ES2259224T3 - Produccion microbiana de actinol. - Google Patents
Produccion microbiana de actinol.Info
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Abstract
Un procedimiento de fabricación de {(}4R, 6R{-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanone comprende poner en contacto {(}6R{-2,2,6-trimetilciclohexanodiona con un microorganismo seleccionado del grupo constituido por microorganismos del género Cellulomonas, Corynebacterium, Planococcus y Arthrobacter y que es capaz de la reducción selectiva asimétrica de {(}6R{-2,2,6-trimetilciclohexanodiona a {(}4R, 6R{-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona, y recuperación de la {(}4R, 6R{-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona resultante de la mezcla de reacción. La reducción selectiva asimétrica se puede efectuar en presencia de un cofactor tal como nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP), o dicho cofactor con glucosa y glucosa deshidrogenasa (GDH), y/o en presencia de un tensioactivo. El producto se utiliza para la síntesis de carotenoides tal como zeaxantina.
Description
Producción microbiana de actinol.
La presente invención se relaciona con un
proceso para la producción microbiana de
(4R,6R)-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona
(nos referimos a esta como actinol) a partir de
(6R)-2,2,6-trimetilciclohexanodiona
(nos referimos a esta como levodiona). El actinol es útil en la
síntesis de carotenoides, tales como la zeaxantina. Más
particularmente, la presente invención se relaciona con un proceso
para la producción microbiana de actinol utilizando un
microorganismo específico que es capaz de reducir de forma
asimétrica y selectiva el grupo carbonilo de la posición
C-4 de la levodiona.
El actinol se ha preparado previamente mediante
la resolución óptica de la mezcla diastereomérica de actinol. Dicho
proceso, no obstante, requiere la hidrogenación de la levodiona
mediante catalizadores metálicos y la subsiguiente resolución óptica
por medios químicos con agentes de resolución tales como el
anhídrido maléico (T. Ohashi et al., The Proceedings of the
Symposium "Molecular Chirality 1996" celebrado el 30 y 31 de
Mayo, 1996, en Tokyo, Japón, páginas 47 a 50, "Practical Syntheses
using Biocatalysts"). De acuerdo con esto, este proceso no es
factible económicamente para propósitos industriales.
Se conocen procesos para la preparación
enzimática de actinol a partir de la levodiona per se. Por
ejemplo, Bacillus thermophilus es capaz de transformar la
dihidrooxoisoforona racémica en 4 isómeros de la
4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona,
es decir, en los isómeros cis-(4R,6S)-, cis-(4S,6R)-,
trans-(4R,6R)- y trans-(4S,6S)-. La proporción cuantitativa
resultante de dichos isómeros es 68:25:5:2 (J. Biotechnol.,
9(2), 117-128, 1989). De acuerdo con esto, el
contenido del isómero (4R,6R)-, de actinol, corresponde sólo a un 5%
del de los isómeros totales, y este proceso tampoco es
económicamente factible para propósitos industriales.
Además, la DE-A 2 537 060
describe un método para producir
(4R,6R)-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona
mediante la fermentación de
(6R)-2,2,6-trimetilciclohexanodiona
en presencia de un microorganismo, que puede ser del género
Arthrobacter.
Como resultado de estudios exhaustivos sobre la
reducción asimétrica selectiva de levodiona, ahora se ha encontrado
que se puede obtener actinol de forma eficiente a partir de
levodiona mediante reducción asimétrica selectiva utilizando ciertos
microorganismos nuevos, seguida de la recuperación de actinol de la
mezcla de reacción. La presente invención se basa en este
resultado.
De acuerdo con esto, la presente invención
proporciona un proceso para la producción de actinol que implica la
puesta en contacto de levodiona con un microorganismo que se
selecciona a partir del grupo que consiste en Cellulomonas
sp. AKU672, Corynebacterium aquaticum AKU610,
Corynebacterium aquaticum AKU611, Planococcus
okeanokoites AKU152 y Arthrobacter sulfureus AKU635 y que
es capaz de realizar una reducción asimétrica selectiva de la
levodiona para obtener actinol, y la recogida del actinol resultante
de la muestra de reacción.
Se efectuó un cribaje utilizando un método
conocido per se. Por ejemplo, se cultiva un microorganismo en
un medio nutritivo que contiene sacáridos tales como la glucosa o la
sacarosa, alcoholes tales como el etanol y el glicerol, ácidos
grasos tales como el ácido oleico y el ácido esteárico o ésteres de
los mismos, o aceites tales como el aceite de colza y el aceite de
soja como fuentes de carbono; sulfato de amonio, nitrato sódico,
peptona, aminoácidos, licor de maíz fermentado, salvado, extracto de
levadura y similares como fuentes de nitrógeno; sulfato de magnesio,
cloruro sódico, carbonato cálcico, monohidrogenofosfato potásico,
dihidrogenofosfato potásico y similares como fuentes de sales
inorgánicas, y extracto de malta, extracto cárnico y similares como
fuentes de otros nutrientes mediante un método convencional para
proporcionar células. El cultivo puede llevarse a cabo de forma
aeróbica, normalmente durante un periodo de cultivo de 1 a 7 días a
un pH medio de entre 3 y 9 y a una temperatura de cultivo de entre
10 y 40ºC. Después del cultivo, las células resultantes se recogen
mediante centrifugado o filtración. Las células así obtenidas y la
levodiona se juntan (se ponen en contacto) en un disolvente como
agua, tampón fosfato potásico, acetonitrilo, etanol y similares, y
se inicia una reacción bajo las condiciones de reacción adecuadas
(concentración de levodiona: de 400 a 2000 mg/g de células
deshidratadas/l, intervalo de pH: 4 a 9, intervalo de temperatura:
de 20 a 50ºC, periodo de reacción: de 10 minutos a 80 horas). La
mezcla de reacción se extrae mediante un disolvente orgánico como,
por ejemplo, acetato de etilo, n-hexano, tolueno,
acetato de n-butilo y similares. La solución
extraída se somete a una cromatografía apropiada para medir la
productividad del actinol.
Como resultado del cribaje, se ha descubierto
que los microorganismos mencionados anteriormente son capaces de
realizar una reducción asimétrica selectiva de levodiona. De los
cinco microorganismos mencionados, Corynebacterium aquaticum
AKU611 es el más preferido.
Los microorganismos Cellulomonas sp.
AKU672, Corynebacterium aquaticum AKU610 y Corynebacterium
aquaticum AKU611 se aislaron a partir de muestras de suelo
recogidas en el Lago Manahime, Prefectura Fukui, Japón. Estos
microorganismos se depositaron en el National Institute of
Bioscience and Human-Technology, Agency of
Industrial Science and Technology, Japón, el 4 de agosto de 1998 de
acuerdo con el Tratado de Budapest y tienen las siguientes
designaciones:
Cellulomonas sp. AKU672 (FERM
BP-6449)
Corynebacterium aquaticum AKU610 (FERM
BP-6447)
Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM
BP-6448)
Estos tres microorganismos, y también
Planococcus okeanokoites AKU152 y Arthrobacter
sulfureus AKU635, son nuevos y representan otro aspecto de la
presente invención.
La cepa AKU672 (FERM BP-6449)
anteriormente mencionada consta de las siguientes propiedades
taxonómicas:
Mediante microscopía electrónica se observó el
pleomorfismo característico de la cepa de Cellulomonas
sp.
AKU672. Un cultivo antiguo de la cepa era cocoide, como se muestra en la Figura 1. En los cultivos jóvenes predominaban los bacilos irregulares (Figura 2). Las características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas de la cepa se resumen en las Tablas I y II.
AKU672. Un cultivo antiguo de la cepa era cocoide, como se muestra en la Figura 1. En los cultivos jóvenes predominaban los bacilos irregulares (Figura 2). Las características morfológicas, fisiológicas y bioquímicas de la cepa se resumen en las Tablas I y II.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
- Forma y tamaño
- Corineformes
- \quad
- Cultivo antiguo: células cocoides, ca. 0,5-0,6 \mum
- \quad
- Cultivo fresco; bacilos irregulares, desde 0,5-0,7 \mum hasta 20 \mum o más
- Motilidad
- Móviles con un flagelo
- Tinción Gram de la cepa
- +
- Esporas
- No se observan
- Placa de agar nutritivo
- Circular, convexa, lisa, entera, amarilla (2 días)
- Caldo nutritivo
- Sedimento leve y en forma de anillo
- Punción de gelatina
- Licuefacción
- Leche tornasolada
- Formación de ácido
- Relación con NaCl
- Crecimiento hasta en un 5% de NaCl
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- Tipo de pared celular
- Ornitina
- Tipo de división celular
- En ángulo (Bending)
- Contenido de GC
- 74,7%
- Hidrólisis de Gelatina
- +
- Hidrólisis de almidón
- +
- Producción de indol
- -
- Producción de sulfuro de hidrógeno
- -
- Reducción de nitrato a nitrito
- +
- Utilización de citrato
- -
- Actividad catalasa
- +
- Actividad oxidasa
- -
- Actividad ureasa
- -
- Actividad DNasa
- +
- Actividad aminopeptidasa
- -
- Ataque a la celulosa
- -
- Prueba de Voges-Proskauer
- -
- Prueba del Rojo de Metilo
- -
- Prueba de Oxidación-Fermentación*
- Fermentación
- Degradación de Carbohidratos
- Producción de ácido pero no de gas a partir de arabinosa, arbutina, celobiosa, dextrina, fructosa, galactosa, glucosa, glicógeno, maltosa, almidón, sacarosa, trehalosa y xilosa;
- \quad
- No se produce ácido a partir de glicerol, inulina, lactosa, manitol, manosa, \alpha-metilglucósido, rafinosa, ramnosa, sorbitol ni sorbosa.
- Temperatura óptima para el crecimiento
- 37-42ºC
- pH óptimo para el crecimiento
- pH 6,0-7,5
- Calentamiento a 63ºC durante 30 min en leche descremada
- \\[2.1mm]{}\hskip0.7cmSobrevive
- Aeróbica o anaeróbica
- Aeróbica
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
- \text{*}R.
- Hugh & Leifson, J. Bacteriol. 66, 24 (1953)
La cepa Cellulomonas sp. AKU672 es
gram-positiva y aeróbica, y pude clasificarse como
perteneciente al grupo de las "bacterias corineformes". Esta
cepa era móvil y presentaba un flagelo. En la pared celular se
encontró ornitina como aminoácido principal. Su contenido,
determinado mediante cromatografía de gases (GC), fue de un 74%. Se
observó división celular del tipo "bending" (en ángulo). La
cepa produjo ácido a partir de una gran variedad de azúcares sin
formar gas durante 4 días. Esta cepa no mostró actividad
celulolítica.
La clasificación de las bacterias corineformes
no está reconocida definitivamente. Yamada y Komagata (J. Gen.
Appl. Microbiol., 18, 471 (1992)) propusieron recientemente la
clasificación de las bacterias corineformes en siete grupos
dependiendo del tipo principal de división celular, pared celular y
contenido de DNA según la GC. Diferenciaron el Grupo 4 de otros
grupos a pesar de la falta de actividad celulolítica. Las bacterias
de este grupo muestran una división celular tipo "bending" (en
ángulo), y el amino ácido principal de la pared celular es la
ornitina. Sus contenidos según la GC están distribuidos en un
intervalo elevado y estrecho del 71 al 73%. Estas bacterias producen
ácido por fermentación a partir de una amplia variedad de azúcares.
Según su propuesta, la cepa de Cellulomonas sp. AKU672, que
no mostró actividad celulolítica, debería pertenecer al Grupo 4.
Otras características de la cepa a clasificar coincidieron
bien con las del Grupo 4, y por esta razón se le ha denominado provisionalmente como Cellulomonas sp. AKU672.
bien con las del Grupo 4, y por esta razón se le ha denominado provisionalmente como Cellulomonas sp. AKU672.
Las cepas AKU610 y AKU611, mencionadas
anteriormente, presentan las siguientes propiedades taxonómicas:
| 1) Temperatura de crecimiento factible: | 15-40ºC | |
| 2) Temperatura óptima para el crecimiento: | 30ºC | |
| 3) Organismo aeróbico obligado y Gram negativo | ||
| 4) Formación de esporas: | Ninguna | |
| 5) Se pueden observar polimorfismo y ciclos tradicionales bacilo-coco durante el cultivo. | ||
| 6) Motilidad: | Ninguna |
Además, las cepas de Corynebacterium
aquaticum AKU610 y AKU611 se identificaron como tales en base a
la asimilación de diversas fuentes de carbono mediante el Sistema
Biolog (Biolog Inc., 3447 Investment Blvd.,
Suite 3, Hayward, California 94545, EEUU: Nature Vol. 339, 157-158, 11 de Mayo de 1989) de la siguiente mane-
ra:
Suite 3, Hayward, California 94545, EEUU: Nature Vol. 339, 157-158, 11 de Mayo de 1989) de la siguiente mane-
ra:
Se inocularon células de cada cepa en placas
microtituladas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 horas a
28ºC. Cada pocillo contiene una de 96 fuentes diferentes de carbono
en medio BUGM+B (Caldo de Cultivo Universal Biolog + sangre; Biolog
Inc.).
Tras la incubación, cada cepa mostró la
siguiente asimilación de las fuentes de carbono:
\vskip1.000000\baselineskip
| Fuente de C | AKU610 | AKU611 | Fuente de C | AKU 610 | AKU611 |
| A1 | - | - | A2 | - | - |
| A3 | - | - | A4 | - | - |
| A5 | - | - | A6 | - | - |
| A7 | - | - | A8 | + | + |
| A9 | + | + | A10 | - | - |
| A11 | - | - | A12 | + | + |
| B1 | - | - | B2 | - | + |
| B3 | - | - | B4 | + | - |
| B5 | + | + | B6 | - | - |
| B7 | + | + | B8 | - | - |
| B9 | + | + | B10 | + | + |
| B11 | + | + | B12 | - | - |
| C1 | - | - | C2 | - | - |
| C3 | - | - | C4 | + | + |
| C5 | + | + | C6 | + | + |
| C7 | + | - | C8 | + | + |
| C9 | - | - | C10 | - | - |
| C11 | - | - | C12 | - | - |
| D1 | - | - | D2 | - | - |
| D3 | + | + | D4 | - | - |
| D5 | + | + | D6 | - | - |
| D7 | - | - | D8 | - | + |
| D9 | - | - | D10 | - | - |
| D11 | + | + | D12 | + | + |
| E1 | - | - | E2 | - | - |
| E3 | + | + | E4 | - | - |
| E5 | - | - | E6 | - | - |
| E7 | - | - | E8 | - | - |
| E9 | - | - | E10 | - | - |
| E11 | - | - | E12 | - | - |
| F1 | - | - | F2 | - | - |
| F3 | - | - | F4 | - | - |
| F5 | - | - | F6 | + | + |
| F7 | - | - | F8 | - | - |
| F9 | - | - | F10 | - | - |
| F11 | - | - | F12 | - | - |
| G1 | - | - | G2 | - | - |
| G3 | - | - | G4 | - | - |
| G5 | - | - | G6 | - | - |
| G7 | - | - | G8 | - | - |
| G9 | - | - | G10 | - | - |
| G11 | - | - | G12 | - | - |
| H1 | - | - | H2 | - | - |
(Continuación)
| Fuente de C | AKU610 | AKU611 | Fuente de C | AKU 610 | AKU611 |
| H3 | - | - | H4 | - | - |
| H5 | - | - | H6 | - | - |
| H7 | - | - | H8 | - | - |
| H9 | - | - | H10 | - | - |
| H11 | - | - | H12 | - | - |
- A1: agua
- A2: \alpha-ciclodextrina
- A3: \beta-ciclodextrina
- A4: dextrina
- A5: glicógeno
- A6: inulina
- A7: manano
- A8: Tween® 40
- A9: Tween® 80
- A10: N-acetil-D-glucosamina
- \quad
- A11: N-acetil-D-manosamina
- A12: amigdalina
- B1: L-arabinosa
- B2: D-arabitol
- B3: arbutina
- B4: celobiosa
- B5: D-fructosa
- B6: L-fucosa
- B7: D-galactosa
- B8: ácido D-galacturónico
- B9: gentiobiosa
- B10: ácido D-glucónico
- B11: \alpha-D-glucosa
- B12: m-inositol
- C1: \alpha-D-lactosa
- C2: lactulosa
- C3: maltosa
- C4: maltotriosa
- C5: D-manitol
- C6: D-manosa
- C7: D-melecitosa
- C8: D-melibiosa
- C9: \alpha-metil-D-galactósido
- C10: \alpha-metil-D-galactósido
- C11: 3-metil-glucosa
- C12: \alpha-metil-D-glucósido
- D1: \beta-metil-D-glucósido
- D2: \alpha-metil-D-manósido
- D3: palatinosa
- D4: D-psicosa
- D5: D-rafinosa
- D6: L-ramnosa
- D7: D-ribosa
- D8: salicina
- D9: sedoheptulosano
- D10: D-sorbitol
- D11: estaquiosa
- D12: sacarosa
- E1: D-tagatosa
- E2: D-trehalosa
- E3: turanosa
- E4: xilitol
- E5: D-xilosa
\newpage
(Continuación)
- E6: ácido acético
- E7: ácido \alpha-hidroxibutírico
- E8: ácido \beta-hidroxibutírico
- E9: ácido \gamma-hidroxibutírico
- \quad
- E10: ácido p-hidroxifenilacético
- E11: ácido \alpha-cetoglutárico
- E12: ácido \alpha-cetovalérico
- F1: lactamida
- F2: éster metílico de ácido D-láctico
- F3: ácido L-láctico
- F4: ácido D-málico
- F5: ácido L-málico
- F6: metil piruvato
- F7: succinato de monometilo
- F8: ácido propiónico
- F9: ácido pirúvico
- F10: ácido succinámico
- F11 ácido succínico
- F12: ácido N-acetil-L-glutámico
- G1: alaninamida
- G2: D-alanina
- G3: L-alanina
- G4: L-alanil-glicina
- G5: L-asparagina
- G6: ácido L-glutámico
- G7: ácido glicil-L-glutámico
- G8: ácido L-piroglutámico
- G9: L-serina
- G10: putrescina
- G11: 2,3-butanodiol
- G12: glicerol
- H1: adenosina
- H2: 2'-desoxiadenosina
- H3: inosina
- H4: timidina
- H5: uridina
- H6: adenosín-5'-monofosfato
- \quad
- H7: timidín-5'-monofosfato
- \quad
- H8: uridín-5'-monofosfato
- H9: fructosa-6-fosfato
- H10: glucosa-1-fosfato
- H11: glucosa-6-fosfato
- H12: DL-\alpha-glicerol fosfato
A partir de los resultados anteriores, ambas
cepas se identifican como Corynebacterium aquaticum y se les
denomina como Corynebacterium aquaticum AKU610 y AKU611,
respectivamente.
Otros microorganismos mencionados anteriormente
están disponibles en un depósito público (colección de colonias)
para quien los solicite, tal como en el Instituto de Fermentación de
Osaka, Japón (IFO). Son ejemplos de dichas cepas en depósito el
Planococcus okeanokoites AKU152 (IFO 15880) y el
Arthrobacter sulfureus AKU635 (IFO 12678).
El proceso de reducción asimétrica selectiva de
la presente invención puede llevarse a cabo de forma discontinua,
semidiscontinua o continua, en agua o en general en un medio
solvente que sea miscible en agua, potencie la solubilidad de la
levodiona y sea inerte a la reacción enzimática, tal como el tampón
de fosfato potásico de 0,01 M a 0,5 M, otro tampón con el intervalo
de pH de 4 a 10, acetonitrilo, etanol o
N,N-dimetilformamida. Convenientemente, la
concentración de levodiona es de 400 a 2000 mg/g de células
deshidratadas/l, preferentemente de 400 a 800 mg/g de células
deshidratadas/l. El proceso de reducción asimétrica selectiva puede
llevarse a cabo dentro de un intervalo de pH de 4 a 9,
preferentemente de 6 a 7, dentro de un intervalo de temperatura de
20 a 50ºC, preferentemente de 30 a 40ºC, y durante un periodo de
tiempo que oscila entre 10 minutos y 80 horas, preferentemente entre
8 y 24 horas.
El proceso de reducción selectiva asimétrica de
la presente invención se lleva a cabo convenientemente en presencia
de un cofactor como el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD),
el fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina (NADP), o
dicho cofactor con glucosa y glucosa deshidrogenasa (GDH). La
concentración de dicho cofactor en el medio de reacción es
preferentemente de 300 mM/l o superior, más preferentemente de 700
mM/l a 900 mM/l. Además, el rendimiento del actinol puede
incrementarse mediante adición de un tensioactivo a la mezcla de
reacción. El Span® 20, el Span® 80, el Tween® 20 y el Tween® 40
(todos disponibles en Wako Pure Chemical Ind.,
3-1-2 Dosho-machi,
Osaka, Japón) y similares, son ejemplos de tensioactivos que pueden
utilizarse. Convenientemente, la cantidad de tensioactivo en el
medio de reacción es de 2 a 20 mM/l, preferentemente unos 8
mM/l.
Tras completar la reducción asimétrica
selectiva, el actinol obtenido puede recuperarse mediante extracción
con un disolvente orgánico insoluble en agua (inmiscible con agua)
en el que el actinol se disuelva fácilmente, como el acetato de
etilo, el n-hexano, el tolueno o el acetato de
n-butilo. Se puede realizar una mayor purificación
del actinol mediante concentración del extracto para cristalizar el
actinol directamente o mediante la combinación de varios tipos de
cromatografía, tales como la cromatografía en capa fina, la
cromatografía de adsorción, la cromatografía de intercambio de iones
y/o la cromatografía de filtrado en gel. Si es necesario, se puede
efectuar una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Una
recuperación preferida que conduce a la obtención de cristales de
actinol impli-
ca la extracción de actinol mediante acetato de etilo y la concentración del extracto para obtener cristales de actinol.
ca la extracción de actinol mediante acetato de etilo y la concentración del extracto para obtener cristales de actinol.
Como una alternativa a la técnica de "reacción
de células en reposo" anteriormente descrita, el actinol puede
producirse mediante fermentación llevada a cabo por los
microorganismos anteriormente mencionados en un medio nutritivo en
presencia de levodiona, es decir, en una "reacción de células en
crecimiento". Ambas alternativas son utilizadas en el proceso de
la presente invención.
En la técnica de "reacción de células en
crecimiento" pueden utilizarse como medios nutritivos aquellos
que contienen sacáridos como la glucosa y la sacarosa, alcoholes
como el etanol o el glicerol, ácidos grasos tales como el ácido
oleico y el ácido esteárico o ésteres de los mismos, o aceites tales
como el aceite de colza y el aceite de soja como fuentes de carbono;
sulfato de amonio, nitrato sódico, peptona, aminoácidos, licor de
maíz fermentado, salvado, extracto de levadura y similares como
fuentes de nitrógeno; sulfato de magnesio, cloruro sódico, carbonato
cálcico, monohidrogenofosfato de potasio, dihidrogenofosfato de
potasio y similares como sales inorgánicas; y extracto de malta,
extracto cárnico y similares como fuentes de otros nutrientes. Como
un aspecto más de la invención, el actinol puede producirse mediante
fermentación llevada a cabo por los microorganismos mencionados en
un medio nutritivo en presencia de levodiona.
La fermentación puede llevarse a cabo de forma
aeróbica, normalmente con un periodo de incubación de 1 a 7 días, a
un pH medio entre 3 y 7 y a una temperatura de fermentación de 10 a
40ºC.
Los microorganismos a utilizar en la
fermentación pueden estar en cualquier forma, por ejemplo, como
cultivos obtenidos por fermentación de cepas en medio líquido, como
células aisladas a partir de cultivos líquidos, como células
deshidratadas obtenidas al procesar células o cultivos, o como
células inmovilizadas.
Los siguientes Ejemplos ilustran la presente
invención.
Un medio líquido (pH 7,0) consistente en un 0,5%
de 1,4-ciclohexanodiona (análoga estructuralmente a
la
(6R)-2,2,6-trimetilciclohexanodiona;
utilizada para el cribaje), un 0,5% de Tween® 20, un 0,1% de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, un 0,1% de K_{2}HPO_{4}, un
0,02% de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O y un 0,02% de extracto de
levadura se dispersó en fracciones de 5 ml en tubos de ensayo, y
después se esterilizó a 121ºC durante 20 minutos. En cada uno de
esos tubos se introdujeron aproximadamente 0,3 g de muestra de suelo
y se cultivaron durante 24 horas a 30ºC. Se utilizó una fracción de
0,1 ml del cultivo así obtenido para inocular medio de cultivo de
tubo de ensayo fresco como el descrito anteriormente, y esta
operación se repitió dos veces para enriquecer en los
microorganismos diana. El cultivo enriquecido obtenido de esta forma
se diluyó en solución salina y se extendió sobre un medio de agar
constituido por los mismos ingredientes que se han mencionado
anteriormente. Simultáneamente, se diluyó de forma apropiada el
sobrenadante de la suspensión de suelo en solución salina y también
se extendió sobre el medio de agar. Las placas se incubaron durante
48 horas a 30ºC. Las colonias cultivadas en las placas se utilizaron
para inocular 5 ml de medio líquido (pH 7,0) formado por un 10% de
glucosa, un 0,3% de K_{2}HPO_{4}, un 0,02% de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, un 1,5% de peptona (Mikuni Kagaku Sangyo
K.K., 4-1-6 Muromachi, Nihonbashi,
Chuo-ku, Tokio, Japón), un 0,2% de NaCl y un 0,1% de
extracto de levadura (Nacalai Tesuque Inc., Karasumaru Nishihairu,
Nijohtouri, Nakakyoku, Kyoto, Japón) en un tubo. Tras haber incubado
los tubos a 30ºC durante 24 horas, las células se recogieron
mediante centrifugación y se lavaron con solución salina. Las
células obtenidas de esta manera se fijaron para el cribaje
posterior. Además de los microorganismos mencionados anteriormente,
en el cribaje también se utilizaron células deshidratadas de los
microorganismos que habían sido cultivados en un medio
nutritivo.
Se preparó una mezcla de reacción (pH 7,0 en
tampón fosfato potásico 0,01 M ) que contenía 0,6 mg de NAD
(Oriental Yeast Co., 3-6-10 Azusawa,
Itabashi-ku, Tokyo, Japón), 0,6 mg de NADP (Oriental
Yeast Co.), 50 mg de D-glucosa y 0,2 mg de
D-glucosa deshidrogenasa (Amano Pharmaceutical Co.,
1-2-7 Nishiki,
Naka-ku, Nagoya, Japón). Se añadieron unos 0,3 g de
las células preparadas en el Ejemplo 1 a 1 ml de la mezcla de
reacción, seguido de una cantidad suficiente de
(6R)-2,2,6-trimetilciclohexanodiona
para obtener una concentración final del 0,5%. La mezcla de reacción
después se incubó con agitación durante 24 horas a 30ºC. Tras la
incubación, la mezcla de reacción se extrajo con 1 ml de acetato de
etilo y se concentró. El rendimiento y la pureza óptica de la (4R,
6R)-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona
se analizaron mediante cromatografía de gases (columna:
HR-20 M (Shinwa Chemical Ind.,
Keishyo-cho 50, Fushimi-ku, Kyoto,
Japón) 0,25 mm\diameter x 30 m, temperatura de la columna: 160ºC
(constante), temperatura del inyector: 250ºC, gas portador: He
(aprox. 1 ml/min)). Los resultados se presentan en la Tabla III.
| Nombre de la cepa | Tasa de reducción | Pureza óptica de la |
| (%) | (4R,6R)-4-hidroxi-2,2,6- | |
| trimetil-ciclohexanona (% e.e.) | ||
| Planococcus okeanokoites | 42,3 | 56,7 |
| AKU 152 (IFO 15880) | ||
| Arthrobacter sulfureus | 64 | 44 |
| AKU 635 (IFO 12678) | ||
| Cellulomonas sp. | 73 | 78,3 |
| AKU672 (FERM BP-6449) | ||
| Corynebacterium aquaticum | 93,7 | 85,9 |
| AKU610 (FERM BP-6447) | ||
| Corynebacterium aquaticum | 97,4 | 87,7 |
| AKU611 (FERM BP-6448) |
El efecto de la adición de NAD o de NADP a la
mezcla de reacción se evidenció mediante la utilización de los
microorganismos que se describen en la tabla III. La mezcla básica
de reacción contenía todos los componentes descritos en el Ejemplo 2
a excepción del NAD y el NADP. Las células de los microorganismos
utilizados en el presente ejemplo se deshidrataron mediante aire, y
se incorporaron 10 mg de la masa celular a la mezcla de reacción. La
reacción se llevó a cabo a 30ºC durante 24 horas. Los resultados se
presentan en la Tabla IV, en la que los valores de pureza óptica (%
e.e.) se refieren al isómero (4R,6R)-, como también es el caso de
las Tablas V (Ejemplo 4) y VI (Ejemplo 5).
| Adición de cofactor | ||||||
| NAD | NADP | Ninguno | ||||
| Nombre de la cepa | Tasa de | Pureza | Tasa de | Pureza | Tasa de | Pureza |
| reducción | óptica | reducción | óptica | reducción | óptica | |
| (%) | (% e.e.) | (%) | (% e.e.) | (%) | (% e.e.) | |
| Planococcus okeanokoites | 89,3 | 60,4 | 65,4 | 54,7 | 63,4 | 58,2 |
| AKU152 (IFO 15880) | ||||||
| Arthrobacter sulfureus | 82,7 | 24 | 66,5 | -7,3 | 56,5 | -9,5 |
| AKU635 (IFO 12678) | ||||||
| Cellulomonas sp. | 59,2 | 67,1 | 30,1 | 21,6 | 24,8 | 25,7 |
| AKU 672 (FERM BP-6449) | ||||||
| Corynebacterium aquaticum | 62,5 | 87,4 | 60 | 85,3 | 17 | 52,1 |
| AKU610 (FERM BP-6447) | ||||||
| Corynebacterium aquaticum | 96,8 | 93,9 | 85,3 | 88,5 | 92,5 | 89,1 |
| AKU611 (FERM BP-6448) |
El efecto de la adición de varios tensioactivos
(concentración final: 0,1% p/v) a la mezcla de reacción se dilucidó
utilizando los microorganismos descritos en la Tabla III. La mezcla
básica de reacción contenía todos los componentes descritos en el
Ejemplo 2. Las células de los microorganismos utilizados en el
presente ejemplo se deshidrataron mediante aire, y se incorporaron
10 mg de la masa celular a la mezcla de reacción. La reacción se
llevó a cabo a 30ºC durante 24 horas. Los resultados se presentan en
la Tabla V.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tensioactivo | ||||||
| Ninguno | Tween® 20 | Tween® 40 | ||||
| Nombre de la cepa | Tasa de | Pureza | Tasa de | Pureza | Tasa de | Pureza |
| reducción | óptica | reducción | óptica | reducción | óptica | |
| (%) | (% e.e.) | (%) | (% e.e.) | (%) | (% e.e.) | |
| Planococcus okeanokoites | 53,9 | 51,6 | 78,1 | 63,4 | 63,9 | 57,7 |
| AKU152 (IFO 15880) | ||||||
| Arthrobacter sulfureus | 73,4 | 25,1 | 86,8 | 38,6 | 82,4 | 33,8 |
| AKU635 (IFO 12678) | ||||||
| Cellulomonas sp. | 32,3 | 80 | 32,1 | 86,2 | no medida | n.m. |
| AKU672 (FERM BP-6449) | (n.m) | |||||
| Corynebacterium aquaticum | 58,9 | 87,6 | 71,7 | 89,3 | n.m | n.m |
| AKU610 (FERM BP-6447) | ||||||
| Corynebacterium aquaticum | 85,7 | 92,6 | 97,5 | 93,7 | n.m. | n.m |
| AKU611 (FERM BP-6448) |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Tensioactivo | ||||
| Span® 20 | Span® 80 | |||
| Nombre de la cepa | Tasa de | Pureza óptica | Tasa de | Pureza óptica |
| reducción (%) | (% e.e.) | reducción (%) | (% e.e.) | |
| Planococcus okeanokoites | 71,4 | 65,7 | 57,3 | 57,3 |
| AKU152 (IFO 15880) | ||||
| Arthrobacter sulfureus | 78,5 | 49,9 | 65,2 | 32 |
| AKU635 (IFO 12678) | ||||
| Cellulomonas sp. | 22,2 | 66,2 | 38 | 78,1 |
| AKU672 (FERM BP-6449) | ||||
| Corynebacterium aquaticum | 64,6 | 89,9 | 83 | 87,3 |
| AKU610 (FERM BP-6447) | ||||
| Corynebacterium aquaticum | 96,7 | 94 | 88,8 | 93,2 |
| AKU611 (FERM BP-6448) |
La influencia de la concentración de sustrato
sobre la reacción se dilucidó a concentraciones del 0,5; del 1,0 y
del 1,5%. La mezcla básica de reacción contenía todos los
componentes descritos en el Ejemplo 2. En el presente ejemplo, las
células de Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM
BP-6448) se deshidrataron mediante aire, y se
incorporaron 10 mg de la masa celular a la mezcla de reacción. La
reacción se llevó a cabo a 30ºC durante 24 horas. Los resultados se
presentan en la Tabla VI.
| Concentración de sustrato | Tasa de reducción | Pureza óptica | Concentración |
| (%) | (%) | (% e.e.) | de producto (%) |
| 0,5 | 92,2 | 93,0 | 0,46 |
| 1,0 | 73,1 | 92,9 | 0,73 |
| 1,5 | 66,3 | 92,8 | 0,99 |
Se cultivó Corynebacterium aquaticum
AKU611 (FERM BP-6448) durante 24 horas a 30ºC en 20
l de medio de cultivo compuesto a partir de un 0,1% de extracto de
levadura, un 1,5% de peptona, un 2,0% de D-glucosa,
un 0,02% de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, un 0,3% de K_{2}HPO_{4}
y un 0,2% de NaCl utilizando un recipiente fermentador de 30 l con
agitación a 400 rpm y aireación de 0,5 l por minuto. Después las
células se recogieron del cultivo mediante centrifugación a 5.000 g
durante 5 minutos. El peso de la pasta de células obtenidas de esta
forma fue de 400 g.
Después, se añadieron 12 g de levodiona y 120 g
de D-glucosa a la pasta celular y el volumen se
ajustó hasta 2,4 l mediante agua de intercambio iónico. El pH se
ajustó a 7,0 mediante una solución de NaOH al 2,0%. La mezcla de
reacción se transfirió a un recipiente de 2 l y se incubó a 30ºC
durante 15 horas con agitación a 220 rpm. Tras la incubación, la
mezcla de reacción se separó mediante centrifugación a 12.000 g
durante 5 minutos. El volumen de la mezcla de reacción así obtenida
fue de 2,2 l, y la pureza óptica, el rendimiento y la concentración
de actinol fueron del 96% e.e., del 93% y de 4,6 g/l,
respectivamente.
La mezcla de reacción (10 l), preparada como se
describe en el Ejemplo 6, se mezcló con acetato de etilo (10 l)
para extraer actinol. La fase de acetato de etilo (7,5 l) se separó
y se le añadieron 350 gramos de carbón activo en polvo para
decolorarla. Tras 10 minutos de agitación, el carbono en polvo se
eliminó mediante filtración. Se añadieron 600 g de Na_{2}SO_{4}
anhidro a la solución de 6,5 l de acetato de etilo para deshidratar.
Tras unos pocos minutos de agitación, el Na_{2}SO_{4} se eliminó
mediante filtración. La solución de acetato de etilo (6,0 l) se
concentró a 50 ml bajo presión reducida a 30ºC. Al concentrado
obtenido de esta manera se le añadieron 5 l de
n-hexano, y la mezcla se agitó durante cinco
minutos, después se enfrió hasta 5ºC y se mantuvo a esta temperatura
durante 12 horas para cristalizar el actinol. El actinol
cristalizado se recogió mediante filtración y después se secó. El
peso de los cristales de actinol obtenidos de esta manera fue de 32
g, y la pureza, la pureza óptica y el rendimiento del actinol fueron
del 96%, del 96% e.e. y del 70%, respectivamente.
Se inoculó caldo de cultivo (150 ml) de
Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM
BP-6448) en 3 l de medio de fermentación compuesto
por un 0,1% de extracto de levadura, un 1,5% de peptona, un 2,0% de
glucosa, un 0,02% de MgSo_{4}\cdot7H_{2}O, un 0,3% de
K_{2}HPO_{4}, un 0,2% NaCl y un 0,3% de levodiona. La
fermentación se llevó a cabo durante 48 horas a 30ºC utilizando un
recipiente de fermentación de 5 l con agitación a 250 rpm y
aireación de 1,5 l por minuto. El pH del caldo de fermentación se
mantuvo a 7,0 mediante gas NH_{3}. Tras la fermentación, se
extrajo el caldo y las células se recogieron mediante centrifugación
a 12.000 g durante 5 minutos. La pureza óptica, el rendimiento y la
concentración de actinol en el caldo fueron de un 96% e.e., un 71% y
de 2,1 g/l, respectivamente.
Claims (7)
1. Un proceso para la producción de
(4R,6R)-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona
que consiste en poner en contacto
(6R)-2,2,6-trimetilciclohexanodiona
con un microorganismo seleccionado a partir del grupo que consiste
en Cellulomonas sp. AKU672 (FERM BP-6449),
Corynebacterium aquaticum AKU610 (FERM
BP-6447), Corynebacterium aquaticum AKU611
(FERM BP-6448), Planococcus okeanokoites
AKU152 (IFO 15880) o Arthrobacter sulfureus AKU635 (IFO
12678) y capaz de llevar a cabo la reducción asimétrica selectiva de
la
(6R)-2,2,6-trimetilciclohexanodiona
para obtener
(4R,6R)-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona,
y recuperar la
(4R,6R)-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona
resultante de la mezcla de reacción.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, donde la reducción asimétrica selectiva se realiza en presencia
de NAD, NADP, o NAD o NADP con glucosa y GDH.
3. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 o 2, en el que la reducción asimétrica selectiva
se efectúa en presencia de un tensioactivo.
4. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la reducción asimétrica selectiva
se lleva a cabo dentro de un intervalo de pH de 4 a 9, dentro de un
intervalo de temperatura de 20 a 50ºC y durante un periodo de 10
minutos a 80 horas.
5. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la recuperación de la
(4R,6R)-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona
de la mezcla de reacción se realiza mediante extracción de la
(4R,6R)-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona
con acetato de etilo y concentrando el extracto resultante para
obtener cristales de
(4R,6R)-4-hidroxi-2,2,6-trimetilciclohexanona.
6. Un microorganismo seleccionado a partir del
grupo que consiste en Cellulomonas sp. AKU672 (FERM
BP-6449), Corynebacterium aquaticum AKU610
(FERM BP-6447) y Corynebacterium aquaticum
AKU611 (FERM BP-6448).
7. Un microorganismo seleccionado a partir del
grupo que consiste en Planococcus okeanokoites AKU152 (IFO
15880) y Arthrobacter sulfureus AKU635 (IFO 12678).
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