DE69908644T2

DE69908644T2 - Kombnationen von cholesteryl ester transfer protein inhibitoren und gallensäure sequestriermitteln für kardiovaskuläre indikationen

Info

Publication number: DE69908644T2
Application number: DE69908644T
Authority: DE
Inventors: A. James SIKORSKI; C. Kevin GLENN
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2019-12-18
Also published as: DK1140185T3; WO2000038723A1; JP2002533409A; CA2356240A1; EP1340510A1; ATE242008T1; US6569905B1; AU2157500A; EP1140185A1; ES2203239T3; EP1140185B1; DE69908644D1; US20040028644A1; CA2356240C; PT1140185E

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen, die nützlich für die Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen sind, und bezieht sich insbesondere auf Kombinationen von Verbindungen, Zusammensetzungen und deren Verwendung in der Medizin, insbesondere bei der Prophylaxe und Behandlung von hyperlipidämischen Krankheitsbildern, und bei solchen, welche mit Atherosklerose, Hypercholesterinämie und anderen Koronararterienerkrankungen bei Säugern einhergehen. Noch spezieller bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Cholesterinester-Transfer-Protein (CETP)-Aktivitäts-inhibierende Verbindungen. Die Erfindung bezieht sich auch auf Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindungen.
Beschreibung des Standes der Technik
Es herrscht die feste Meinung, dass hyperlipidämische Krankheitsbilder, die mit erhöhten Konzentrationen von Gesamtcholesterin und Lipoprotein niedriger Dichte (LDL)-Cholesterin verbunden sind, Hauptrisikofaktoren für koronäre Herzerkrankungen und insbesondere Atherosklerose sind. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass eine niedrige Plasmakonzentration von Lipoprotein hoher Dichte (HDL)-Cholesterin ein starker Risikofaktor für die Entwicklung von Atherosklerose ist (Barter und Rye, Atherosclerosis, 121, 1–12 (1996). HDL ist eine der Hauptklassen von Lipoproteinen, die eine Funktion beim Transport von Lipiden durch das Blut erfüllen. Die Hauptlipide, die man in Verbindung mit HDL findet, schließen Cholesterin, Cholesterinester, Triglyceride, Phospholipide und Fettsäuren mit ein. Die anderen Klassen von Lipoproteinen, die im Blut gefunden werden, sind Lipoprotein geringer Dichte (LDL), Lipoprotein mittlerer Dichte (IDL) und Lipoprotein sehr geringer Dichte (VLDL). Da niedrige HDL-Cholesterin-Spiegel das Risiko von Atherosklerose erhöhen, waren Verfahren zur Erhöhung von Plasma-HDL-Cholesterin für die Behandlung von Atherosklerose und anderen Krankheiten, die mit der Akkumulation von Lipiden in den Blutgefäßen einhergehen, therapeutisch vorteilhaft. Diese Krankheiten schließen koronare Herzkrankheit, peripher-vaskuläre Krankheiten und Hirnschlag mit ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Atherosklerose liegt den meisten koronaren Herzkrankheiten (KHK, engl.: CAD) zugrunde, ein Hauptgrund für Morbidität und Sterblichkeit in der modernen Gesellschaft. Es wurde gezeigt, dass hohes LDL-Cholesterin (oberhalb von ungefähr 180 mg/dl) und niedriges HDL-Cholesterin (unter 35 mg/dl) wichtige Mitwirkende der Entwicklung von Atherosklerose sind. Andere Krankheiten oder Risikofaktoren, wie z. B. peripher-vaskuläre Krankheiten, Hirnschlag und Hypercholesterinämie, werden durch ungünstige HDL/LDL-Verhältnisse negativ beeinflusst.
Es wurde herausgefunden, dass die Beeinflussung der Rückführung von Gallensäuren aus dem Lumen des Verdauungstraktes die Serumcholesterinspiegel in einem kausalen Zusammenhang reduziert. Es haben sich epidemiologische Daten angesammelt, die Hinweise darauf geben, dass eine solche Reduktion zu einer Verbesserung des Krankheitszustandes der Atherosklerose führen. Stedronsky, in "Interaction of bile acids and cholesterol with nonsystemic agents having hypocholesterolemic properties, "Biochimica et Biophysica Acta, 1210, 255–287 (1994) diskutiert die Biochemie, Physiologie und bekannte aktive Agentien im Umfeld von Gallensäuren und Cholesterin.
Es wurde gezeigt, dass die Inhibierung von Cholesterylester-Transferprotein (CETP) effektiv Plasma-HDL/LDL-Verhältnisse verändert, und man erwartet, dass diese das Fortschreiten und/oder die Bildung von bestimmten kardiovaskulären Krankheiten kontrolliert. CETP ist ein Plasmaprotein, das die Bewegung von Cholesterinestern und Triglyceriden zwischen den verschiedenen Lipoproteinen im Blut erleichtert (Tall, J. Lipid Res., 34, 1255–74 (1993)). Die Bewegung von Cholesterinester von HDL zu LDL durch CETP hat die Wirkung, HDL-Cholesterin zu erniedrigen. Es folgt daraus, dass die Inhibierung von CETP zu einer Erhöhung von Plasma-HDL-Cholesterin und zu einer Erniedrigung von Plasma-LDL-Cholesterin führen sollte, und dabei zu einem therapeutisch vorteilhaften Plasma-Lipid-Profil führen sollte. Ein Beweis für diese Wirkung ist in McCarthy, Medicinal Res., Revs., 13, 139–59 (1993) beschrieben. Weitere Beweise für diese Wirkung sind in Sitori, Pharmac. Ther., 67, 443–47 (1995)) beschrieben. Dieses Phänomen wurde als erstes von Swenson et al., (J. Biol. Chem., 264, 14318 (1989)) mit der Verwendung von einem monoclonalen Antikörper, der spezifisch CETP inhibiert, gezeigt. Bei Kaninchen verursachte der Antikörper eine Erhöhung des Plasma-HDL-Cholesterins und eine Erniedrigung des LDL-Cholesterins. Son et al. (Biochim. Biophys. Acta, 795, 743–480 (1984)) beschreiben Proteine des menschlichen Plasmas, die CETP inhibieren. Das U.S. Patent 5 519 001, das für Kushwaha et al. erteilt wurde, beschreibt ein Peptid mit 36 Aminosäuren, abgeleitet von Pavian-apo-C-1, das CETP-Aktivität inhibiert. Cho et al. (Biochim. Biophys. Acta 1391, 133–144 (1998)) beschreiben ein Peptid aus Schweineplasma, das humanes CETP inhibiert. Bonin et al. (J. Peptide Res., 51, 216–225 (1998)) offenbaren einen Decapeptid-Inhibitor von CETP. Ein Depsipeptid-Pilzmetabolit wird als CETP-Inhibitor von Hedge et al. in Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, 1277–80 (1998) offenbart.
Es gab etliche Berichte von nicht-peptidischen Verbindungen, die als CETP-Inhibitoren wirken. Barrett et al. (J. Am. Chem. Soc., 188, 7863–63 (1996)) beschreiben Cyclopropan-enthaltende CETP-Inhibitoren. Weitere Cyclopropan-enthaltende CETP-Inhibitoren werden von Kuo et al. beschrieben (J. Am. Chem. Soc., 117, 10629–34 (1995)). Pietzonka et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 1951–54 (1996)) beschreiben Phosphonat-enthaltende Analoga von Cholesterinester als CETP-Inhibitoren. Coval et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett., 5, 605–610 (1995)) beschreiben Wiedendiol-A und -B und verwandte Sesquiterpen-Verbindungen als CETP-Inhibitoren. Lee et al. (J. Antibiotics, 49, 693–96 (1996)) beschreiben CETP-Inhibitoren, die von einem Insektenpilz abgeleitet sind. Busch et al. (Lipids, 25, 216–220, (1990)) beschreiben Cholesterinacetylbromid als CETP-Inhibitor. Morton und Zilversmit (J. Lipid Res., 35, 836–47 (1982)) beschreiben, dass p-Chlormercuriphenylsulfonat, p-Hydroxymercuribenzoat und Ethylmercurithiosalicylat CETP inhibieren. Connolly et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm., 223, 42–47 (1996)) beschreiben andere Cystein-Modifikationsreagentien als CETP-Inhibitoren. Xia et al. (Bioorg. Med. Chem. Lett., 6, 919–22 (1996) beschreiben 1,3,5-Triazine als CETP-Inhibitoren. Bisgaier et al. (Lipids, 29, 811–8 (1994)) beschreiben 4-Phenyl-5-tridecyl-4H-1,2,4-triazolthiol als CETP-Inhibitor. Zusätzliche Triazol-CETP-Inhibitoren sind in der U.S. Patentanmeldung mit der Serial Nr. 09/153 360 beschrieben. Sikorski et al. offenbarten weitere neue CETP-Inhibitoren in der PCT-Patentanmeldung WO 9914204.
Substituierte 2-Mercaptoanilinamid-Verbindungen können als CETP-Inhibitoren verwendet werden und solche therapeutischen Verbindungen sind von H. Shinkai et al. in der PCT-Patentanmeldung WO 98/35937 beschrieben.
Von einigen substituierten Heteroalkylamin-Verbindungen ist bekannt, dass sie CETP-Inhibitoren sind. In der europäischen Patentanmeldung Nr. 796846 beschreiben Schmidt et al. 2-Aryl-substituierte Pyridine als Cholesterinester-Transferprotein-Inhibitoren, die nützlich als kardiovaskuläre Agentien sind. Ein Substituent an dem C₃-Atom des Pyridinrings kann eine Hydroxyalkylgruppe sein. In der europäischen Patentanmeldung Nr. 801060 beschreiben Dow und Wright heterocyclische Derivate, substituiert mit einem Aldehyd-Additionsprodukt eines Alkylamins um 1-Hydroxy-1-amine hervorzubringen. Von diesen wird berichtet, dass sie Agonisten von β3-adrenergen Rezeptoren sind, die nützlich für die Behandlung von Diabetes und anderen Krankheiten sind. In der britischen Patentanmeldung Nr. 2305665 offenbaren Fisher et al. agonistische, in der 3-Position mit einem sekundären Aminoalkohol substituierte Pyridinderivate, die nützlich bei der Behandlung von mehreren Krankheiten sind, einschließlich Störungen beim Cholesterinspiegel- und atherosklerotische Erkrankungen. In der europäischen Patentanmeldung Nr. 818448 beschreiben Schmidt et al. Tetrahydrochinolin-Derivate als Cholesterinester-Transferprotein-Inhibitoren. In der europäischen Patentanmeldung Nr. 818197 beschreiben Schmek et al. Pyridine mit fusionierten Heterocyclen als Cholesterinester-Transferprotein-Inhibitoren. Brandes et al. beschreiben in der deutschen Patentanmeldung Nr. 19627430 bicyclische kondensierte Pyridinderivate als Cholesterinester-Transferprotein-Inhibitoren. In der PCT-Patentanmeldung WO 9839299 beschreiben Muller-Gliemann et al. Chinolinderivate als Cholesterinester-Transferprotein-Inhibitoren.
Polycyclische Verbindungen, die nützlich als CETP-Inhibitoren sind, sind auch von A. Oomura et al. im japanischen Patent Nr. 10287662 beschrieben. Zum Beispiel wurden therapeutische Verbindungen, die die Struktur C-1 und C-8 haben, durch Kultivieren von Penicillium spp. hergestellt.
Cycloalkylpyridine, die nützlich als CETP-Inhibitoren sind, werden von Schmidt et al. im europäischen Patent Nr. EP 818448 offenbart. Zum Beispiel ist offenbart, dass die therapeutische Verbindung mit der Struktur C-9 besonders effektiv als CETP-Inhibitor ist.
Substituierte Tetralin-Verbindungen, die als CETP-Inhibitoren nützlich sind, sind in der PCT-Patentanmeldung WO 9914174 beschrieben. In dieser Offenbarung ist insbesondere (8S)-3-Cyclopentyl-1-(4-fluorphenyl)-2-[(S)-fluor-(4-trifluormethylphenyl)methyl]-8-hydroxy-6-spirocyclobutyl-5,6,7,8-tetrahydronaphthalin als nützlicher CETP-Inhibitor beschrieben.
Einige 4-Heteroaryltetrahydrochinoline, die als CETP-Inhibitoren nützlich sind, sind in der PCT-Patentanmeldung Nr. WO 9914215 beschrieben. Diese Offenbarung beschreibt z. B. 3-(4-Trifluormethylbenzoyl)-5,6,7,8-tetrahydrochinolin-5-on als einen nützlichen CETP-Inhibitor.
Für die Behandlung von kardiovaskulären Krankheiten wurden einige Kombinationstherapien in der Literatur beschrieben. Kombinationen von IBAT-Inhibitoren mit HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren, die nützlich für die Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen sind, sind in der U.S. Patentanmeldung Nr. 09/037 308 beschrieben.
Eine Kombinationstherapie mit Fluvastatin und Niceritrol ist bei J. Sasaki et al. (ebd.) beschrieben. Diese Forscher folgern, dass die Kombination von Fluvastatin mit Niceritrol "bei einer Dosis von 750 mg/Tagesdosis die vorteilhaften Wirkungen von Fluvastatin nicht erhöht oder abschwächt."
L. Cashin-Hemphill et al. (J. Am. Med. Assoc., 264, (23), 3013–17 (1990)) beschreiben vorteilhafte Wirkungen einer Kombinationstherapie von Colestipol und Niacin bei koronarer Atherosklerose. Die beschriebenen Wirkungen schließen ein Nicht-Fortschreiten und den Rückgang von nativen Koronararterien-Läsionen mit ein.
Eine Klasse von anderen Materialien, die über einen anderen Mechanismus arbeitet, um LDL-Cholesterin zu senken, umfasst Gallensäure-Sequestriermittel ("Gallensäure-Sequestriermittel" oder "Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindungen"). Solche Agentien sind typischerweise Anionenaustauscher-Polymere, die einem Patienten oral verabreicht werden. Während das Agens den Darm passiert, werden Anionen von Gallensäure durch das Agens sequestriert und ausgeschieden. Es wurde spekuliert, dass eine solche Sequestrierung die Reabsorption durch den Darm, beispielsweise durch das Ileum, verhindert, was den Körper veranlasst, die Umsetzung von Cholesterin in Gallensäure zu erhöhen und dadurch Serumcholesterinspiegel zu senken. Ein solches Gallensäure-Sequestriermittel ist Cholestyramin, ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymer, das quaternäre kationische Ammoniumgruppen enthält, die in der Lage sind, Gallensäuren zu binden. Man glaubt, dass Cholestyramin die Gallensäuren im Verdauungstrakt bindet und dabei deren normale enterohepatische Zirkulation stört. Diese Wirkung ist bei Reihnér et al. in "Regulation of hepatic cholesterol metabolism in humans: stimulatory effects of cholestyramine on HMG-CoA reductase activity and low density lipoprotein receptor expression in gallstone patients", Journal of Lipid Research, 31, 2219–2226 (1990) beschrieben. Eine weitere Beschreibung dieser Wirkung findet man in Suckling et al. in "Cholesterol Lower ing and bile acid excretion in the hamster with cholestyramine treatment", Atherosclerosis, 89, 183–90 (1991). Dies führt zu einem Anstieg der Leber-Gallensäure-Synthese, da die Leber Cholesterin verbraucht, sowie zu einem Hochregulieren der Leber-LDL-Rezeptoren, was die Entladung von Cholesterin erhöht und Serum-LDL-Cholesterinspiegel senkt.
Ein weiteres Gallensäure-Sequestriermittel ist Colestipol, ein Copolymer aus Diethylentriamin und 1-Chlor-2,3-epoxypropan. Colestipol ist im U.S. Patent Nr. 3 692 895 beschrieben. Eine häufige Nebenwirkung von Colestipol und von Cholestyramin sind Magenbeschwerden.
Zusätzliche Gallensäure-Sequestriermittel sind im U.S. Patent Nr. 5 703 188 beschrieben, das Geltex Pharmaceuticals, Inc. erteilt wurde. Zum Beispiel ist ein solches Gallensäure-Sequestriermittel 3-Methacrylamidopropyltrimethylammoniumchlorid, das mit Ethylenglykoldimethacrylat copolymerisiert ist um ein Copolymer zu erhalten.
Weitere Gallensäure-Sequestriermittel sind in der PCT-Patentanmeldung WO 98/57652 beschrieben, die Geltex Pharmaceuticals, Inc. erteilt wurde. Die WO 98/57652-Anmeldung beschreibt Polyallyaminpolymere.
Ein Beispiel eines Gallensäure-Sequestriermittels ist CholestaGel, CAS-Registrier-Nr. 182815-44-7. CholestaGel ist N,N,N-Trimethyl-6-(2-propenylamino)-1-hexanaminiumchlorid-Polymer mit (Chlormethyl)oxiran, 2-Propen-1-amin und N-2-Propenyl-1-decanaminhydrochlorid.
Noch eine weitere Klasse von Materialien, die als Gallensäure-Sequestriermittel vorgeschlagen sind, umfassen Partikel, die amphiphile Copolymere umfassen, die eine quervernetzte Hülldomäne und eine innere Kerndomäne besitzen (Patentanmeldung PCT/US 97/11610). Strukturen und die Herstellung solcher vernetzter amphiphiler Copolymere sind in der PCT/US97/11345 beschrieben. Solchen Partikeln wurde der Trivialname „Knedels" gegeben (K. B. Thurmond et al., J. Am. Chem. Soc., 118 (30), 7239–40 (1996)).
Einige Kombinationstherapien für die Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen wurden in der Literatur beschrieben. Kombinationen von IBAT-Inhibitoren mit HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren, die für die Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen nützlich sind, sind in der U.S. Patentanmeldung Nr. 09/037 308 offenbart.
Eine Kombinationstherapie mit Fluvastatin und Niceritrol wurde von J. Sasaki et al. (ebd.) beschrieben. Jene Forscher folgern, dass die Kombination von Fluvastatin mit Niceritrol "bei einer Dosis von 750 mg/Tag die günstigen Wirkungen von Fluvastatin nicht zu verbessern oder abzuschwächen scheint."
L. Cashin-Hemphill et al. (J. Am. Med. Assoc., 264 (23), 3013–17 (1990)) beschreiben vorteilhafte Wirkungen einer Kombinationstherapie von Colestipol und Niacin auf koronare Atherosklerose. Die beschriebenen Wirkungen schließen Nicht-Fortschreiten und die Regression von nativen Koronararterien-Läsionen mit ein.
Eine Kombinationstherapie von Acipimox und Simvastatin zeigt vorteilhafte HDL-Wirkungen bei Patienten, die hohe Triglyceridspiegel aufweisen (N. Hoogerbrugge et al., J. Internal Med., 241, 151–55 (1997)).
Eine Sitostanolester-Margarine- und Pravastatin-Kombinationstherapie ist von H. Gylling et al. beschrieben worden (J. Lipid Res., 37, 1776–85 (1996)). Von dieser Therapie wird berichtet, dass sie bei nicht-insulinabhängigen diabetischen Männern simultan die Cholesterinabsorption inhibiert und LDL-Cholesterin signifikant herabsetzt.
Brown et al. (New. Eng. J. Med., 323 (19), 1289–1339 (1990) beschreiben eine Kombinationstherapie von Lovastatin und Colestipol, die das Fortschreiten von atherosklerotischen Läsionen reduziert und die Läsionsregression, verglichen mit Lovastatin allein, erhöht.
Eine Kombinationstherapie eines apoB-Sekretionsinhibitors mit einem CETP-Inhibitor wurde von Chang et al. in der PCT-Patentanmeldung WO 9823593 offenbart.
Buch et al. (PCT-Patentanmeldung Nr. WO 9911263) beschreiben eine Kombinationstherapie, die Amlodipin und eine Statin-Verbindung umfasst, für die Behandlung von Patienten, die unter Angina pectoris, Atherosklerose, Bluthochdruck in Verbindung mit Hyperlipidämie leiden, und um Herzstillstand zu behandeln. Buch et al. beschreiben in der PCT-Patentanmeldung WO 9911259 eine Kombinationstherapie, die Amlodipin und Atorvastatin umfasst.
Scott et al. (PCT-Patentanmeldung Nr. WO 9911260) beschreiben eine Kombinationstherapie, die Atorvastatin und ein Antihypertonikum umfasst.
Dettmer und Gibson (UK-Patentanmeldung Nr. GB 2329334 A) beanspruchen eine therapeutische Zusammensetzung, die nützlich für die Reduktion der Spiegel von Plasmalipoprotein geringer Dichte und Cholesterin ist, wobei die Zusammensetzung einen HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor und ein Gallenkomplexierungsmittel umfasst.
Die obigen Verweise zeigen einen fortwährenden Bedarf, sichere und effektive Agentien für die Prophylaxe oder Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen zu finden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Um dem fortwährenden Bedarf nachzukommen, sichere und effektive Agentien für die Prophylaxe und Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen zu finden, wird nun von Kombinationstherapien kardiovaskulärer Arzneimittel (bzw. Medikamente) berichtet.
Unter ihren zahlreichen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung eine Kombinationstherapie zur Verfügung, die eine erste Menge eines CETP-Inhibitors und eine zweite Menge eines Gallensäure-Sequestriermittels, die nützlich bei der Prophylaxe oder Behandlung von Hyperlipidämie, Atherosklerose oder Hypercholesterinämie ist, wobei die erste und die zweite Menge zusammen eine wirksame Menge der Verbindungen gegen hyperlipidämische Krankheitsbilder, eine wirksame Menge der Verbindungen gegen atherosklerotische Krankheitsbilder oder eine wirksame Menge der Verbindungen gegen Hypercholesterinämie-Krankheitsbilder enthalten.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung von irgendeiner der hierin beschriebenen kardiovaskulären Kombinationstherapien zur Herstellung eines Medikamentes für die Prophylaxe oder Behandlung von Hypercholesterinämie, Atherosklerose oder Hyperlipidämie. Daher stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform die Verwendung einer Kombination für die Herstellung eines Medikamentes in einer Dosierungseinheits-Form für die Prophylaxe oder Behandlung eines hyperlipidämischen Krankheitsbildes zur Verfügung, wobei die Kombination eine erste Menge einer Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung und eine zweite Menge einer CETP-Inhibitorverbindung umfasst, wobei die erste Menge und die zweite Menge zusammen eine wirksame Menge der Verbindungen gegen hyperlipidämische Krankheitsbilder umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Kombination für die Herstellung eines Medikamentes in einer Dosierungseinheits-Form zur Verfügung, wobei die Kombination eine erste Menge einer Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung und eine zweite Menge einer CETP-Inhibitorverbindung umfasst, wobei die erste Menge und die zweite Menge zusammen eine wirksame Menge der Verbindungen gegen atherosklerotische Krankheitsbilder umfassen.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Kombination für die Herstellung eines Medikamentes in einer Dosierungseinheits-Form für die Prophylaxe oder Behandlung von Hypercholesterinämie zur Verfügung, wobei die Kombination eine erste Menge einer Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung und eine zweite Menge einer CETP-Inhibitorverbindung umfasst, wobei die erste Menge und die zweite Menge zusammen eine wirksame Menge gegen Hypercholesterinämie-Krankheitsbilder umfassen.
Der weitere Umfang der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung wird aus der unten gegebenen detaillierten Beschreibung offenbart. Es versteht sich jedoch, dass die folgende detaillierte Beschreibung und die Beispiele, obgleich diese bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben, lediglich zum Zwecke der Veranschaulichung gegeben werden, da verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung für den Fachmann aus dieser detaillierten Beschreibung offensichtlich sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die folgende detaillierte Beschreibung wird gegeben um dem Fachmann beim Ausführen der vorliegenden Erfindung zu helfen. Auch wenn dies so ist, sollte diese detaillierte Beschreibung nicht so ausgelegt werden, dass sie die vorliegende Erfindung ungerechtfertigt begrenzt, da Modifikationen und Abwandlungen der hierin diskutierten Ausführungsformen durch den Fachmann vorgenommen werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
a. Definitionen
Um dem Leser beim Verständnis der detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung zu helfen, werden die folgenden Definitionen gegeben:
"Kombinationstherapie" bezeichnet die Verabreichung von zwei oder mehr therapeutischen Agentien um ein hyperlipidämisches Krankheitsbild, z. B. Atherosklerose und Hypercholesterinämie, zu behandeln. Eine solche Verabreichung umfasst die gleichzeitige Verabreichung dieser therapeutischen Agentien auf im Wesentlichen simultane Weise, wie z. B. in einer einzigen Kapsel, die ein festgelegtes Verhältnis aktiver Inhaltsstoffe enthält, oder in mehreren getrennten Kapseln für jedes Inhibitoragens. Zusätzlich kann eine solche Verabreichung auch die Verwendung von jeder Art therapeutischen Agens in aufeinanderfolgender Art und Weise umfassen. In jedem Fall bietet der Behandlungsplan vorteilhafte Wirkungen der Arzneimittelkombination bei der Behandlung des hyperlipidämischen Krankheitsbildes.
Es ist beabsichtigt, dass der Ausdruck "therapeutisch wirksam" die kombinierte Menge von Inhibitoren bei der Kombinationstherapie beschreibt. Diese kombinierte Menge erreicht das Ziel der Reduzierung oder Auslöschung des hyperlipidämischen Zustandes.
"Therapeutische Verbindung" bezeichnet eine Verbindung, die nützlich bei der Prophylaxe oder Behandlung eines hyperlipidämischen Krankheitsbildes, einschließlich Atherosklerose und Hypercholesterinämie, ist.
b. Kombinationen
Die Kombinationen der vorliegenden Erfindung werden sich für zahlreiche Zwecke eignen. Zum Beispiel werden die individuellen Dosierungen, die in den Kombinationen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, durch Dosierungseinstellung und medizinisches Überwachen niedriger sein als sie für Dosierungen der therapeutischen Verbindungen typischerweise sind, wenn sie in der Einzeltherapie verwendet werden. Das Herabsetzen der Dosierung bietet Vorteile, einschließlich der Reduzierung von Nebenwirkungen der individuellen therapeutischen Verbindungen, verglichen mit der Einzeltherapie. Zusätzlich werden weniger Nebenwirkungen der Kombinationstherapie, verglichen mit Einzeltherapien zu einer größeren Akzeptanz der Therapie durch Patienten im Hinblick auf die Therapie-Pläne führen.
Eine weitere Verwendung der vorliegenden Erfindung liegt in Kombinationen, die komplementäre Wirkungen oder komplementäre Wirkungsweisen haben. Zum Beispiel kontrollieren Gallensäure-Sequestriermittel Blutserum-Cholesterinspiegel durch Inhibition der Reabsorption von Gallensäuren im Darm. Im Gegensatz dazu inhibieren CETP-Inhibitoren die Bewegung von Cholesterinestern und Triglyceriden zwischen den verschiedenen Lipoproteinen im Blut.
Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen einen weiten Bereich therapeutischer Verbindungen. Einige individuelle CETP-Inhibitor-Verbindungen sind einzeln in den folgenden einzelnen Patentanmeldungen beschrieben.
R9 U.S. Patentameldung Nr. 60/101661.
R10 U.S. Patentameldung Nr. 60/101711.
R11 U.S. Patentameldung Nr. 60/101660.
R12 U.S. Patentameldung Nr. 60/101664.
R13 U.S. Patentameldung Nr. 60/101668.
R14 U.S. Patentameldung Nr. 60/101662.
R15 U.S. Patentameldung Nr. 60/101663.
R16 U.S. Patentameldung Nr. 60/101669.
R17 U.S. Patentameldung Nr. 60/101667.
R18 U.S. Patentameldung Nr. 09/401 916.
R19 U.S. Patentameldung Nr. 09/405 524.
R20 U.S. Patentameldung Nr. 09/404 638.
R21 U.S. Patentameldung Nr. 09/404 638.
R22 U.S. Patentameldung Nr. 09/400 915.
R23 U.S. Patent Nr. 5 932 587.
R24 U.S. Patent Nr. 5 925 645.
Die CETP-Inhibitorverbindung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird durch die Formel C-12 dargestellt, die in Tabelle 1 gezeigt ist, sowie durch deren Diastereomere, Enantiomere, Racemate, Salze und Tautomere.
Tabelle 1
Gallensäure-Sequestriermittel, die nützlich für die Kombinationen und Verfahren der vorliegenden Erfindung sind, umfassen eine breite Vielfalt von Strukturen und Funktionalitäten. Bevorzugte Gallensäure-Sequestriermittel für die vorliegende Erfindung sind in Tabelle 2 beschrieben. Die therapeutischen Verbindungen aus Tabelle 2 können in der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von Formen verwendet werden, einschließlich der Säureform, Salzform, Racematen, Enantiomeren, Zwitterionen und Tautomere. Auf die einzelnen Patentdokumente, auf die in Tabelle 2 Bezug genommen wird, wird hiermit expressis verbis Bezug genommen. Zusätzliche Gallensäure-Sequestriermittel, die hier nützlich sind, sind Partikel, die amphiphile Copolymere umfassen, die eine quervernetzte Hülldomäne und eine innere Kerndomäne besitzen ("knedels", Patentanmeldung PCT/US 97/11610). "Knedels" von besonderem Interesse in der vorliegenden Erfindung umfassen Polystyrol-b-poly(acrylsäure) (PS-b-PAA), vernetzt mit einem oder mehreren Polyaminen. Besonders bevorzugte "knedels" umfassen PS-b-PAA, vernetzt mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-methiodid und Triethylentetramin ("Knedel A") oder 1,7-Diaza-4,10-diazonium-4,4,10,10-tetramethylundecandiiodid ("Knedel B").
Tabelle 2
Die für die Erfindung nützlichen Verbindungen (z. B. CETP-Inhibitorverbindungen oder Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindungen) können keine asymmetrischen Kohlenstoffatome oder alternativ dazu eines oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome aufweisen. Wenn die nützlichen Verbindungen eines oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome aufweisen, umfassen sie deshalb Racemate und Stereoisomere, wie z. B Diastereomere und Enantiomere, sowohl in reiner Form als auch in Mischung. Solche Stereoisomere können unter Verwendung von konventionellen Techniken hergestellt werden, entweder indem enantiomere Ausgangsmaterialien zur Reaktion gebracht werden oder indem Isomere erfindungsgemäßer Verbindungen getrennt werden.
Isomere können geometrische Isomere, z. B. cis-Isomere oder trans-Isomere, über eine Doppelbindung umfassen. Unter den Verbindungen, die für die vorliegende Erfindung verwendbar sind, werden alle solche Isomere in Betracht gezogen.
Die Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen auch Tautomere.
Die Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, wie unten diskutiert wird, umfassen deren Salze, Solvate und Prodrugs.
Dosierungen, Formulierungen und Wege der Verabreichung
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können für die Prophylaxe und Behandlung von hyperlipidämischen Erkrankungen oder Krankheitsbildern auf jede Weise verabreicht werden, bevorzugt oral, die einen Kontakt dieser Verbindungen mit ihrem Wirkungsort im Körper herstellt, z. B. im Ileum, Plasma oder der Leber eines Säugers, z. B. eines Menschen.
Zur Prophylaxe oder Behandlung der oben beschriebenen Krankheitsbilder können die Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren verwendbar sind, als Verbindung per se verwendet werden. Pharmazeutisch annehmbare Salze sind aufgrund ihrer größeren Wasserlöslichkeit, verglichen mit der Stammverbindung, besonders geeignet für medizinische Anwendungen. Solche Salze müssen natürlich ein pharmazeutisch annehmbares Anion oder Kation besitzen. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen wenn möglich jene, die von anorganischen Säuren abgeleitet sind, wie z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Metaphosphorsäure, Salpetersäure, Sulfonsäure und Schwefelsäure, und organische Säuren, wie Essigsäure, Benzolsulfonsäure, Benzoesäure, Citronensäure, Ethansulfonsäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Glykolsäure, Isothioketonsäure, Milchsäure, Lactobionsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Methansulfonsäure, Bernsteinsäure, Toluolsulfonsäure, Weinsäure und Trifluoressigsäuren. Das Chloridsalz ist für medizinische Zwecke besonders bevorzugt. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Basensalze schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, und Erdalkalisalze, wie Magnesium- und Calciumsalze, mit ein.
Es ist natürlich auch erforderlich, dass die in der vorliegenden Erfindung nützlichen Anionen pharmazeutisch annehmbar sind und auch aus der obigen Aufzählung ausgewählt werden.
Die in der vorliegenden Erfindung nützlichen Verbindungen können mit einem annehmbaren Trägermaterial in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung präsentiert werden. Das Trägermaterial muss natürlich annehmbar sein, und zwar in dem Sinne, dass es kompatibel mit den anderen Inhaltsstoffen der Zusammensetzung ist und nicht schädlich für den Empfänger sein darf. Das Trägermaterial kann fest oder flüssig sein, oder beides, und es ist bevorzugt, zusammen mit der Verbindung als Einheitsdosis-Zusammensetzung formuliert, z. B. in einer Tablette, die von 0,05 bis 95 Gew.-% der aktiven Verbindungen enthalten kann. Andere pharmakologisch aktive Substanzen können auch zugegen sein, einschließlich anderer erfindungsgemäßer Verbindungen. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch irgendeine der wohlbekannten Techniken der Pharmazie hergestellt werden, bestehend im Wesentlichen aus dem Vermischen der Komponenten.
Wahlweise kann die Kombination der folgenden Erfindung eine Zusammensetzung umfassen, die eine den ilealen Gallensäure-Transport inhibierende Verbindung und eine Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung umfasst. In solch einer Zusammensetzung können die CETP-Inhibitor-Verbindung und die Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung in einer Einzeldosierungsform vorliegen, z. B. einer Pille, einer Kapsel oder einer Flüssigkeit, die beide Verbindungen enthält.
Diese Verbindungen können mittels jeder konventionellen Methode verabreicht werden, die zur Verwendung in Verbindung mit Pharmazeutika zur Verfügung steht, entweder als individuelle therapeutische Verbindungen oder als eine Kombination von therapeutischen Verbindungen.
Die Menge der Verbindung, die notwendig ist um die erwünschte biologische Wirkung zu erzielen, wird natürlich von einer Vielzahl von Faktoren abhängen, wie z. B. der spezifischen ausgewählten Verbindung, der beabsichtigten Verwendung, der Verabreichungsart und dem klinischen Zustand des Empfängers.
Für einen CETP-Inhibitor kann im Allgemeinen eine tägliche Dosis von ungefähr 0,01 bis ungefähr 100 mg/kg Körpergewicht/Tag und bevorzugt zwischen ungefähr 0,5 bis ungefähr 20 mg/kg Körpergewicht/Tag geeignet sein.
Für ein Gallensäure-Sequestriermittel kann eine Tagesgesamtdosis im Bereich von ungefähr 1000 bis ungefähr 30.000 mg/Tag und bevorzugt von ungefähr 5000 bis ungefähr 15.000 mg/Tag liegen, in einer einzelnen oder in einer aufgeteilten Dosis.
Die in den vorstehenden Absätzen für die verschiedenen therapeutischen Verbindungen beschriebenen Tagesdosen können dem Patienten in einer einzelnen Dosis oder in entsprechenden mehreren Teildosen verabreicht werden. Teildosen können 2- bis 6mal pro Tag verabreicht werden. Dosen können in Formen mit verzögerter Freisetzung sehr wirkungsvoll sein um die erwünschten Ergebnisse zu erreichen.
Im Falle pharmazeutisch annehmbarer Salze beziehen sich die oben angegebenen Gewichte auf das Gewicht des Säureäquivalents oder des Baseäquivalents der vom Salz abgeleiteten therapeutischen Verbindung.
Die orale Abgabe der erfindungsgemäßen Kombinationen kann Formulierungen umfassen, wie sie im Stand der Technik wohlbekannt sind um eine verlängerte oder fortwährende Abgabe des Arzneimittels im Gastrointestinal-Trakt durch eine Vielzahl von Mechanismen zu gewährleisten. Diese umfassen pH-sensitive Freisetzung aus der Dosierungsform, basierend auf dem pH-Wechsel des Dünndarms, langsamen Zerfall einer Tablette oder Kapsel, Retention im Magen, basierend auf physikalischen Eigenschaften der Formulierung, Bioadhäsion der Dosierungsform an die Schleimhäute des Darmtrakts oder enzymatische Freisetzung des aktiven Arzneimittels aus der Dosierungsform; sie sind aber nicht auf diese Formen beschränkt. Für einige der therapeutischen Verbindungen, die nützlich in der vorliegenden Erfindung sind, ist die beabsichtigte Wirkung, dass die Zeitspanne, während der das aktive Arznemittelmolekül an die Stelle der Wirkung abgegeben wird, durch Manipulation der Dosierungsform verlängert wird. Daher liegen im Dünndarm lösliche Formulierungen mit Schutzschicht und im Dünndarm lösliche Formulierungen mit Schutzschicht und mit kontrollierter Freisetzung innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Geeignete im Dünndarm lösliche Beschichtungen umfassen Celluloseacetatphthalat, Polyvinylacetatphthalat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat und anionische Polymere von Methacrylsäure und Methacrylsäuremethylester. In einer weiteren Ausführungsform kann das Gallensäure-Sequestriermittel in Form einer Flüssigkeit, eines Feststoffes, dispergiert in einer Flüssigkeit, oder in einer Kapsel vorliegen.
Die erfindungsgemäßen Kombinationen können oral entweder in fester, in semifester oder in flüssiger Form bereitgestellt werden. In flüssiger oder semifester Form können die erfindungsgemäßen Kombinationen z. B. in der Form einer Flüssigkeit, eines Sirups oder enthalten in einer Gelkapsel (z. B. einer Gelkappe) vorliegen. In einer Ausführungsform kann der CETP-Inhibitor in der Form einer Flüssigkeit, eines Sirups oder enthalten in einer Gelkapsel zur Verfügung gestellt werden.
Für einen CETP-Inhibitor kann die intravenös verabreichbare Dosis z. B. im Bereich von ungefähr 0,003 mg/kg Körpergewicht bis ungefähr 1,0 mg/kg Körpergewicht liegen, bevorzugt von ungefähr 0,01 mg/kg Körpergewicht bis ungefähr 0,75 mg/kg Körpergewicht, bevorzugter von ungefähr 0,1 mg/kg Körpergewicht bis ungefähr 0,6 mg/kg Körpergewicht.
Die Dosis von jeder dieser therapeutischen Verbindungen kann geeigneterweise als Infusion von ungefähr 10 ng/kg Körpergewicht bis ungefähr 100 ng/kg Körpergewicht pro Minute verabreicht werden. Infusionsflüssigkeiten, die für diesen Zweck geeignet sind, können z. B. von ungefähr 0,1 ng bis ungefähr 10 mg, bevorzugt von ungefähr 1 ng bis ungefähr 10 mg pro Milliliter enthalten. Einheitsdosierungen können z. B. von ungefähr 1 mg bis ungefähr 10 g der erfin dungsgemäßen Verbindung enthalten. Daher können Ampullen für die Injektion z. B. von ungefähr 1 mg bis ungefähr 100 mg enthalten.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen jene, die für die orale, rektale, topische, bukkale (z. B. sublinguale) und parenterale (z. B. subkutane, intramuskuläre, intradermale oder intravenöse) Verabreichung geeignet sind, obwohl der geeignetste Weg in jedem Fall von der Art und Schwere des Krankheitszustandes, der behandelt wird, und von der Art der jeweiligen Verbindung, die verwendet wird, abhängt. In den meisten Fällen ist der bevorzugte Verabreichungsweg der orale. Typischerweise wird ein Gallensäure-Sequestriermittel oral abgegeben.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind, können in einzelnen Einheiten dargeboten werden, wie z. B. als Kapseln, Oblatenkapseln, Pastillen oder Tabletten, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge von mindestens einer der therapeutischen Verbindungen, die nützlich in der vorliegenden Erfindung sind, enthält; außerdem z. B. als Pulver oder Granulat; als Lösung oder als Suspension in einer wässrigen oder nichtwässrigen Flüssigkeit; oder als Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsion. Wie schon angedeutet, können solche Zusammensetzungen mittels jeder geeigneten pharmazeutischen Methode hergestellt werden, die den Schritt umfasst, die aktiven Verbindungen/die aktive Verbindung und das Trägermaterial (welches ein oder mehrere akzessorische Inhaltsstoffe umfassen kann) in Verbindung zu bringen. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem man die aktive Verbindung gleichmäßig durch und durch mit einer Flüssigkeit oder einem fein aufgetrennten festen Trägermaterial oder beidem vermischt und dann, wenn notwendig, das Produkt ausformt. Zum Beispiel kann eine Tablette durch Pressen oder Formen von Pulver oder Körnern (bzw. Granulat) der Verbindung hergestellt werden, wahlweise mit einem oder mehreren akzessorischen Inhaltsstoffen. Presstabletten können hergestellt werden, indem man die Verbindung in frei fließender Form, wie z. B. als Pulver oder Granulat, wahlweise mit einem Bindemittel, Gleitmittel, inertem Verdünnungsmittel und/oder oberflächenaktiven/dispergierenden Agens oder Agentien vermischt, in einer geeigneten Maschine, presst. Geformte Tabletten können hergestellt werden, indem man die Verbindung in Pulverform, befeuchtet mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel, in einer geeigneten Maschine in Form presst/Form gießt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die bukkale (sublinguale) Verabreichung geeignet sind, umfassen Pastillen, die eine erfindungsgemäße Verbindung in einer aromatisierten Basis umfassen, üblicherweise Saccharose, und Akazin oder Tragacanth, und Pastillen, die die Verbindung in einer inerten Basis, wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Akazin, umfassen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen geeigneterweise sterile wässrige Präparationen einer erfindungsgemäßen Verbindung. Diese Präparationen werden bevorzugt intravenös verabreicht, obwohl die Verabrei chung auch mittels subkutaner, intramuskulärer oder intradermaler Injektion erfolgen kann. Solche Präparationen können geeigneterweise hergestellt werden, indem man die Verbindung mit Wasser mischt und die daraus hervorgehende Lösung sterilisiert und Isotonie mit dem Blut herstellt. Injizierbare Zusammensetzungen entsprechend der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen 0,1 bis 5% Gew./Gew. einer hierin offenbarten Verbindung enthalten.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur rektalen Verabreichung geeignet sind, werden bevorzugt als Einheitsdosis-Zäpfchen dargeboten. Diese können hergestellt werden, indem eine erfindungsgemäße Verbindung mit einem oder mehreren konventionellen festen Trägermaterialien vermischt wird, z. B. Kakaobutter, und dann die daraus hervorgehende Mischung ausgeformt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur topischen Anwendung auf der Haut geeignet sind, haben bevorzugt die Form einer Salbe, Creme, Lotion, Paste, eines Gels, Sprays, Aerosols oder eines Öls. Trägermaterialien, die verwendet werden können, umfassen Petrolatum (z. B. Vaseline), Lanolin, Polyethylenglykole, Alkohole und Kombinationen aus zwei oder mehreren von diesen. Die aktive Verbindung ist üblicherweise in einer Konzentration von 0,1 bis 50% Gew./Gew. der Zusammensetzung enthalten, z. B. von 0,5 bis 2%.
Die transdermale Verabreichung ist ebenfalls möglich. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die zur transdermalen Verabreichung geeignet sind, können als einzelnes Pflaster dargeboten werden, die daran angepasst sind, für einen längeren Zeitraum in engem Kontakt mit der Epidermis des Empfängers zu verbleiben. Solche Pflaster enthalten geeigneterweise eine erfindungsgemäße Verbindung in einer, wahlweise gepufferten wässrigen Lösung, gelöst und/oder dispergiert in einem Klebstoff, oder dispergiert in einem Polymer. Eine geeignete Konzentration der aktiven Verbindung ist ungefähr 1% bis 35%, bevorzugter ungefähr 3% bis 15%. Als besondere Möglichkeit kann die Verbindung durch Elektrotransport oder Iontophorese abgegeben werden, z. B. wie beschrieben in Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986).
In jedem Fall wird die Menge des aktiven Inhaltsstoffes, die mit Trägermaterialien kombiniert werden kann, um eine einzelne Dosierungsform herzustellen, die zu verabreichen ist, abhängig von dem behandelten Patienten und der besonderen Art der Verabreichung variieren.
Die feste Dosierungsformen zur oralen Verabreichung einschließlich der oben genannten Kapseln, Tabletten, Pillen, Puder, Gelkapseln und Körner umfassen eine oder mehrere Verbindungen, die nützlich in der vorliegenden Erfindung sind, gemischt mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel, wie Saccharose, Lactose oder Stärke. Solche Dosierungsformen können, genauso wie in der üblichen Praxis, auch zusätzliche Substanzen außer den inerten Verdünnungsmitteln umfassen, z. B. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat oder löslichmachende Agentien, wie z. B. Cyclodextrine. Im Falle von Kapseln, Tabletten, Pudern, Körnern, Gelkapseln und Pillen können die Dosierungsformen auch Pufferagentien umfassen. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit im Dünndarm löslichen Beschichtungen hergestellt werden.
Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung können pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere umfassen, die inerte Verdünnungsmittel enthalten, die für gewöhnlich im Stand der Technik verwendet werden, wie z. B. Wasser. Solche Zusammensetzungen können auch Adjuvantien umfassen, wie z. B. Benetzungsmittel, Emulsions- und Suspendierungsmittel, und Süßstoffe, Aromastoffe und Geruchsstoffe.
Injizierbare Präparationen, z. B. sterile injizierbare wässrige oder ölige Suspensionen, können entsprechend dem Stand der Technik formuliert werden, indem geeignete Dispergiermittel oder Härter (setting agent) und Suspendiermittel verwendet werden. Die sterile injizierbare Zusammensetzung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in eine nicht-toxischen parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, z. B. als Lösung in 1,3-Butandiol. Unter den annehmbaren Trägermaterialien und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, finden sich Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden sterile fette (nicht-flüssige) Öle für gewöhnlich als Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Zu diesem Zweck kann jedes milde fette Öl verwendet werden einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride. Zusätzlich finden Fettsäuren, wie z. B. Ölsäure, bei der Herstellung von injizierbaren Mitteln Verwendung.
Pharmazeutisch annehmbare Trägermaterialien umfassen alle die Vorhergehenden und ähnliche.
Bei der Kombinationstherapie kann die Verwendung von zweien oder mehreren der in der vorliegenden Erfindung nützlichen therapeutischen Agentien sequentiell in getrennten Formulierungen stattfinden oder sie kann durch simultane Verabreichung in einer einzelnen Formulierung oder getrennten Formulierungen durchgeführt werden. Die Verabreichung kann über den oralen Weg durchgeführt werden oder durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektionen. Die Formulierung kann in der Form eines Bolus oder in der Form wässriger oder nicht-wässriger isotonischer steriler Injektionslösungen oder -suspensionen erfolgen. Diese Lösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern oder Körnern hergestellt werden, die zudem ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Trägermaterialien oder Verdünnungsmittel enthalten, oder ein Bindemittel, wie Gelatine oder Hydroxypropylmethylcellulose, zusammen mit einem oder mehreren Gleitmitteln, Konservierungsstoffen, oberflächenaktiven Agentien oder Dispergiermitteln.
Zur oralen Verabreichung kann die pharmazeutische Zusammensetzung z. B. in der Form einer Tablette, Kapsel, Suspension oder Flüssigkeit vorliegen. Kapseln, Tabletten etc. können mittels konventioneller Methode, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, hergestellt werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist bevorzugt in Form einer Dosierungseinheit hergestellt, die eine bestimmte Menge des aktiven Inhaltsstoffes oder der aktiven Inhaltsstoffe enthält. Beispiele von Dosierungseinheiten sind Tabletten oder Kapseln. Diese können vorteilhafterweise eine oder mehrere therapeutische Verbindungen in einer Menge, wie sie oben be schrieben ist, enthalten. Die Dosierung kann z. B. im Fall eines CETP-Inhibitors von ungefähr 0,01 mg bis ungefähr 500 mg reichen. Es kann aber auch jede andere Dosierung sein, abhängig vom spezifischen Inhibitor, wie im Stand der Technik bekannt ist. Im Falle eines Gallensäure-Sequestriermittels kann die Dosis von ungefähr 1000 mg bis ungefähr 30000 mg reichen. Es kann auch jede andere Dosierung sein, abhängig von dem spezifischen Gallensäure-Sequestriermittel, wie im Stand der Technik bekannt ist.
Die aktiven Inhaltsstoffe können auch durch Injektion als eine Zusammensetzung verabreicht werden, wobei z. B. Kochsalzlösung, Dextrose oder Wasser als geeignetes Trägermaterial verwendet werden können. Eine geeignete Tagesdosis von jeder der aktiven therapeutischen Verbindungen ist eine Dosis, die denselben Blutserumspiegel erreicht wie er durch orale Verabreichung, wie sie oben beschrieben ist, hervorgerufen wird.
Die therapeutischen Verbindungen können zudem durch jede der folgenden Kombinationen verabreicht werden: oral/oral, oral/parenteral oder parenteral/parenteral.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können in oraler Form oder durch intravenöse Verabreichung verabreicht werden. Die orale Verabreichung der Kombinationstherapie ist bevorzugt. Die Dosierung für orale Verabreichung kann mit einem Plan durchgeführt werden, die eine einzelne Tagesdosis erfordert oder eine einzelne Dosis alle 2 Tage oder mehrere über den Tag verteilte Dosen. Die therapeutischen Verbindungen, aus denen sich die Kombinationstherapie zusammensetzt, können gleichzeitig verabreicht werden, entweder in einer kombinierten Dosierungsform oder in getrennten Dosierungsformen, die für im Wesentlichen gleichzeitige orale Verabreichung vorgesehen sind. Die therapeutischen Verbindungen, aus denen sich die Kombinationstherapie zusammensetzt, können auch nacheinander verabreicht werden, wobei jede der therapeutischen Verbindungen im Rahmen eines Dosierungsplans verabreicht wird, was eine Aufnahme in zwei Schritten erfordert. Daher kann ein Plan, die sequentielle Verabreichung der therapeutischen Verbindungen mit getrennter Aufnahme der getrennten aktiven Agentien erfordern. Die Zeitspanne zwischen mehreren Einnahmen kann von wenigen Minuten bis mehrere Stunden reichen, abhängig von den Eigenschaften der jeweiligen therapeutischen Verbindung, wie Wirksamkeit, Löslichkeit, Bioverfügbarkeit, Plasma-Halbwertszeit und kinetisches Profil der therapeutischen Verbindung, sowie abhängig von den Auswirkungen von Nahrungsaufnahme und dem Alter und Zustand des Patienten. Cyclische Veränderungen der Zielmolekül-Konzentration kann ebenfalls das optimale Dosisintervall bestimmen. Die therapeutischen Verbindungen der kombinierten Therapie können, ob sie nun gleichzeitig, im Wesentlichen gleichzeitig oder aufeinanderfolgend verabreicht werden, einen Plan umfassen, der die Verabreichung von einer therapeutischen Verbindung über den oralen Weg und einer anderen therapeutischen Verbindung über den intravenösen Weg erfordert. Ob nun die therapeutischen Verbindungen der kombinierten Therapie über den oralen oder intravenösen Weg, getrennt oder zusammen, verabreicht werden, jede therapeutische Verbindung wird in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung aus pharmazeutisch annehmbaren Exzi pientien, Verdünnungsmitteln oder andern Formulierungs-Komponenten enthalten sein. Beispiele geeigneter pharmazeutisch annehmbarer Formulierungen, die die therapeutischen Verbindungen für die orale Verabreichung enthalten, sind oben angegeben.
Behandlungsplan
Der Dosierungsplan soll einen Krankheitszustand, der Hyperlipidämie als ein Element der Krankheit aufweist, z. B. Atherosklerose, verhindern, davon befreien oder diesen verbessern oder vor hohen Plasma- oder Blut-Cholesterinspiegeln schützen oder diese weiter behandeln, und zwar mit den Verbindungen und/oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung; der Dosierungsplan wird nach einer Vielzahl von Faktoren ausgerichtet. Diese umfassen Art, Alter, Gewicht, Geschlecht, Ernährung und die medizinische Verfassung des Patienten, die Schwere der Erkrankung, den Weg der Verabreichung, pharmakologische Abwägungen, wie die Aktivität, Wirksamkeit, pharmakokinetische und toxikologische Profile der jeweils verwendeten Verbindung, ob ein Abgabesystem für das Arzneimittel verwendet wird und ob die Verbindung als Teil einer Arzneimittelkombination verabreicht wird. Daher kann der Dosierungsplan, der jeweils angewendet wird, in weiten Grenzen variieren und daher von dem bevorzugten Dosierungsplan, der oben dargelegt ist, abweichen. Die Anfangsbehandlung eines Patienten, der an einem hyperlipidämischen Krankheitsbild leidet, kann mit den oben angegebenen Dosierungen beginnen. Die Behandlung sollte im Allgemeinen je nach Notwendigkeit über einen Zeitraum von mehreren Wochen bis zu mehreren Monaten oder Jahren fortgeführt werden, bis der hyperlipidämische Krankheitszustand unter Kontrolle gebracht oder eliminiert wurde. Patienten, die sich einer Behandlung mit den hier offenbarten Verbindungen oder Zusammensetzungen unterziehen, können routinemäßig überwacht werden, z. B. indem Serum-LDL- und Gesamt-Cholesterin-Spiegel mittels irgendeiner der im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren gemessen werden um die Effektivität der Kombinationstherapie zu bestimmen. Eine fortwährende Analyse solcher Daten erlaubt die Anpassung des Behandlungsplans während der Therapie, so dass Mengen mit optimaler Wirksamkeit von jeder Art der therapeutischen Verbindung zu jedem Zeitpunkt verabreicht werden, und so dass die Dauer der Behandlung ebenfalls bestimmt werden kann. Auf diese Weise kann der Behandlungs-Dosierungsplan vernünftig während des Verlaufs der Therapie modifiziert werden, so dass die niedrigste Menge an therapeutischen Verbindungen verabreicht wird, welche zusammen eine zufriedenstellende Wirksamkeit zeigen, und so dass die Verabreichung nur so lange fortgesetzt wird, wie es notwendig ist um den hyperlipidämischen Krankheitszustand erfolgreich zu behandeln.
Ein möglicher Vorteil der Kombinationstherapie, die hier offenbart ist, kann die Reduktion der Menge von jeder einzelnen therapeutischen Verbindung oder aller therapeutischen Verbindungen sein, die wirksam bei der Behandlung von hyperlipidämischen Krankheitsbildern, wie z. B. Atherosklerose und Hypercholesterinämie sind.
Eine der verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst eine Kombinationstherapie, die die Verwendung einer ersten Menge CETP-Inhibitor und einer zwei ten Menge einer Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung umfasst, wobei die besagte erste und zweite Menge zusammen eine wirksame Menge der Verbindungen gegen hyperlipidämische Krankheitbilder oder atherosklerotische Krankheitsbilder umfassen. Zum Beispiel ist eine der vielen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eine Kombinationstherapie, die therapeutische Dosierungen eines CETP-Inhibitors und eines Gallensäure-Sequestriermittels umfasst.
Die folgenden nicht-begrenzenden Beispiele dienen dazu, die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen.
c. Beispiele
Tabelle 3 stellt Beispiele von einigen Kombinationen der vorliegenden Erfindung und einigen anderen Kombination zum Zwecke der Veranschaulichung dar, wobei die Kombination eine erste Menge eines CETP-Inhibitors und eine zweite Menge eines Gallensäure-Sequestriermittels umfasst, wobei die erste Menge und die zweite Menge zusammen eine wirksame Menge der Verbindungen gegen hyperlipidämische Krankheitsbilder oder eine wirksame Menge der Verbindungen gegen atherosklerotische Krankheitsbilder von den Verwendungen umfasst.
Tabelle 3
BIOLOGISCHE ASSAYS
Die Nützlichkeit der erfindungsgemäßen Kombinationen kann anhand der folgenden Assays gezeigt werden. Diese Assays werden in vitro und im Tiermodell durchgeführt und zwar im Wesentlichen unter Verwendung von bekannten Verfahren um die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung zu zeigen.
In-vitro-Assays von Verbindungen, die IBAT-vermittelte Aufnahme von [¹⁴C]-Taurocholat (TC) in H14-Zellen inhibieren
Babyhamster-Nierenzellen (BHK), transfiziert mit der cDNA von humanem IBAT (H14-Zellen) werden in 96-Vertiefungs-Top-Count-Gewebekulturplatten ausgesät und zwar mit 60000 Zellen/Vertiefung für Assays, die innerhalb 24 Stunden nach dem Aussäen durchgeführt werden, mit 30000 Zellen/Vertiefung für Assays, die innerhalb von 48 Stunden durchgeführt werden, und mit 10000 Zellen/Vertiefung für Assays, die innerhalb von 72 Stunden durchgeführt werden.
Am Tag des Assays wird die einlagige Zellschicht sanft mit 100 μl Assay-Puffer (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium mit 4,5 g/l Glucose + 0,2% (Gew./Vol.) fettsäurefreiem Rinderserumalbumin-(FAF)BSA) gewaschen. Zu jeder Vertiefungen werden 50 μl zweifach konzentrierte Testverbindung in Assay-Puffer mit 50 μl 6 μM [¹⁴C]-Taurocholat in Assay-Puffer (Endkonzentration 3 μM [¹⁴C]-Taurocholat) gegeben. Die Zellkulturplatten werden 2 Stunden bei 37°C inkubiert, bevor jede Vertiefung zweimal mit 100 μl 4°C Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,2% (Gew./Vol.) (FAF)BSA, gewaschen wird. Die Vertiefungen werden dann einmal sanft mit 100 μl 4°C PBS ohne (FAF)BSA gewaschen, in jede Vertiefung werden 200 μl flüssige Szintillationszählungs-Flüssigkeit gegeben, die Platten werden zugeschweißt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt, bevor die Radioaktivitätsmenge in jeder Vertiefung mit einem Packard-Top-Count-Gerät gemessen wird.
In-vitro-Assay von Verbindungen, die die Aufnahme von [^l4C]-Alanin inhibieren
Der Alanin-Aufnahmeassay kann in identischer Art und Weise zum Taurocholat-Assay durchgeführt werden, mit der Ausnahme, dass markiertes Taurocholat durch markiertes Alanin ersetzt werden muss.
In-vivo-Assay von Verbindungen, die die ileale Aufnahme von [¹⁴C]-Taurocholat in Galle bei der Ratte inhibieren
(Siehe "Metabolismus von 3α,7β-Dihydroxy-7α-methyl-5β-cholansäure und 3α,7β-Dihydroxy-7α-methyl-5β-cholansäure in Hamstern" in Biochimica et Biophysica Acta, 833, 196–202 (1985) von Une et al.)
Männliche Wistar-Ratten (200 bis 300 g) werden mit Inactin bei 100 mg/kg anästhetisiert. Die Gallengänge werden mit 10" Länge PE10-Röhrchen kanüliert. Der Dünndarm wird bloßgelegt und auf einer Gaze-Unterlage ausgelegt. Eine Kanüle (1/8'' Luer-Lock, konischer Buchsenadapter) wird 12 cm entfernt von der Verbindung von Dünndarm und Zaekum eingeführt. 4 cm entfernt von derselben Verbindung wird ein Schlitz geschnitten (indem 8 cm Ileum-Länge verwendet werden). 20 ml warme Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 6,5 (PBS) werden verwendet um das Darmsegment auszuspülen. Die distale Öffnung wird mit einem 20 cm langen Silikonröhrchen kanüliert (0,02'' LD. × 0,037'' O.D.). Die proximale Kanüle wird an eine peristaltische Pumpe angeschlossen und der Darm wird 20 Minuten lang mit warmem PBS mit 0,25 ml/min gewaschen. Die Temperatur des Darmsegmentes muss fortwährend überwacht werden. Am Beginn des Experimentes werden 2,0 ml einer Kontrollprobe mit einer 3 ml-Spritze in das Darmsegment geladen und es wird mit der Sammlung von Gallenproben begonnen. Die Kontrollprobe wird mit einer Rate von 0,25 ml/min über 21 min infundiert. Gallensäurefraktionen werden alle 3 Minuten für die ersten 27 Minuten des Verfahrens gesammelt. Nach 21 min der Probeninfusion wird die ileale Schleife mit 20 ml warmem PBS gewaschen (unter Verwendung einer 30 ml Spritze), und dann wird die Schleife für 21 min mit warmem PBS mit 0,25 ml/min. ausgewaschen. Eine zweite Perfusion wird wie oben beschrieben initiiert, wobei aber auch die Testverbindung verabreicht wird (21 min Verabreichung, gefolgt von 21 min Auswaschen) und wobei Galle alle 3 min über die ersten 27 min zu entnehmen ist. Wenn notwendig, wird eine dritte Perfusion wie oben durchgeführt, die typischerweise die Kontrollprobe enthält.
Messung von hepatischen Cholesterinkonzentrationen (HEPATIC CHOL)
Lebergewebe ist zu wiegen und in Chloroform : Methanol (2 : 1) zu homogenisieren. Nach der Homogenisierung und Zentrifugation wird der Überstand abgetrennt und unter Stickstoffatmosphäre getrocknet. Der Rest wird in Isopropanol gelöst und der Cholesteringehalt wird enzymatisch gemessen, unter Verwendung einer Kombination von Cholesterin-Oxidase und - Peroxidase, wie beschrieben bei Allain, C. A. et al., Clin. Chem., 20, 470 (1974)
Messung von hepatischer HMG-CoA-Reduktaseaktivität (HMG CoA)
Hepatische Mikrosomen werden durch Homogenisieren von Leberproben in einem Phosphat/Saccharose-Puffer hergestellt, gefolgt von zentrifugaler Abtrennung. Das am Ende sedimentierte Material wird in Puffer resuspendiert und ein Aliquot durch Inkubation für 60 Minuten bei 37°C in Anwesenheit von ¹⁴C-HMG-CoA (Dupont-NEN) auf HMG-CoA-Reduktaseaktivität untersucht. Die Reaktion wird durch Zugabe von 6 N HCl gestoppt, gefolgt von Zentrifugation. Ein Aliquot des Überstandes wird abgetrennt, und zwar durch Dünnschichtchromatographie, und der Fleck, der dem Enzymprodukt entspricht, wird von der Platte abgekratzt, extrahiert und die Radioaktivität wird durch Szintillationszählung bestimmt (Referenz: Akerlund, J. und Bjorkhem, I. (1990), J. Lipid Res. 31, 2159).
Bestimmung von Serumcholesterin (SER.CHOL, HDL-CHOL, TGI und VLDL + LDL)
Gesamtserum-Cholesterin (SER.CHOL) wird enzymatisch gemessen und zwar unter Verwendung eines kommerziellen Kits von Wako Fine Chemicals (Richmond, VA), Cholesterin C11, Katalog Nr. 276-64909. HDL-Cholesterin (HDL-CHOL) wird unter Verwendung desselben Kits nach Präzipitation von VLDL und LDL mit Sigma Chemical Co. HDL-Cholesterin-Reagens, Katalog Nr. 352-3 (Dextransulfat-Methode) bestimmt. Gesamtserum-Triglyceride (freigesetzte) (TGI) werden enzymatisch mit Sigma Chemical Co. GPO-Trinder, Katalog Nr. 337-B gemessen. VLDL und LDL (VLDL + LDL)-Cholesterin-Konzentrationen werden als Differenz zwischen Gesamt- und HDL-Cholesterin errechnet.
Messung von hepatischer Cholesterin-7-α-Hydroxylase-Aktivität (7a-OHase)
Hepatische Mikrosomen werden durch Homogenisieren von Leberproben in einem Phosphat/Saccharose-Puffer präpariert, gefolgt von zentrifugaler Abtrennung. Das am Ende sedimentierte Material wird in Puffer resuspendiert und ein Aliquot wird durch Inkubation für 5 Minuten bei 37°C in Anwesenheit von NADPH auf Cholesterin-7-α-Hydroxylase-Aktivität untersucht. Nach der Extraktion in Petrolether wird das organische Lösungsmittel verdampft und der Rest wird in Acetonitril/Methanol gelöst. Das enzymatische Produkt wird durch Injektion eines Aliquots des Extraktes auf eine C₁₈-reverse-phase-HPLC-Säule abgetrennt und das eluierte Material mittels UV-Detektion bei 240 nm quantifiziert (Referenz: Horton, J. D., et al. (1994) J. Clip. Invest. 93, 2084).
Ratten-Magensonden-Assay
Männlichen Wistar-Ratten (275 bis 300 g) werden IBAT-Inhibitoren unter Verwendung eines oralen Magensonden-Verfahrens verabreicht. Arzneimittel oder Trägermaterial (0,2% TWEEN 80 in Wasser) wird einmal täglich (9:00–10:00 Uhr) für 4 Tage mit verschiedenen Dosierungen in einem Endvolumen von 2 ml pro Kilogramm Körpergewicht verabreicht. (TWEEN 80 ist ein oberflächenaktives Mittel, 20-molares oberflächenaktives Polyethylenoxidsorbitanmonooleat, das von ICI Specialty Chemicals, Wilmington, Delaware, USA) hergestellt wird. Gesamt-Fäkalproben werden während der letzten 48 Stunden der Behandlungsphase gesammelt und auf Gallensäuregehalt untersucht, und zwar unter Verwendung eines enzymatischen Assays, wie oben beschrieben. Die Wirksamkeit der Verbindung wird durch Vergleich des Anstiegs der fäkalen Gallensäure(FBA)-Konzentration in behandelten Ratten mit dem Durchschnitt der FBA-Konzentration von Ratten in der Trägermaterial-Gruppe bestimmt.
Messungen der fäkalen Gallensäure-Konzentration (FBA)
Die gesamte fäkale Produktion von einzeln gehaltenen Ratten wird über 24 oder 48 Stunden gesammelt, unter einem Stickstoffstrom getrocknet, pulverisiert und gewogen. Ungefähr 0,1 g wird abgewogen und in ein organisches Lösungsmittel extrahiert (Butanol/Wasser). Nach Auftrennung und Trocknen wird der Rest in Methanol gelöst und die vorhandene Menge Gallensäure wird enzymatisch gemessen, und zwar unter Verwendung der 3α-Hydroxysteroid-Steroiddehydrogenase-Reaktion mit Gallensäuren unter Reduktion von NAD (siehe Mashige, F. et al., Clin. Chem., 27, 1352 (1981).
[³H]Taurocholat-Aufnahme in Kaninchen-Bürstensaum-Membranvesikeln (BBMV)
Kaninchen-Ileum-Bürstensaummembranen werden aus gefrorenen ilealen Schleimhäuten mittels der Calciumpräzipitations-Methode präpariert, die von Malathi et al. beschrieben ist (Biochimica Biophysica Acta, 554, 259 (1979)). Das Verfahren zur Messung von Taurocholat ist im Wesentlichen das, wie es von Kramer et al. beschrieben ist (Biochimica Biophysica Acta, 1111, 93 (1992)), mit der Ausnahme, dass das Assayvolumen 200 μl anstelle von 100 μl ist. Kurz, bei Raumtemperatur werden 190 μl einer Lösung, die 2 μM [³H]Taurocholat (0,75 μCi), 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 100 mM Mannit pH 7,4 enthält, für 5 s mit 10 μl Bürstensaum-Membranvesikeln (60–120 μg Protein) inkubiert. Die Inkubation wird durch die Zugabe von den BBMV initiiert, während gevortext wird, und die Reaktion wird durch Zugabe von 5 ml eiskaltem Puffer (20 mM Hepes-Tris, 150 mM KCl), unmittelbar gefolgt von einer Filtration durch einen Nylonfilter (0,2 μm Porengröße) und eine zusätzliche Waschung mit 5 ml Stopp-Puffer gestoppt.
Acyl-CoA; Cholesterin-Acyl-Transferase (ACAT)
Hamsterleber- und Rattendarm-Mikrosomen sind aus Gewebe so zu präparieren, wie es vorstehend beschrieben ist (J. Biol. Chem., 255, 9098 (1980)), und als Quelle für ACAT-Enzym verwendet. Der Assay besteht aus einer 2,5 ml-Inkubation, enthaltend 24 μM Oleoyl-CoA (0,05 μCi) in 50 mM Natriumphosphat, 2 mM DTT pH 7,4-Puffer, enthaltend 0,25% BSA und 200 μg mikrosomales Protein. Der Assay wird durch die Zugabe von Oleoyl-CoA gestartet. Die Reaktion schreitet für 5 min bei 37°C fort und wird durch Zugabe von 8,0 ml Chloroform/Methanol (2 : 1) beendet. Zu der Extraktion werden 125 μg Cholesterinoleat in Chloroform-Methanol gegeben, damit dieses als Träger fungiert, und die organischen und wässrigen Phasen der Extraktion werden durch Zentrifugation nach gründlichem Verwirbeln getrennt. Die Chloroform-Phase wird eingetrocknet und dann auf eine Silicagel-60-TLC-Platte aufgebracht und in Hexan/Ethylether (9 : 1) entwickelt. Die Menge gebildeten Cholesterinesters wird durch Messen der Radioaktivitätsmenge, die in den Cholesterin-Oleat-Fleck auf der TLC-Platte eingebaut wurde, mittels eines Packard-Instaimager bestimmt.
Hundemodell zur Beurteilung von lipidsenkenden Arzneimitteln
Männliche Beagle-Hunde, bezogen von einem Verkäufer, wie z. B. Marshall Farms, und mit einem Gewicht von 6 bis 12 kg werden einmal täglich für zwei Stunden gefüttert und Wasser wird ad libitum gegeben. Die Hunde können zufällig Dosierungsgruppen zugeteilt werden, die jeweils aus 6 bis 12 Hunden bestehen, wie z. B.: Trägermaterial, i. g.; 1 mg/kg, i. g.; 2 mg/kg, i. g.; 4 mg/kg, i. g.; 2 mg/kg, p. o. (Puder in einer Kapsel). Intragastrale Dosierung eines therapeutischen Materials, verdünnt in wässriger Lösung (z. B. 0,2% Tween 80-Lösung [Polyoxyethylenmonooleat, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO]) kann unter Verwendung einer Magensonde durchgeführt werden. Vor dem Beginn der Dosierung können Blutproben aus der Vena cephalica am Morgen vor der Fütterung entnommen werden um Serumcholesterin(Gesamt- und HDL-)- und Triglycerid-Werte zu ermitteln. Für mehrere darauffolgende Tage werden den Tieren am Morgen vor der Fütterung Dosen verabreicht, den Tieren wird erlaubt, 2 Stunden zu fressen, bevor jegliche übriggebliebene Nahrung entfernt wird. Faeces werden über eine Dauer von 2 Tagen am Ende der Studie gesammelt und können auf den Gallensäure- der Lipidgehalt hin untersucht werden. Blutproben müssen ebenfalls genommen werden am Ende der Behandlungsphase für den Vergleich mit den Serumlipidwerten vor der Studie. Die statistische Signifikanz wird unter Verwendung des Standard-Student's-Tests mit p < 0,05 bestimmt.
Hunde-Serumlipid-Messung
Blut wird aus der Vena cephalica von nüchternen Hunden in Serum-Abscheideröhrchen (Vacutainer SST, Becton Dickinson und Co., Frankling Lakes, NJ) entnommen. Das Blut wird für 20 Minuten bei 2000 UpM zentrifugiert und das Serum dekantiert.
Gesamtcholesterin kann in einem Mikrotiter-Format mit 96 Vertiefungen unter Verwendung eines enzymatischen Wako-Diagnostic-Kits (Cholesterin CII) (Wako Chemicals, Richmond, VA) gemessen werden, unter Ausnutzung der Cholesterin-Oxidase-Reaktion, die Wasserstoffperoxid produziert, welches kolorimetrisch gemessen wird. Eine Standardkurve von 0,5 bis 10 μg Cholesterin ist in den ersten beiden Spalten der Platte zu erstellen. Die Serumproben (20 bis 40 μl, abhängig von der erwarteten Lipidkonzentration) oder bekannte Serumkontrollproben werden in einzelne Vertiefungen jeweils in doppelter Ausfertigung gegeben. Wasser wird zugegeben um das Volumen in jeder Vertiefung auf 100 μl zu bringen. Ein 100 μl-Aliquot-Farbreagens wird zu jeder Vertiefung gegeben und die Platten werden bei 500 nm nach einer 15minütigen Inkubation bei 37°C eingelesen.
HDL-Cholesterin kann unter Verwendung des Sigma-Kits Nr. 352-3 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gemessen werden, welcher Dextransulfat und Mg-Ionen verwendet um LDL und VLDL selektiv zu präzipitieren. Ein Volumen von 150 μl jeder Serumprobe wird in einzelne Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, gefolgt von 15 μl des HDL-Cholesterin-Reagenses (Sigma 352-3). Die Proben werden gemischt und bei 5000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert. Ein 50 μl-Aliquot des Überstandes wird dann mit 200 μl Kochsalzlösung gemischt und unter Verwendung desselben Verfahrens wie für die Messung von Gesamtcholesterin gemessen.
Triglyceride werden unter Verwendung des Sigma-Kits Nr. 337 in einem Mikrotiterformat mit 96 Vertiefungen gemessen. Dieses Verfahren misst Glycerin, und zwar nach dessen Freisetzung durch die Reaktion von Triglyceriden mit der Lipoproteinlipase. Standardlösungen von Glycerin (Sigma 339-11) im Bereich von 1 bis 24 μg werden verwendet um eine Standardkurve zu erstellen. Serumproben (20 bis 40 μl, abhängig von der erwarteten Lipidkonzentration) werden in doppelter Ausfertigung in die Vertiefungen gegeben. Wasser wird hinzugegeben um das Volumen in jeder Vertiefung auf 100 μl zu bringen und 100 μl Farbreagens werden ebenfalls zu jeder Vertiefung gegeben. Nach Mischen und einer 15minütigen Inkubation werden die Platten bei 540 nm eingelesen und die Triglycerid-Werte aus der Standardkurve errechnet. Eine Abgleichungsplatte wird ebenfalls verwendet und zwar mit einem Blindproben-Enzymreagens um gegen jegliches endogenes Glycerin in den Serumproben zu korrelieren.
Fäkale Gallensäure-Messung bei Hunden
Fäkalproben können gesammelt werden um die fäkale Gallensäure (FBA)-Konzentration für jedes Tier zu messen. Das Sammeln der Faeces kann während der letzten 48 Stunden der Studie vorgenommen werden und zwar für zwei aufeinanderfolgende 24-Stunden-Intervalle zwischen 9:00 und 10:00 Uhr täglich, und zwar vor Dosierung und Fütterung. Die getrennten zwei Tages-Sammlungen von jedem Tier sind zu wiegen, werden jeweils vereinigt und mit destilliertem Wasser in einer Küchenmaschine (Cuisinart) homogenisiert um einen homogenen Schlamm zu erzeugen. Ungefähr 1,4 g des Homogenats werden in einer Endkonzentration von 50% tert.-Butanol/destilliertes Wasser (2 : 0,6) für 45 Minuten in einem 37°C-Wasserbad extrahiert und für 13 Minuten bei 2000 × g zentrifugiert. Die Konzentration von Gallensäuren (mmol/Tag) kann unter Verwendung eines enzymatischen Assaysystems (1,2) im Mikrotiterformat mit 96 Vertiefungen bestimmt werden. Ein 20 μl-Aliquot des fäkalen Extraktes wird zu jeweils zwei Sets von Vertiefungen in jeweils dreifacher Ausführung in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Eine standardisierte Natriumtaurocholatlösung und eine standardisierte Fäkalextrakt-Lösung (die zuvor aus vereinigten Proben hergestellt wurde und deren Gallensäurekonzentration bestimmt wurde) wird ebenfalls analysiert zum Zwecke der Qualitätskontrolle des Assays. 20 Mikroliter-Aliquots von Natriumtaurocholat, seriell verdünnt um eine Standardkurve zu erstellen, werden in ähnlicher Weise in zwei Sätze von Vertiefungen in dreifacher Ausführung gegeben. Eine 230 μl-Reaktionsmischung, enthaltend 1 M Hydrazinhydrat, 0,1 M Pyrophosphat und 0,46 mg/ml NAD, wird zu jeder Vertiefung gegeben. Ein 50 μl-Aliquot 3a-Hydroxysteroid-Dehydrogenaseenzym (HSD; 0,8 Einheiten/ml) oder Assay-Puffer (0,1 M Natriumpyrophosphat) werden dann zu einem der zwei Sätze in dreifacher Ausführung gegeben. Alle Reagentien können von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO bezogen werden. Nach 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wird die optische Dichte bei 340 nm gemessen und der Durchschnitt jedes Probensatzes in dreifacher Ausführung wird errechnet. Die Differenz der optischen Dichte ± HSD-Enzym wird verwendet um die Gallensäure-Konzentration (mM) von jeder Probe, basierend auf der Natriumtaurocholat-Standardkurve, zu bestimmen. Die Gallensäure-Konzentration des Extraktes, das Gewicht des fäkalen Homogenats (Gramm) und das Körpergewicht des Tieres verwendet werden um die entsprechende FBA-Konzentration in mmol/kg/Tag für jedes Tier zu errechnen. Die durchschnittliche FBA-Konzentration (mmol/kg/Tag) der Trägermaterial-Gruppe ist von der FBA-Konzentration jeder Behandlungsgruppe zu subtrahieren um den Anstieg (delta-Wert) in der FBA-Konzentration als Ergebnis der Behandlung zu bestimmen.
CETP-Aktivitätsassay in humanem Plasma (Tritium-markierter Cholesterylester)
Blut ist von gesunden Freiwilligen zu beziehen. Das Blut wird in Röhrchen gesammelt, die EDTA enthalten (EDTA-Plasmapool). Der humane EDTA-Plasmapool, der zuvor bei –20°C gelagert wurde, wird bei Raumtemperatur aufgetaut und für 5 Minuten zentrifugiert um Partikel zu entfernen. Tritium-markiertes HDL, radioaktiv in der Cholesterylestergruppe markiert, ([³H]CE-HDL) wie von Morton und Zilversmit beschrieben (J. Biol. Chem., 256, 11992–95 (1981)), wird bis zu einer Endkonzentration von (25 μg/ml Cholesterin) zum Plasma hinzugegeben. Inhibitorverbindungen werden dem Plasma wie folgt hinzugegeben: gleiche Volumina Plasma, enthaltend [³H]CE-HDL (396 μl) werden in Mikroreaktionsgefäße pipettiert (Titertube^®, Bio-Rad laboratories, Hercules, CA). Die Verbindungen, üblicherweise als 20 bis 50 mM-Standardlösungen in DMSO gelöst, werden in DMSO oder in einem alternativen Lösungsmittel in einigen Fällen, wie z. B. Dimethylformamid oder Ethanol) seriell verdünnt. Vier μl von jeder der seriellen Verdünnungen der Inhibitorverbindungen oder DMSO alleine werden dann zu einem jeden der Plasmaröhrchen gegeben. Die Röhrchen werden sofort gemischt. Aliquots (100 μl) in dreifacher Ausführung von jedem Plasmaröhrchen werden dann in Vertiefungen von Polystyrol-Mikrotiterplatten mit 96 Grundboden-Vertiefungen (Corning, Corning, NY) transferriert. Die Platten werden mit Plastikfolie versiegelt und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Die Testvertiefungen sollen Plasma mit Verdünnungen der Inhibitorverbindungen enthalten. Die Kontrollvertiefungen sollen Plasma mit DMSO alleine enthalten. Blindwert-Vertiefungen sollen Plasma mit DMSO alleine enthalten, welche während der 4stündigen Inkubation bei 4°C in den Mikroreaktionsröhrchen gelassen wurden und am Ende der Inkubationszeit in die Mikrotiter-Vertiefungen gegeben wurden. VLDL und LDL werden durch Zugabe von 10 μl Präzipitations reagens (1% (Gew./Vol.) Dextransulfat (Dextralip50)/0,5 M Magnesiumchlorid, pH 7,4) zu jeder Vertiefung präzipitiert. Die Vertiefungen werden auf einem Plattenmischer gemischt und dann bei Umgebungstemperatur 10 Minuten inkubiert. Die Platten werden dann 30 Minuten bei 10°C und bei 1000 × g zentrifugiert. Die Überstände (50 μl) jeder Vertiefung werden dann in die Vertiefungen einer Picoplate^TM-96-Platte (Packard, Meriden, CT), enthaltend 250 : 1 Microscint^TM-40 (Packard, Meriden, CT) transferriert. Die Platten werden zugeschweißt (TopSeal^TM-P, Packard, Meriden, CT), entsprechend den Angaben des Herstellers und für 30 min gemischt. Auf einem Mikrotiterplatten-Szintillationszähler wird die Radioaktivität gemessen (TopCount, Packard, Meriden, CT). Die IC₅₀-Werte als Konzentration der Inhibitorverbindung bestimmt, die den Transfer von [³H]CE aus [³H]CE-HDL im Überstand auf das präzipitierte VLDL und LDL zu 50% inhibiert, verglichen mit dem Transfer, der in den Kontrollvertiefungen erhalten wird. Der maximale prozentuale Transfer (in den Kontrollvertiefungen) wird unter Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt:
Der Prozentsatz des Kontrolltransfers, der in den Vertiefungen bestimmt wurde, die Inhibitorverbindungen enthalten, wird wie folgt bestimmt:
Die IC₅₀-Werte werden aus dem Auftrag der % Kontrolle gegenüber der Konzentration der Inhibitorverbindung errechnet.
CETP-Aktivität in vitro
Die Fähigkeit von Verbindungen, die CETP-Aktivität zu inhibieren, wird unter Verwendung eines in-vitro-Assays, der die Transferrate von radioaktiv markiertem Cholesterylester ([³H]CE) von HDL-Donorpartikeln auf LDL-Akzeptorpartikeln misst, untersucht. Details des Assays werden von Glenn et al. bereitgestellt (Glenn und Melton, "Quantificatioin of Cholesteryl Ester Transfer Protein (CETP): A) CETP Activity and B) Immunochemical Assay of CETP Protein", Meth. Enzymol., 263, 339–351 (1996)). CETP kann aus dem serumfreien konditionierten Medium von CHO-Zellen erhalten werden, die mit einer cDNA für CETP transfiziert wurden (Wang, S. et al., J. Biol. Chem., 267, 17487–17490 (1992)). Um die CETP-Aktivität zu messen, werden [³H]CE-markiertes HDL, LDL, CETP und Assaypuffer (50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 7,4; 150 mM Natriumchlorid; 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure; 1% Rinderserumalbumin) in einem Volumen von 200 μl für 2 Stunden bei 37°C in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen inkubiert. LDL wird durch Zugabe von 50 μl 1% (Gew./Vol.) Dextransulfat/0,5 M Magnesiumchlorid getrennt präzipitiert, durch Verwirbeln gemischt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Die Lösung (200 μl) wird auf eine Filterplatte transferriert (Millipore). Nach der Filtration wird die im präzipitierten LDL vorhandene Radioaktivität durch Flüssig-Szintillationszählung gemessen. Die Korrektur gegen nicht-spezifischen Transfer oder nicht-spezifische Präzipitation wird vorgenommen, indem Proben dazugenommen werden, die kein CETP enthalten. Die Transferrate von [³H]CE bei diesem Assay verhält sich linear im Verhältnis zu Zeit und CETP-Konzentration, bis 25 bis 30% des [³H]CE transferriert sind.
Die Wirksamkeit der Testverbindungen kann bestimmt werden, indem der oben beschriebene Assay in Anwesenheit von variierenden Konzentrationen der Testverbindungen durchgeführt wird und die Konzentration bestimmt wird, die für eine 50%ige Inhibierung des Transfers von [³H]CE von HDL auf LDL erforderlich ist. Dieser Wert ist als der IC₅₀-Wert definiert. Die IC₅₀-Werte, die aus diesem Assay bestimmt wurden, sind genau, wenn der IC₅₀ größer als 10 nM ist. Im Falle, wenn Verbindungen eine größere inhibitorische Wirksamkeit besitzen, können genaue Messungen der IC₅₀-Werte bestimmt werden, indem längere Inkubationszeiten (bis zu 18 Stunden) und niedrigere Endkonzentrationen von CETP (< 50 nM) verwendet werden.
Inhibition der CETP-Aktivität in vivo
Die Inhibition der CETP-Aktivität durch eine Testverbindung kann bestimmt werden, indem die Verbindung einem Tier durch intravenöse Injektion oder oral durch eine Magensonde verabreicht wird, die Menge des Transfers von Tritium-markiertem Cholesterylester ([³H]CE) von HDL- auf VLDL- und LDL-Partikel gemessen wird, und diese Transfermenge mit der Transfermenge verglichen wird, die bei Kontrolltieren beobachtet wird.
Männliche syrische Goldhamster werden für mindestens zwei Wochen vor der Studie auf einer Diät mit Futter, das 0,24% Cholesterin enthält, gehalten. Damit die Tiere unmittelbar vor dem Experiment die intravenöse Dosierung erhalten, werden die Tiere mit Pentobarbital anästhesiert. Die Anästhesie wird während des Experimentes aufrechterhalten. Dauerkatheter werden in die Jugularvene und in die Karotte-Arterie eingeführt. Bei Beginn des Experimentes erhalten alle Tiere 0,2 ml einer Lösung, die [³H]CE-HDL enthält, in die Jugularvene. [³H]CE-HDL ist eine Präparation von humanem HDL, das Tritium-markierten Cholesterylester enthält, und es wird entsprechend dem Verfahren von Glenn et al. hergestellt (Meth. Enzymol., 263, 339–351 (1996)). Die Testverbindung wird als 80 mM-Stammlösung in einem Trägermaterial (2% Ethanol: 98% PEG 400, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA) gelöst und entweder durch Bolus-Injektion oder durch kontinuierliche Infusion verabreicht. Zwei Minuten nachdem die [³H]CE-HDL-Dosis verabreicht ist, sollen die Tiere 0,1 ml der Testlösung, injiziert in die Drosselvene, erhalten. Die Kontrolltiere sollen 0,1 ml der intravenösen Trägermateriallösung ohne Testverbindung erhalten. Nach 5 Minuten werden die ersten Blutproben (0,5 ml) aus der Karotis-Arterie entnommen und in Standard-Mikroreaktionsröhrchen gesammelt, die Ethylendiamintetraessigsäure enthalten. Es wird Kochsalzlösung (0,5 ml) injiziert um den Katheter zu spülen und das Blutvolumen zu ersetzen. Darauf folgende Blutproben sind nach zwei Stunden und nach vier Stunden mittels derselben Methode zu entnehmen. Die Blutproben werden gut gemischt und bis zur Fertigstellung des Experimentes auf Eis gehalten. Plasma wird durch Zentrifugation der Blutproben bei 4°C erhalten. Das Plasma (50 μl) wird mit 5 μl Präzipitationsreagens (Dextransulfat, 10 g/l; 0,5 M Magnesiumchlorid) behandelt um VLDL/LDL zu entfernen. Nach der Zentrifugation wird der daraus hervorgehende Überstand (25 μl), der das HDL enthält, auf Radioaktivität untersucht, indem ein Flüssig-Szintillationszähler verwendet wird.
Der prozentuale Anteil [³H]CE, der von HDL auf LDL und VLDL übertragen wurde (% Transfer), wird auf der Basis der Gesamtradioaktivität in äquivalenten Plasmaproben vor der Präzipitation errechnet. Typischerweise wird die Transfermenge von HDL auf LDL und VLDL in Kontrolltieren nach 4 Stunden 20% bis 35% betragen.
Alternativ dazu können nicht-anästhesierte Tiere bei Bewußtsein eine orale Dosis Testverbindung mittels einer Magensonde als Suspension in 0,1% Methylcellulose in Wasser erhalten. Zu einem für jede Verbindung bestimmten Zeitpunkt, an dem die Plasmaspiegel der Testsubstanzen nach der oralen Gabe ihr Maximum erreichen (C_max), werden die Tiere mit Pentobarbital anästhesiert und es werden ihnen dann 0,2 ml einer Lösung, die [³H]CE-HDL enthält, wie oben beschrieben in die Drosselvene verabreicht. Kontrolltiere sollen 0,25 ml der Trägerlösung ohne Testverbindung durch die orale Magensonde erhalten. Nach 4 Stunden sind die Tiere zu schlachten, Blutproben werden gesammelt und der prozentuale Anteil von [³H]CE, das von HDL auf LDL und VLDL transferriert wurde (% Transfer), wird wie oben beschrieben untersucht.
Alternativ dazu kann die Inhibierung der CETP-Aktivität durch eine Testverbindung bestimmt werden, indem die Verbindung Mäusen verabreicht wird, die selektiert wurden auf Expression von humanem CETP (hCETP) durch transgene Manipulation (hCETP-Mäuse). Testverbindungen können durch intravenöse Injektion oder orale Schlundsonde verabreicht werden und die Menge des Transfers von Tritium-markiertem Cholesterylester ([³H]CE) von HDL- auf VLDL- und LDL-Partikel wird bestimmt und mit der Menge des Transfers, der bei Kontrolltieren beobachtet wird, verglichen. C57B1/6-Mäuse, die homozygot für das hCETP-Gen sind, werden auf einer Futterdiät mit hohem Fettanteil gehalten, wie z. B. TD 88051, wie beschrieben von Nishina et al. (J. Lipid Res., 31, 859–869 (1990)), und zwar für mindestens zwei Wochen vor der Studie. Die Mäuse erhalten eine orale Gabe der Testverbindung mittels der Schlundsonde als eine Suspension in 0,1% Methylcellulose in Wasser oder eine intravenöse Bolus-Injektion der Testverbindung in 10% Ethanol und 90% Polyethylenglykol. Die Kontrolltiere erhalten die Trägermateriallösung ohne Testverbindung durch die orale Schlundsonde oder durch intravenöse Bolus-Injektion. Bei Beginn des Experimentes erhalten alle Tiere 0,05 ml einer Lösung, die [³H]CE-HDL enthält, in die Schwanzvene. Das [³H]CE-HDL wird eine Prä paration aus humanem HDL sein, das Tritium-markierten Cholesterylester enthält, und wird entsprechend dem Verfahren von Glenn et al. hergestellt (Meth. Enzymol., 263, 339–351 (1996)). Nach 30 Minuten werden die Tiere ausgeblutet und das Blut in Standard-Mikroreaktionsröhrchen gesammelt, die Ethylendiamintetraessigsäure enthalten. Die Blutproben werden gut gemischt und bis zur Beendigung des Experimentes auf Eis gehalten. Plasma erhält man durch Zentrifugation der Blutproben bei 4°C. Das Plasma wird abgetrennt und durch Gelfiltrations-Chromatographie analysiert und der relative Anteil von [³H]CE in den VLDL-, LDL- und HDL-Regionen wird bestimmt.
Der prozentuale Anteil [³H]CE, der von HDL auf LDL und VLDL transferriert wurde (% Transfer), wird basierend auf der Gesamtradioaktivität in äquivalenten Plasmaproben vor der Präzipitation errechnet. Typischerweise wird die Transfermenge von HDL auf LDL und VLDL in Kontrolltieren nach 30 Minuten 20% bis 35% betragen.
Intestinaler Cholesterin-Absorptions-Assay
Von einer Vielzahl von Verbindungen wurde gezeigt, dass sie die Cholesterin-Absorption aus dem Darmtrakt inhibieren. Diese Verbindungen erniedrigen die Serum-Cholesterinspiegel, indem sie die intestinale Absorption von Cholesterin sowohl aus exogenen Quellen (Nahrungs-Cholesterin) als auch aus endogenen Quellen (von der Gallenblase in den Darmtrakt sekretiert) reduzieren.
Die Verwendung einer Zwei-Isotopen-Plasmaverhältnis-Methode bei Hamstern um die intestinale Cholesterinabsorption zu messen, wurde wie von Turley et al. (J. Lipid Res. 35, 329– 339 (1994)) beschrieben, verfeinert und evaluiert.
Männlichen Hamstern mit einem Gewicht von 80 bis 100 g wird Nahrung und Wasser ad libitum gegeben und zwar in einem Raum mit alternierenden 12stündigen Phasen von Licht und Dunkelheit. Nach vier Stunden Lichtphase wird jedem Hamster zunächst eine intravenöse Dosis von 2,5 μCi [1,2-³H]Cholesterin, suspendiert in Intralipid (20%), und dann eine Oraldosis von [4-¹⁴C]Cholesterin in einem Öl aus Triglyceriden mittlerer Kettenlänge (MCT) verabreicht. Die i. v.-Dosis wird verabreicht, indem ein Volumen von 0,4 ml der Intralipid-Mischung in die distale Vena femoralis injiziert wird. Die orale Dosis wird durch eine Magensonde gegeben und zwar ein Volumen von 0,6 ml der MCT-Ölmischung, die intragastral über einen Polyethylenschlauch in den Magen eingeführt wird. Nach 72 Stunden werden die Hamster ausgeblutet und die Menge von ³H und ¹⁴C im Plasma und in der ursprünglichen Menge des verabreichten Markierungsstoffes durch Flüssig-Szintillations-Spektrometrie bestimmt. Die Cholesterin-Absorption errechnet sich auf der Grundlage der folgenden Gleichung:
Mikrosomales Triglycerid-Transferprotein(MTP)-Assay
MTP kann aus Lebergewebe oder aus kultivierten Zellen (z. B. HepG2-Zellen) unter Verwendung von Standardmethoden, wie sie von Ohringer et al. beschrieben sind (Acta Crystallogra. D52, 224–225 (1996)), gereinigt werden.
Die nachfolgende Analyse der MTP-Aktivität kann durchgeführt werden wie von Jamil et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 11991–11995 (1996).
Die Basis dieses Assays ist es, dem Transfer von markierten Triglyceriden aus einer Population von Donorvesikeln in eine Population von Akzeptorvesikeln in Anwesenheit von MTP zu messen. Inhibitoren von MTP können beurteilt werden, indem sie vor der Zugabe von MTP zu der Mischung hinzugegeben werden. Donor-Vesikel werden durch Beschallen eines wässrigen Gemisches von Ei-Phospholipiden, Cardiolipid, ³H-markierten Phospholipiden und ¹⁴C-markierten Triglyceriden hergestellt. Akzeptorvesikel werden durch Beschallen einer wässrigen Mischung von Ei-Phospholipiden hergestellt. Die Vesikellösungen werden zusammengemischt, mit oder ohne hinzugegebene MTP-Inhibitoren, und MTP wird hinzugefügt um die Transferreaktion zu starten. Der Assay wird nach 60 Minuten durch Zugabe von 0,5 ml DE-52-Cellulose terminiert, gefolgt von einer Zentrifugation um die Donormoleküle zu sedimentieren. Die Menge an ³H und ¹⁴C im Pellet und in der ursprünglichen Menge des Markierungsmittels in der Mischung werden durch Flüssig-Szintillations-Spektrometrie bestimmt. Die Lipid-Transferrate errechnet sich nach einer Kinetik erster Ordnung unter Verwendung des folgenden Ausdrucks: [S] = [S]0e–kt wobei [S]₀ und [S] die Fraktionen von ¹⁴C-Markierung in Donormembran-Pellet zu dem Zeitpunkten 0 bzw. t sind und der Ausdruck k der Anteil an Markierung ist, der pro Zeiteinheit transferriert wird.
Plasmalipid-Assay in Kaninchen
Plasmalipide können unter Verwendung von Standarmethoden untersucht werden, wie von J. R. Schuh et al., J. Clin. Invest., 91, 1453–1458 (1993) berichtet. Gruppen von männlichen weißen Neuseeland-Kaninchen werden auf eine Standardnahrung gesetzt (100 g/Tag), supplementiert mit 0,3% Cholesterin und 2% Maisöl (Zeigler Bothers, Inc., Gardners, PA). Wasser steht ad lib. zur Verfügung. Gruppen von Kontrolltieren und behandelten Tieren werden nach 1 und 3 Monaten der Behandlung getötet. Gewebe werden zur Charakterisierung der atherosklerotischen Läsionen entnommen. Blutproben sind zur Bestimmung der Plasmalipid-Konzentrationen zu entnehmen.
Plasmalipide
Plasma zur Lipiduntersuchung wurde durch Entnahme von Blut aus der Ohrvene in EDTA-enthaltende Röhrchen erhalten (Vacutainer; Becton Dickinson & Co., Rutherford, NJ), gefolgt von einer zentrifugalen Abtrennung der Zellen. Gesamt-Cholesterin wurde enzymatisch bestimmt, unter Verwendung der Cholesterin-Oxidase-Reaktion (C. A. Allain et al., Clin. Chem., 20, 470–475 (1974)). HDL-Cholesterin wurde ebenfalls enzymatisch gemessen nach der selektiven Präzipitation von LDL und VLDL durch Dextransulfat mit Magnesium (G. R. Warnick et al., Clin. Chem., 28, 1379–1388 (1982)). Plasma-Triglycerid-Spiegel werden durch Messung der Menge von Glycerin bestimmt, die durch Lipoprotein-Lipase über einen enzymgekoppelten Assay freigesetzt wurde (G. Bucolo et al., Clin. Chem., 19, 476–482 (1973)).
Atherosklerose
Die Tiere werden durch Pentobarbital-Injektion getötet. Die thorakalen Aortas werden schnell entnommen, in 10%igem neutral gepuffertem Formalin immersionsfixiert und mit Oil Red 0 (0,3%) gefärbt. Nach einem einzelnen longitudinalen Schnitt entlang der Wand gegenüber der arteriellen Öffnung werden die Gefäße für die Untersuchung des Plaque-Bereiches mit Nadeln aufgesteckt. Die prozentuale Bedeckung mit Plaques wird aus den Werten für den gesamten untersuchten Bereich und für den gefärbten Bereich bestimmt, und zwar durch Schwellenwert-Analyse unter Verwendung eines Echtfarbbild-Zerlegers (Videometric 150; American Innovision, Inc., San Diego, CA), verbunden mit einer Farbkamera (Toshiba 3CCD), montiert auf ein Seziermikroskop. Gewebe-Cholesterin wird enzymatisch wie beschrieben gemessen nach der Extraktion mit einer Chloroform/Ethanol-Mischung (2 : 1) entsprechend dem Verfahren von Folch et al. (J. Biol. Chem., 226, 497–590 (1957)).
Vaskuläre Antwort in-vitro
Die abdominalen Aorten werden nach der Injektion von Natriumpentobarbital schnell herausgeschnitten und in mit Sauerstoff angereicherten Krebs-Bicarbonat-Puffer gebracht. Nach dem Entfernen von perivaskulärem Gewebe werden 3 mm-Ringsegmente geschnitten, in ein 37°C-Muskelbad, enthaltend Krebs-Bicarbonat-Lösung, gebracht und zwischen zwei Drähten aus rostfreiem Stahl aufgehängt, von denen einer an einen Kraftmesswandler angebracht ist (Grass Instrument Co., Quincy, MA). Kraftveränderungen in Antwort auf die Zugabe von Angiotensin II zu dem Bad werden mit einem Diagrammschreiber aufgezeichnet.
Die hierin beschriebenen Beispiele können durchgeführt werden, indem die allgemein oder spezifisch beschriebenen therapeutischen Verbindungen oder inerten Ingredientien durch jene, die in den vorstehenden Beispielen verwendet wurden, ersetzt werden.
Es ist offensichtlich, nachdem die Erfindung so beschrieben ist, dass dieselbe auf viele Arten und Weisen variiert werden kann. Solche Variationen werden nicht als Abweichung vom Umfang der vorliegenden Erfindung angesehen und alle solche Modifikationen und Äquivalente wie sie für den Fachmann offensichtlich wären, sollen im Umfang der vorliegenden Ansprüche enthalten sein.

Claims

Therapeutische Zusammensetzung umfassend eine erste Menge einer Cholesterinester-Transfer-Protein-Inhibitor-Verbindung und eine zweite Menge einer Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung, wobei die erste Menge und die zweite Menge zusammen eine wirksame Menge gegen hyperlipidämische Krankheitsbilder, eine wirksame Menge gegen atherosclerotische Krankheitsbilder oder eine wirksame Menge gegen Hypercholesterinämie-Krankheitsbilder enthalten, wobei die Cholesterinester-Transfer-Protein-Inhibitor-Verbindung dargestellt wird durch die Formel C-12
oder deren Enantiomere oder Racemate.
Therapeutische Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung Cholestyramin umfasst.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung Colestipol umfasst.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung ein amphiphiles Copolymer mit einer vernetzten Hülldomäne und einer inneren Kerndomäne umfasst.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Gallensäure-Sequestriermittel-Verbindung ein Polyallylamin-Polymer umfasst.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Polyallylamin-Polymer Colesevelamhydrochlorid umfasst.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Polyallylamin-Polymer OmegaGel umfasst.
Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Prophylaxe oder zur Behandlung eines hyperlipidämischen Krankheitsbildes.
Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Prophylaxe oder zur Behandlung eines atherosclerotischen Krankheitsbildes.
Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Prophylaxe oder zur Behandlung von Hypercholesterinämie.