DE69930031T2 - Mikrobielle Herstellung von Actinol - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von (4R,6R)-4-Hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanon (hierin nachstehend als Actinol bezeichnet) aus (6R)-2,2,6-Trimethylcyclohexandion (hierin nachstehend als Levodion bezeichnet). Actinol ist für die Synthese von Carotenoiden, wie Zeaxanthin, nützlich. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Actinol unter Verwendung eines speziellen Mikroorganismus, der die Carbonylgruppe an der C-4-Stellung des Levodions selektiv asymmetrisch reduzieren kann.
• Actinol ist zuvor durch die optische Auflösung des diastereomeren Gemisches aus Actinol hergestellt worden. Solche Verfahren erfordern jedoch das Hydrieren von Levodion durch Metallkatalysatoren und die anschließende optische Trennung durch chemische Mittel mit Trennmitteln, wie Maleinsäureanhydrid (T. Ohashi et al., Protokolle des Symposiums „Molecular Chirality 1996" gehalten am 30. und 31. Mai, 1996, in Tokio, Japan, Seiten 47 bis 50, „Practical Syntheses using Biocatalysts"). Demnach ist dieses Verfahren für den industriellen Zweck ökonomisch nicht geeignet.
• Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Actinol aus Levodion sind an sich bekannt. Beispielsweise kann Bacillus thermophilus racemisches Dihydrooxoisophoron zu 4 Isomeren des 4-Hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanons umwandeln, d. h. zu den cis-(4R,6S)-, cis-(4S,6R)-, trans-(4R,6R)- und trans-(4S,6S)-Isomeren umwandeln. Das resultierende quantitative Verhältnis dieser Isomere beträgt 68 : 25 : 5 : 2 (J. Biotechnol., 9(2), 117–128, 1989). Demnach beträgt der Gehalt des (4R,6R)-Isomers, Actinol, lediglich 5 % der gesamten Isomere und auch dieses Verfahren ist für den industriellen Zweck ökonomisch nicht geeignet.
• Des weiteren offenbart DE-A 2 537 060 ein Verfahren zur Herstellung von (4R,6R)-4-Hydroxy-2,2,6-trimethyl-cyclohexanon durch Fermentation von (6R)-2,2,6-Trimethyl-cyclohexanodion in Gegenwart eines Mikroorganismus, der von der Gattung Arthrobacter sein kann.
• Als ein Ergebnis zahlreicher Untersuchungen der selektiven asymmetrischen Reduktion von Levodion wurde jetzt herausgefunden, daß Actinol durch selektive asymmetrische Reduktion unter Verwendung bestimmter neuer Mikroorganismen, gefolgt von der Rückgewinnung des Actinols aus dem Reaktionsgemisch effizient aus dem Levodion erhalten werden kann. Die vorliegende Erfindung basiert auf dieser Entdeckung.
• Demnach stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Actinol bereit, umfassend das Kontaktieren von Levodion mit einem Mikroorganismus, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cellulomonas sp. AKU672, Corynebacterium aquaticum AKU610, Corynebacterium aquaticum AKU611, Planococcus okeanokoites AKU152 und Arthrobacter sulfureus AKU635, und der Levodion selektiv asymmetrisch zu Actinol reduzieren kann, und die Rückgewinnung des resultierenden Actinols aus dem Reaktionsgemisch.
• Ein Screening wurde unter Verwendung eines an sich bekannten Verfahrens durchgeführt. Beispielsweise wird ein Mikroorganismus in einem Nährmedium, enthaltend Saccharide wie Glukose und Saccharose, Alkohole wie Ethanol und Glycerol, Fettsäuren wie Ölsäure und Stearinsäure oder Ester davon, oder Öle wie Rapsöl und Sojabohnenöl als Kohlenstoffquellen; Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Pepton, Aminosäuren, Maisquellwasser, Kleie, Hefeextrakt und dergleichen als Stickstoffquellen; Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat und dergleichen als anorganische Salzquellen; und Malzextrakt, Fleischextrakt und dergleichen als andere Nährstoffquellen, durch ein konventionelles Verfahren kultiviert, um Zellen bereitzustellen. Die Kultivierung kann aerob, normalerweise für einen Kultivierungszeitraum von 1 bis 7 Tagen bei einem mittleren pH von 3 bis 9 und einer Kultivierungstemperatur von 10 bis 40 AC durchgeführt werden. Nach der Kultivierung werden die resultierenden Zellen durch Zentrifugieren oder Filtration gesammelt. Die so erhaltenen Zellen und das Levodion werden in einem Lösungsmittel, wie Wasser, Kaliumphosphatpuffer, Acetonitril, Ethanol und dergleichen zusammengebracht (kontaktiert) und eine Reaktion wird unter entsprechenden Reaktionsbedingungen initiiert (Levodionkonzentration: 400 bis 2.000 mg/g trockne Zellen/l, pH-Bereich: 4 bis 9, Temperaturbereich: 20 bis 50 AC, Reaktionszeitraum: 10 Minuten bis 80 Stunden). Das Reaktionsgemisch wird mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethylacetat, n-Hexan, Toluol, n-Butylacetat und dergleichen extrahiert. Die extrahierte Lösung wird einer entsprechenden Chromatographie unterzogen, um die Ergiebigkeit von Actinol zu messen.
• Als ein Ergebnis des Screenings wurde herausgefunden, daß die zuvor genannten Mikroorganismen Levodion selektiv asymmetrisch reduzieren können. Von den fünf genannten Mikroorganismen wird Corynebacterium aquaticum AKU611 am stärksten bevorzugt.
• Die Mikroorganismen Cellulomonas sp. AKU672, Corynebacterium aquaticum AKU610 und Corynebacterium aquaticum AKU611 wurden aus den Bodenproben isoliert, gesammelt am Lake Manahime, Fukui Prefecture, Japan. Diese Mikroorganismen wurden bei dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan am 4. August, 1998 gemäß dem Budapester Abkommen hinterlegt und haben die folgenden Bezeichnungen:
  Cellulomonas sp. AKU672 (FERM BP-6449)
  Corynebacterium aquaticum AKU610 (FERM BP-6447)
  Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448)
• Diese drei Mikroorganismen, und auch Planococcus okeanokoites AKU152 und Arthrobacter sulfureus AKU635, sind neu und stellen einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.
• Der oben genannte Stamm AKU672 (FERM BP-6449) weist die folgenden taxonomischen Eigenschaften auf:
  Der typische Pleomorphismus des Stamms Cellulomonas sp. AKU672 wurde bei der elektronenmikroskopischen Beobachtung entdeckt. Eine alte Kultur des Stamms war kokkoid, wie in 1 gezeigt. In jungen Kulturen waren unregelmäßige Stäbchen dominant (2). Die morphologischen, physiologischen und biochemischen Merkmale des Stamms werden in Tabelle I und II zusammengefaßt.
• Tabelle I Morphologische und Kulturmerkmale des Stamms Cellulomonas sp. AKU672

  
• Tabelle II Physiologische und biochemische Merkmale des Stamms Cellulomonas sp. AKU672

  
• Der Stamm Cellulomonas sp. AKU672 ist gram-positiv und aerob, und kann als zu der Gruppe der „Coryneform-Bakterien" gehörend klassifiziert werden. Dieser Stamm war beweglich mit einem Flagellum. Ornithin wurde in der Zellwand als die wichtigste Aminosäure entdeckt. Ihr Gehalt gemäß der Gaschromatographie (GC) betrug 74,7 %. Bending-artige Zellteilung wurde beobachtet. Der Stamm produzierte Säure mit einer breiten Vielfalt an Zuckern ohne Gasbildung für 4 Tage. Dieser Stamm zeigte keine cellulolytische Aktivität.
• Die Klassifzierung der Coryneform-Bakterien hat sich noch nicht gut etabliert. Kürzlich schlugen Yamada und Komagata [J. Gen. Appl. Microbiol., 18, 417(1992)] die Klassifizierung der Coryneform-Bakterien in sieben Gruppen vor, abhängig von der wichtigsten Art der Zellteilung, Zellwandzusammensetzung und dem DNA-Gehalt gemäß der GC. Sie unterschieden die Gruppe 4 von anderen Gruppen trotz mangelnder cellulolytischer Aktivität. Bakterien dieser Gruppe weisen die Bendingart der Zellteilung auf und die wichtigste Aminosäure in der Zellwand ist Ornithin. Ihre Gehalte gemäß der GC werden in einen engen und hohen Bereich von 7l bis 73 % gegliedert. Diese Bakterien produzieren Säure fermentativ aus einer breiten Vielfalt von Zuckern. Gemäß deren Vorschlag sollte der Stamm Cellulomonas sp. AKU672, der keine cellulolytische Aktivität zeigte, zur Gruppe 4 gehören. Andere Merkmale der Stammesklassifikation fallen gut mit denen der Gruppe 4 zusammen, und so wurde sie vorläufig als Cellulomonas sp. AKU672 benannt.
• Die zuvor genannten Stämme AKU610 und AKU611 weisen die folgenden taxonomischen Eigenschaften auf:
• 1) kultivierbare Temperatur: 15 bis 40 °C
• 2) optimale Temperatur für das Wachstum: 30 °C
• 3) obligatorischer aerober und gramnegativer Mikroorganismus
• 4) Sporenbildung: keine
• 5) Polymorphismus und traditionelle Stab-cocus-Zyklen können während der Kultivierung beobachtet werden.
• 6) Motilität: keine
• Außerdem wurden die Stämme Corynebacterium aquaticum AKU610 und AKU611 als solche, basierend auf der Assimilation von verschiedenen Kohlenstoffquellen von dem Biolog System (Biolog Inc., 3447 Investment Blvd., Suite 3, Hayward, California 94545, USA : Nature Vol. 339, 157–158, 11. Mai 1989), folgendermaßen identifiziert:
  Zellen des Stammes wurden mit 96-Loch-Mikrotiterplatten inokuliert und für 24 Stunden bei 28 °C inkubiert. Jedes Loch enthielt eine von 96 Arten von Kohlenstoffquellen in BUGM+B-Medium (Biolog Universal Growth Media + Blut; Biolog Inc.).
• Nach der Inkubation zeigte jeder Stamm die folgende Assimilation von Kohlenstoffquellen:

  

  

  

  
• Aus den obigen Ergebnissen werden beide Stämme als Corynebacterium aquaticum identifiziert und als Corynebacterium aquaticum AKU610 bzw. AKU611 bezeichnet.
• Andere zuvor genannte Mikroorganismen sind in öffentlichen Hinterlegungsstellen (Kultursammlung), wie dem Institute of Fermentation Osaka, Japan (IFO), für jeden auf Antrag erhältlich. Beispiele für solche hinterlegten Stämme sind Planococcus okeanokoites AKU152 (IFO 15880) und Arthrobacter sulfureus AKU635 (IFO 12678).
• Das selektive asymmetrische Reduktionsverfahren der vorliegenden Erfindung kann diskontinuierlich, semidiskontinuierlich oder kontinuierlich in Wasser oder allgemein in einem Lösungsmittelmedium durchgeführt werden, das mit Wasser mischbar ist, die Levodionlöslichkeit erhöht und inert zu der Enzymreaktion ist, wie 0,01 bis 0,5 M Kaliumphosphatpuffer, ein anderer Puffer mit dem pH-Bereich 4 bis 10, Acetonitril, Ethanol oder N,N-Dimethylform amid. Die Konzentration von Levodion beträgt günstigerweise 400 bis 2.000 mg/1g trockene Zellen/l, vorzugsweise 400 bis 800 mg/1g trockene Zellen/l. Das selektive asymmetrische Reduktionsverfahren kann in einem pH-Bereich von 4 bis 9, vorzugsweise von 6 bis 7, in einem Temperaturbereich von 20 bis 50 °C, vorzugsweise 30 bis 40 °C, und von 10 Minuten bis zu 80 Stunden, vorzugsweise von 8 Stunden bis 24 Stunden durchgeführt werden.
• Das selektive asymmetrische Reduktionsverfahren der vorliegenden Erfindung wird günstigerweise in Gegenwart eines Co-Faktors, wie Nicotinamidadenindinucleotid (NAD), Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP), oder dem Co-Faktor mit Glukose und Glukosedehydrogenase (GDH) durchgeführt. Die Konzentration eines solchen Co-Faktors in dem Reaktionsmedium beträgt vorzugsweise 300 mM/l oder mehr, stärker bevorzugt von 700 mM/l bis 900 mM/l. Des weiteren kann die Ausbeute an Actinol durch Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels zu dem Reaktionsgemisch erhöht werden. Span^® 20, Span^® 80, Tween^® 20, Tween^® 40 (alle erhältlich von Wako Pure Chemical Ind., 3-1-2 Dosho-machi, Osaka, Japan) und dergleichen sind Beispiele für oberflächenaktive Mittel, die verwendet werden können. Die Menge an oberflächenaktivem Mittel in dem Reaktionsmedium beträgt günstigerweise 2 bis 20 mM/l, vorzugsweise etwa 8 mM/l.
• Nachdem die selektive asymmetrische Reduktion beendet worden ist, kann das so erhaltene Actinol durch Extrahieren mit einem wasserunlöslichen (Wasser-unmischbaren) organischen Lösungsmittel rückgewonnen werden, das das Actinol ohne weiteres löslich macht, wie Ethylacetat, n-Hexan, Toluol oder n-Butylacetat. Die weitere Reinigung von Actinol kann durch Konzentration des Extrakts zum direkten Kristallisieren des Actinols oder durch die Kombination verschiedener Arten der Chromatographie erreicht werden, wie Dünnschichtchromatographie, Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und/oder Gelfiltrationschromatographie. Wenn notwendig, kann auch die Hochleistungsflüssigchromatographie angewandt werden. Eine bevorzugte Rückgewinnung, die zu Actinolkristallen führt, beinhaltet das Extrahieren von Actinol mit Ethylacetat und die Konzentration des Extrakts, um Actinolkristalle zu erhalten.
• Als eine Alternative zu dem zuvor beschriebenen „ruhenden Zellreaktions"-Verfahren kann Actinol durch Fermentation der obigen Mikroorganismen in einem Nährmedium in Gegenwart von Levodion, d.h. in einer „wachsenden Zellreaktion" hergestellt werden. Beide Alternativen werden durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt.
• Als Nährmedien in dem „wachsenden Zellreaktions"-Verfahren können die verwendet werden, enthaltend Saccharide wie Glucose und Saccharose, Alkohole wie Ethanol und Glycerol, Fettsäuren wie Ölsäure und Stearinsäure oder Ester davon, oder Öle wie Rapsöl und Sojabohnenöl als Kohlenstoffquellen; Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Pepton, Aminosäuren, Maisquellwasser, Kleie, Hefeextrakt und dergleichen als Stickstoffquellen; Magnesiumsulfat, Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat und dergleichen als anorganische Salze; und Malzextrakt, Fleischextrakt und dergleichen als andere Nährstoffquellen. Als ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung kann Actinol durch Fermentation der obigen Mikroorganismen in einem Nährmedium in Gegenwart von Levodion hergestellt werden.
• Die Fermentation kann aerob, normalerweise für einen Inkubationszeitraum von 1 bis 7 Tagen bei einem mittleren pH von 3 bis 9 und einer Fermentationstemperatur von 10 bis 40 °C durchgeführt werden.
• Die bei der Fermentation zu verwendenden Mikroorganismen können in irgendeiner Form vorliegen, beispielsweise Kulturen, erhältlich durch Fermentation von Stämmen in flüssigen Medien, von den flüssigen Kulturen getrennte Zellen, getrocknete Zelle, erhältlich durch Verarbeitung von Zellen oder Kulturen, oder immobilisierte Zellen.
• Die folgenden Beispiele stellen die vorliegende Erfindung dar.
• Beispiel 1
• Ein flüssiges Medium (pH 7,0) bestehend aus 0,5 % 1,4-Cyclohexandion (analoge Struktur zu (6R)-2,2,6-Trimethylcyclohexandion; verwendet für das Screening), 0,5 % Tween^® 20, 0,1 % (NH₄)₂SO₄, 0,1 % K₂HPO₄, 0,02 % MgSO₄·7H₂O und 0,02 % Hefeextrakt wurden in Anteilen von 5 ml in Teströhrchen verteilt und dann bei 121 °C für 20 Minuten sterilisiert. Etwa 0,3 g der Bodenprobe wurden in jedes dieser Röhrchen eingeführt und für 24 Stunden bei 30 °C kultiviert. Ein Anteil von 0,1 ml der so erhaltenen Kultur wurde verwendet, um frisches Teströhrchenmedium wie zuvor zu inokulieren und dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, um die Zielmikroorganismen anzureichern. Die so erhaltene angereicherte Kultur wurde mit Salzlösung verdünnt und auf einem Agarmedium verteilt, bestehend aus denselben Bestandteilen wie zuvor. Gleichzeitig wurde der Überstand der Bodensuspension in Salzlösung entsprechend verdünnt und auch auf dem Agarmedium verteilt. Die Platten wurden bei 30 °C für 48 Stunden inkubiert. Die auf den Platten gewachsenen Kolonien wurden verwendet, um 5 ml flüssiges Medium (pH 7,0), bestehend aus 1,0 % Glucose, 0,3 % K₂HPO₄, 0,02 % MgSO₄·7H₂O, 1,5 % Pepton (Mikuni Kagaku Sangyo K. K., 4-1-6 Muro-machi, Nihonbashi, Chuo-ku, Tokio, Japan), 0,2 % NaCl und 0,1 % Hefeextrakt (Nacalai Tesuque Inc., Karasumaru Nishihairu, Nijohtouri, Nakakyo-ku, Kioto, Japan), in einem Röhrchen zu inokulieren. Nachdem die Röhrchen bei 30 °C für 24 Stunden inkubiert worden waren, wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und mit Salzlösung gewaschen. Die so erhaltenen Zellen wurden dem anschließenden Screening unterzogen. Zusätzlich zu den obigen Mikroorganismen wurden auch luftgetrocknete Zellen der Mikroorganismen für das Screening verwendet, die in einem Nährmedium kultiviert worden waren.
• Beispiel 2
• Ein Reaktionsgemisch (pH 7,0 in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer) enthaltend 0,6 mg NAD (Oriental Yeast Co., 3-6-10 Azusawa, Itabashi-ku, Tokio, Japan), 0,6 mg NADP (Oriental Yeast Co.), 50 mg D-Glucose und 0,2 mg D-Glucosedehydrogenase (Amano Pharmaceutical Co., 1-2-7 Nishiki, Naka-ku, Nagoya, Japan) wurde hergestellt. Etwa 0,3 g der in Beispiel 1 hergestellten Zellen wurden zu 1 ml des Reaktionsgemisches gegeben, gefolgt von einer ausreichenden Menge (6R)-2,2,6-Trimethylcyclohexandion, wodurch eine Endkonzentration von 0,5 % erreicht wurde. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei 30 °C für 24 Stunden unter Schütteln inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch mit 1 ml Ethylacetat extrahiert und konzentriert. Die Ausbeute und die optische Reinheit des (4R,6R)-4-Hydroxy-2,2,6-trimethyl-cyclohexanons wurde durch Gaschromatographie analysiert [Säule: HR-20M (Shinwa Chemical Ind., Keishyo-cho 50, Fushimi-ku, Kioto, Japan) 0,25 mmϕ × 30 m, Säulentemperatur: 160 °C (konstant), Injektortemperatur: 250 °C, Trägergas: He (ca. 1 ml/min)]. Die Ergebnisse werden in Tabelle III dargestellt.
• Tabelle III

  
• Beispiel 3
• Die Wirkung der Zugabe von NAD oder NADP zu dem Reaktionsgemisch wurde durch die Verwendung der in Tabelle III angegebenen Mikroorganismen ermittelt. Das basische Reaktionsgemisch enthielt alle in Beispiel 2 beschriebenen Komponenten, außer NAD und NADP. Die Zellen der in dem vorliegenden Beispiel verwendeten Mikroorganismen wurden luftgetrocknet und 10 mg der Zellmasse wurden in das Reaktionsgemisch eingeführt. Die Reaktion wurde bei 30 °C für 24 Stunden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV dargestellt, worin die Werte der optischen Reinheit (% e. e.) für das (4R,6R)-Isomer zutreffen, wie auch für die Tabellen V (Beispiel 4) und VI (Beispiel 5).
• Tabelle IV

  
• Beispiel 4
• Die Wirkung der Zugabe verschiedener oberflächenaktiver Mittel (Endkonzentration: 0,1 % Gew./V) in das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung der in Tabelle III angegebenen Mikroorganismen ermittelt. Das basische Reaktionsgemisch enthielt alle in Beispiel 2 beschriebenen Komponenten. Die Zellen der in dem vorliegenden Beispiel verwendeten Mikroorganismen wurden luftgetrocknet und 10 mg der Zellmasse wurden in das Reaktionsgemisch eingeführt. Die Reaktion wurde bei 30 °C für 24 Stunden durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle V dargestellt.
• Tabelle V

  
• Tabelle V (Fortsetzung)

  
• Beispiel 5
• Der Einfluß der Substratkonzentration auf die Reaktion wurde bei Konzentrationen von 0,5, 1,0 und 1,5 % ermittelt. Das basische Reaktionsgemisch enthielt alle in Beispiel 2 beschriebenen Komponenten. In dem vorliegenden Beispiel wurden die Zellen des Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448) luftgetrocknet und 10 mg der Zellmasse wurden in das Reaktionsgemisch eingeführt. Die Reaktion wurde bei 30 °C für 24 Stunden durchgeführt. Die Ergebnisse werden in Tabelle VI dargestellt.
• Tabelle VI

  
• Beispiel 6
• Das Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448) wurde bei 30 °C für 24 Stunden in 20 l des Kulturmediums, bestehend aus 0,1 % Hefeextrakt, 1,5 % Pepton, 2,0 % D-Glucose, 0,02 % MgSO₄·7H₂O, 0,3 % K₂HPO₄ und 0,2 % NaCl, unter Verwendung eines 30 Glasfermentors unter Rühren bei 400 U/min und Belüftung von 0,5 l pro Minute kultiviert. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 5.000 g für 5 Minuten von der Kultur gesammelt. Das Gewicht der Paste der so erhaltenen Zellen betrug 400 g.
• Dann wurden 12 g Levodion und 120 g D-Glucose zu der Zellpaste zugegeben und das Volumen wurde mit Ionen-ausgetauschtem Wasser auf 2,4 l aufgefüllt. Der pH wurde mit einer 2,0%igen NaOH-Lösung auf 7,0 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde in einen 2 l-Kolben überführt und bei 30 °C für 15 Stunden unter Schütteln bei 220 U/min inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Reaktionsgemisch durch Zentrifugieren bei 12.000 g für 5 Minuten getrennt. Das Volumen des so erhaltenen Reaktionsgemisches betrug 2,2 l und die optische Reinheit, die Ausbeute und die Konzentration von Actinol betrugen 96 % e. e., 93 % bzw. 4,6 g/l.
• Beispiel 7
• Das Reaktionsgemisch (10 l), hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben, wurde mit Ethylacetat (10 l) gemischt, um Actinol zu extrahieren. Die Ethylacetatphase (7,5 l) wurde getrennt und 350 g Aktivkohlepulver wurden zugegeben, wodurch es entfärbt wurde. Nach dem Rühren für 10 Minuten wurde das Kohlepulver durch Filtration entfernt. 600 g wasserfreies Na₂SO₄ wurden zu den 6,5 l Ethylacetatlösung zur Dehydratisierung zugegeben. Nach dem Rühren für ein paar Minuten wurde das Na₂SO₄ durch Filtration entfernt. Die Ethylacetatlösung (6,0 l) wurde unter reduziertem Druck bei 30 °C auf 50 ml konzentriert. Zu dem so erhaltenen Konzentrat wurden 5 l n-Hexan zugegeben und das Gemisch wurde für 5 Minuten gerührt, dann auf 5 °C abgekühlt und für 12 Stunden bei dieser Temperatur gehalten, wodurch Actinol kristallisierte. Das kristallisierte Actinol wurde durch Filtration gesammelt und dann getrocknet. Das Gewicht der so erhaltenen Actinolkristalle betrug 32 g und die Reinheit, die optische Reinheit und die Ausbeute des Actinols betrugen 96 %, 96 % e. e bzw. 70 %.
• Beispiel 8
• Die Impfkulturlösung (150 ml) des Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448) wurde in 3 l des Fermentationsmediums, bestehend aus 0,1 % Hefeextrakt, 1,5 % Pepton, 2,0 % Glucose, 0,02 % MgSO₄·7H₂O, 0,3 % K₂HPO₄, 0,2 % NaCl und 0,3 % Levodion, inokuliert. Die Fermentation wurde bei 30 °C für 48 Stunden unter Verwendung eines 5 l Glasfermentors unter Rühren bei 250 U/min und Belüftung von 1,5 l pro Minute durchgeführt. Der pH der Fermentationslösung wurde durch NH₃-Gas auf 7,0 geregelt. Nach der Fermentation wurde die Nährlösung entfernt und die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 12.000 g für 5 Minuten gesammelt. Die optische Reinheit, die Ausbeute und die Konzentration des Actinols in der Nährlösung betrugen 96 % e. e., 71 % bzw. 2,1 g/l.

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung von (4R,6R)-4-Hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanon, umfassend das Kontaktieren von (6R)-2,2,6-Trimethylcyclohexandion mit einem Mikroorganismus, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cellulomonas sp. AKU672 (FERM BP-6449), Corynebacterium aquaticum AKU610 (FERM BP-6447), Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448), Planococcus okeanokoites AKU152 (IFO 15880) oder Arthrobacter sulfureus AKU635 (IFO 12678), und der zur selektiven asymmetrischen Reduktion von (6R)-2,2,6-Trimethylcyclohexandion zu (4R,6R)-4-Hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanon fähig ist, und die Rückgewinnung des resultierenden (4R,6R)-4-Hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanons aus dem Reaktionsgemisch.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die selektive asymmetrische Reduktion in Gegenwart von NAD, NADP oder NAD oder NADP mit Glukose und GDH durchgeführt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die selektive asymmetrische Reduktion in Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die selektive asymmetrische Reduktion in einem pH-Bereich von 4 bis 9, in einem Temperaturbereich von 20 bis 50 °C und für 10 Minuten bis 80 Stunden durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Rückgewinnung des resultierenden (4R,6R)-4-Hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanons aus dem Reaktionsgemisch durch Extrahieren des (4R,6R)-4-Hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanons mit Ethylacetat und Konzentrieren des resultierenden Extrakts unter Erhalt von Kristallen von (4R,6R)-4-Hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanon durchgeführt wird.
6. Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cellulomonas sp. AKU672 (FERM BP-6449), Corynebacterium aquaticum AKU610 (FERM BP-6447) und Corynebacterium aquaticum AKU611 (FERM BP-6448).
7. Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Planococcus okeanokoites AKU 152 (IFO 15880) und Arthrobacter sulfureus AKU635 (IFO 12678).