CN1152133C - 左旋二酮还原酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有下列理化性质的左旋二酮还原酶：分子量：142,000-155,000±10,000，由四个分子量为36,000±5,000的相同亚基组成；辅因子：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)；底物特异性：对左旋二酮具有活性；最适温度：在pH7.0时为15-20℃；最适pH7.5；激活剂：K+、Cs+、Rb+、Na+和NH4 +。该酶能从左旋二酮生产放线醇，产自属于棒杆菌属的微生物，优选的是微生物水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)或其功能等同物、传代培养物、突变体、变种。本发明的另一个方面是一种生产左旋二酮还原酶的方法。本发明还提供了从左旋二酮生产放线醇的方法。

Description

左旋二酮还原酶
技术领域
本发明涉及一种新型酶，即左旋二酮(levodione)还原酶，涉及一种用于生产该酶的方法，以及使用该酶从(6R)-2，2，6-三甲基环己烷-1，4-二酮(下文称为左旋二酮)生产(4R，6R)-4-羟基-2，2，6-三甲基环己酮(下文称为放线醇(actinol)的方法。放线醇是生产玉米黄质的重要中间体。
背景技术
在欧洲专利申请98115564.1(1998年8月19日提交)和随后的欧洲申请99115723.1(1999年8月16日提交并要求在先申请的优先权)中，公开了一种制造放线醇的方法，该方法包括使左旋二酮与一种微生物接触，该微生物选自纤维单胞菌属(Cellulomonas)、棒杆菌属(Corynebacterium)、动性球菌属(Planococcus)和节杆菌属(Arthrobacter)，并能使左旋二酮选择性地非对称还原为放线醇，然后从反应混合物中回收形成的放线醇。人们发现水生棒杆菌(Corynebacterium aquaticum)AKU611(FERM BP-6448)是用于这种用途的最好的微生物菌株之一。
微生物菌株水生棒杆菌AKU611的分类学特性如下：
1)可生长的温度：15-40℃
2)最适生长温度：30℃
3)专性好氧性及革兰氏阴性微生物
4)孢子形成：无
5)在培养过程中可以观察到多态性和传统的棒状-球状(rod-cocus)周期。
6)运动性：无
而且，通过Biolog System(Biolog公司，3447 Investment Blvd.，Suite 3，Hayward，California 94545，美国：自然(Nature)，339，157-158，1989年5月11日)基于多种碳源的同化对菌株水生棒杆菌AKU611的鉴定如下：将该菌株的细胞接种到96-孔微滴定板上，在28℃下培养24小时。每孔包含在BUGM+B培养基(Biolog通用生长培养基+血液；Biolog公司)中的96种碳源中的一种。
在培养后，该菌株表现出了下列的碳源同化作用：
碳源                     碳源
A1  -                    A2  -
A3  -                    A4  -
A5  -                    A6  -
A7  -                    A8  +
A9  +                    A10 -
A11 -                    A12 +
B1  -                    B2  +
B3  -                    B4  -
B5  +                    B6  -
B7  +                    B8  -
B9  +                    B10 +
B11 +                    B12 -
C1  -                    C2  -
C3  -                    C4  +
C5  +                    C6  +
C7  -                    C8  +
C9  -                    C10 -
C11 -                    C12 -
D1  -                    D2  -
D3  +                    D4  -
D5  +                    D6  -
D7  -                    D8  +
D9  -                    D10 -
D11 +                    D12 +
E1  -                    E2  -
E3  +                    E4  -
E5  -                    E6  -
E7  -                    E8  -
E9  -                    E10 -
E11 -                    E12 -
F1  -                    F2  -
F3  -                    F4  -
F5  -                    F6  +
F7  -                    F8  -
F9  -                    F10 -
F11 -                    F12 -
G1  -                    G2  -
G3  -                    G4  -
G5  -                           G6  -
G7  -                           G8  -
G9  -                           G10 -
G11 -                           G12 -
H1  -                           H2  -
H3  -                           H4  -
H5  -                           H6  -
H7  -                           H8  -
H9  -                           H10 -
H11 -                           H12 -
A1：水                          A2：α-环糊精
A3：β-环糊精                   A4：糊精
A5：糖原                        A6：菊粉
A7：甘露聚糖                    A8：Tween_40
A9：Tween_80                  A10：N-乙酰-D-葡糖胺
A11：N-乙酰-D-甘露糖胺
A12：扁桃苷                     B1：L-阿拉伯糖
B2：D-阿糖醇                    B3：熊果苷
B4：纤维二糖                    B5：D-果糖
B6：L-岩藻糖                    B7：D-半乳糖
B8：D-半乳糖醛酸                B9：龙胆二糖
B10：D-葡糖酸                   B11：α-D-葡萄糖
B12：m-肌醇                     C1：α-D-乳糖
C2：乳果糖                      C3：麦芽糖
C4：麦芽三糖(maltotriitrose)    C5：D-甘露糖醇
C6：D-甘露糖                    C7：D-松三糖
C8：D-蜜二糖                    C9：α-甲基-D-半乳糖苷
C10：α-甲基-D-半乳糖苷         C11：3-甲基-葡萄糖
C12：α-甲基-D-葡糖苷           Dl：β-甲基-D-葡糖苷
D2：α-甲基-D-甘露糖苷          D3：腭糖(palatinose)
D4：D-阿洛酮糖                  D5：D-棉子糖
D6：L-鼠李糖                    D7：D-核糖
D8：水杨苷                      D9：景天庚酮糖
D10：D-山梨醇                   D11：水苏糖
D12：蔗糖                       E1：D塔格糖
E2：D-海藻糖                    E3：土冉糖
E4：木糖醇                      E5：D-糖
E6：乙酸                        E7：α-羟丁酸
E8：β-羟丁酸                   E9：γ-羟丁酸
E10：对羟基苯乙酸
E11：α-酮戊二酸                E12：α-酮戊酸
Fl：乳酰胺                      F2：D-乳酸甲酯
F3：L-乳酸                      F4：D-苹果酸
F5：L-苹果酸                    F6：丙酮酸甲酯
F7：丁二酸单甲酯                F8：丙酸
F9：丙酮酸                      F10：琥珀酰胺酸
F11：琥珀酸                     F12：N-乙酰-L-谷氨酸
G1：丙氨酰胺                    G2：D-丙氨酸
G3：L-丙氨酸                    G4：L-丙氨酰甘氨酸
G5：L-天冬酰胺                  G6：L-谷氨酸
G7：甘氨酰-L-谷氨酸             G8：L-pyloglutamic acid
G9：L-丝氨酸                    G10：腐胺(putrscine)
G11：2，3-丁二醇                G12：甘油
Hl：腺苷                        H2：2′-脱氧-腺苷
H3：肌苷                        H4：胸苷
H5：尿苷                        H6：腺苷-5′-单磷酸
H7：胸苷-5′-单磷酸
H8：尿苷-5′-单磷酸
H9：果糖-6-磷酸                 H10：葡萄糖-1-磷酸
H11：葡萄糖-6-磷酸              H12：DL-α-甘油磷酸
发明内容
本发明的一个目的是提供新的左旋二酮还原酶，该左旋二酮还原酶可作用于左旋二酮产生放线醇。左旋二酮还原酶具有下列理化性质：
a)分子量：142,000-155,000±10,000(由四个分子量为36,000±5,000的相同亚基组成)
b)辅因子：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)
c)底物特异性：对左旋二酮具有活性
d)最适温度：在pH 7.0时为15-20℃
e)最适pH：7.5
f)激活剂：K+、Cs+、Rb+、Na+和NH4 +
本发明的另一个目的是提供一种生产如上所述的新左旋二酮还原酶的方法，该方法包括通过在液体营养培养基中、好氧条件下培养属于棒杆菌属的微生物，其中该微生物能产生具有上述理化性质的左旋二酮还原酶；破坏所述微生物的细胞；从所述微生物破坏的细胞之无细胞提取物中分离并纯化左旋二酮还原酶。本发明的另一个目的是提供一种使用左旋二酮还原酶从左旋二酮生产放线醇的方法，该方法包括：使左旋二酮与(i)如上所述的左旋二酮还原酶在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)存在下接触，或(ii)与所述的微生物的无细胞提取物接触，然后分别在(i)和(ii)的情况下从反应混合物中分离形成的放线醇。
根据下面所述的实施例制备的左旋二酮还原酶的纯化样品的理化性质如下：
1) 酶活性
本发明的新左旋二酮还原酶在辅因子存在下根据下式催化左旋二酮还原成放线醇：
在此还原系统中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH)的还原形式不能用作电子供体。
标准的酶测定进行如下：总体积为500μl的基本反应混合物(由100μl1M的磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、20μl在0.2mM KOH中的8mM NADH、10-40μl的酶溶液并加水至500μl组成)在37℃下温育1分钟。然后加入2μl0.5M的左旋二酮溶液以达到2mM的最终浓度，将整个溶液在37℃下温育1分钟。用在340nm下NADH吸光度的降低来测定酶活性。一单位的酶活性定义为每分钟催化1μmol NADH氧化的酶的量。
NAD、NADH和NADPH可从日本东京Oriental Yeast，3-6-10 Azusawa，Itabashi-ku获得。
蛋白质浓度通过使用Bio-Rad蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad试验室，2000Alfred Nobel Drive，Hercules，CA 94547，美国)测定。
2) 分子量
所述酶的分子量(MW)使用凝胶过滤HPLC柱Cosmosil 5Diol-300(nacalai tesque：Nishi-iru，Karasuma，Nijodohri，Nakagyouku，Kyoto-fu，日本)测定。与下列分子量标记蛋白质相比较，计算出全酶的表观分子量为142,000-155,000±10,000：LMW+HMW凝胶过滤校准试剂盒，Amersham Pharmacia Biotech(SE-75184 Uppsala，瑞典)；铁蛋白(MW440,000)；醛缩酶(MW 158,000)；牛血清白蛋白(MW 67,000)；卵清蛋白(MW 43,000)以及核糖核酸酶A(MW 13,700)。与下列分子量标记蛋白质相比较，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)得出了分子量为36,000±-5,000的单条带：LMW电泳校准试剂盒，Amersham PharmaciaBiotech；牛血清白蛋白(MW 67,000)；卵清蛋白(MW 43,000)；碳酸酐酶(MW 30,000)；大豆胰蛋白酶抑制剂(MW 20,100)以及α-乳清蛋白(MW14,400)。这表明该酶是由四个亚基组成的。全酶的分子量的值(142,000-155,000±10,000)和每个亚基分子量的值(36,000±5,000)使用各自所允许的方法(即凝胶过滤柱方法和SDS-PAGE方法)精确地测定。
3) 辅因子
研究了所述的酶将左旋二酮转变为放线醇所需的辅因子。结果是：确立NADH可以作为这种还原反应的辅因子，但是NADPH不能。
4) 底物特异性
除了使用每种底物溶液(在反应混合物中的最终浓度为2mM)替换左旋二酮外，使用与1)中所述的相同酶测定方法测定所述酶的底物特异性。结果表明左旋二酮是该酶表现出活性的唯一底物。
                      表1
    底物     酶活性(单位/ml)
    左旋二酮     5.66
    环己酮     未检测到(ND)
    1，2-环己二酮     ND
    1，3-环己二酮     ND
    1，4-环己二酮     ND
    环戊酮     ND
    2-环己烯     ND
    1，5，5-三甲基环己烯     ND
    1，3-环戊二酮     ND
    DL-甲羟戊酸内酯     ND
    D-樟脑     ND
    L-樟脑     ND
    顺丁烯二酸酐     ND
    4-氯-3-氧代-丁酸乙酯     ND
5) 最适温度
在2至45℃的温度下测定酶活性。酶活性的最适温度是15-20℃。
               表2
    温度(℃)     相对活性(％)
    2     77.8
    5     83.8
    10     89.1
    15     100
    20     92.4
    25     90.9
    30     78
    35     70.7
    40     59.4
    45     31.6
6) 最适pH
除了使用多种pH和缓冲液以及向反应混合物中添加40μl 2.5M KCl溶液外，使用如1)中所述的相同酶测定方法测定酶活性和反应混合物pH值之间的关系。测得酶反应的最适pH为7.5。
                             表3
    缓冲液     pH     相对活性(％)
磷酸钾缓冲液     5.5     59.3
    6.0     68.5
    7.0     78.4
    7.5     100
[4-(2-羟基乙基)-哌嗪]-乙基磺酸(HEPES)     7.0     7.2
    7.5     10.0
    8.0     21.7
    8.5     21.9
Tris-HCl     8.5     6.5
    9.0     3.9
    10.0     1.3
7) 金属离子的影响
除了使用100μl 1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)替代100μl 1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)，以及向反应混合物中添加多种金属离子以达到100mM至3M的金属离子最终浓度外，使用如1)中所述的相同酶测定方法测定金属离子对酶活性的影响。结果表明在3M RbCl和1.8M CsCl存在下酶活性增加了大约250倍。
                     表4-1
金属   浓度(mM)   相对活性(％)
NaCl   3   0.4
RbCl(+3mM NaCl)   100   6.4
  200   7.5
  400   23.3
  800   32.6
  1600   66.4
  1800   65.1
  2000   93.2
  2500   93.3
  3000   100
CsCl(+3mM NaCl)   100   5.9
  200   14.3
  400   28.3
  800   48.1
  1600   71.4
  1800   100
  2000   86.8
  2500   88.4
  3000   88.0
               表4-2
金属   浓度(mM)   相对活性(％)
无   0   2.8
KCl   200   11.5
  400   22.2
  800   40.5
  1600   45.3
  1800   33.5
  2000   28.4
  2500   25.9
  3000   25.2
NH4Cl   100   6.4
  200   21.3
  400   39.3
  800   67.1
  1600   100
  1800   75.3
NaCl   100   4.2
  200   7.7
  400   19.7
  800   35.9
  1600   75.3
  1800   62.8
  2000   62.8
  2500   53.9
  3000   34.1
8) 温度稳定性
将酶溶液在不同温度下处理10分钟，然后使用如1)中所述的相同酶测定方法测定剩余的酶活性。测得该酶在高达35℃时稳定，随着温度的提高逐渐失活，在55℃时完全失活。
             表5
    温度(℃)     相对活性(％)
    0     100
    30     93.3
    35     85.1
    40     47.8
    45     28.9
    50     3.2
    55     0
9) pH稳定性
在30℃下将该酶在多种pH的1M缓冲液中处理10分钟，然后使用如1)中所述的相同酶测定方法测定剩余的酶活性。测得该酶在8.0至8.5的pH范围内最稳定。
                     表6
    缓冲液     pH     相对活性(％)
    Bis-tris     6     40.6
    7     71.9
    HEPES     7     63.4
    7.5     61.6
    8     91.6
    Tris-HCl     8.5     100
    9     85.3
10) 米氏常数(Km)和最大速度(Vmax)值
使用左旋二酮和放线醇作为底物测定该酶的Km和Vmax值。基本的酶测定方法与1)中所述的方法相同，但是底物和酶浓度不同。左旋二酮作为底物时的Km和Vmax值分别为8.5mM和101.26单位/mg。而放线醇作为底物时的Km和Vmax值分别为1.36mM和15.91单位/mg。
Km和Vmax值在已知的米氏方程的基础上计算。Km是达到酶反应的Vmax的50％时的底物浓度。该值是该酶对所用底物的催化活性的有用指示值。
11) 纯化过程
原则上左旋二酮还原酶的纯化可以由下列已知的纯化方法的任意组合完成：如使用沉淀剂(如硫酸铵、聚乙二醇等)、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤层析、凝胶电泳和盐析与透析等进行分级分离。
如上所述，本发明所提供的左旋二酮还原酶可以通过如下方法制备：在液体营养培养基中、有氧条件下培养适当的微生物，破坏所述微生物的细胞，并从所破坏微生物的细胞之无细胞提取物中分离并纯化左旋二酮还原酶。
用于本发明的微生物是属于可以产生上文定义的左旋二酮还原酶的棒杆菌属的微生物。所述微生物的功能等同物、传代培养物、突变体、变种也可用于本发明。
优选的菌株是水生棒杆菌。在本发明中使用的最优选的特定菌株是水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6448)，该菌株的一个样品已根据布达佩斯条约于1998年8月4日保藏在日本工业科技局的国立生命科学和人类技术研究所中。
而且，欧洲专利申请98115564.1(1998年8月19日提交)和随后的欧洲申请99115723.1(1999年8月16日提交并要求在先申请的优先权)公开了该菌株的某些特性。
该微生物可以在含有下列物质的营养培养基上培养：糖(如葡萄糖和蔗糖)、醇(如乙醇和甘油)、脂肪酸(如油酸和硬脂酸)及其酯或油(如油菜籽油和大豆油)作为碳源；硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、氨基酸、玉米浆、麸糠、酵母提取物等作为氮源；硫酸镁、氯化纳、碳酸钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等作为无机盐来源；麦芽提取物、肉膏提取物等作为其它营养源。培养可以在好氧条件下进行，通常在3至9的培养基pH、10至40℃的培养温度下进行1-7天。
在培养后从所述微生物中分离和纯化左旋二酮还原酶的实施方案如下：
(1)通过离心或过滤从液体培养液中收获细胞。
(2)用水、生理盐水或适当pH的缓冲液洗涤所收获的细胞。
(3)将洗涤后的细胞悬浮在缓冲液中，通过匀浆器、超声波机、弗氏压碎器破坏或用溶菌酶等处理以形成破坏细胞的溶液。
(4)从所破坏细胞的无细胞提取物中分离并纯化左旋二酮还原酶。
本发明所提供的左旋二酮还原酶可用作从左旋二酮生产放线醇的催化剂。
左旋二酮还原酶催化的左旋二酮还原为放线醇的反应可以方便地在NADH存在时、大约6.0至大约9.0的pH值下在溶剂中进行。作为溶剂，任何可将pH保持在大约6.0至大约9.0的缓冲液(如Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、Bis-tris缓冲液、HEPES缓冲液等)都是适合的。
进行该反应的优选的温度范围是大约2至大约30℃。当pH和温度分别在大约7.0至8.0和10至25℃的范围中时，反应通常产生最好的结果。
在溶剂中左旋二酮的浓度依赖于其它反应条件，但通常是1mM至2M，优选的是10mM至100mM。
存在于反应混合物中的左旋二酮还原酶和NADH的适当量依赖于其它反应条件，但通常是在每种情况下独立地为底物量的大约10-4至10-6。当从NAD到NADH的再生系统与上述反应系统偶联时，反应进行得更有效。
在该反应中，左旋二酮还原酶也可以以用适当载体固定化的状态使用。可以使用在本领域公知的任何固定化酶的方式。例如，可以将酶直接结合到具有一个或多个官能团的膜、颗粒剂或树脂类等物质上，也可以通过具有一个或多个官能团的桥连化合物(如戊二醛)等酶连接到树脂上。在如《微生物酶和生物技术》第二版(Elsevier Applied Science 1990；W.M.Fogarty和C.T.Kelly，编)的369-394页中描述了这样的酶固定化方式。
具体实施方式
下列实施例进一步说明了本发明。
                              实施例1
左旋二酮还原酶的制备
所有操作均在4℃下进行，除非特别指出，所有缓冲液是包含0.1mM二硫苏糖醇的10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)。
(1)水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6488)的培养
将琼脂板上的水生棒杆菌AKU611(FERM BP-6488)的一个菌落接种入试管中含D-葡萄糖(1％)、KH2PO4(0.3％)、MgSO4·7H2O(0.02％)、蛋白胨(1.5％)、NaCl(0.2％)和酵母提取物(0.1％)的5ml培养基(pH 7.0)中，并在30℃下培养20小时。将培养物接种入2升坂口氏烧瓶中的500ml与上述培养基相同的培养基中，并在30℃下培养20小时。将250ml的种子培养物接种入发酵罐MSJ-U3W(Marubishi Bioengineering，2-20-15，Higashikanda，Chiyoda-ku，东京，日本)中20升相同培养基中。在20升/分的通风速率和300转/分的搅动下在30℃培养20小时。将这样获得的培养物于4℃下以8,000转/分离心20分钟。总共获得了133.8g的湿细胞。
(2)无细胞提取物的制备
将湿细胞(30g)悬浮在90ml的缓冲液中，使用Kubota Insonator 201超声波器(Kubota，3-29-9 Hongo，Bunkyo-ku，东京，日本)在190W下超声波处理1小时。超声波处理后，将样品以16,000转/分离心20分钟。结果得到了80ml包含2,444mg蛋白质的无细胞提取物。
(3)硫酸铵沉淀
向上一步骤中获得的无细胞提取物(80ml)中添加硫酸铵直至饱和浓度的60％。然后通过离心收集形成的沉淀，将其溶解在15ml缓冲液中，对5升缓冲液透析四次。在该溶液中总酶活性为38.8单位。
(4)二乙基氨基乙基(下文称为DEAE)-Sephacel柱层析
将上述制备的透析样品加入已用缓冲液平衡的DEAE-Sephacel柱(直径2.8cm，高度18cm；Amersham Pharmacia Biotech)中。在用相同缓冲液清洗柱后，用600ml线性梯度的NaCl(0-0.8M)洗脱所述酶。收集活性级分并通过超滤(超滤器YM-10，Amicon浓缩器(Amicon公司，Beverly，MA 01915，美国))浓缩至10ml。
(5)烷基Superose柱层析
向上一步制备的样品添加(NH4)2SO4至2M的最终浓度，过滤混合物。用含2M(NH4)2SO4的缓冲液平衡烷基Superose 10/10柱(直径1cm，高度10cm；Amersham Pharmacia Biotech)，然后加入上述样品。用150ml线性梯度的缓冲液[2-0M(NH4)2SO4]洗脱所述酶。收集活性级分并对5升缓冲液透析四次。
(6)MONO Q HR5/5柱层析
将上一步的透析样品添加进已用缓冲液平衡的MONO Q HR5/5柱(直径5mm，高度5cm；Amersham Pharmacia Biotech)中。用21ml线性梯度的NaCl(0-0.8M)洗脱所述酶。由于该层析之前透析过程中酶的失活，酶的比活性并没有增加。但酶在SDS-PAGE分析中为一条均一带。
该酶的纯化步骤的概要如表7所示。
                                        表7
    步骤 总活性(单位) 总蛋白质(mg) 比活性(单位/mg) 产量(％)
无细胞提取物     -     2444      -     -
60％(NH4)2SO4沉淀     38.8     427      0.91     100
DEAE Sephacel     22     30      0.73     57
烷基Superose     15.2     0.92      16.5     39
MONO Q 5/5     5.4     0.38      14.2     14
(7)反应产物的鉴别
将包含50mg NADH、833μl 1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、2ml得自DEAE-Sephacel柱层析纯化步骤的酶样品以及550μl蒸馏水的反应混合物(3.33ml)在30℃下温育。以6分钟的时间间隔五次向该反应混合物中添加10μl 0.5M左旋二酮溶液。将反应混合物再温育5分钟，然后用1ml乙酸乙酯提取。用气相色谱[柱：HR-20M(Shinwa，50 Keisho-Machi，Fushimi-ku，Kyoto-shi，东京，日本)，0.25mm直径×30m，柱温：160℃(恒定)，注射器温度：250℃，载气：He(大约1ml/分钟)]分析提取物。结果表明：与放线醇的标准样品相比，可以确定该产品是放线醇。当用NADPH替换NADH时，仅检测到痕量的放线醇。

Claims (6)

1.一种左旋二酮还原酶，该酶源于棒杆菌属的微生物并具有下列理化性质：
a)分子量：142,000-155,000±10,000，由四个分子量为36,000±5,000的相同亚基组成
b)辅因子：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，即：NAD/NADH
c)底物特异性：对左旋二酮具有活性
d)最适温度：在pH 7.0时为15-20℃
e)最适pH：7.5
f)激活剂：K+、Cs+、Rb+、Na+和NH4 +。
2.根据权利要求1的左旋二酮还原酶，其中所述的微生物是水生棒杆菌AKU611，保藏号FERM BP-6448。
3.一种生产左旋二酮还原酶的方法，该酶具有下列理化性质：
a)分子量：142,000-155,000±10,000，由四个分子量为36,000±5,000的相同亚基组成
b)辅因子：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，即：NAD/NADH
c)底物特异性：对左旋二酮具有活性
d)最适温度：在pH 7.0时为15-20℃
e)最适pH：7.5
f)激活剂：K+、Cs+、Rb+、Na+和NH4 +
该方法包括：在液体营养培养基中、好氧条件下培养属于棒杆菌属的、能产生具有上述理化性质的左旋二酮还原酶的微生物，破坏所述微生物的细胞，从所破坏的微生物细胞的无细胞提取物中分离并纯化左旋二酮还原酶。
4.根据权利要求3的方法，其中所述的微生物是水生棒杆菌AKU611，保藏号FERM BP-6448。
5.一种从左旋二酮生产放线醇的方法，该方法包括将左旋二酮：
(i)在还原形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸存在下与具有下列理化性质的源于棒杆菌属的微生物的左旋二酮还原酶接触：
a)分子量：142,000-155,000±10,000，由四个分子量为36,000±5,000的相同亚基组成
b)辅因子：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，即：NAD/NADH
c)底物特异性：对左旋二酮具有活性
d)最适温度：在pH 7.0时为15-20℃
e)最适pH：7.5
f)激活剂：K+、Cs+、Rb+、Na+和NH4 +
或者与(ii)所述微生物的无细胞提取物接触，
然后在每种情况下从反应混合物中分离形成的放线醇。
6.根据权利要求5的方法，其中所述的微生物是水生棒杆菌AKU611，保藏号FERM BP-6448。
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