CN1246466C - 制备(4r,6r)－4－羟基－2,2,6－三甲基环己酮的微生物方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮的方法，包括使(6R)-2，2，6-三甲基环己烷二酮与一种微生物接触，该微生物选自纤维单孢菌属、棒状杆菌属、游动球菌属和节杆菌属，并能将(6R)-2，2，6-三甲基环己烷二酮选择性不对称还原为(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮，然后从反应混合物回收得到的(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮。该选择性不对称还原作用一般在辅因子例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，或者所述辅因子与葡萄糖和葡萄糖脱氢酶(GDH)存在下，和/或在表面活性剂存在下实现。该产物用于合成类胡萝卜素，例如玉米黄质。

Description

制备(4R，6R)-4-羟基-2，2，6- 三甲基环己酮的微生物方法
本发明涉及从(6R)-2，2，6-三甲基环己烷二酮(下文称之为levodione)制备(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮(下文称之为actinol)的微生物方法。Actinol用于合成类胡萝卜素，例如玉米黄质。更特别地，本发明涉及利用特异性微生物制备actinol的微生物方法，所述特异地微生物能选择性地不对称还原levodioneC-4位的羰基。
Actinol先前已经通过光学拆分actinol的非对映体混合物制备。但是这样的方法需要通过金属催化剂对levodione的氢化作用和接着通过化学方法用拆解试剂例如马来酐进行光学拆分(T.Ohashi等，“分子手性1996”研讨会汇编，1996年5月30和31举行，日本，东京，47-50页，“使用生物催化剂实施合成”)。因此，该方法对于工业化来说在经济上是不可行的。
从levodione用酶方法制备actinol本来是已知的。例如，嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermophilus)能将外消旋二氢氧代异佛尔酮转化为4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮的4个异构体，即转化为顺-(4R，6S)-，顺-(4S，6R)-，反-(4R，6R)-和反-(4S，6S)-异构体。得到的这些异构体的定量比例是68∶25∶5∶2(生物技术杂志(J.Biotechnol.，)9(2)，117-128，1989)。因此，(4R，6R)异构体actinol的含量只占总的异构体的5％，该方法对于工业目的在经济上也是不可行的。
对选择性不对称还原levodione的大量研究结果，现已发现actinol可以通过使用某些微生物的选择性不对称还原后从反应混合物回收actinol而从levodione有效获得。本发明是以此研究结果为基础的。
因此本发明提供制备actinol的方法，包括使levodione与一种微生物接触，该微生物选自纤维单孢菌属(Cellulomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、游动球菌属(Planococcus)和节杆菌属(Arthrobacter)，并能将levodione选择性不对称还原为actinol，然后从反应混合物回收得到的actinol。
用本来已知的方法进行筛选。例如，在一种营养培养基中通过常规方法培养微生物提供细胞，该营养基含有：糖例如葡萄糖和蔗糖、醇例如乙醇和甘油、脂肪酸例如油酸和硬脂酸或者其酯、或者油例如油菜籽油和豆油，作为碳源；硫酸铵、硝酸钠、胨、氨基酸、玉米浆、糠、酵母提取液和类似物，作为氮源；硫酸镁、氯化钠、碳酸钙、磷酸一氢钾，磷酸二氢钾和类似物作为无机盐源；和麦芽汁、肉膏和类似物，作为其它营养源。培养可以在需氧情况下进行，一般在pH3-9的培养基中培养1-7天，培养温度是10-40℃。培养后，通过离心或过滤收集得到的细胞。这样得到的细胞和levodione一起在溶剂例如水、磷酸钾缓冲液、乙腈、乙醇和类似物中接触，反应在合适的反应条件下起始(levodione浓度：400-2000mg/g干细胞/l，pH范围：4-9，温度范围20-50℃，反应时间：10分钟至80小时)。反应混合物用有机溶剂例如乙酸乙酯、正己烷、甲苯、乙酸正丁酯等萃取。使萃取的溶液进行合适的色谱来测定actinol的产率。
筛选结果发现，属于纤维单孢菌属(Cellulomonas)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、游动球菌属(Planococcus)和节杆菌属(Arthrobacter)的微生物能选择性不对称还原levodione。这样的微生物特别优选的是纤维单孢菌属AKU672、水生棒状杆菌(Corynebacterium aquaticum)AKU610、水生棒状杆菌AKU611、PlanococcusokeanokoitesAKU152和硫磺节杆菌(Arthrobacter sulfureus)AKU635，特别是头三个命名的微生物。这5个命名的微生物中，水生棒状杆菌AKU611是最优选的。
纤维单孢菌属AKU672、水生棒杆菌AKU610和水生棒杆菌AKU611这些微生物是从日本的Lake Manahime，Fukui Prefecture收集的土壤样品中分离出来的。根据布达佩斯条约，这些微生物已于1998年8月4日在日本国立生命科学和人体技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)保藏，具有下面的保藏号：
纤维单孢菌属AKU672(FERM BP-6449)，
水生棒状杆菌AKU610(FERM BP-6447)，
水生棒状杆菌AKU611(FERM BP-6448)。
这三种微生物是新的并且代表本发明的又一个方面。
本申请中的Corynebacterium aquaticum和Planococcus okeanokoites曾分别被再分类为Leifsonia aquatica和Planomicrobium okeanokoites(分别参见：Int J Syst Evol Microbiol 2000 Jan；50 Pt 1：371-80和Int J Syst EvolMicrobiol 2001 Jul；51 Pt 4：1511-20)。
上面的菌株AKU672(FERM BP-6449)具有下面的分类学性质：菌属AKU672在28℃在营养琼脂斜面下培养4天。洗过的细胞在真空下干燥并用铬投影。
图2.表示菌株纤维单孢菌属AKU672的多态现象。细胞在营养肉汤中培养。
上面的菌株AKU672(FERM BP-6449)具有下面的分类学性质：
电子显微镜观察发现菌株纤维单孢菌属AKU672的典型多态性。如图1所示，该菌株的老培养物是球状的。在新培养物中，不规则杆菌是显性的(图2)。该菌株的形态学，生理学和生物化学特征总结在表I和II中。
表1.纤维单孢菌属AKU672菌株的形态学和培养特征
形状和大小   棒状形式老培养物；球状细胞，大约0.5-0.6μm新培养物；不规则杆状，0.5-0.7μm×20μm或20μm以上游动性       一个鞭毛游动革兰氏染液   +孢子         没有发现营养物琼脂板 圆状，凸面，平滑，完整，黄色(2天)营养物肉汤   环状且轻微沉淀明胶穿刺     液化石芯牛乳     酸生成关于NaCl     增加至5％NaCl
表II.纤维单孢菌属AKU672菌株的生理学和生物化学特征
细胞壁类型                 鸟氨酸
细胞分裂类型               弯曲
GC含量(％)                 74.7％
明胶水解                   +
淀粉水解                   +
吲哚的产生                 -
硫化氢的产生               -
硝酸根还原为亚硝酸根       +
柠檬酸盐的利用             -
过氧化氢酶活性             +
氧化酶活性                  -
脲酶活性                    -
DN酶活性                    +
氨基肽酶活性                -
纤维素攻击                  -
Voges-Proskauer试验         -
甲基红试验                  -
氧化-发酵试验*             发酵
碳水化合物裂解
从阿拉伯糖，熊果苷，纤维二糖，糊精，果糖，半乳糖，葡萄糖，糖原，麦芽糖，淀粉，蔗糖，海藻糖和木聚糖产生酸但是不产生气体；
从甘油，菊粉，乳糖，甘露糖醇，甘露糖，α-甲基葡糖苷，棉子糖，鼠李糖，山梨糖醇，山梨糖没有酸产生
生长的最佳温度               37-42℃
生长的最佳pH                 pH 6.0-7.5
在脱脂乳中在63℃加热30分钟   成活
需氧或厌氧                   需氧
*R.Hugh & E.Leifson，细菌学杂志(J.Bacteriol.)66，24(1953)
菌株纤维单孢菌属AKU672是革兰氏阳性的和需氧的，分类属于“棒状杆菌”种群。该菌株一个鞭毛游动。在细胞壁中发现鸟氨酸是主要的氨基酸。根据气相色谱(GC)发现其含量是74.7％。发现类弯曲细胞分裂。该菌株在4天中从多种多样糖中产生酸而不生成气体。该菌株没有表现出溶纤维素活性。
没有完全确定棒状杆菌的分类。最近，Yamada和Komagata[J.Gen.Appl.Microbiol.，18，417(1992)]建议，根据细胞分裂的主要类型、按GC的细胞壁组成和DNA含量将棒状杆菌分为7个组。他们将第4组从其它组中分出，尽管其缺少溶纤维素活性。该组的细菌表现出弯曲类型的细胞分裂，并且细胞壁中主要的氨基酸是鸟氨酸。其根据GC的含量分布在窄而高的范围内，为71-73％。这些细菌从多种多样的糖中发酵产生酸。根据其建议，不表现出溶纤维素活性的纤维单孢菌属AKU672菌株应该属于第4组。该菌株分类学上的其它特征与第4组的那些很好符合，因此暂时命名为纤维单孢菌属AKU672。
上面提到的菌株AKU610和AKU611具有下面的分类学特征：
1)可生长温度：            15-40℃
2)生长最佳温度：          30℃
3)专性需氧和革兰氏阴性微生物
4)孢子生成：              无
5)在培养期间可以观察到多态性和常规的杆状-cocus环
6)游动性：                无
此外，对于水生棒杆菌AKU610和水生棒杆菌AKU611这样的菌株以吸收各种各样碳源为基础通过Biolog System(Biolog Inc.，3447InvestmentBlvd.，Suite 3，Hayward，加里弗尼亚94545，USA：自然Vol.339，157-158，1989年5月11日)鉴定如下：
每种菌株的细胞接种96-孔微量滴定板并在28℃温育24小时。每一个孔含有BUGM+B培养基(Biolog Universal Growth Media+血液；BiologInc.)中96种碳源中的一种。
温育后，每一种菌株表现出下面的碳源吸收作用：
  C源   AKU610   AKU611   C源   AKU610   AKU611
A1A3A5A7A9A11B1B3B5B7B9B11C1 ----+---++++- ----+---++++- A2A4A6A8A10A12B2B4B6B8B10B12C2 ---+-+-+--+-- ---+-++---+--
  C3C5C7C9C11D1D3D5D7D9D11E1E3E5E7E9E11F1F3F5F7F9F11G1G3G5G7G9G11H1H3H5H7H9H11   -++---++--+-+----------------------   -+----++--+-+----------------------   C4C6C8C10C12D2D4D6D8D10D12E2E4E6E8E10E12F2F4F6F8F10F12G2G4G6G8G10G12H2H4H6H8H10H12   +++-------+--------+---------------   +++-----+-+--------+---------------
A1：水                    A2：α-环糊精
A3：β-环糊精             A4：糊精
A5：糖原                  A6：菊粉
A7：甘露聚糖              A8：Tween40
A9：Tween80            A10：N-乙酰基-D-葡糖胺
A11：N-乙酰基-D-甘露糖胺
A12：苦杏仁苷             B1：L-阿拉伯糖
B2：D-阿拉伯糖醇          B3：熊果苷
B4：纤维二糖              B5：D-果糖
B6：L-岩藻糖              B7：D-半乳糖
B8：D-半乳糖醛酸          B9：龙胆二糖
B10：D-葡糖酸             B11：α-D-葡萄糖
B12：间-肌醇              C1：α-D-乳糖
C2：lactulose             C3：麦芽糖
C4：麦芽三糖              C5：D-甘露糖醇
C6：D-甘露糖              C7：D-松三糖
C8：D-蜜二糖              C9：α-甲基D-半乳糖苷
C10：α-甲基-D-半乳糖苷   C11：3-甲基-葡萄糖
C12：α-甲基-D-葡糖苷     D1：β-甲基D-葡糖苷
D2：α-甲基D-甘露糖苷     D3：palatinose
D4：D-阿洛酮糖            D5：D-棉子糖
D6：L-鼠李糖              D7：D-核糖
D8：水杨苷                D9：景天庚酮糖原
D10：D-山梨糖醇           D11：水苏糖
D12：蔗糖                 E1：D-塔格糖
E2：D-海藻糖              E3：松二糖
E4：木糖醇                E5：D-木聚糖
E6：乙酸                  E7：α-羟基丁酸
E8：β-羟基丁酸           E9：γ-羟基丁酸
F10：对-羟基苯基乙酸
E11：α-酮基-戊二酸       E12：α-酮基-戊酸
F1：乳酰胺               F2：D-乳酸甲酯
F3：L-乳酸               F4：D-苹果酸
F5：L-苹果酸             F6：丙酮酸甲酯
F7：琥珀酸一甲酯         F8：丙酸
F9：戊酸                 F10：琥珀酰胺酸
F11：琥珀酸              F12：N-乙酰基-L-谷氨酸
G1：丙氨酸酰胺           G2：D-丙氨酸
G3：L-丙氨酸             G4：L-丙氨酰-甘氨酸
G5：L-天冬胺酰           G6：L-谷氨酸
G7：甘胺酰-L-谷氨酸      G8：L-pyloglutamic acid
G9：L-丝氨酸             G10：腐胺(putrscine)
G11：2，3-丁二醇         G12：甘油
H1：腺苷                 H2：2’-脱氧腺苷
H3：肌苷                 H4：胸苷
H5：尿苷                 H6：腺苷-5’-一磷酸酯
H7：胸苷-5’-一磷酸酯
H8：尿苷-5’-一磷酸酯
H9：果糖-6-磷酸          H10：葡萄糖-1-磷酸
H11：葡萄糖-1-磷酸       H12：DL-α-甘油磷酸
从上述结果，两个菌株鉴定为水生棒杆菌，分别命名为水生棒杆菌AKU610和水生棒杆菌AKU611。
上面提到的其它微生物，任何人均可以提出要求从公共保藏处(培养物收集处)获得，例如Institute of Fermentation Osaka，日本(IFO)。这些保藏的菌株例子是Planococcus okeanokoitesAKU152(IFO15880)和硫磺节杆菌AKU635(IFO12678)。
本发明选择性不对称还原方法可以在水中或者一般在溶剂培养基中分批式、半分批式或连续进行，所指溶剂培养基与水可混溶，提高了levodione溶解度，并且对酶反应呈惰性，例如0.01至0.5M磷酸钾缓冲液、pH范围是4-10的另一种缓冲液、乙腈、乙醇或N，N-二甲基甲酰胺。levodione的浓度一般是400-2000mg/lg干细胞/升，优选400-800mg/lg干细胞/升。选择性不对称还原方法可以在pH范围是4-9.优选6-7，在温度范围是20-50℃，优选30-40℃下进行10分钟至80小时，优选8小时至24小时。
本发明选择性不对称还原方法一般在辅因子例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、或者所述辅因子与葡萄糖和葡萄糖脱氢酶(GDH)存在下进行。这种辅因子在反应培养基中的浓度优选是300mM/l或300mM/l以上，更优选700mM/l至900mM/l。此外，通过向反应混合物加入表面活性剂来提高actinol产率。可以使用的表面活性剂的例子是Span20，Span80，Tween20，Tween40(都是购自Wako PureChemical Ind.，3-1-2 Dosho-machi，Osaka，日本)和类似物。反应培养基中的表面活性剂的量一般是2-20mM/l，优选大约8mM/l。
选择性不对称还原完成后，由此得到的actinol通过用容易溶解actinol的水不溶性(水不混溶性)溶剂例如乙酸乙酯、正己烷、甲苯或乙酸正丁酯萃取来回收。actinol的进一步纯化可以通过浓缩萃取液直接结晶actinol或者通过联合使用各种类型色谱例如薄层色谱、吸附色谱、离子交换色谱和/或凝胶过滤色谱进行。如果需要，也可以使用高效液相色谱。引导actinol结晶的优选的回收方法包括用乙酸乙酯萃取actinol，和浓缩萃取液获得actinol结晶。
作为替代上述“静息细胞反应”技术的另一种技术，可以通过使上述微生物在levodione存在下在营养培养基中发酵(即“生长细胞反应”技术)来制备actinol。本发明方法包括这两种可选择的方法。
作为“生长细胞反应”技术中的营养培养基可以使用下面那些培养基，含有：糖例如葡萄糖和蔗糖、醇例如乙醇和甘油、脂肪酸例如油酸和硬脂酸或者其酯、或者油例如油菜籽油和豆油，作为碳源；硫酸铵、硝酸钠、胨、氨基酸、玉米浆、糠、酵母提取液和类似物，作为氮源；硫酸镁、氯化钠、碳酸钙、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾和类似物，作为无机盐源；和麦芽汁、肉膏和类似物，作为其它营养源。作为本发明的又一个方面，actinol可以通过使上述微生物在levodione存在下在营养培养基中发酵来制备。
发酵可以在需氧条件下进行，一般在pH3-9的培养基中温育1-7天，发酵温度是10-40℃。
在发酵中使用的微生物可以是任何形式，例如通过菌株在液体培养基中发酵获得的培养物、从液体培养物中分离的细胞、通过处理细胞或培养物获得的干细胞、或固定化细胞。
下面的实施例详细说明了本发明。
实施例1
由0.5％1，4-环己烷二酮(结构类似于(6R)-2，2，6-三甲基环己烷二酮；用于筛选)、0.5％Tween20、0.1％硫酸铵、0.1％磷酸氢二钾、0.02％七水硫酸镁和0.02％酵母提取液组成的液体培养基(pH7.0)以5ml等份分配在试验试管中，然后在121℃灭菌20分钟。向各试管中加入大约0.3g土壤样品并在30℃培养24小时。用这样获得的培养物的0.1ml部分接种上述新试管培养基，重复该操作两次富集目的微生物。这样获得的富集培养物用盐水稀释并铺展在由上述相同成分组成的琼脂培养基上。同时，盐水中土壤悬浮液的上清液被适当稀释并且也同样铺展在琼脂培养基上。这些培养板在30℃温育48小时。平板上生长的菌落用来接种一个试管中由1.0％葡萄糖，0.3％磷酸氢二钾，0.02％七水硫酸镁，1.5％胨(Mikuni KagakuSangyo K.K.，4-1-6Muro-machi，Nihonbashi，Chuo-ku，日本东京)，0.2％氯化钠和0.1％酵母提取液(Nacalai Tesuque Inc.，Karasumaru Nishihairu，Nijohtouri，Nakakyoku，Kyoto，日本)组成的5ml液体培养基。试管在30℃温育24小时后，通过离心收集细胞并用盐水洗涤。这样获得的细胞用于接下来的筛选。除了上述微生物外，在营养培养基中已培养的微生物的空气风干细胞也用于筛选。
实施例2
制备含有0.6mg NAD(Oriental Yeast Co.，3-6-10Azusawa，Itabashi-ku，日本东京)，0.6mg NADP(Oriental Yeast Co.)，50mgD-葡萄糖和0.2mgD-葡萄糖脱氢酶(Amano Pharmaceutical Co.，1-2-7Nishiki，Naka-ku，Nagoya，日本)的反应混合物(pH7.0，0.1M磷酸钾缓冲液)。向1ml反应混合物中加入大约0.3g实施例1制备的细胞，接着加入足量(6R)-2，2，6-三甲基环己烷二酮，得到最终浓度是0.5％。然后将该反应混合物在振荡下在30℃温育24小时。温育后，反应混合物用1ml乙酸乙酯萃取并浓缩。通过气相色谱[柱子：HR-20M(Shinwa Chemical Ind.，Keishyo-cho50，Fushimi-ku，Kyoto，日本)0.25mm×30m，柱温：160℃(恒温)，注入温度：250℃，载体气体：He(大约1ml/分钟)]分析(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基-环己酮的产率和光学纯度。结果见表III。
                                     表III
  菌株名称   还原比例(％)   (4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基-环己酮的光学纯度(％e.e.)
  PlanococcusokeanokoitesAKU152(IFO15880)   42.3   56.7
  硫磺节杆菌AKU635(IFO12678)   64   44
  纤维单孢菌属AKU672(FERM BP-6449)   73   78.3
  水生棒杆菌AKU610(FERM BP-6447)   93.7   85.9
  水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)   97.4   87.7
实施例3
通过使用表III给出的微生物解释向反应混合物加入NAD或NADP的作用。基础反应混合物含有除了NAD和NADP以外所有的实施例2中描述的成分。本实施例中使用的微生物的细胞是空气干燥的，并且将10mg细胞质混合到反应混合物中。反应在30℃进行24小时。结果见表IV，其中光学纯度值(％e.e.)适用于(4R，6R)-异构体，在表V(实施例4)和VI(实施例5)的情况下也是如此。
                                             表IV
                                    加入辅因子
         NAD          NADP            无
  菌株名称   还原比例(％)   光学纯度(％e.e.)   还原比例(％)   光学纯度(％e.e.)   还原比例(％)   光学纯度(％e.e)
  PlanococcusokeanokoitesAKU152(IFO15880)   89.3   60.4   65.4   54.7   63.4   58.2
  硫磺节杆菌AKU635(IFO12678)   82.7   24   66.5   -7.3   56.5   -9.5
  纤维单孢菌属AKU672(FERM BP-6449)   59.2   67.1   30.1   21.6   24.8   25.7
  水生棒杆菌AKU610(FERM BP-6447)   62.5   87.4   60   85.3   17   52.1
  水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)   96.8   93.9   85.3   88.5   92.5   89.1
实施例4
通过使用表III中给出的微生物解释反应混合物中加入各种表面活性剂的影响(终浓度：0.1w/v％)。基础反应混合物含有实施例2中描述的所有成分。本实施例中使用的微生物的细胞是空气干燥的，并且将10mg细胞质混合到反应混合物中。反应在30℃进行24小时。结果见表V。
                                             表V
                                   表面活性剂
          无          Tween20          Tween40
  菌株名称   还原比例(％)   光学纯度(％e.e.)   还原比例(％)   光学纯度(％e.e.)   还原比例(％)   光学纯度(％e.e.)
  PlanococcusokeanokoitesAKU152(IFO15880)   53.9   51.6   78.1   63.4   63.9   57.7
  硫磺节杆菌AKU635(IFO12678)   73.4   25.1   86.8   38.6   82.4   33.8
  纤维单孢菌属AKU672(FERM BP-6449)   32.3   80   32.1   86.2   没有测定(n.m.)   n.m.
  水生棒杆菌AKU610(FERM BP-6447)   58.9   87.6   71.7   89.3   n.m.   n.m.
  水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)   85.7   92.6   97.5   93.7   n.m.   n.m.
                                    表V(续)
                    表面活性剂
        Span20         Span80
  菌株名称   还原比例(％)   光学纯度(％e.e.)   还原比例(％)   光学纯度(％e.e.)
  Planococcus okeanokoites AKU152(IFO15880)   71.4   65.7   57.3   57.3
  硫磺节杆菌AKU635(IFO12678)   78.5   49.9   65.2   32
  纤维单孢菌属AKU672(FERM BP-6449)   22.2   66.2   38   78.1
  水生棒杆菌AKU610(FERM BP-6447)   64.6   89.9   83   87.3
  水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)   96.7   94   88.8   93.2
实施例5
解释底物浓度在0.5，1.0和1.5％浓度时对反应的影响。基础反应混合物含有实施例2中描述的所有成分。本实施例中水生棒杆菌AKU611(FERMBP-6448)的细胞是空气干燥的，并且将10mg该细胞质混合到反应混合物中。反应在30℃进行24小时。结果见表VI。
                             表VI
  底物浓度(％)   还原比例(％)   光学纯度(％e.e.)   产物浓度(％)
  0.5   92.2   93.0   0.46
  1.0   73.1   92.9   0.73
  1.5   66.3   92.8   0.99
实施例6
用30升罐发酵器，以400rpm搅拌和每分钟通气0.5升下在20升由0.1％酵母提取液、1.5％胨、2.0％D-葡萄糖、0.02％七水硫酸镁、0.3％磷酸氢二钾和0.2％氯化钠组成的培养基中将水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)在30℃培养24小时。此后通过以5000g离心5分钟从培养物中收集细胞。这样获得的细胞膏状物重量是400g。
然后向细胞膏状物加入12g levodione和120gD-葡萄糖，并且加入离子交换的水使体积达2.4升。用2.0％氢氧化钠溶液调节pH至7.0。反应混合物转移到2升烧瓶中并且以220rpm振荡下在30℃温育15小时。温育后，通过以12000g离心5分钟分离反应混合物。这样获得的反应混合物的体积是2.2升，光学纯度，产率和actinol浓度分别是96％e.e.，93％和4.6g/l。
实施例7
根据实施例6所述制备的反应混合物(10升)与乙酸乙酯(10升)混合以萃取actinol。分离乙酸乙酯相(7.5升)，并且向其中加入350g活性炭使其脱色。搅拌10分钟后，过滤去除碳粉。向6.5升乙酸乙酯溶液中加入600g无水硫酸钠来脱水。搅拌几分钟后过滤去除硫酸钠。30℃减压下将乙酸乙酯溶液(6.0升)浓缩到50ml。向这样获得的浓缩液中加入5升正己烷，混合物搅拌5分钟后冷却到5℃，并在该温度下保持12小时以结晶actinol。过滤收集结晶的actinol后干燥。这样获得的actinol结晶重量是32g，actinol的纯度、光学纯度和产率分别是96％、96％e.e.和70％。
实施例8
将水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)的种子培养肉汤(150ml)接种到由0.1％酵母提取液、1.5％胨、2.0％葡萄糖、0.02％七水硫酸镁、0.3％磷酸氢二钾、0.2％氯化钠和0.3％levodione组成的3升发酵培养基中。发酵用5升罐发酵器，以250rpm搅拌和每分钟通气1.5升下在30℃进行48小时。通入NH3气体将发酵肉汤的pH控制在7.0。发酵后，通过以12000g离心5分钟取出肉汤并且收集细胞。肉汤中actinol的光学纯度、产率和浓度分别是96％e.e.、71％和2.1g/l。

Claims (7)

1.制备(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮的方法，包括使(6R)-2，2，6-三甲基环己烷二酮与一种微生物接触，该微生物选自纤维单孢菌属(Cellulomonas sp.)FERM BP-6449、水生棒状杆菌FERM BP-6447或水生棒状杆菌FERM BP-6448，并能将(6R)-2，2，6-三甲基环己烷二酮选择性不对称还原为(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮，然后从反应混合物回收得到的(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮。
2.权利要求1的方法，其中所述微生物是水生棒状杆菌FERM BP-6448。
3.权利要求1-2任一项的方法，其中选择性不对称还原作用在NAD、NADP、或NAD或NADP与葡萄糖和GDH的存在下实现。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中选择性不对称还原作用在表面活性剂存在下实现。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中选择性不对称还原作用在pH4-9范围，温度在20-50℃范围，和10分钟至80小时条件下实现。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中从反应混合物中回收(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮是通过用乙酸乙酯萃取(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮并且将得到的萃取液浓缩以获得(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮结晶。
7.纤维单孢菌属(Cellulomonas sp.)FERM BP-6449。
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