청의 에틸 아세테이트층을 회수하고, 원심 증발기 (Tommy Seiko Co., Ltd.제, CC-101형)로 용매를 제거한 후, 잔류물을 메탄올 1 ml에 용해시켰다. 이 메탄올 용액의 일부를 사용하여 HPLC 분석 (컬럼: Inertsil ODS-2 (5 ㎛, 4 x 250 mm, GL Sciences 제); 컬럼 온도: 60℃; 이동상: 55:45:0.05의 아세토니트릴:물:인산; 유속: 0.9 ml/분; 검출 파장: 237 nm)을 행한 결과, 화합물 (VIII-a-1) [화학식 (VIII-a) 중, R1이 나트륨인 화합물]의 생성이 그의 체류 시간으로부터 확인되었다.
수득된 화합물 (VIII-a-1)의 양은 바실루스 알베이 ATCC 6344주를 사용한 경우 0.18 mg/ℓ, 바실루스 서큘란스 NTCT-2610주를 사용한 경우 0.18 mg/ℓ, 바실루스 마세란스 NCIB-9368주를 사용한 경우 0.32 mg/ℓ, 바실루스 메가테리움 ATCC 10778주를 사용한 경우 8.4 mg/ℓ, 바실루스 메가테리움 ATCC 11562주를 사용한 경우 0.31 mg/ℓ, 바실루스 메가테리움 ATCC 13402주를 사용한 경우 1.30 mg/ℓ, 바실루스 메가테리움 ATCC 15177주를 사용한 경우 1.60 mg/ℓ, 바실루스 메가테리움 ATCC 15450주를 사용한 경우 0.58 mg/ℓ, 바실루스 메가테리움 ATCC 19213주를 사용한 경우 0.16 mg/ℓ, 바실루스 메가테리움 IAM 1032주를 사용한 경우 9.20 mg/ℓ, 바실루스 푸밀루스 FERM BP-2064주를 사용한 경우 0.17 mg/ℓ, 그리고 바실루스 서틸리스 ATCC 6051주를 사용한 경우 1.11 mg/ℓ였다.
실시예 4
바실루스 라테로스포루스 ATCC 4517주를 실시예 1과 동일하게 한천 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하고, 한천 배지 상에 생육한 균주 일백금니를, pH 7.5로 조정한 C 배지 3 ml을 포함하는 15 ml A-스피츠 튜브 (16.5 x 115 mm, Iuchi Seieido 제) 2개에 접종하여 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 후의 배양액 0.06 ml을, pH 7.5로 조정한 C 배지 3 ml을 포함하는 15 ml A-스피츠 튜브 60개에 각각 접종하고, 30℃에서 진탕 배양하였다. 배양 개시 후 24시간째에 실시예 1과 동일하게 하여 수득한 화합물 (VII-a-1)을 최종 농도가 0.4 mg/ml이 되도록 첨가하고, 배양 개시 후 24시간째와 72시간째에 각각 글루코스를 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하여 총 120시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 배양액을 3000 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상청액을 분취하였다. 이 상청액의 pH를 1 N 염산을 사용하여 3.0으로 조정하고, 360 ml의 에틸 아세테이트를 첨가하여 진탕한 후, 정치하여 상청액을 회수하는 조작을 3회 행하였다. 이 상청액에 탈이온수 90 ml을 첨가하여 진탕한 후 상청액을 회수하였다. 이 상청액에 포화 식염수 90 ml을 첨가하여 진탕한 후 상청액을 회수하였다.
다음, 상기 상청액에 무수 Na2SO4를 4.5 g 첨가하여 실온에서 15분간 방치하고 탈수한 후, 감압 하에 농축 건조시켰다. 수득한 잔류물을 탈이온수 5 ml에 용해시키고, 수산화나트륨으로 pH를 9.0으로 조정하고, 50 ml의 HP-20 칼럼 (25 x 100 mm, Mitsubishi Chemical Corporation제)에 통과시켰다. 칼럼은 150 ml의 탈이온수로 세정한 후, 아세톤 함량이 20%, 30% 및 40%인 아세톤 수용액 100 ml로 단계적으로 용출하였다. 분취한 분획은 HPLC 분석 [분석 칼럼: Inertsil ODS-2 (5 ㎛, 4 x 250 mm, GL Sciences); 칼럼 온도: 60℃; 이동상: 55:45:0.05의 아세토니트릴:물:인산; 유속: 0.9 ml/분; 검출 파장: 237 nm]을 행하여, 체류 시간으로부터 화합물 (VIII-a-1)을 포함하는 분획을 회수하였다. 이 분획은, 감압 하에서 아세토니트릴을 제거한 후, pH를 1 N 염산을 사용하여 3.0으로 조정하고, 360 ml의 에틸 아세테이트를 첨가하여 진탕하였다. 진탕 후, 정치하여 상청액을 회수하고, 이 상청액에 탈이온수 90 ml을 첨가하여 진탕하여 다시 상청액을 회수하였다. 이 상청액에 포화 식염수 90 ml을 첨가하여 진탕시키고, 상청액을 회수하였다.
다음, 이 상청액에 무수 Na2SO44.5 g을 첨가하고, 실온에서 15분간 유지하고, 탈수시키고, 감압하에 농축 건조시켜 수득한 잔류물을 디클로로메탄에 용해시키고, 1%의 트리플루오로아세트산을 첨가하여 락톤화한 후, 분취용 TLC (실리카 겔 판; No. 1.05744 (200 x 200 mm, 0.5 mm 두께), MERCK Co. Inc.제, 전개 용매: 에틸 아세테이트, 발색액: 12.5% 인몰리브덴산·1% 황산세륨/10% 황산 용액]을 사용하여 정제를 행한 결과, 화합물 (VIII-b)를 0.8 mg 수득하였다. 수득한 화합물 (VIII-b)의 매스 스펙트럼 및1H-NMR 스펙트럼 분석 결과를 이하에 나타내었다.
매스 스펙트럼
JEOL Ltd. 제 JMS-HX/HX110A 질량 분석계를 사용하여 매트릭스로서 m-니트로벤질 알콜을 사용하여 양성 모드로 측정하였다. 그 결과, m/z 407에서 유사 분자 이온 피크 ([M+H]+)를 관찰하였는데, 이것은 화합물 (VIII-b)의 구조 및 분자량 (406)으로부터 기대되는 수치와 일치하였다.
또한, 고분해능 FAB MA 측정 결과, m/z 407.2440에서 유사 분자 이온 피크([M+H]+)를 관찰하였는데, 이것은 화합물의 분자식 (C23H34O6)으로부터 기대되는 계산치 (m/z 407.2434: C23H35O6)와 측정 오차 범위 내에서 일치하였다.
1H-NMR 스펙트럼
JEOL Ltd.제 JNM-LA 300형 핵 자기 공명 장치를 사용하여, 클로로포름-d 중에서 내부 표준으로 클로로포름 (δ7.26 ppm)을 사용하여 300 MHz에서 측정하였다. 그 결과를 이하에 나타내었다. 이 스펙트럼 데이터는 화합물 (VIII-b)의 공지의 데이터 [Annual Report of Research Laboratories of Sankyo Co., Ltd., 37, 147 (1985)]와 일치하였다.
본 발명에 따르면 HMG-CoA 환원효소를 저해하고, 혈청 콜레스테롤의 수준을 저하시키는 작용 등을 갖는 화합물을 효율적으로 제조할 수 있다.

Claims (13)

  1. 바실루스 (Bacillus)속에 속하는 미생물로부터 유래된, 하기 화학식 (I-a):
    [화학식 I-a]
    (식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타내고, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (I-a)라 함), 또는 하기 화학식 (I-b):
    [화학식 I-b]
    (식 중, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (I-a)의 폐쇄 락톤체 (이하, 화합물 (I-b)라 함)으로부터 하기 화학식 (II-a):
    [화학식 II-a]
    (식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타내고, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (II-a)라 함), 또는 하기 화학식 (II-b):
    [화학식 II-b]
    (식 중, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (II-a)의 폐쇄 락톤체 (이하, 화합물 (II-b)라 함)을 생성하는 활성을 갖는 효소원을, 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)에 반응액 중에서 작용시켜, 반응액 중에서 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)를 생성하고, 상기 반응액으로부터 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)를 회수하는 것을 특징으로 하는, 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)의 제조법.
  2. 제1항에 있어서, 화합물 (I-a)가 하기 화학식 (III-a):
    [화학식 III-a]
    (식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타내고, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (III-a)라 함)이고, 화합물 (I-b)가 하기 화학식 (III-b):
    [화학식 III-b]
    (식 중, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (III-b)라 함)이고, 화합물 (II-a)가 하기 화학식 (IV-a):
    [화학식 IV-a]
    (식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (IV-a)라 함)이고, 화합물 (II-b)가 하기 화학식 (IV-b):
    [화학식 IV-b]
    (식 중, R2는 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (IV-b)라 함)인 제조법.
  3. 제1항에 있어서, 화합물 (I-a)가 하기 화학식 (V-a):
    [화학식 V-a]
    (식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (V-a)라 함)이고, 화합물 (I-b)가 하기 화학식 (V-b):
    [화학식 V-b]
    의 화합물 (이하, 화합물 (V-b)라 함)이고, 화합물 (II-a)가 하기 화학식 (VI-a):
    [화학식 VI-a]
    (식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (VI-a)라 함)이고, 화합물 (II-b)가 하기 화학식 (VI-b):
    [화학식 VI-b]
    의 화합물 (이하, 화합물 (VI-b)라 함)인 제조법.
  4. 제1항에 있어서, 화합물 (I-a)가 하기 화학식 (VII-a):
    [화학식 VII-a]
    (식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (VII-a)라 함)이고, 화합물 (I-b)가 하기 화학식 (VII-b):
    [화학식 VII-b]
    의 화합물 (이하, 화합물 (VII-b)라 함)이고, 화합물 (II-a)가 하기 화학식 (VIII-a):
    [화학식 VIII-a]
    (식 중, R1은 수소 원자, 치환 또는 비치환 알킬 또는 알칼리 금속을 나타냄)의 화합물 (이하, 화합물 (VIII-a)라 함)이고, 화합물 (II-b)가 하기 화학식 (VIII-b):
    [화학식 VIII-b]
    의 화합물 (이하, 화합물 (VIII-b)라 함)인 제조법.
  5. 제1항에 있어서, 효소원이 화합물 (I-a) 또는 화합물 (I-b)로부터 화합물 (II-a) 또는 화합물 (II-b)를 생성하는 활성을 갖는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 균체, 또는 이들의 처리물, 또는 상기 미생물로부터 추출한 효소인 제조법.
  6. 제2항에 있어서, 효소원이 화합물 (III-a) 또는 화합물 (III-b)로부터 화합물 (IV-a) 또는 화합물 (IV-b)를 생성하는 활성을 갖는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 균체, 또는 이들의 처리물, 또는 상기 미생물로부터 추출한 효소인 제조법.
  7. 제3항에 있어서, 효소원이 화합물 (V-a) 또는 화합물 (V-b)로부터 화합물 (VI-a) 또는 화합물 (VI-b)를 생성하는 활성을 갖는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 균체, 또는 이들의 처리물, 또는 상기 미생물로부터 추출한 효소인 제조법.
  8. 제4항에 있어서, 효소원이 화합물 (VII-a) 또는 화합물 (VII-b)로부터 화합물 (VIII-a) 또는 화합물 (VIII-b)를 생성하는 활성을 갖는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 균체, 또는 이들의 처리물, 또는 상기 미생물로부터 추출한 효소인 제조법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바실루스 속에 속하는 미생물이 바실루스 라테로스포루스 (Bacillus laterosporus), 바실루스 바디우스 (Bacillus badius), 바실루스 브레비스 (Bacillus brevis), 바실루스 알베이 (Bacillus alvei), 바실루스 서큘란스 (Bacillus circulans), 바실루스 마세란스 (Bacillus macerans), 바실루스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실루스 푸밀루스 (Bacillus pumilus) 또는 바실루스 서틸리스 (Bacillus subtilis) 속에 속하는 미생물인 제조법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바실루스 속에 속하는 미생물이 바실루스 라테로스포루스 ATCC 4517주, 바실루스 바디우스 ATCC 14574주, 바실루스 브레비스 NRRL B-8029주, 바실루스 알베이 ATCC 6344주, 바실루스 서큘란스 NTCT-2610주, 바실루스 마세란스 NCIB-9368주, 바실루스 메가테리움 ATCC 10778주, 바실루스 메가테리움 ATCC 11562주, 바실루스 메가테리움 ATCC 13402주, 바실루스 메가테리움 ATCC 15177주, 바실루스 메가테리움 ATCC 15450주, 바실루스 메가테리움 ATCC 19213주, 바실루스 메가테리움 IAM 1032주, 바실루스 푸밀루스 FERM BP-2064주 또는 바실루스 서틸리스 ATCC 6051주인 제조법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 바실루스 속에 속하는 미생물이 미생물 수탁 번호 FERM BP-6029로 기탁된 바실루스 종 (Bacillus sp.) PV-6주 또는 미생물 수탁 번호 FERM BP-6030으로 기탁된 바실루스 종 PV-7주인 제조법.
  12. 미생물 수탁 번호 FERM BP-6029로 기탁된 바실루스 종 PV-6주.
  13. 미생물 수탁 번호 FERM BP-6030으로 기탁된 바실루스 종 (Bacillus sp.) PV-7주.
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