NO319415B1

NO319415B1 - Mikrobiell fremstilling av actinol

Info

Publication number: NO319415B1
Application number: NO19993987A
Authority: NO
Inventors: Sakaya Shimizu; Masaru Wada
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 1998-08-19
Filing date: 1999-08-18
Publication date: 2005-08-08
Also published as: NO993987L; US6444460B1; AU4455399A; EP0982406A3; DE69930031D1; AU753590B2; CN1246466C; JP2000069986A; CA2280350A1; ATE318925T1; JP3897489B2; DE69930031T2; NO993987D0; TWI229697B; KR100602296B1; BR9903739A; KR20000017373A; CN1254760A; EP0982406B1; EP0982406A2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for mikrobiell fremstilling av (4R,6R)-4-hydroksy-2,2,6-trimetyl-cykloheksanon (nedenfor referert til som aktinol) fra (6R)-2,2,6-trimetylcykloheksandion (nedenfor referert til som levodion) samt mikroorganismer for dette formål. Aktinol er anvendelig for syntesen av karotenoider så som zeaksan-tin. Mer spesielt angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for mikrobiell fremstilling av aktinol ved å an-vende en spesifikk mikroorganisme som er i stand til selektivt asymmetrisk å redusere karbonylgruppen ved C-4-posi-sjonen hos levodion.

Aktinol har tidligere blitt fremstilt ved optisk resolusjon av den diastereomeriske blanding av aktinol. En slik fremgangsmåte krever imidlertid hydrogenering av levodion med metallkatalysatorer og etterfølgende optisk resolusjon på kjemisk måte med atskillelsesmidler så som maleinsyrean-hydrid (T. Ohashi et al., referater fra symposiet "Molecu-lar Chirality 1996" holdt 30. og 31. mai 1996 i Tokyo, Japan, på side 47 - 50, "Practical Syntheses using Biocata-lysts"). Følgelig er denne prosess ikke økonomisk gunstig for industrielle formål.

Prosesser med enzymatisk fremstilling av aktinol fra levodion er i og for seg kjent. For eksempel er Bacillus thermophilus i stand til å omdanne rasemisk dihydrooksoiso-foron til 4 isomere av 4-hydroksy-2,2,6-trimetylcyklohek-sanon, dvs. til cis-(4R,6S)-, cis-(4S,6R)-, trans-(4R,6R)-og trans-(4S,6S)-isomerene. Det resulterende kvantitative forhold mellom disse isomere er 68:25:5:2 (J-Biotechnol., 9(2), 117-128,1989). Følgelig er innholdet av (4R,6R)-iso-meren aktinol bare 5% av de totale isomere og denne prosess er heller ikke økonomisk gunstig for industrielle formål.

Som et resultat av utstrakte studier angående selektiv asymmetrisk reduksjon av levodion, har det blitt funnet at aktinol kan bli fremstilt effektivt fra levodion ved selektiv asymmetrisk reduksjon ved å bruke visse mikroorganismer fulgt av gjenvinning av aktinolforbindelsen fra reaksjonsblandingen. Foreliggende oppfinnelse er basert på dette funn.

Følgelig fremskaffer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av aktinol som omfatter å sette levodion i kontakt med en mikroorganisme som er valgt fra gruppen omfattende mikroorganismer av artene Cellulomonas, Cor-ynebackterium, Planococcus og Arthrobacter og som er i stand til selektiv asymmetrisk reduksjon av levodion til aktinol, og gjenvinne det resulterende aktinol fra reaksjonsblandingen.

En utvelgelse ble utført ved å bruke en i og for seg kjent metode. For eksempel blir en mikroorganisme dyrket i et næringsmedium inneholdende sakkarider så som glukose og sakkarose, alkoholer så som etanol og glyserol, fettsyrer så som oleinsyre og stearinsyre eller estere derav eller oljer så som rapsfrøolje og soyabønneolje som karbonkilder; ammoniumsulfat, natriumnitrat, pepton, aminosyrer, mais-sirup, kli, gjærekstrakt og lignende som nitrogenkilder; magnesiumsulfat, natriumklorid, kalsiumkarbonat, kaliummo-nohydrogenfosfat, kaliumdihydrogenfosfat og lignende som uorganiske saltkilder; og maltekstrakt, kjøttekstrakt og lignende som andre næringsmiddelkilder ved en konvensjonell metode for å fremskaffe celler. Virkningen kan bli utført aerobisk, normalt over en dyrkningsperiode på 1 - 7 dager ved en medium-pH på 3 - 9, samt en dyrkningstemperatur på 10 - 40°C. Etter dyrkningen blir de resulterende celler samlet opp ved sentrifugering eller filtrering. Cellene således fremstilt og levodion blir brakt (satt i kontakt) sammen i et oppløsningsmiddel så som vann, kaliumfosfatbuffer, acetonitril, etanol og lignende, og en reaksjon blir startet opp under passende reaksjonsbetingelser (levodion-konsentrasjon: 400 - 2000 mg/g tørrceller/1, pH-område: 4 - 9, temperaturområde: 20 - 50°C, reaksjonsperiode: 10 minutter - 80 timer). Reaksjonsblandingen ekstraheres med et organisk oppløsningsmiddel så som etylacetat, n-heksan, toluen, n-butylacetat og lignende. Den ekstraherte oppløs-ning utsettes for en passende kromatografi for å måle pro-duktiviteten av aktinol.

Som et resultat av utvelgelsen har det blitt funnet at mikroorganismer som tilhører artene Cellulomonas, Corynebacterium, Planococcus og Arthrobacter er i stand til selektiv asymmetrisk reduksjon av levodion. Spesielt er slike foretrukne mikroorganismer Cellulomonas sp. AKU672, Corynebacterium aquaticum AKU610, Corynebacterium aquaticum AKU611, Planococcus okeanokoites AKU152 og Arthrobacter sulfureus AKU635, og spesielt de første tre mikroorganismer. Av de fem nevnte mikroorganismer er Corynebacterium aquaticum AKU611 den mest foretrukne.

Mikroorganismene Cellulomonas sp. AKU672, Corynebacterium aquaticum AKU610 og Corynebacterium aquaticum AKU611 ble isolert fra jordprøver samlet ved Lake Manahime, Fukui Pre-fecture, Japan. Disse mikroorganismer ble deponert hos the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan den 4. august 1998 under Budapestkonvensjonen og har de følgende betegnelser:

Cellulomonas sp. AKU672(FERM BP-6449)

Corynebacterium aquaticum AKU610(FERM BP-6447)

Cory/jejbacteriujn aguaticujn AKU611 {FERM BP-6448)

Disse tre mikroorganismer er nye og representerer et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse.

Planococcus okeanaokoites AKU152 (IFO 15880) ble deponert hos Institute for Fermentation, Osaka, Japan den 14, juni 1967.

Arthrobacter sulfureus AKU635 (IFO 12678) ble deponert hos Institute for Fermentation, Osaka, Japan 31. juli 1968.

Den ovennevnte stamme av AKU672(FERM BP-6449) har de føl-gende taksonomiske egenskaper:

Typisk pleomorfi av stamme Cellulomonas sp. AKU672 ble funnet ved elektronmikroskopobservasjon. En gammel kultur av stammen var coccoidal som vist i fig. 1. I unge kulturer var uregelmessige staver dominante (fig. 2). De morfolo-giske, fysiologiske og biokjemiske karakteristika av stammen er oppsummert i tabell I og II.

Stammen Cellulomonas sp. AKU672 er gram-positiv og aerobisk og kan bli klassifisert til å tilhøre gruppen "koryneforme bakterier". Denne stammen var bevegelsesdyktig med et fla-gellum. Ornitin ble funnet i celleveggen som hovedamino-syre. Dets innhold ifølge gasskromatografi (GC) ble funnet å være 74,7%. Bøyningslignende celledeling ble observert. Stammen produserte syre fra et stort antall sukre uten gassdannelse i 4 dager. Denne stamme viste ikke cellulolytisk aktivitet.

Klassifiseringen av koryneforme bakterier er ikke godt eta-blert. Nylig foreslo Yamada og Komagata

[J.Gen.Appl.Microbiol., 18,417(1992)] å klassifisere de koryneforme bakterier i syv grupper avhengig av hovedtypen celledeling, celleveggsammensetning og DNA-innhold i henhold til GC. De atskilte Gruppe 4 fra andre grupper til tross for mangelen på cellulolytisk aktivitet. Bakterier hos denne gruppe oppviser en bøyende type celledeling og hovedaminosyren i celleveggen er ornitin. Deres innhold i henhold til GC er fordelt i et smalt og høyt område fra 71 til 73%. Disse bakterier danner syre fermentativt fra et stort antall sukre. I henhold til deres forslag burde stammen Cellulomonas sp. AKU672, som ikke viste cellulolytisk aktivitet tilhøre Gruppe 4. Andre karakteristika hos stammen ved klassifisering sammenfalt godt med dem hos Gruppe 4 og således har den forsøksvis blitt gitt navnet Cellulomonas sp. AKU672.

De ovennevnte stammer AKU610 og AKU611 har de følgende taksonomiske egenskaper:

1) Veksttemperatur 15-40°C

2) Optimal temperatur for vekst 30°C

3) Obligatorisk aerob og gram-negativ mikroorganisme

4) Sporedannelse Ingen

5) Polymorfi og tradisjonelle stav-coccer kan bli observert under dyrkning

6) Bevegelighet Ingen

Videre ble stammene Corynebacterium aquaticum AKU610 og AKU611 identifisert som sådan basert på assimileringen på forskjellige karbonkilder av biologsystemet (Biolog Inc., 3447 Investment Blvd., Suite 3, Hayward, California 94545, USA: Nature Vol. 339, 157-158, May 11, 1989) som følger: Celler fra hver stamme ble inokulert med 96-brønners mikro-titerplater og inkubert i 24 timer ved 28°C. Hver brønn inneholdt en av 96 typer karbonkilder i BUGM+B medium (Biolog Universal Growth Media + blood; Biolog Inc.).

Etter inkubering viste hver stamme den følgende assimiler-ing av karbonkilder:

Fra de ovennevnte kilder blir begge stammer identifisert som Corynebacterium aquaticum og betegnet henholdsvis Corynebacterium aquaticum AKU610 og AKU611.

Andre mikroorganismer nevnt ovenfor er tilgjengelige fra offentlige deponeringsinstitusjoner (kultursamlinger) til enhver ved henvendelse, så som the Institute of Fermentation Osaka, Japan (IFO). Eksempler på slike deponerte stammer er Planococcus okeanokoites AKU152 (IFO 15880) og Arthrobacter sulfureus AKU635 (IFO 12678).

Den selektivt asymmetriske reduksjonsprosess ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli utført porsjonsvis, semipor-sjonsvis eller kontinuerlig i vann eller generelt i et opp-løsningsmedium som er blandbart med vann, øker levodionopp-løselighet og er inert i forhold til enzymreaksjonen så som 0,01 til 0,5M kaliumfosfatbuffer, en annen buffer med pH-område 4 til 10, acetonitril, etanol eller N,N-dimetylfor-mamid. Konsentrasjonen av levodion er passende 400 til 2000 mg/lg tørrceller/1, fortrinnsvis 400 til 800 mg/lg tørrceller/1. Den selektive asymmetriske reduksjonsprosess kan bli utført i pH-området fra 4 til 9, fortrinnsvis fra 6 til 7 i et temperaturområde fra 20 til 50°C, fortrinnsvis 30 til 40°C, og i 10 minutter til 80 timer, fortrinnsvis i

8 timer til 24 timer.

Den selektive asymmetriske reduksjonsprosess ifølge foreliggende oppfinnelse blir passende utført i nærvær av en ko-faktor så som nikotinamidadenin-dinukleotid(NAD), niko-tinamidadenin-dinukleotidfosfat(NADP), eller nevnte ko-faktor med glukose og glukosedehydrogenase(GDH). Konsentrasjonen av en slik ko-faktor i reaksjonsmediet er fortrinnsvis 300 mM/1 eller mer, mer foretrukket fra 700 mM/1 til 900 mM/1. Videre kan utbyttet av aktinol bli øket ved til-setning av et overflateaktivt middel til reaksjonsblandingen. Span®, Span® 80, Tween® 20, Tween® 40 (alle tilgjengelige fra Wako Pure Chemical Ind.,3-1-2 Dosho-machi, Osaka, Japan) og lignende er eksempler på overflateaktive midler som kan bli benyttet. Mengden av overflateaktivt middel i reaksjonsmediet er passende 2 til 20 mM/1, fortrinnsvis omkring 8 mM/1.

Etter at selektiv asymmetrisk reduksjon har blitt utført kan aktinolet således fremstilt bli gjenvunnet ved ekstrak-sjon med vann-uoppløselig (vann-ublandbart) organisk opp-løsningsmiddel som lett solubiliserer aktinol, så som etylacetat, n-heksan, toluen eller n-butylacetat. Ytterligere opprenskning av aktinol kan bli utført ved å konsentrere ekstraktet for direkte å krystallisere aktinolet eller ved kombinasjonen av forskjellige typer kromatografi så som tynnskikts-kromatografi, adsorpsjons-kromatografi, ione-bytte-kromatografi og/eller gelfiltrerings-kromatografi. Om nødvendig kan høyeffekts væskekromatografi også bli benyttet. En foretrukket gjenvinning som fører til krystaller av aktinol involverer å ekstrahere aktinolet med etylacetat og konsentrere ekstraktet for å danne krystaller av aktinol.

Som et alternativ til den ovenfor beskrevne "hvilende cel-lereaksjon"-teknikken kan aktinol bli fremstilt ved fermentering av de ovennevnte mikroorganismer i et næringsmiddelmedium ved nærvær av levodion, dvs. i en "voksende cellere-aksjon". Begge alternativer er omfattet av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Som næringsmiddelmedium i den "voksende cellereaksjons"-teknikk kan det bli benyttet slike som inneholder sakkarider så som glukose og sakkarose, alkoholer så som etanol og glyserol, fettsyrer så som oleinsyre og stearinsyre eller estere derav eller oljer så som rapsfrøolje og soyabønne-olje som karbonkilder; ammoniumsulfat; natriumnitrat; pepton; aminosyrer; maisuttrekksvæske; kli; gjærekstrakt og lignende som nitrogenkilder; magnesiumsulfat, natriumklorid, kalsiumkarbonat, kalium-monohydrogenfosfat, kalium-di-hydrogenfosfat og lignende som uorganiske salter; og maltekstrakt, kjøttekstrakt og lignende som kilder for andre næringsmidler. Som et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse kan aktinol bli fremstilt ved fermentering av de ovennevnte mikroorganismer i et næringsmiddelmedium ved nærvær av levodion.

Fermenteringen kan bli utført aerobisk, normalt i en inku-beringsperiode på 1 til 7 dager ved en medium-pH på 3 til 9 og en fermenteringstemperatur på 10 til 40°C.

Mikroorganismene som skal bli brukt i fermenteringen kan være i enhver form, for eksempel kulturer fremstilt ved fermentering av stamme i flytende medium, celler atskilt fra flytende kulturer, tørkede celler fremstilt ved å pro-sessere celler eller kulturer eller immobiliserte celler.

De følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 1

Et flytende medium (pH 7,0) bestående av 0,5% 1,4-cyklohek-sandion (strukturelt analog med (6R)-2,2,6-trimetylcyklo-heksandion; benyttet for utvelgelsen), 0,5% Tween® 20, 0,1% (NH4)2SCU, 0,1% K2HP04, 0,02% MgS04»7H20 og 0,02% gjærekstrakt ble dispergert i 5 ml porsjoner i forsøksrør og så sterilisert ved 121°C i 20 minutter. Omkring 0,3 g jord-prøve ble innført i hvert av disse rør og dyrket i 24 timer ved 30°C. En 0,1 ml porsjon av kulturen således fremstilt ble brukt for å inokulere ferskt forsøksrørmedium som ovenfor, og denne operasjonen ble gjentatt to ganger for å an-rike objektive mikroorganismer. Den anrikede kultur således fremstilt ble fortynnet med fysiologisk saltvann og spredd på et agar-medium bestående av samme bestanddeler som ovenfor. På lignende måte ble supernatanten av jord-suspensjonen i fysiologisk saltvann passende fortynnet og også spredt på agar-mediet. Platene ble inkubert i 4 8 timer ved 30°C. Dyrkede kolonier på platene ble benyttet for å inokulere 5 ml flytende medium (pH 7,0) bestående av 1,0% glukose, 0,3% K2HP04, 0,02% MgS04«7H20, 1,5% pepton (Mikuni Kagaku Sangyo K.K., 4-1-6 Muro-machi, Nihonbashi, Chuo-ku, Tokyo, Japan), 0,2% NaCl og 0,1% gjærekstrakt (Nacalai Tesuque Inc., Karasumaru Nishihairu, Nijohtouri, Nakakyo-ku, Kyoto, Japan) i et rør. Etter at rørene hadde blitt inkubert ved 30°C i 24 timer ble cellene samlet opp ved sentrifugering og vasket med fysiologisk saltvann. Cellene således fremstilt ble utsatt for påfølgende undersøkelse.

I tillegg til de ovennevnte mikroorganismer ble lufttørkede celler av mikroorganismene som hadde blitt dyrket i et næringsmiddelmedium også brukt for undersøkelsen.

Eksempel 2

En reaksjonsblanding (pH 7,0 i 0,1 M kaliumfosfatbuffer) inneholdende 0,6 mg NAD (Oriental Yeast Co., 3-6-10 Azu-sawa, Itabashi-ku, Tokyo, Japan), 0,6 mg NADP (Oriental Yeast Co.,) 50 mg D-glukose og 0,2 mg D-glukosedehydrogenase

(Amano Pharmaceutical Co., 1,2,7 Nishiki, Naka-ku, Nagoya, Japan) ble fremstilt. Omkring 0,3 g av cellene adskilt i eksempel 1 ble satt til 1 ml av reaksjonsblandingen fulgt av en tilstrekkelig mengde (6R)-2,2,6-trimetylcykloheksan-dion for å gi en sluttkonsentrasjon på 0,5%. Reaksjonsblandingen ble så inkubert med risting i 24 timer ved 30°C. Etter inkuberingen ble reaksjonsblandingen ekstrahert med 1 ml etylacetat og konsentrert. Utbyttet og den optiske renhet av (4R,6R)-4-hydroksy-2,2,6-trimetyl-cykloheksanon ble analysert med gasskromatografi [kolonne:HR-20M(Shinwa Chemical Ind., Keishyo-cho 50, Fushimi-ku, Kyoto, Japan) 0,25 mm<j> x 30m, kolonnetemperatur: 160°C (konstant), injek-tortemperatur: 250°C, bæregass: He (omtrent 1 ml/min)]. Resultatene er vist i tabell III.

Eksempel 3

Effekten av tilsetningen av NAD eller NADP til reaksjonsblandingen ble funnet ved å bruke mikroorganismene gitt i

tabell III. Den grunnleggende reaksjonsblanding inneholdt alle komponentene beskrevet i eksempel 2 bortsett fra NAD og NADP. Cellene av mikroorganismene benyttet i foreliggende eksempel ble lufttørket og 10 mg av cellemassen ble inkorporert i reaksjonsblandingen. Reaksjonen ble utført

ved 30°C i 24 timer. Resultatene er vist i tabell IV hvor de optiske renhets-(% e.e.)verdier angår {4R,6R)-isomeren, noe som også er tilfelle i tabell V (eksempel 4) og VI (eksempel 5) .

Eksempel 4

Effekten av tilsetningen av forskjellige overflateaktige midler (endelig konsentrasjon: 0,1 w/v%) i reaksjonsblandingen ble funnet ved å bruke mikroorganismene gitt i tabell III. Den grunnleggende reaksjonsblanding inneholdt alle komponentene beskrevet i eksempel 2. Cellene av mikroorganismene benyttet i foreliggende eksempel ble luft-tørket og 10 mg av cellemassen ble inkorporert i reaksjonsblandingen. Reaksjonen ble utført ved 30°C i 24 timer. Resultatene er gitt i tabell V.

Eksempel 5

Innvirkningen av substratkonsentrasjonen på reaksjonen ble funnet ved konsentrasjoner på 0,5, 1,0 og 1,5%. Den grunnleggende reaksjonsblanding inneholdt alle komponentene beskrevet i eksempel 2. I foreliggende eksempel ble cellene av Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448) lufttør-ket, og 10 mg av cellemassen ble inkorporert i reaksjonsblandingen. Reaksjonen ble utført ved 30°C i 24 timer. Resultatene er gitt i tabell VI.

Eksempel 6

Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448) ble dyrket i 24 timer ved 30°C i 20 1 av kulturmediet bestående av 0,1% gjærekstrakt, 1,5% pepton, 2,0% D-glukose, 0,02% MgS04*7H2O, 0,3% K2HP04 og 0,2% NaCl ved å bruke en 30 1 krukkefermentator med omrøring ved 400 rpm og aerering på 0,5 1 pr. minutt. Celler ble samlet opp fra kulturen ved sentrering ved 5000 g 5 minutter senere. Vekten av celle-pastaen således fremstilt var 400 g.

Derpå ble 12 g levodion og 120 g D-glukose tilsatt til cel-lepastaen, og volumet ble brakt til 2,4 1 med ionebyttet vann. pH ble justert til 7,0 med 2,0% NaOH-oppløsning. Reaksjonsblandingen ble overført til en 2-liters flaske og inkubert ved 30°C i 15 timer med risting ved 220 rpm. Etter inkuberingen ble reaksjonsblandingen separert med sentrifugering ved 12000 g i 5 minutter. Volumet av reaksjonsblandingen således fremstilt var 2,2 1 og den optiske renhet, utbytte av konsentrasjonen av aktinol var henholdsvis 96% e.e., 93% og 4,6 g/l.

Eksempel 7

Reaksjonsblandingen (10 1), fremstilt som beskrevet i eksempel 6 ble blandet med etylacetat (10 1) for å ekstrahere aktinol. Etylacetatfasen (7,5 1) ble atskilt og 350 g av aktivt karbonpulver ble tilsatt til denne for å avfarge den. Etter 10 minutters omrøring ble karbonpulveret fjernet med filtrering. 600 g vannfri Na2S04 ble tilsatt til de 6,5 1 av etylacetatoppløsning for dehydrering. Etter et par minutters omrøring ble Na2S04 fjernet med filtrering. Etylacetatoppløsningen (6,0 1) ble konsentrert til 50 ml under redusert trykk ved 30°C. Til det således fremstilte konsentrat ble det tilsatt 5 1 n-heksan, og blandingen ble omrørt i 5 minutter og derpå avkjølt til 5°C og holdt ved denne temperaturen i 12 timer for å rekrystallisere aktinol. Det krystalliserte aktinol ble samlet opp ved filtrering og så tørket. Vekten av aktinolkrystaller således fremstilt var 32 g og renheten, den optiske renhet og utbytte av aktinol var henholdsvis 96%, 96% e.e. og 70%.

Eksempel 8

Utsåingsdyrkningsmedium (150 ml) av Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448) ble inokulert i 3 1 fermente-ringsmedium bestående av 0,1% gjærekstrakt, 1,5% pepton, 2,0% glukose, 0,02% MgS04»7H20, 0,3%K2HPO4, 0,2% NaCl og 0,3% levodion. Fermenteringen ble utført i 48 timer ved 30°C ved å bruke en 5 liters krukkefermentator ved omrøring ved 250 rpm og aerering på 1,5 1 pr. minutt. pH av fermen-teringsmediet ble kontrollert ved 7,0 ved NH3-gass. Etter fermenteringen ble mediet fjernet og cellene ble samlet opp ved sentrifugering ved 12000 g i 5 minutter. Den optiske renhet, utbyttet og konsentrasjonen av aktinol i mediet var henholdsvis 96% e.e., 71% og 2,1 g/l.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av (4R,6R)-4-hydroksy-2,2,6-trimetylcykloheksanon karakterisert ved at den omfatter å sette (6R)-2,2,6-trimetylcykloheksandion i kontakt med en mikroorganisme som er valgt fra gruppen omfattende mikroorganismer fra slektene Cellulomonas, Corynebacterium, Planococcus og Arthrobacter og som er i stand til selektivt asymmetrisk reduksjon av (6R)-2,2,6-trimetylcykloheksandion til (4R,6R)-4-hydroksy-2,2,6-trimetylcykloheksanon, og gjenvin-ner den resulterende (4R,6R)-4-hydroksy-2,2,6-trimetylcyk-loheksanon fra reaksjonsblandingen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mikroorganismen er valgt fra gruppen omfattende Cellulomonas sp. AKU672 {FERM BP-6449), Corynebacterium aquaticum AKU610 (FERM BP-6447), Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448) og fortrinnsvis Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at mikroorganismen er Planococcus okeanokoites AKU152 (IFO 15880) eller Arthrobacter sulfureus AKU635(IFO 12678).

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at den selektive asymmetriske reduksjon utføres ved nærvær av NAD, NADP, eller NAD eller NADP med glukose og GDH.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 4, karakterisert ved at den selektive asymmetriske reduksjon utføres ved nærvær av et overflateaktivt middel.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 5, karakterisert ved at den selektive asymmetriske reduksjon utføres i et pH-område fra 4 til 9, i et temperaturområde fra 20 til 50<C>C, og i 10 minutter til 80 timer.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 6, karakterisert ved at gjenvinningen av det resulterende (4R,6R)-4-hydroksy-2,2,6-trimetylcykloheksanon fra reaksjonsblandingen utføres ved å ekstrahere (4R,6R)-4-hydroksy-2,2,6-trimetylcykloheksanon med etylacetat og å konsentrere det resulterende ekstrakt for å danne krystaller av (4R,6R)-4-hydroksy-2,2,6-trimetylcykloheksanon.

8. Mikroorganisme karakterisert ved at den er Cellulomonas sp. AKU672 (FERM BP-6449), Corynebacterium aquaticum AKU610 (FERM BP-6447) og Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448).