JP3897489B2 - アクチノールの微生物による産生 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサンジオン（以後レボジオンと記載する）からの（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノン（以後アクチノールと記載する）の微生物による生産方法に関する。アクチノールは、ゼアキサンチンのようなカロテノイドの合成に有用である。より詳細には、本発明は、レボジオンのＣ−４位のカルボニル基を選択的に不斉還元することができる特定の微生物を利用した、微生物によるアクチノールの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来アクチノールは、アクチノールのジアステレオ異性体混合物の光学分割により調製されてきた。しかし、この方法は、金属触媒によるレボジオンの水素化と、それに続く無水マレイン酸のような分割剤を用いた化学的手段での光学分割を必要とする（T.Ohashiら、“分子キラリティー１９９６”紀要（the proceedings of the symposium“Molecular Chirality 1996”）１９９６年５月３０日と３１日開催、東京、日本、４７〜５０ページ、“生物触媒を利用した実用的合成（Practical Syntheses using Biocatalysts））。そのため、この方法は工業目的には経済的に実用的でない。
【０００３】
レボジオン自体からアクチノールを酵素的に調製する方法は公知である。例えば、Bacillus thermophilusは、ラセミ体のジヒドロオキソイソホロンを、４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンの４種類の異性体、すなわちシス（４Ｒ，６Ｓ）−、シス（４Ｓ，６Ｒ）−、トランス−（４Ｒ，６Ｒ）−、及びトランス−（４Ｓ，６Ｓ）−異性体に変換することができる。得られたこれら異性体の量比は６８：２５：５：２である（J. Biotechnol., 9 (2), 117-128, 1989）。したがって、（４Ｒ，６Ｒ）−異性体、アクチノールの含有量は、全異性体の５％に過ぎず、この方法もまた、工業目的には経済的に実用的でない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
レボジオンの選択的不斉還元に関する精力的な研究の結果、今回ある種の微生物を利用した選択的不斉還元と、それに続く反応混合液からの回収により、アクチノールをレボジオンから効率的に得ることができることが見出された。本発明はこの発見に基づく。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、アクチノールの製造方法であって、レボジオンを、Cellulomonas属、Corynebacterium属、Planococcus属及びArthrobacter属からなる微生物群より選択され、かつレボジオンをアクチノールに選択的に不斉還元することができる微生物と接触せしめ、生成したアクチノールをその反応混合物から回収する方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
スクリーニングは、それ自体公知の方法にて実施した。例えば、微生物は、炭素源としてグルコース及びショ糖のような糖類、エタノール及びグリセロールのようなアルコール、オレイン酸及びステアリン酸のような脂肪酸もしくはそのエステル、又はナタネ油及びダイズ油のような油；窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、アミノ酸、コーン浸漬液、ふすま、酵母抽出液など；無機塩源として硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウムなど；その他の栄養源として麦芽エキスや肉エキスなどを含む栄養培地中、通常の方法で培養した。培養は、好気性条件下、通常は、pH３〜９の培地で１〜７日間の期間、１０〜４０℃の培養温度で行うことができる。培養後、細胞は遠心分離又は濾過により集められる。こうして得た細胞とレボジオンは、水、リン酸カリウム緩衝液、アセトニトリル、エタノールなどの溶媒中で一緒にし（接触）、適当な反応条件下（レボジオン濃度：４００〜２，０００mg/g乾燥細胞／リットル、pH域：４〜９、温度域：２０〜５０℃、反応期間：１０分〜８０時間）で反応を開始させる。反応混合物を酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、トルエン、酢酸ｎ−ブチルなどの有機溶媒で抽出した。抽出液を適当なクロマトグラフィーにかけ、アクチノールの生産性を測定する。
【０００７】
スクリーニングの結果、Cellulomonas属、Corynebacterium属、Planococcus属及びArthrobacter属に属する微生物が、レボジオンを選択的に不斉還元することができることを発見した。特に好適な微生物は、Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１、Planococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２及びArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５であり、特に先頭から３種類の微生物が好適である。上記５種類の微生物のうち、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１が、最も好ましい。
【０００８】
微生物Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０、及びCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１は、日本国、福井県の真名姫湖で採取した土壌サンプルより分離された。これら微生物は、ブダベスト条約に従い、次の名称により１９９８年、８月４日に日本の工業技術院生命工学工業技術研究所（the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology）に寄託された。
Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４９）
Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４７）
Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）
【０００９】
これら３種類の微生物、並びにPlanococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２及びArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５は新規であり、本発明の更なる面を表す。
【００１０】
上記の株ＡＫＵ６７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４９）は以下の分類上の特徴を有する：
【００１１】
Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株の典型的な多型性は、電子顕微鏡による観察で認められる。当該株の古い培養体は、図１に示す如く球状であった。Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株は、栄養寒天斜面培地上、２８℃で４日間生育させた。洗浄した細胞を真空下で乾燥し、クロムでシャドウイングした。若い培養株では、不規則な桿状細胞が多く見られた（図２）。細胞は、栄養ブロス上で培養した。当該株の形態学的、生理学的そして生化学的特徴を表ＩとIIにまとめた。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【表２】
【００１４】
Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株は、グラム陽性の好気性で、“コリネフォルム細菌”（coryneform bacteria）の群に属するものとして分類できる。この株は、１本の鞭毛を有する運動性である。細胞壁内には主要アミノ酸としてオルニチンが認められた。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による含有量は、７４．７％であった。屈曲型（bending like）細胞分裂が観察された。この株は、４日間広い範囲の糖からガス形成なしに酸を産生した。この株はセルロース分解性を示さなかった。
【００１５】
コリネフォルム細菌の分類は十分に確立されていない。最近、YamadaとKomagata〔J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 417 (1992)〕は、細胞分裂の基本形、細胞壁の組成とＧＣによるＤＮＡ含有量に基づいて、コリネフォルム細菌を７つの群に分類することを提言した。かれらは、セルロース分解性の欠如にもかかわらず、他の群から第４群を区別した。この群の細菌の細胞分裂は屈曲型で、細胞壁中の主要アミノ酸はオルニチンである。ＧＣによるその含有量は、７１〜７３％と狭い範囲に高度に分布している。これら細菌は、広範囲の糖から発酵により酸を産生する。かれらの提言に従えば、セルロース分解性を示さないCellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株は、第４群に属するはずである。この株のその他の分類学上の特徴は第４群の特徴によく一致することから、本株はCellulomonas sp. ＡＫＵ６７２と仮称した。
【００１６】
上記のＡＫＵ６１０及びＡＫＵ６１１株は、以下の分類学上の特性を有する：
１）増殖可能温度： １５〜４０℃
２）至適増殖温度： ３０℃
３）絶対好気性のグラム陰性菌
４）胞子形成： なし
５）培養中に多型性と典型的な桿−球菌周期が観察される。
６）運動性： なし
【００１７】
更に、Biologシステム（Biolog Inc., 3447 Investment Blvd., Suite3, Hayward, California 94545, USA: Nature Vol.339, 157-158, May 11, 1989）による各種炭素源の同化に基づき、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０及びＡＫＵ６１１株を以下のように同定した：
【００１８】
それぞれの株の細胞を９６ウエルのマイクロタイタープレートに接種し、２８℃で２４時間培養した。各ウエルは、９６種類の炭素源のうちの１種類をＢＵＧＭ＋Ｂ培地（Biolog Universal Growth Media＋Blood; Biolog Inc.）に含んでいる。
【００１９】
培養後、各株は炭素源について以下の同化を示した：
【００２０】
【表３】
【００２１】
【表４】
【００２２】
Ａ１：水 Ａ２：α−シクロデキストリン
Ａ３：β−シクロデキストリン Ａ４：デキストリン
Ａ５：グリコゲン Ａ６：イヌリン
Ａ７：マンナン Ａ８：TweenR 40
Ａ９：TweenR 80 Ａ１０：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
Ａ１１：Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン
Ａ１２：アミグダリン Ｂ１：Ｌ−アラビノース
Ｂ２：Ｄ−アラビトール Ｂ３：アルブチン
Ｂ４：セロビオース Ｂ５：Ｄ−フルクトース
Ｂ６：Ｌ−フコース Ｂ７：Ｄ−ガラクトース
Ｂ８：Ｄ−ガラクツロン酸 Ｂ９：ゲンチオビオース
Ｂ１０：Ｄ−グルコン酸 Ｂ１１：α−Ｄ−グルコース
Ｂ１２：ｍ−イノシトール Ｃ１：α−Ｄ−ラクトース
Ｃ２：ラクツロース Ｃ３：マルトース
Ｃ４：マルトトリオース Ｃ５：Ｄ−マンニトール
Ｃ６：Ｄ−マンノース Ｃ７：Ｄ−メレチトース
Ｃ８：Ｄ−メリビオース Ｃ９：α−メチルＤ−ガラクトシド
Ｃ１０：α−メチル−Ｄ−ガラクトシド Ｃ１１：３−メチル−グルコース
Ｃ１２：α−メチル−Ｄ−グルコシド Ｄ１：β−メチル−Ｄ−グルコシド
Ｄ２：α−メチルＤ−マンノシド Ｄ３：パラチノース
Ｄ４：Ｄ−プシコース Ｄ５：Ｄ−ラフィノース
Ｄ６：Ｌ−ラムノース Ｄ７：Ｄ−リボース
Ｄ８：サリシン Ｄ９：セドヘプツロース
Ｄ１０：Ｄ−ソルビトール Ｄ１１：スタキオース
Ｄ１２：ショ糖 Ｅ１：Ｄ−タガトース
Ｅ２：Ｄ−トレハロース Ｅ３：ツラノース
Ｅ４：キシリトール Ｅ５：Ｄ−キシロース
Ｅ６：酢酸 Ｅ７：α−ヒドロキシ酪酸
Ｅ８：β−ヒドロキシ酪酸 Ｅ９：γ−ヒドロキシ酪酸
Ｅ１０：ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸
Ｅ１１：α−ケト−グルタル酸 Ｅ１２：α−ケト−吉草酸
Ｆ１：ラクトアミド Ｆ２：Ｄ−乳酸メチルエステル
Ｆ３：Ｌ−乳酸 Ｆ４：Ｄ−リンゴ酸
Ｆ５：Ｌ−リンゴ酸 Ｆ６：ピルビン酸メチル
Ｆ７：コハク酸モノメチルエステル Ｆ８：プロピオン酸
Ｆ９：ピルビン酸 Ｆ１０：スクシンアミド酸
Ｆ１１：コハク酸 Ｆ１２：Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸Ｇ１：アラニンアミド Ｇ２：Ｄ−アラニン
Ｇ３：Ｌ−アラニン Ｇ４：Ｌ−アラニル−グリシン
Ｇ５：Ｌ−アスパラギン Ｇ６：Ｌ−グルタミン酸
Ｇ７：グリシル−Ｌ−グルタミン酸 Ｇ８：Ｌ−ピログルタミン酸
Ｇ９：Ｌ−セリン Ｇ１０：プトレッシン
Ｇ１１：２，３−ブタンジオール Ｇ１２：グリセロール
Ｈ１：アデノシン Ｈ２：２′−デオキシアデノシン
Ｈ３：イノシン Ｈ４：チミジン
Ｈ５：ウリジン Ｈ６：アデノシン−５′−１リン酸
Ｈ７：チミジン−５′−１リン酸
Ｈ８：ウリジン−５′−１リン酸
Ｈ９：フルクトース−６−リン酸 Ｈ１０：グルコース−１−リン酸
Ｈ１１：グルコース−６−リン酸 Ｈ１２：ＤＬ−α−グリセロールリン酸
【００２３】
上記結果より、両株はCorynebacterium aquaticumと同定され、それぞれCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０及びＡＫＵ６１１と命名された。
【００２４】
上記の他の微生物は、いずれの人間でも日本国、発酵研究所（Institute for Fermentation, Osaka、ＩＦＯ）のような公的寄託機関（培養コレクション）から請求により入手することができる。このような寄託株の例として、Planococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２（ＩＦＯ １５８８０）及びArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５（ＩＦＯ １２６７８）がある。
【００２５】
本発明の選択的不斉還元法は、水中、又は一般には水と混和でき、レボジオンの溶解性を高め、酵素反応に不活性である、０．０１〜０．５Mリン酸カリウム緩衝液、pH範囲４〜１０のその他の緩衝液、アセトニトリル、エタノール、又はＮ，Ｎ′−ジメチルホルムアミドのような溶媒中で、バッチ法、半バッチ法、又は連続的に行うことができる。レボジオンの濃度は、好都合には４００〜２０００mg／１ｇ乾燥細胞／リットルであり、好ましくは４００〜８００mg／１ｇ乾燥細胞／リットルである。選択的不斉還元法は、pH域４〜９、好ましくは６〜７で、温度域２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で、１０分〜８０時間、好ましくは８時間〜２４時間、行うことができる。
【００２６】
本発明の選択的不斉還元法は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）のような補因子の存在下、又は当該補因子とグルコース及びグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の存在下に好都合に行うことができる。このような補因子の反応溶媒中の濃度は、３００mM/l以上が好ましく、より好ましくは７００mM/l〜９００mM/lである。更に、アクチノールの収率は、反応混合物に界面活性剤を加えることによって上昇させることができる。SpanR 20、SpanR ８０、TweenR 20、TweenR 40（いずれも和光純薬、大阪市道修町３−１−２より入手できる）などが、使用できる界面活性剤の例である。反応溶媒中の界面活性剤の量は、好都合には２〜２０mM/lであり、好ましくは約８mM/lである。
【００２７】
選択的不斉還元終了後、得られたアクチノールは、アクチノールを容易に溶解する酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、トルエン又は酢酸ｎ−ブチルのような水−不溶性（水に混合しない）有機溶媒で抽出することにより回収できる。抽出物を濃縮してアクチノールを直接結晶化させるか、又は薄層クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲル濾過クロマトグラフィーのような各種クロマトグラフィーを組み合わせることで、アクチノールを更に精製することができる。必要に応じ、高速液体クロマトグラフィーも利用できる。アクチノールの結晶を得るための好適な回収方法としては、アクチノールを酢酸エチルで抽出し、当該抽出物を濃縮してアクチノール結晶を得ることが挙げられる。
【００２８】
上記“休止細胞反応”法に変わる方法として、アクチノールは、レボジオンの存在下、栄養培地中での上記微生物の発酵、すなわち“増殖細胞反応”により生成することができる。両方法はともに本発明の方法に包含される。
【００２９】
“増殖細胞反応”法の栄養培地としては、炭素源としてグルコース及びショ糖のような糖類、エタノール及びグリセロールのようなアルコール、オレイン酸及びステアリン酸のような脂肪酸もしくはそのエステル、ナタネ油及びダイズ油のような油；窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、アミノ酸、コーン浸漬液、ふすま、酵母抽出液など；無機塩源として硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウムなど；その他の栄養源として麦芽エキスや肉エキスなどを含むものが利用できる。本発明の別の観点として、アクチノールは、レボジオンの存在下、栄養培地中で上記微生物の発酵により生成できる。
【００３０】
発酵は、好気的に、通常は培養期間１〜７日間、培地pH３〜９、そして発酵温度１０〜４０℃で行うことができる。
【００３１】
発酵に利用する微生物はいずれの形でもよく、例えば液体培地中の株の発酵により得られた培養体、液体培地から分離した細胞、細胞又は培養物の処理により得られた乾燥細胞、又は固定化細胞が挙げられる。
【００３２】
【実施例】
以下の実施例により本発明を例示する。
【００３３】
実施例１
０．５％の１，４−シクロヘキサンジオン（（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサンジオンの構造類似体；スクリーニングに利用）、０．５％TweenR 20、０．１％（ＮＨ4)2ＳＯ4、０．１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及び０．０２％酵母抽出物を含む液体培地（pH７．０）を試験管内に５ml加え、次に１２１℃で２０分間滅菌した。これらの試験管のそれぞれに土壌サンプル約０．３ｇを加え、３０℃で２４時間培養した。得られた培養体の０．１mlを上記と同じである新しい試験管培地に接種し、この作業を２回繰り返して目的微生物を増やした。得られた増殖培地を食塩水で希釈し、上記と同じ成分を含む寒天培地上に広げた。同時に食塩水中の土壌の懸濁液の上清を適当に希釈し、同様にして寒天培地上に広げた。このプレートを３０℃で４８時間培養した。プレート上の増殖コロニーを用い、１．０％グルコース、０．３％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．５％ペプトン（三国化学産業株式会社、東京都中央区日本橋室町４−１−６）、０．２％ＮａＣｌ及び０．１％酵母抽出物（ナカライテスク株式会社、京都市中京区二条通烏丸西入）を含む液体培地（pH７．０）５mlの入った試験管に接種した。試験管を３０℃で２４時間培養した後、遠心分離により細胞を集め、食塩水で洗浄した。得られた細胞を引き続きスクリーニングに用いた。上記微生物に加え、栄養培地中で培養した微生物の空気乾燥細胞もスクリーニングに使用した。
【００３４】
実施例２
０．６mgのＮＡＤ（オリエンタル酵母株式会社、東京都板橋区小豆沢３−６−１０）、０．６mgのＮＡＤＰ（オリエンタル酵母株式会社）、５０mgのＤ−グルコース及び０．２mgのＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬株式会社、名古屋市中区錦１−２−７）を含む反応混合液（pH７．０の０．１Mリン酸カリウム緩衝液）を調製した。実施例１で調製した細胞約０．３ｇを１mlの反応混合物に加え、次いで十分量の（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサンジオンを最終濃度０．５％になるように加えた。反応混合物を振とうしながら３０℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物を１mlの酢酸エチルで抽出し、濃縮した。（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチル−シクロヘキサノンの収率と光学純度は、ガスクロマトグラフィー〔カラム：ＨＲ−２０Ｍ（Shinwa Chemical Ind., 京都市伏見区景勝町）直径０．２５mm×３０ｍ、カラム温度：１６０℃（一定）、インジェクター温度：２５０℃、キャリアーガス：Ｈｅ（約１ml／分）〕で分析した。結果を表IIIに示す。
【００３５】
【表５】
【００３６】
実施例３
反応混合液へのＮＡＤ又はＮＡＤＰの添加の効果を、表IIIの微生物を用いて検討した。基本の反応混合物は、ＮＡＤとＮＡＤＰを除く実施例２記載の成分を全て含んでいた。本実施例で用いた微生物の細胞を、空気乾燥し、その細胞塊１０mgを反応混合物に加えた。反応は３０℃で２４時間行った。結果は表IVに示した。表中の光学純度の値（％e.e.）は（４Ｒ，６Ｒ）−異性体についてのものであり、表Ｖ（実施例４）ならびにVI（実施例５）も同様である。
【００３７】
【表６】
【００３８】
実施例４
反応混合物中の各種界面活性剤（最終濃度：０．１w/v％）の効果について、表IIIの微生物を用いて検討した。基本の反応混合物は、実施例２記載の全成分を含んでいた。本実施例で用いた微生物の細胞を空気乾燥し、その細胞塊１０mgを反応混合物に加えた。反応は３０℃で２４時間行った。結果を表Ｖに示す。
【００３９】
【表７】
【００４０】
【表８】
【００４１】
実施例５
反応に対する基質濃度の影響を、０．５％、１．０％及び１．５％の濃度で検討した。基本の反応混合物は、実施例２記載の全成分を含んでいた。本実施例では、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）の細胞を空気乾燥し、その細胞塊１０mgを反応混合液に加えた。反応は３０℃で２４時間行った。結果を表VIに示す。
【００４２】
【表９】
【００４３】
実施例６
Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＭ−６４４８）を、３０リットルのジャー発酵装置を用いて、０．１％酵母抽出物、１．５％ペプトン、２．０％Ｄ−グルコース、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３％Ｋ2ＨＰＯ4及び０．２％ＮａＣｌを含む培地２０リットル中、４００rpmで振とうしながら毎分０．５リットル通気して、３０℃で２４時間培養した。その後培養物を５，０００ｇで５分間遠心分離して、細胞を集めた。このようにして得られた細胞のペーストの重量は、４００ｇであった。
次に、レボジオン１２ｇ及びＤ−グルコース１２０ｇを細胞ペーストに加え、イオン交換水で容積を２．４リットルとした。２．０％ＮａＯＨ溶液でpHを７．０に調整した。反応混合物を２リットルのフラスコに移し、３０℃で１５時間、２２０rpmで振とうしながらインキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物を１２，０００ｇで５分間遠心分離することによって分離した。こうして得られた反応混合物の容積は２．２リットルであり、アクチノールの光学純度、収率及び濃度は、それぞれ９６％e.e.、９３％及び４．６g/lであった。
【００４４】
実施例７
実施例６に記載のように調製した反応混合物（１０リットル）を酢酸エチル（１０リットル）と混合して、アクチノールを抽出した。酢酸エチル相（７．５リットル）を分離し、脱色のためにそれに３５０ｇの活性炭粉末を加えた。１０分間撹拌後、活性炭粉末を濾過により除去した。無水Ｎａ2ＳＯ4６００ｇを６．５リットルの酢酸エチル溶液に加えて脱水した。数分間撹拌したのち、Ｎａ2ＳＯ4を濾過により除去した。酢酸エチル溶液（６．０リットル）を減圧下、３０℃で５０mlに濃縮した。こうして得た濃縮液に５リットルのｎ−ヘキサンを加え、混合物を５分間撹拌した後５℃まで冷却し、同温度で１２時間保持して、アクチノールを結晶化させた。結晶化したアクチノールを濾過により集め、乾燥した。こうして得たアクチノール結晶の重量は３２ｇであり、アクチノールの純度、光学純度、収率は、それぞれ９６％、９６％e.e.、７０％であった。
【００４５】
実施例８
Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）の種培養ブロス（１５０ml）を、０．１％酵母抽出物、１．５％ペプトン、２．０％グルコース、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３％Ｋ2ＨＰＯ4、０．２％ＮａＣｌ及び０．３％のレボジオンを含む３リットルの発酵培地に接種した。５リットルのジャー発酵装置を用いて、２５０rpmで撹拌しながら、毎分１．５リットルの空気を通気して、３０℃で４８時間発酵させた。発酵ブロスのpHは、ＮＨ3ガスにより７．０に調整した。発酵後、このブロスを除去し、細胞を１２，０００ｇで５分間遠心分離することにより集めた。本ブロス中のアクチノールの光学純度、収率、及び濃度は、それぞれ９６％e.e.、７１％及び２．１g/lであった。
【００４６】
本発明の実施態様は、以下のとおりである。
１． （４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンの製造方法であって、（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサン−ジオンを、Cellulomonas属、Corynebacterium属、Planococcus属及びArthrobacter属からなる微生物群より選択され、かつ（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサンジオンを（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンに選択的に不斉還元することができる微生物と接触せしめ、生成した（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンをその反応混合物から回収する方法。
２． 微生物が、Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４９）、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４７）、及びCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）からなる群から選択され、好ましくはCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）である、上記１の方法。
３． 微生物が、Planococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２（ＩＦＯ １５８８０）又はArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５（ＩＦＯ １２６７８）である、上記１の方法。
４． 選択的不斉還元を、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、あるいはグルコース及びＧＤＨと共にＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下で行う、上記１〜３のいずれか１の方法。
５． 選択的不斉還元を、界面活性剤の存在下で行う、上記１〜４のいずれか１の方法。
６． 選択的不斉還元を、pH域４〜９、温度域２０〜５０℃で、１０分間〜８０時間行う、上記１〜５のいずれか１の方法。
７． 得られた（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンの反応混合物からの回収を、（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンを酢酸エチルで抽出し、得られた抽出液を濃縮して（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンの結晶を得ることによって行う、上記１〜６のいずれか１の方法。
８． Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４９）、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４７）、又はCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）。９． Planococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２（ＩＦＯ １５８８０）又はArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５（ＩＦＯ １２６７８）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株の電子顕微鏡写真である。Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株は、栄養寒天斜面培地上、２８℃で４日間生育させた。洗浄した細胞を真空下で乾燥し、クロムでシャドウイングした。
【図２】図２は、Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株の多型性を示す。細胞は、栄養ブロス上で培養した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサンジオン（以後レボジオンと記載する）からの（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノン（以後アクチノールと記載する）の微生物による生産方法に関する。アクチノールは、ゼアキサンチンのようなカロテノイドの合成に有用である。より詳細には、本発明は、レボジオンのＣ−４位のカルボニル基を選択的に不斉還元することができる特定の微生物を利用した、微生物によるアクチノールの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来アクチノールは、アクチノールのジアステレオ異性体混合物の光学分割により調製されてきた。しかし、この方法は、金属触媒によるレボジオンの水素化と、それに続く無水マレイン酸のような分割剤を用いた化学的手段での光学分割を必要とする（T.Ohashiら、“分子キラリティー１９９６”紀要（the proceedings of the symposium“Molecular Chirality 1996”）１９９６年５月３０日と３１日開催、東京、日本、４７〜５０ページ、“生物触媒を利用した実用的合成（Practical Syntheses using Biocatalysts））。そのため、この方法は工業目的には経済的に実用的でない。
【０００３】
レボジオン自体からアクチノールを酵素的に調製する方法は公知である。例えば、Bacillus thermophilusは、ラセミ体のジヒドロオキソイソホロンを、４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンの４種類の異性体、すなわちシス（４Ｒ，６Ｓ）−、シス（４Ｓ，６Ｒ）−、トランス−（４Ｒ，６Ｒ）−、及びトランス−（４Ｓ，６Ｓ）−異性体に変換することができる。得られたこれら異性体の量比は６８：２５：５：２である（J. Biotechnol., 9 (2), 117-128, 1989）。したがって、（４Ｒ，６Ｒ）−異性体、アクチノールの含有量は、全異性体の５％に過ぎず、この方法もまた、工業目的には経済的に実用的でない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
レボジオンの選択的不斉還元に関する精力的な研究の結果、今回ある種の微生物を利用した選択的不斉還元と、それに続く反応混合液からの回収により、アクチノールをレボジオンから効率的に得ることができることが見出された。本発明はこの発見に基づく。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、アクチノールの製造方法であって、レボジオンを、Cellulomonas属、Corynebacterium属、Planococcus属及びArthrobacter属からなる微生物群より選択され、かつレボジオンをアクチノールに選択的に不斉還元することができる微生物と接触せしめ、生成したアクチノールをその反応混合物から回収する方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
スクリーニングは、それ自体公知の方法にて実施した。例えば、微生物は、炭素源としてグルコース及びショ糖のような糖類、エタノール及びグリセロールのようなアルコール、オレイン酸及びステアリン酸のような脂肪酸もしくはそのエステル、又はナタネ油及びダイズ油のような油；窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、アミノ酸、コーン浸漬液、ふすま、酵母抽出液など；無機塩源として硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウムなど；その他の栄養源として麦芽エキスや肉エキスなどを含む栄養培地中、通常の方法で培養した。培養は、好気性条件下、通常は、pH３〜９の培地で１〜７日間の期間、１０〜４０℃の培養温度で行うことができる。培養後、細胞は遠心分離又は濾過により集められる。こうして得た細胞とレボジオンは、水、リン酸カリウム緩衝液、アセトニトリル、エタノールなどの溶媒中で一緒にし（接触）、適当な反応条件下（レボジオン濃度：４００〜２，０００mg/g乾燥細胞／リットル、pH域：４〜９、温度域：２０〜５０℃、反応期間：１０分〜８０時間）で反応を開始させる。反応混合物を酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、トルエン、酢酸ｎ−ブチルなどの有機溶媒で抽出した。抽出液を適当なクロマトグラフィーにかけ、アクチノールの生産性を測定する。
【０００７】
スクリーニングの結果、Cellulomonas属、Corynebacterium属、Planococcus属及びArthrobacter属に属する微生物が、レボジオンを選択的に不斉還元することができることを発見した。特に好適な微生物は、Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１、Planococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２及びArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５であり、特に先頭から３種類の微生物が好適である。上記５種類の微生物のうち、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１が、最も好ましい。
【０００８】
微生物Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０、及びCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１は、日本国、福井県の真名姫湖で採取した土壌サンプルより分離された。これら微生物は、ブダベスト条約に従い、次の名称により１９９８年、８月４日に日本の工業技術院生命工学工業技術研究所（the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology）に寄託された。
Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４９）
Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４７）
Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）
【０００９】
これら３種類の微生物、並びにPlanococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２及びArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５は新規であり、本発明の更なる面を表す。
【００１０】
上記の株ＡＫＵ６７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４９）は以下の分類上の特徴を有する：
【００１１】
Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株の典型的な多型性は、電子顕微鏡による観察で認められる。当該株の古い培養体は、図１に示す如く球状であった。Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株は、栄養寒天斜面培地上、２８℃で４日間生育させた。洗浄した細胞を真空下で乾燥し、クロムでシャドウイングした。若い培養株では、不規則な桿状細胞が多く見られた（図２）。細胞は、栄養ブロス上で培養した。当該株の形態学的、生理学的そして生化学的特徴を表ＩとIIにまとめた。
【００１２】
【表１】
【表２】
Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株は、グラム陽性の好気性で、“コリネフォルム細菌”（coryneform bacteria）の群に属するものとして分類できる。この株は、１本の鞭毛を有する運動性である。細胞壁内には主要アミノ酸としてオルニチンが認められた。ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による含有量は、７４．７％であった。屈曲型（bending like）細胞分裂が観察された。この株は、４日間広い範囲の糖からガス形成なしに酸を産生した。この株はセルロース分解性を示さなかった。
【００１５】
コリネフォルム細菌の分類は十分に確立されていない。最近、YamadaとKomagata〔J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 417 (1992)〕は、細胞分裂の基本形、細胞壁の組成とＧＣによるＤＮＡ含有量に基づいて、コリネフォルム細菌を７つの群に分類することを提言した。かれらは、セルロース分解性の欠如にもかかわらず、他の群から第４群を区別した。この群の細菌の細胞分裂は屈曲型で、細胞壁中の主要アミノ酸はオルニチンである。ＧＣによるその含有量は、７１〜７３％と狭い範囲に高度に分布している。これら細菌は、広範囲の糖から発酵により酸を産生する。かれらの提言に従えば、セルロース分解性を示さないCellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株は、第４群に属するはずである。この株のその他の分類学上の特徴は第４群の特徴によく一致することから、本株はCellulomonas sp. ＡＫＵ６７２と仮称した。
【００１６】
上記のＡＫＵ６１０及びＡＫＵ６１１株は、以下の分類学上の特性を有する：
１）増殖可能温度： １５〜４０℃
２）至適増殖温度： ３０℃
３）絶対好気性のグラム陰性菌
４）胞子形成： なし
５）培養中に多型性と典型的な桿−球菌周期が観察される。
６）運動性： なし
【００１７】
更に、Biologシステム（Biolog Inc., 3447 Investment Blvd., Suite3, Hayward, California 94545, USA: Nature Vol.339, 157-158, May 11, 1989）による各種炭素源の同化に基づき、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０及びＡＫＵ６１１株を以下のように同定した：
【００１８】
それぞれの株の細胞を９６ウエルのマイクロタイタープレートに接種し、２８℃で２４時間培養した。各ウエルは、９６種類の炭素源のうちの１種類をＢＵＧＭ＋Ｂ培地（Biolog Universal Growth Media＋Blood; Biolog Inc.）に含んでいる。
【００１９】
培養後、各株は炭素源について以下の同化を示した：
【００２０】
【表３】
【表４】
Ａ１：水 Ａ２：α−シクロデキストリン
Ａ３：β−シクロデキストリン Ａ４：デキストリン
Ａ５：グリコゲン Ａ６：イヌリン
Ａ７：マンナン Ａ８：TweenR 40
Ａ９：TweenR 80 Ａ１０：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
Ａ１１：Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン
Ａ１２：アミグダリン Ｂ１：Ｌ−アラビノース
Ｂ２：Ｄ−アラビトール Ｂ３：アルブチン
Ｂ４：セロビオース Ｂ５：Ｄ−フルクトース
Ｂ６：Ｌ−フコース Ｂ７：Ｄ−ガラクトース
Ｂ８：Ｄ−ガラクツロン酸 Ｂ９：ゲンチオビオース
Ｂ１０：Ｄ−グルコン酸 Ｂ１１：α−Ｄ−グルコース
Ｂ１２：ｍ−イノシトール Ｃ１：α−Ｄ−ラクトース
Ｃ２：ラクツロース Ｃ３：マルトース
Ｃ４：マルトトリオース Ｃ５：Ｄ−マンニトール
Ｃ６：Ｄ−マンノース Ｃ７：Ｄ−メレチトース
Ｃ８：Ｄ−メリビオース Ｃ９：α−メチルＤ−ガラクトシド
Ｃ１０：α−メチル−Ｄ−ガラクトシド Ｃ１１：３−メチル−グルコース
Ｃ１２：α−メチル−Ｄ−グルコシド Ｄ１：β−メチル−Ｄ−グルコシド
Ｄ２：α−メチルＤ−マンノシド Ｄ３：パラチノース
Ｄ４：Ｄ−プシコース Ｄ５：Ｄ−ラフィノース
Ｄ６：Ｌ−ラムノース Ｄ７：Ｄ−リボース
Ｄ８：サリシン Ｄ９：セドヘプツロース
Ｄ１０：Ｄ−ソルビトール Ｄ１１：スタキオース
Ｄ１２：ショ糖 Ｅ１：Ｄ−タガトース
Ｅ２：Ｄ−トレハロース Ｅ３：ツラノース
Ｅ４：キシリトール Ｅ５：Ｄ−キシロース
Ｅ６：酢酸 Ｅ７：α−ヒドロキシ酪酸
Ｅ８：β−ヒドロキシ酪酸 Ｅ９：γ−ヒドロキシ酪酸
Ｅ１０：ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸
Ｅ１１：α−ケト−グルタル酸 Ｅ１２：α−ケト−吉草酸
Ｆ１：ラクトアミド Ｆ２：Ｄ−乳酸メチルエステル
Ｆ３：Ｌ−乳酸 Ｆ４：Ｄ−リンゴ酸
Ｆ５：Ｌ−リンゴ酸 Ｆ６：ピルビン酸メチル
Ｆ７：コハク酸モノメチルエステル Ｆ８：プロピオン酸
Ｆ９：ピルビン酸 Ｆ１０：スクシンアミド酸
Ｆ１１：コハク酸 Ｆ１２：Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸Ｇ１：アラニンアミド Ｇ２：Ｄ−アラニン
Ｇ３：Ｌ−アラニン Ｇ４：Ｌ−アラニル−グリシン
Ｇ５：Ｌ−アスパラギン Ｇ６：Ｌ−グルタミン酸
Ｇ７：グリシル−Ｌ−グルタミン酸 Ｇ８：Ｌ−ピログルタミン酸
Ｇ９：Ｌ−セリン Ｇ１０：プトレッシン
Ｇ１１：２，３−ブタンジオール Ｇ１２：グリセロール
Ｈ１：アデノシン Ｈ２：２′−デオキシアデノシン
Ｈ３：イノシン Ｈ４：チミジン
Ｈ５：ウリジン Ｈ６：アデノシン−５′−１リン酸
Ｈ７：チミジン−５′−１リン酸
Ｈ８：ウリジン−５′−１リン酸
Ｈ９：フルクトース−６−リン酸 Ｈ１０：グルコース−１−リン酸
Ｈ１１：グルコース−６−リン酸 Ｈ１２：ＤＬ−α−グリセロールリン酸
【００２３】
上記結果より、両株はCorynebacterium aquaticumと同定され、それぞれCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０及びＡＫＵ６１１と命名された。
【００２４】
上記の他の微生物は、いずれの人間でも日本国、発酵研究所（Institute for Fermentation, Osaka、ＩＦＯ）のような公的寄託機関（培養コレクション）から請求により入手することができる。このような寄託株の例として、Planococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２（ＩＦＯ １５８８０）及びArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５（ＩＦＯ １２６７８）がある。
【００２５】
本発明の選択的不斉還元法は、水中、又は一般には水と混和でき、レボジオンの溶解性を高め、酵素反応に不活性である、０．０１〜０．５Mリン酸カリウム緩衝液、pH範囲４〜１０のその他の緩衝液、アセトニトリル、エタノール、又はＮ，Ｎ′−ジメチルホルムアミドのような溶媒中で、バッチ法、半バッチ法、又は連続的に行うことができる。レボジオンの濃度は、好都合には４００〜２０００mg／１ｇ乾燥細胞／リットルであり、好ましくは４００〜８００mg／１ｇ乾燥細胞／リットルである。選択的不斉還元法は、pH域４〜９、好ましくは６〜７で、温度域２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で、１０分〜８０時間、好ましくは８時間〜２４時間、行うことができる。
【００２６】
本発明の選択的不斉還元法は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）のような補因子の存在下、又は当該補因子とグルコース及びグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の存在下に好都合に行うことができる。このような補因子の反応溶媒中の濃度は、３００mM/l以上が好ましく、より好ましくは７００mM/l〜９００mM/lである。更に、アクチノールの収率は、反応混合物に界面活性剤を加えることによって上昇させることができる。SpanR 20、SpanR ８０、TweenR 20、TweenR 40（いずれも和光純薬、大阪市道修町３−１−２より入手できる）などが、使用できる界面活性剤の例である。反応溶媒中の界面活性剤の量は、好都合には２〜２０mM/lであり、好ましくは約８mM/lである。
【００２７】
選択的不斉還元終了後、得られたアクチノールは、アクチノールを容易に溶解する酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、トルエン又は酢酸ｎ−ブチルのような水−不溶性（水に混合しない）有機溶媒で抽出することにより回収できる。抽出物を濃縮してアクチノールを直接結晶化させるか、又は薄層クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び／又はゲル濾過クロマトグラフィーのような各種クロマトグラフィーを組み合わせることで、アクチノールを更に精製することができる。必要に応じ、高速液体クロマトグラフィーも利用できる。アクチノールの結晶を得るための好適な回収方法としては、アクチノールを酢酸エチルで抽出し、当該抽出物を濃縮してアクチノール結晶を得ることが挙げられる。
【００２８】
上記“休止細胞反応”法に変わる方法として、アクチノールは、レボジオンの存在下、栄養培地中での上記微生物の発酵、すなわち“増殖細胞反応”により生成することができる。両方法はともに本発明の方法に包含される。
【００２９】
“増殖細胞反応”法の栄養培地としては、炭素源としてグルコース及びショ糖のような糖類、エタノール及びグリセロールのようなアルコール、オレイン酸及びステアリン酸のような脂肪酸もしくはそのエステル、ナタネ油及びダイズ油のような油；窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、アミノ酸、コーン浸漬液、ふすま、酵母抽出液など；無機塩源として硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウムなど；その他の栄養源として麦芽エキスや肉エキスなどを含むものが利用できる。本発明の別の観点として、アクチノールは、レボジオンの存在下、栄養培地中で上記微生物の発酵により生成できる。
【００３０】
発酵は、好気的に、通常は培養期間１〜７日間、培地pH３〜９、そして発酵温度１０〜４０℃で行うことができる。
【００３１】
発酵に利用する微生物はいずれの形でもよく、例えば液体培地中の株の発酵により得られた培養体、液体培地から分離した細胞、細胞又は培養物の処理により得られた乾燥細胞、又は固定化細胞が挙げられる。
【００３２】
【実施例】
以下の実施例により本発明を例示する。
【００３３】
実施例１
０．５％の１，４−シクロヘキサンジオン（（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサンジオンの構造類似体；スクリーニングに利用）、０．５％TweenR 20、０．１％（ＮＨ4)2ＳＯ4、０．１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ及び０．０２％酵母抽出物を含む液体培地（pH７．０）を試験管内に５ml加え、次に１２１℃で２０分間滅菌した。これらの試験管のそれぞれに土壌サンプル約０．３ｇを加え、３０℃で２４時間培養した。得られた培養体の０．１mlを上記と同じである新しい試験管培地に接種し、この作業を２回繰り返して目的微生物を増やした。得られた増殖培地を食塩水で希釈し、上記と同じ成分を含む寒天培地上に広げた。同時に食塩水中の土壌の懸濁液の上清を適当に希釈し、同様にして寒天培地上に広げた。このプレートを３０℃で４８時間培養した。プレート上の増殖コロニーを用い、１．０％グルコース、０．３％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．５％ペプトン（三国化学産業株式会社、東京都中央区日本橋室町４−１−６）、０．２％ＮａＣｌ及び０．１％酵母抽出物（ナカライテスク株式会社、京都市中京区二条通烏丸西入）を含む液体培地（pH７．０）５mlの入った試験管に接種した。試験管を３０℃で２４時間培養した後、遠心分離により細胞を集め、食塩水で洗浄した。得られた細胞を引き続きスクリーニングに用いた。上記微生物に加え、栄養培地中で培養した微生物の空気乾燥細胞もスクリーニングに使用した。
【００３４】
実施例２
０．６mgのＮＡＤ（オリエンタル酵母株式会社、東京都板橋区小豆沢３−６−１０）、０．６mgのＮＡＤＰ（オリエンタル酵母株式会社）、５０mgのＤ−グルコース及び０．２mgのＤ−グルコースデヒドロゲナーゼ（天野製薬株式会社、名古屋市中区錦１−２−７）を含む反応混合液（pH７．０の０．１Mリン酸カリウム緩衝液）を調製した。実施例１で調製した細胞約０．３ｇを１mlの反応混合物に加え、次いで十分量の（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサンジオンを最終濃度０．５％になるように加えた。反応混合物を振とうしながら３０℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物を１mlの酢酸エチルで抽出し、濃縮した。（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチル−シクロヘキサノンの収率と光学純度は、ガスクロマトグラフィー〔カラム：ＨＲ−２０Ｍ（Shinwa Chemical Ind., 京都市伏見区景勝町）直径０．２５mm×３０ｍ、カラム温度：１６０℃（一定）、インジェクター温度：２５０℃、キャリアーガス：Ｈｅ（約１ml／分）〕で分析した。結果を表IIIに示す。
【００３５】
【表５】
実施例３
反応混合液へのＮＡＤ又はＮＡＤＰの添加の効果を、表IIIの微生物を用いて検討した。基本の反応混合物は、ＮＡＤとＮＡＤＰを除く実施例２記載の成分を全て含んでいた。本実施例で用いた微生物の細胞を、空気乾燥し、その細胞塊１０mgを反応混合物に加えた。反応は３０℃で２４時間行った。結果は表IVに示した。表中の光学純度の値（％e.e.）は（４Ｒ，６Ｒ）−異性体についてのものであり、表Ｖ（実施例４）ならびにVI（実施例５）も同様である。
【００３７】
【表６】
実施例４
反応混合物中の各種界面活性剤（最終濃度：０．１w/v％）の効果について、表IIIの微生物を用いて検討した。基本の反応混合物は、実施例２記載の全成分を含んでいた。本実施例で用いた微生物の細胞を空気乾燥し、その細胞塊１０mgを反応混合物に加えた。反応は３０℃で２４時間行った。結果を表Ｖに示す。
【００３９】
【表７】
【表８】
実施例５
反応に対する基質濃度の影響を、０．５％、１．０％及び１．５％の濃度で検討した。基本の反応混合物は、実施例２記載の全成分を含んでいた。本実施例では、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）の細胞を空気乾燥し、その細胞塊１０mgを反応混合液に加えた。反応は３０℃で２４時間行った。結果を表VIに示す。
【００４２】
【表９】
実施例６
Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＭ−６４４８）を、３０リットルのジャー発酵装置を用いて、０．１％酵母抽出物、１．５％ペプトン、２．０％Ｄ−グルコース、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３％Ｋ2ＨＰＯ4及び０．２％ＮａＣｌを含む培地２０リットル中、４００rpmで振とうしながら毎分０．５リットル通気して、３０℃で２４時間培養した。その後培養物を５，０００ｇで５分間遠心分離して、細胞を集めた。このようにして得られた細胞のペーストの重量は、４００ｇであった。
次に、レボジオン１２ｇ及びＤ−グルコース１２０ｇを細胞ペーストに加え、イオン交換水で容積を２．４リットルとした。２．０％ＮａＯＨ溶液でpHを７．０に調整した。反応混合物を２リットルのフラスコに移し、３０℃で１５時間、２２０rpmで振とうしながらインキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物を１２，０００ｇで５分間遠心分離することによって分離した。こうして得られた反応混合物の容積は２．２リットルであり、アクチノールの光学純度、収率及び濃度は、それぞれ９６％e.e.、９３％及び４．６g/lであった。
【００４４】
実施例７
実施例６に記載のように調製した反応混合物（１０リットル）を酢酸エチル（１０リットル）と混合して、アクチノールを抽出した。酢酸エチル相（７．５リットル）を分離し、脱色のためにそれに３５０ｇの活性炭粉末を加えた。１０分間撹拌後、活性炭粉末を濾過により除去した。無水Ｎａ2ＳＯ4６００ｇを６．５リットルの酢酸エチル溶液に加えて脱水した。数分間撹拌したのち、Ｎａ2ＳＯ4を濾過により除去した。酢酸エチル溶液（６．０リットル）を減圧下、３０℃で５０mlに濃縮した。こうして得た濃縮液に５リットルのｎ−ヘキサンを加え、混合物を５分間撹拌した後５℃まで冷却し、同温度で１２時間保持して、アクチノールを結晶化させた。結晶化したアクチノールを濾過により集め、乾燥した。こうして得たアクチノール結晶の重量は３２ｇであり、アクチノールの純度、光学純度、収率は、それぞれ９６％、９６％e.e.、７０％であった。
【００４５】
実施例８
Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）の種培養ブロス（１５０ml）を、０．１％酵母抽出物、１．５％ペプトン、２．０％グルコース、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．３％Ｋ2ＨＰＯ4、０．２％ＮａＣｌ及び０．３％のレボジオンを含む３リットルの発酵培地に接種した。５リットルのジャー発酵装置を用いて、２５０rpmで撹拌しながら、毎分１．５リットルの空気を通気して、３０℃で４８時間発酵させた。発酵ブロスのpHは、ＮＨ3ガスにより７．０に調整した。発酵後、このブロスを除去し、細胞を１２，０００ｇで５分間遠心分離することにより集めた。本ブロス中のアクチノールの光学純度、収率、及び濃度は、それぞれ９６％e.e.、７１％及び２．１g/lであった。
【００４６】
本発明の実施態様は、以下のとおりである。
１． （４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンの製造方法であって、（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサン−ジオンを、Cellulomonas属、Corynebacterium属、Planococcus属及びArthrobacter属からなる微生物群より選択され、かつ（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサンジオンを（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンに選択的に不斉還元することができる微生物と接触せしめ、生成した（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンをその反応混合物から回収する方法。
２． 微生物が、Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４９）、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４７）、及びCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）からなる群から選択され、好ましくはCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）である、上記１の方法。
３． 微生物が、Planococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２（ＩＦＯ １５８８０）又はArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５（ＩＦＯ １２６７８）である、上記１の方法。
４． 選択的不斉還元を、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、あるいはグルコース及びＧＤＨと共にＮＡＤ又はＮＡＤＰの存在下で行う、上記１〜３のいずれか１の方法。
５． 選択的不斉還元を、界面活性剤の存在下で行う、上記１〜４のいずれか１の方法。
６． 選択的不斉還元を、pH域４〜９、温度域２０〜５０℃で、１０分間〜８０時間行う、上記１〜５のいずれか１の方法。
７． 得られた（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンの反応混合物からの回収を、（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンを酢酸エチルで抽出し、得られた抽出液を濃縮して（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンの結晶を得ることによって行う、上記１〜６のいずれか１の方法。
８． Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４９）、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４７）、又はCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）。９． Planococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２（ＩＦＯ １５８８０）又はArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５（ＩＦＯ １２６７８）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株の電子顕微鏡写真である。Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株は、栄養寒天斜面培地上、２８℃で４日間生育させた。洗浄した細胞を真空下で乾燥し、クロムでシャドウイングした。
【図２】図２は、Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２株の多型性を示す。細胞は、栄養ブロス上で培養した。
Claims (3)
- （４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンの製造方法であって、（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサンジオンを、Cellulomonas属、Corynebacterium属、Planococcus属及びArthrobacter属からなる微生物群より選択され、かつ（６Ｒ）−２，２，６−トリメチルシクロヘキサンジオンを（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンに選択的に不斉還元することができる微生物と接触せしめ、生成した（４Ｒ，６Ｒ）−４−ヒドロキシ−２，２，６−トリメチルシクロヘキサノンをその反応混合物から回収する方法。
- Cellulomonas sp. ＡＫＵ６７２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４９）、Corynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４７）又はCorynebacterium aquaticum ＡＫＵ６１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６４４８）。
- Planococcus okeanokoites ＡＫＵ１５２（ＩＦＯ １５８８０）又はArthrobacter sulfureus ＡＫＵ６３５（ＩＦＯ １２６７８）。
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