KR100602296B1 - 미생물을 이용한 악티놀의 제조방법 - Google Patents

미생물을 이용한 악티놀의 제조방법 Download PDF

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Abstract

(4R,6R)-4-하이드록시-2,2,6-트리메틸사이클로헥사논의 제조방법은 (6R)-2,2,6-트리메틸사이클로헥산디온을, 셀룰로모나스(Cellulomonas), 코리네박테리움(Corynebacterium), 플라노코쿠스(Planococcus) 및 아르트로박터(Arthrobacter) 속의 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되고 (6R)-2,2,6-트리메틸사이클로헥산디온을 (4R,6R)-4-하이드록시-2,2,6-트리메틸사이클로헥사논으로 선택적 비대칭 환원시킬 수 있는 미생물과 접촉시키고; 생성된 (4R,6R)-4-하이드록시-2,2,6-트리메틸사이클로헥사논을 반응 혼합물로부터 회수함을 포함한다. 선택적 비대칭 환원은 니코틴아미드 아데닌 디누클레오타이드(NAD), 니코틴아미드 아데닌 디누클레오타이드 포스페이트(NADP)와 같은 조인자, 또는 글루코스 및 글루코스 디하이드로게나제(GDH)와 함께 상기 조인자 및/또는 계면활성제의 존재하에서 수행될 수 있다. 생성물은 제아크산틴과 같은 카로테노이드의 합성에 유용하다.

Description

미생물을 이용한 악티놀의 제조방법{MICROBIAL PRODUCTION OF ACTINOL}
도 1은 28℃에서 4일동안 영양 한천 사면 배지에서 성장시키고, 세척하여 진공에서 건조시키고, 크롬으로 음영을 넣은 균주 셀룰로모나스 sp. AKU672의 전자현미경 사진이다.
도 2는 영양 배양액에서 배양시킨 균주 셀룰로모나스 sp. AKU672의 다형성을 도시한 것이다.
본 발명은 미생물을 이용하여, (6R)-2,2,6-트리메틸사이클로헥산디온(이하 레보디온이라 함)으로부터 (4R,6R)-4-하이드록시-2,2,6-트리메틸사이클로헥사논(이하 악티놀이라 함)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 악티놀은 제아크산틴과 같은 카로테노이드의 합성에 유용하다. 특히, 본 발명은 레보디온의 C-4 위치에서 카보닐 그룹을 선택적 비대칭 환원시킬 수 있는 특정한 미생물을 사용하는, 미생물을 이용한 악티놀의 제조 방법에 관한 것이다.
종래, 악티놀은 악티놀의 부분입체 이성질체 혼합물의 광학 분할에 의해 제조되어 왔다. 그러나, 이런 방법은 금속 촉매에 의한 레보디온의 수소화 및 무수 말레산과 같은 분할제로서의 화학적 수단에 의한 후속적인 광학 분할을 필요로 한다[참조: T. Ohashi et al., the proceedings of the symposium "Molecular Chirality 1996" held on May 30 and 31, 1996 in Tokyo, Japan, Pages 47 to 50, "Practical Syntheses using Biocatalysts"]. 따라서, 이 방법은 산업적인 목적면에서 경제적으로 타당하지 않다.
레보디온 그 자체로부터 악티놀을 효소적으로 제조하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들면, 바실루스 써모필루스(Bacillus thermophilus)는 라세미 디하이드로옥소이소포론을 4-하이드록시-2,2,6-트리메틸사이클로헥사논의 4종류의 이성질체, 즉 시스-(4R,6S)-, 시스-(4S,6R)-, 트란스-(4R,6R)- 및 트란스-(4S,6S)-이성질체로 전환시킬 수 있다. 수득된 이러한 이성질체의 정량비는 68:25:5:2이다[참조: J. Biotechnol., 9(2), 117-128, 1989]. 따라서, (4R,6R)-이성질체인 악티놀은 총 이성질체의 5 %에 불과하고, 이 방법은 또한 산업적인 목적면에서 경제적으로 타당하지 않다.
레보디온의 선택적 비대칭 환원에 대한 광범위한 연구의 결과로서, 이제 특정한 미생물을 사용한 선택적 비대칭 환원 후 반응 혼합물로부터 악티놀의 회수에 의해 레보디온으로부터 악티놀이 효율적으로 수득될 수 있음을 발견했다. 본 발명은 이 발견을 기초로 한다.
본 발명의 목적은 레보디온으로부터 악티놀을 효율적으로 및 경제적으로 수득하는, 미생물을 이용한 악티놀의 제조방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 셀룰로모나스(Cellulomonas), 코리네박테리움(Corynebacterium), 플라노코쿠스(Planococcus) 및 아르트로박터(Arthrobacter) 속의 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되고 레보디온을 악티놀로 선택적 비대칭 환원시킬 수 있는 미생물과 레보디온을 접촉시키고; 생성된 악티놀을 반응 혼합물로부터 회수함을 포함하는, 악티놀의 제조 방법을 제공한다.
스크리닝(screening)은 자체로 공지된 방법을 사용하여 수행된다. 예를 들면, 미생물은 세포를 제공하기 위한 통상적인 방법에 의해 탄소 공급원으로서 글루코스 및 수크로스와 같은 사카라이드, 에탄올 및 글리세롤과 같은 알콜, 올레산 및 스테아르산과 같은 지방산 또는 이들의 에스테르, 또는 평지씨유 및 대두유와 같은 오일; 질소 공급원으로서 황산 암모늄, 질산 나트륨, 펩톤, 아미노산, 옥수수 침지액, 밀기울, 효모 추출물 등; 무기염 공급원으로서 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 탄산 칼슘, 인산 일수소 칼륨, 인산 이수소 칼륨 등; 및 다른 영양 공급원으로서 맥아 추출물, 고기 추출물 등을 함유한 영양 배지에서 배양된다. 배양은 통상적으로 10 내지 40℃의 배양 온도 및 3 내지 9의 배지 pH에서 1 내지 7일의 배양 기간동안 호기적으로 수행될 수 있다. 배양 후, 생성된 세포를 원심분리 또는 여과에 의해 수거한다. 이렇게 수득된 세포 및 레보디온은 물, 인산 칼륨 완충액, 아세토니트릴, 에탄올 등과 같은 용매내에서 서로 반응하고(접촉하고), 반응은 적당한 반응 조건(레보디온 농도: 400 내지 2000 mg/g 건조 세포/l, pH 범위: 4 내지 9, 온도 범위: 20 내지 50℃, 반응 기간: 10분 내지 80시간)하에서 개시된다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트, n-헥산, 톨루엔, n-부틸 아세테이트 등과 같은 유기 용매로 추출된다. 악티놀의 생산성을 측정하기 위해 추출된 용액에 대해 적당한 크로마토그래피를 수행한다.
스크리닝의 결과로서, 셀룰로모나스, 코리네박테리움, 플라노코쿠스 및 아르트로박터 속에 속하는 미생물은 레보디온을 선택적 비대칭 환원시킬 수 있음이 발견되었다. 특히 바람직한 이러한 미생물은 셀룰로모나스 sp. AKU672, 코리네박테리움 아쿠아티쿰(Corynebacterium aquaticum) AKU610, 코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611, 플라노코쿠스 오케아노코이테스(Planococcus okeanokoites) AKU152 및 아르트로박터 술푸레우스(Arthrobacter sulfureus) AKU635, 특히 처음 3종류의 명명된 미생물이다. 5종류의 명명된 미생물중에서, 코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611이 가장 바람직하다.
미생물 셀룰로모나스 sp. AKU672, 코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU610 및 코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611은 일본 후쿠이현 마나히메 호수에서 수집된 토양 샘플으로부터 분리되었다. 이러한 미생물은 부다페스트 조약하에서 1998년 8월 4일에 일본의 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되었고, 하기 명칭을 갖는다:
셀룰로모나스 sp. AKU672(FERM BP-6449)
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU610(FERM BP-6447)
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611(FERM BP-6448)
이러한 3개의 미생물과 플라노코쿠스 오케아노코이테스 AKU152 및 아르트로박터 술푸레우스 AKU635는 신규하고, 본 발명의 추가의 양태를 나타낸다.
상술한 균주 AKU672(FERM BP-6449)는 다음의 분류학적 성질을 갖는다:
균주 셀룰로모나스 sp. AKU672의 전형적인 다형성이 전자 현미경 관찰에서 발견되었다. 균주의 오래된 배양물은 도 1에 도시된 바와 같이 구형이다. 신선한 배양물에서는 불규칙한 봉형이 우세하다(도 2). 균주의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성은 표 1 및 2에 요약된다.
균주 셀룰로모나스 sp. AKU672의 형태학적 특성 및 배양 특성
형태 및 크기 코리네형 오래된 배양물; 구형 세포, 약 0.5 내지 0.6 μm 신선한 배양물; 불규칙한 봉형 세포, 0.5 내지 0.7 μm ×20 μm 이상
운동성 한 개의 편모를 갖고 있는 운동성
그램 염색성 +
포자 관찰 안됨
영양 한천 플레이트 원형의 볼록하고, 매끄러운, 전체적인, 황색(2일)
영양 배양액 고리형태의 약간의 침전물
젤라틴 천자 액화
리트머스 밀크 산 형성
NaCl과의 관계 5 % NaCl까지 성장 가능
균주 셀룰로모나스 sp. AKU672의 생리학적 및 생화학적 특성
세포벽의 유형 오르니틴
세포 분할의 유형 굴곡
GC 함량 74.7 %
젤라틴의 가수분해 +
전분의 가수분해 +
인돌의 생성 -
황화 수소의 생성 -
니트레이트의 니트라이트로의 환원 +
시트레이트의 사용 -
카탈라제 활성 +
옥시다제 활성 -
우레아제 활성 -
DNA 분해효소(DNase) 활성 +
아미노 펩티다제 활성 -
셀룰로스 공격 -
포게스-프로스카우어 (Voges-Proskauer) 시험 -
메틸-레드 시험 -
산화-발효 시험* 발효
탄수화물의 분해 아라비노스, 아부틴, 셀로비오스, 덱스트린, 프룩토스, 갈락토스, 글루코스, 글리코겐, 말토스, 전분, 수크로스, 트레할로스 및 크실로스로부터 산을 생성하나 기체 발생 없음; 글리세롤, 이눌린, 락토스, 만니톨, 만노스, α-메틸글루코사이드, 라피노스, 람노스, 솔비톨 및 솔보스로부터 산 생성 없음.
최적 생육 온도 37 내지 42℃
최적 생육 pH pH 6.0 내지 7.5
탈지 우유에서 30분동안 63℃에서의 가열 생존
호기성 또는 혐기성 호기성
*R. Hugh & E. Leifson, J. Bacteriol. 66, 24(1953)
균주 셀룰로모나스 sp. AKU672는 그램 양성이고, 호기성이고, "코리네형 박테리아"의 그룹에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 이 균주는 한 개의 편모를 갖고 있는 운동성이다. 세포벽내의 주요 아미노산은 오르니틴으로 확인되었다. 기체 크로마토그래피(GC)에 따른 그의 함량은 74.7 %였다. 굴곡형 세포 분할이 관찰되었다. 균주는 4일동안 다양한 당으로부터 기체를 형성하지 않고 산을 생성했다. 이 균주는 셀룰로스 분해 활성을 나타내지 않았다.
코리네형 박테리아의 분류는 충분히 정립되지 않았다. 최근에, 야마다(Yamada) 및 코마가타(Komagata)[참조: J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 417(1992)]는 코리네형 박테리아를 세포 분할의 주요 유형, 세포벽 조성 및 GC에 따른 DNA 함량에 따라 7개의 그룹으로 분류하는 것을 제안했다.
이들은 셀룰로스 분해 활성의 부족에도 불구하고 그룹 4를 다른 그룹과 구별했다. 이 그룹의 박테리아는 굴곡 유형의 세포 분할을 나타내고, 세포벽의 주요 아미노산은 오르니틴이다. GC에 따른 이들의 함량은 71 내지 73 %의 좁은 범위로 많이 분포한다. 이러한 박테리아는 다양한 당으로부터 발효적으로 산을 생성한다. 이들의 제안에 따르면, 셀룰로스 분해 활성을 나타내지 않는 균주 셀룰로모나스 sp. AKU672는 그룹 4에 속해야 한다. 균주의 다른 분류학적 특성은 그룹 4의 특성과 매우 일치하고, 따라서 이것은 셀룰로모나스 sp. AKU672로서 임시로 명명되었다.
상술한 균주 AKU610 및 AKU611은 다음의 분류학적 성질을 갖는다:
1) 증식가능 온도: 15 내지 40℃
2) 최적 증식 온도: 30℃
3) 절대 호기성 및 그램 음성 미생물
4) 포자 형성: 없음
5) 배양하는 동안 다형성 및 통상적인 봉형-구균 사이클이 관찰될 수 있다.
6) 운동성: 없음
더구나, 바이올로그 시스템(Biolog System)[참조: Biolog Inc., 3447 Investment Blvd., Suite 3, Hayward, California 94545, USA: Nature Vol. 339, 157-158, May. 11, 1989]에 의한 여러 탄소 공급원의 동화 작용에 근거하여 균주 코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU610 및 AKU611을 다음과 같이 동정하였다.
각각의 균주의 세포를 96웰(well) 마이크로티터-플레이트로 접종하고, 28℃에서 24시간동안 배양한다. 각각의 웰은 96종의 탄소 공급원중 하나를 BUGM+B 배지(바이올로그 유니버설 성장 배지(Biolog Universal Growth Media) + 혈액; 바이올로그 인코포레이티드(Biolog Inc.))에 함유한다.
배양 후, 각각의 균주는 탄소 공급원에 따라 다음과 같은 동화 작용을 나타낸다:
탄소 공급원 AKU610 AKU611 탄소 공급원 AKU610 AKU611
A1 - - A2 - -
A3 - - A4 - -
A5 - - A6 - -
A7 - - A8 + +
A9 + + A10 - -
A11 - - A12 + +
B1 - - B2 - +
B3 - - B4 + -
B5 + + B6 - -
B7 + + B8 - -
B9 + + B10 + +
B11 + + B12 - -
C1 - - C2 - -
C3 - - C4 + +
C5 + + C6 + +
C7 + - C8 + +
C9 - - C10 - -
C11 - - C12 - -
D1 - - D2 - -
D3 + + D4 - -
D5 + + D6 - -
D7 - - D8 - +
D9 - - D10 - -
D11 + + D12 + +
E1 - - E2 - -
E3 + + E4 - -
E5 - - E6 - -
E7 - - E8 - -
E9 - - E10 - -
E11 - - E12 - -
F1 - - F2 - -
F3 - - F4 - -
F5 - - F6 + +
F7 - - F8 - -
F9 - - F10 - -
F11 - - F12 - -
G1 - - G2 - -
G3 - - G4 - -
G5 - - G6 - -
G7 - - G8 - -
G9 - - G10 - -
G11 - - G12 - -
H1 - - H2 - -
H3 - - H4 - -
H5 - - H6 - -
H7 - - H8 - -
H9 - - H10 - -
H11 - - H12 - -
A1 물 A2 α-사이클로덱스트린
A3 β-사이클로덱스트린 A4 덱스트린
A5 글루코겐 A6 이눌린
A7 만난 A8 트윈(Tween, 등록상표) 40
A9 트윈(등록상표) 80 A10 N-아세틸-D-글루코사민
A11 N-아세틸-D-만노사민 A12 아미그달린
B1 L-아라비노스 B2 D-아라비톨
B3 아부틴 B4 셀로비오스
B5 D-프룩토스 B6 L-푸코스
B7 D-갈락토스 B8 D-갈락투론산
B9 겐티오비오스 B10 D-글루콘산
B11 α-D-글루코스 B12 m-이노시톨
C1 α-D-락토스 C2 락툴로스
C3 말토스 C4 말토트리이트로스
C5 D-만니톨 C6 D-만노스
C7 D-멜레지토스 C8 D-멜리비오스
C9 α-메틸-D-갈락토사이드 C10 α-메틸-D-갈락토사이드
C11 3-메틸-글루코스 C12 α-메틸-D-글루코사이드
D1 β-메틸-D-글루코사이드 D2 α-메틸-D-만노사이드
D3 팔라티노스 D4 D-프시코스
D5 D-라피노스 D6 L-람노스
D7 D-리보스 D8 살리신
D9 세도헤푸툴로산 D10 D-솔비톨
D11 스타치오스 D12 수크로스
E1 D-타가토스 E2 D-트레할로스
E3 투라노스 E4 크실리톨
E5 D-크실로스 E6 아세트산
E7 α-하이드록시부티르산 E8 β-하이드록시부티르산
E9 γ-하이드록시부티르산 E10 p-하이드록시페닐아세트산
E11 α-케토-글루타르산 E12 α-케토-발레르산
F1 락트아미드 F2 D-락트산 메틸 에스테르
F3 L-락트산 F4 D-말산
F5 L-말산 F6 메틸 피루베이트
F7 모노메틸 숙시네이트 F8 프로피온산
F9 피루브산 F10 숙신암산
F11 숙신산 F12 N-아세틸-L-글루탐산
G1 알라닌아미드 G2 D-알라닌
G3 L-알라닌 G4 L-알리닐-글리신
G5 L-아스파라긴 G6 L-글루탐산
G7 글리실-L-글루탐산 G8 L-필로글루탐산
G9 L-세린 G10 푸트르신
G11 2,3-부탄디올 G12 글리세롤
H1 아데노신 H2 2'-데옥시 아데노신
H3 이노신 H4 티미딘
H5 우리딘 H6 아데노신-5'-모노포스페이트
H7 티미딘-5'-모노포스페이트 H8 우리딘-5'-모노포스페이트
H9 프룩토스-6-포스페이트 H10 글루코스-1-포스페이트
H11 글루코스-6-포스페이트 H12 DL-α-글리세롤 포스페이트
상기 결과로부터, 두 균주는 코리네박테리움 아쿠아티쿰으로 동정되고, 각각 코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU610 및 AKU611로서 명명된다.
상술한 다른 미생물은 일본의 발효연구소(Institute of Fermentation Osaka)(IFO)와 같은 공공 기탁 기관(배양 콜렉션)에 요청하면 얻을 수 있다. 기탁된 이러한 균주의 예는 플라노코쿠스 오케아노코이테스 AKU152(IFO 15880) 및 아르트로박터 술푸레우스 AKU635(IFO 12678)이다.
본 발명의 선택적 비대칭 환원 방법은 수중에서, 또는 일반적으로 물과 혼화성이고 레보디온 용해도를 높이고 효소 반응에 불활성인 용매, 예를 들면 0.01 내지 0.5 M 인산 칼륨 완충액, pH 4 내지 10의 다른 완충액, 아세토니트릴, 에탄올 또는 N,N-디메틸포름아미드에서 배치, 반배치 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 레보디온의 농도는 알맞게는 400 내지 2000 mg/1g의 건조 세포/l, 바람직하게는 400 내지 800 mg/1g의 건조 세포/l이다. 선택적 비대칭 환원 방법은 10분 내지 80시간, 바람직하게는 8시간 내지 24시간동안 20 내지 50℃, 바람직하게는 30 내지 40℃의 온도 및 4 내지 9, 바람직하게는 6 내지 7의 pH에서 수행될 수 있다.
본 발명의 선택적 비대칭 환원 방법은 니코틴아미드 아데닌 디누클레오타이드(NAD), 니코틴아미드 아데닌 디누클레오타이드 포스페이트(NADP)와 같은 조인자의 존재하에서 또는 상기 조인자와 글루코스 및 글루코스 디하이드로게나제(GDH)의 존재하에서 수행된다. 반응 배지중에서 이런 조인자의 농도는 바람직하게는 300 mM/l 이상, 보다 바람직하게는 700 mM/l 내지 900 mM/l이다. 더구나, 악티놀의 수율은 계면활성제를 반응 혼합물에 첨가하므로써 증가될 수 있다. 스판(Span, 등록상표) 20, 스판(등록상표) 80, 트윈(등록상표) 20, 트윈 40(이들 모두는 일본 오사카 도쇼 마치 3-1-2 소재의 와코 퓨어 케미칼 인더스트리(Wako Pure Chemical Ind.)로부터 시판됨) 등은 사용될 수 있는 계면활성제의 예이다. 반응 배지중에서 계면활성제의 양은 편리하게는 2 내지 20 mM/l, 바람직하게는 약 8 mM/l이다.
선택적 비대칭 환원 반응이 완료된 후, 이렇게 수득된 악티놀은 악티놀을 쉽게 용해시키는 수 불용성(수 불혼화성) 유기 용매, 예를 들면 에틸 아세테이트, n-헥산, 톨루엔 또는 n-부틸 아세테이트를 이용한 추출에 의해 회수될 수 있다. 악티놀의 추가의 정제는 추출물을 농축하여 직접 악티놀을 결정화하거나 여러 종류의 크로마토그래피, 예를 들면 박층 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 겔 여과 크로마토그래피의 조합에 의해 수행될 수 있다. 필요하다면, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용할 수 있다. 악티놀의 결정을 수득하는 바람직한 회수방법은 악티놀을 에틸 아세테이트로 추출하고, 추출물을 농축하여 악티놀의 결정을 수득하는 것을 포함한다.
상기된 "휴지 세포 반응" 기법에 대한 다른 방법으로서, 악티놀은 레보디온의 존재하에서 영양 배지중에서의 상기 미생물의 발효에 의해, 즉 "증식 세포 반응"으로 생성될 수 있다. 두 방법은 모두 본 발명의 방법에 포함된다.
"증식 세포 반응" 기법에서 영양 배지로서, 탄소 공급원으로서 사카라이드, 예를 들면 글루코스 및 수크로스, 알콜, 예를 들면 에탄올 및 글리세롤, 지방산, 예를 들면 올레산 및 스테아르산 또는 이들의 에스테르, 또는 오일, 예를 들면 평지씨유 및 대두유; 질소 공급원으로서 황산 암모늄, 질산 나트륨, 펩톤, 아미노산, 옥수수 침지액, 밀기울, 효모 추출물 등; 무기염 공급원으로서 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 탄산 칼슘, 인산 일수소 칼륨, 인산 이수소 칼륨 등; 및 다른 영양 공급원으로서 맥아 추출물, 고기 추출물 등을 함유한 것이 사용될 수 있다. 본 발명의 추가의 양태로서, 레보디온의 존재하에서 영양 배지에서 상기 미생물의 발효에 의해 악티놀을 제조할 수 있다.
발효는 통상적으로 10 내지 40℃의 발효 온도에서 3 내지 9의 pH의 배지에서 1 내지 7일의 배양 기간동안 호기적으로 수행될 수 있다.
발효에 사용되는 미생물은 임의의 형태, 예를 들면 액체 배지에서 균주의 발효에 의해 수득된 배양물, 액체 배지로부터 분리된 세포, 세포 또는 배양물을 가공하여 수득된 건조된 세포 또는 고정화된 세포일 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명을 설명한다.
실시예 1
0.5 %의 1,4-사이클로헥산디온((6R)-2,2,6-트리메틸사이클로헥산디온과 구조적으로 유사함; 스크리닝을 위해 사용됨), 0.5 %의 트윈(등록상표) 20, 0.1 %의 (NH4)2SO4, 0.1 %의 K2HPO4, 0.02 %의 MgSO4·7H2O 및 0.02 %의 효모 추출물로 구성된 액체 배지(pH 7.0)를 시험관에 5 ml씩 나누어 분배하고, 이어서 20분동안 121℃에서 살균한다. 약 0.3 g의 토양 샘플을 각각의 이들 시험관에 도입하고, 30℃에서 24시간동안 배양한다. 이렇게 수득된 0.1 ml의 배양물을 상기와 같은 신선한 시험관 배지에 접종하고, 이 조작을 목적 미생물을 풍부하게 하기 위해 2번 반복한다. 이렇게 수득된 증식 배지를 염수로 희석하고, 상기와 동일한 성분으로 구성된 한천 배지상에 도말한다. 동시에, 염수중의 토양 현탁액의 상청액을 적당하게 희석하고, 또한 한천 배지에 도말한다. 플레이트를 30℃에서 48시간동안 배양한다. 플레이트에서 증식된 콜로니를 1.0 %의 글루코스, 0.3 %의 K2HPO4, 0.02 %의 MgSO4·7H2O, 1.5 %의 펩톤(일본 도쿄 추오쿠 니혼바시 무로 마치 4-1-6 소재의 미쿠니 카가쿠 산교 케이케이(Mikuni Kagaku Sangyo K.K.)), 0.2 %의 NaCl 및 0.1 %의 효모 추출물(일본 교토 나카큐쿠 니조토우리 카라수마루 니시하이루 소재의 나칼라이 테수크 인코포레이티드(Nacalai Tesuque Inc.))로 구성된 5 ml의 액체 배지가 들어있는 시험관에 접종한다. 시험관을 30℃에서 24시간동안 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 염수로 세척한다. 이렇게 수득된 세포를 이어서 스크리닝한다. 상기 미생물 외에, 영양 배지에서 배양된 미생물의 공기 건조된 세포를 또한 스크리닝에 사용한다.
실시예 2
0.6 mg의 NAD(일본 도쿄 이타바시쿠 아주사와 3-6-10 소재의 오리엔탈 이스트 캄파니(Oriental Yeast Co.)), 0.6 mg의 NADP(오리엔탈 이스트 캄파니), 50 mg의 D-글루코스 및 0.2 mg의 D-글루코스 디하이드로게나제(일본 나고야 나카쿠 니시키 1-2-7 소재의 아마노 파마슈티칼 캄파니(Amano Pharmaceutical Co.))를 함유한 반응 혼합물(pH 7.0의 0.1 M의 인산 칼륨 완충액)을 제조한다. 실시예 1에서 제조된 약 0.3 g의 세포를 1 ml의 반응 혼합물에 첨가한 후 충분한 양의 (6R)-2,2,6-트리메틸사이클로헥산디온을 첨가하여 0.5 %의 최종 농도를 수득한다. 이어서, 반응 혼합물을 30℃에서 24시간동안 진탕하면서 배양한다. 배양 후, 반응 혼합물을 1 ml의 에틸 아세테이트로 추출하고 농축한다. (4R,6R)-4-하이드록시-2,2,6-트리메틸-사이클로헥사논의 수율 및 광학적 순도를 기체 크로마토그래피[컬럼: HR-20M(일본 교토 후시미쿠 케이쇼초 50 소재의 신와 케미칼 인더스트리(Shinwa Chemical Ind.) 0.25 mmΦ × 30 m, 컬럼 온도: 160℃(일정), 주입기 온도: 250℃, 캐리어 기체: He(약 1 ml/분)]에 의해 분석한다. 결과는 표 3에 나타난다.
균주명 환원율 (%) (4R,6R)-4-하이드록시-2,2,6- 트리메틸-사이클로헥사논의 광학적 순도(% e.e.)
플라노코쿠스 오케아노코이테스 AKU152(IFO 15880) 42.3 56.7
아르트로박터 술푸레우스 AKU635(IFO 12678) 64 44
셀룰로모나스 sp. AKU672 (FERM BP-6449) 73 78.3
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU610(FERM BP-6447) 93.7 85.9
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611(FERM BP-6448) 97.4 87.7
실시예 3
NAD 또는 NADP를 반응 혼합물에 첨가하는 효과는 표 3에 주어진 미생물을 사용하여 검사하였다. 기본 반응 혼합물은 NAD 및 NADP를 제외하고는 실시예 2에 기술된 모든 성분을 함유한다. 본 실시예에 사용된 미생물의 세포를 공기 건조하고, 10 mg의 세포 매스를 반응 혼합물에 혼입한다. 반응을 30℃에서 24시간동안 수행한다. 결과는 표 4에 나타나고, 광학적 순도(% e.e.) 값은 (4R,6R)-이성질체와 일치하고, 또한 표 5a 및 5b(실시예 4) 및 표 6(실시예 5)도 같다.
조인자 첨가
NAD NADP 없음
균주명 환원율 (%) 광학적 순도 (% e.e.) 환원율 (%) 광학적 순도 (% e.e.) 환원율 (%) 광학적 순도 (% e.e.)
플라노코쿠스 오케아노코이테스 AKU152(IFO 15880) 89.3 60.4 65.4 54.7 63.4 58.2
아르트로박터 술푸레우스 AKU635(IFO 12678) 82.7 24 66.5 -7.3 56.5 -9.5
셀룰로모나스 sp. AKU672 (FERM BP-6449) 59.2 67.1 30.1 21.6 24.8 25.7
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU610(FERM BP-6447) 62.5 87.4 60 85.3 17 52.1
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611(FERM BP-6448) 96.8 93.9 85.3 88.5 92.5 89.1
실시예 4
반응 혼합물중의 여러 계면활성제(최종 농도: 0.1w/v%)의 첨가 효과는 표 3에 주어진 미생물을 사용하여 검사하였다. 기본 반응 혼합물은 실시예 2에 기술된 모든 성분을 함유한다. 본 실시예에서 사용된 미생물의 세포를 공기 건조하고, 10 mg의 세포 매스를 반응 혼합물에 혼입한다. 반응을 30℃에서 24시간동안 수행한다. 결과는 표 5a 및 5b에 나타난다.
계면활성제
없음 트윈(등록상표) 20 트윈(등록상표) 40
균주명 환원율 (%) 광학적 순도 (% e.e.) 환원율 (%) 광학적 순도 (% e.e.) 환원율 (%) 광학적 순도 (% e.e.)
플라노코쿠스 오케아노코이테스 AKU152(IFO 15880) 53.9 51.6 78.1 63.4 63.9 57.7
아르트로박터 술푸레우스 AKU635(IFO 12678) 73.4 25.1 86.8 38.6 82.4 33.8
셀룰로모나스 sp. AKU672 (FERM BP-6449) 32.3 80 32.1 86.2 측정 안됨 측정 안됨
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU610(FERM BP-6447) 58.9 87.6 71.7 89.3 측정 안됨 측정 안됨
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611(FERM BP-6448) 85.7 92.6 97.5 93.7 측정 안됨 측정 안됨
계면활성제
스판(등록상표)20 스판(등록상표)80
균주명 환원율 (%) 광학적 순도 (% e.e.) 환원율 (%) 광학적 순도 (% e.e.)
플라노코쿠스 오케아노코이테스 AKU152(IFO 15880) 71.4 65.7 57.3 57.3
아르트로박터 술푸레우스 AKU635(IFO 12678) 78.5 49.9 65.2 32
셀룰로모나스 sp. AKU672 (FERM BP-6449) 22.2 66.2 38 78.1
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU610(FERM BP-6447) 64.6 89.9 83 87.3
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611(FERM BP-6448) 96.7 94 88.8 93.2
실시예 5
반응에 대한 기질 농도의 영향은 0.5, 1.0 및 1.5 %의 농도에서 검사하였다. 기본 반응 혼합물은 실시예 2에 기술된 모든 성분을 함유한다. 본 실시예에서, 코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611(FERM BP-6448)의 세포를 공기 건조하고, 10 mg의 세포 매스를 반응 혼합물에 첨가한다. 반응을 30℃에서 24시간동안 수행한다. 결과는 표 6에 나타난다.
기질 농도(%) 환원율(%) 광학적 순도(% e.e.) 생성물 농도(%)
0.5 92.2 93.0 0.46
1.0 73.1 92.9 0.73
1.5 66.3 92.8 0.99
실시예 6
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611(FERM BP-6448)을 0.1 %의 효모 추출물, 1.5 %의 펩톤, 2.0 %의 D-글루코스, 0.02 %의 MgSO4·7H2O, 0.3 %의 K2HPO4 및 0.2 %의 NaCl로 구성된 20 l의 배양 배지중에서 400 rpm으로 교반하고 0.5 l/분으로 공기를 공급하면서 30℃에서 24시간동안 배양한다. 이후 배양물을 5분동안 5,000 g에서 원심분리하여 세포를 수거한다. 이렇게 수득된 세포의 페이스트의 중량은 400 g이다.
이어서, 12 g의 레보디온 및 120 g의 D-글루코스를 세포 페이스트에 첨가하고, 이온교환수로 부피가 2.4 l가 되게 한다. 2.0 %의 NaOH 용액으로 pH 7.0으로 조정한다. 반응 혼합물을 2 l 크기의 플라스크로 옮기고, 30℃에서 15시간동안 220 rpm으로 진탕하면서 배양한다. 배양 후, 반응 혼합물을 5분동안 12,000 g의 원심분리에 의해 분리한다. 이렇게 수득된 반응 혼합물의 부피는 2.2 l이고, 악티놀의 광학적 순도, 수율 및 농도는 각각 96 % e.e., 93 % 및 4.6 g/l이다.
실시예 7
실시예 6에 기술된 바와 같이 제조된 반응 혼합물(10 l)을 에틸 아세테이트와 혼합하여 악티놀을 추출한다. 에틸 아세테이트 상(7.5 l)을 분리하고, 탈색시키기 위해 350 g의 활성탄 분말을 첨가한다. 10분의 교반 후, 탄소 분말을 여과에 의해 제거한다. 600 g의 무수 Na2SO4를 6.5 l의 에틸 아세테이트 용액에 첨가하여 탈수시킨다. 몇분의 교반 후, Na2SO4를 여과에 의해 제거한다. 에틸 아세테이트 용액(6.0 l)을 감압하에서 30℃에서 50 ml로 농축한다. 이렇게 수득된 농축액에 5 l의 n-헥산을 첨가하고, 혼합물을 5분동안 교반하고, 이어서 5℃로 냉각시키고, 이 온도에서 12시간동안 유지하여 악티놀을 결정화한다. 결정화된 악티놀을 여과에 의해 수거하고, 이어서 건조한다. 이렇게 수득된 악티놀 결정의 중량은 32 g이고, 악티놀의 순도, 광학적 순도 및 수율은 각각 96 %, 96 % e.e. 및 70 %이다.
실시예 8
코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611(FERM BP-6448)의 종자 배양 배양액(150 ml)을 0.1 %의 효모 추출물, 1.5 %의 펩톤, 2.0 %의 글루코스, 0.02 %의 MgSO4·7H2O, 0.3 %의 K2HPO4 및 0.2 %의 NaCl 및 0.3 %의 레보디온으로 구성된 3 l의 발효 배지에 접종한다. 5 l 크기의 자(jar) 발효기를 사용하여 250 rpm으로 교반하고 1.5 l/분으로 공기를 공급하면서 30℃에서 48시간동안 발효시킨다. 발효 배양액의 pH를 NH3 기체에 의해 7.0으로 조절한다. 발효 후, 배양액을 제거하고, 세포를 5분동안 12,000 g의 원심분리에 의해 수거한다. 배양액중의 악티놀의 광학적 순도, 수율 및 농도는 각각 96 % e.e., 71 % 및 2.1 g/l이다.
본 발명의 악티놀의 제조방법은 미생물을 이용하여 레보디온으로부터 악티놀을 효율적이면서도 경제적으로 제조한다.

Claims (4)

  1. 셀룰로모나스(Cellulomonas), 코리네박테리움(Corynebacterium), 플라노코쿠스(Planococcus) 및 아르트로박터 (Arthrobacter) 속의 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되고 (6R)-2,2,6-트리메틸사이클로헥산디온을 (4R,6R)-4-하이드록시-2,2,6-트리메틸사이클로헥사논으로 선택적 비대칭 환원시킬 수 있는 미생물과 (6R)-2,2,6-트리메틸사이클로헥산디온을 접촉시키고; 생성된 (4R,6R)-4-하이드록시-2,2,6-트리메틸사이클로헥사논을 반응 혼합물로부터 회수함을 포함하는, (4R,6R)-4-하이드록시-2,2,6-트리메틸사이클로헥사논의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    미생물이 셀룰로모나스 sp. AKU672(FERM BP-6449), 코리네박테리움 아쿠아티쿰(aquaticum) AKU610(FERM BP-6447) 및 코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611(FERM BP-6448)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    미생물이 플라노코쿠스 오케아노코이테스(okeanokoites) AKU152(IFO 15880) 및 아르트로박터 술푸레우스(sulfureus) AKU635(IFO 12678)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  4. 셀룰로모나스 sp. AKU672(FERM BP-6449), 코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU610(FERM BP-6447), 코리네박테리움 아쿠아티쿰 AKU611(FERM BP-6448), 플라노코쿠스 오케아노코이테스 AKU152(IFO 15880) 및 아르트로박터 술푸레우스 AKU635(IFO 12678)로 이루어진 군으로부터 선택되는, (6R)-2,2,6-트리메틸사이클로헥산디온을 (4R,6R)-4-하이드록시-2,2,6-트리메틸사이클로헥사논으로 선택적 비대칭 환원시킬 수 있는 미생물.
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