JP4728226B2 - Ｃｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、イソプレノイド合成阻害剤及び／又はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤、特にイソプレノイド合成阻害剤であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤が、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内への移行を促進する作用を有することを見出したことに基づくものである。即ち、本発明は、イソプレノイド合成阻害剤及び／又はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤、好ましくはイソプレノイド合成阻害剤、より好ましくはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤からなるＣｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤、同薬剤の核内移行促進剤としての使用、同薬剤を用いたＣｄｃ４２タンパク質の核内移行を促進させる方法、同薬剤を含有してなる医薬組成物に関する。また、本発明は、当該Ｃｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤を有効成分とする血管治療剤、及びＣｄｃ４２タンパク質の核内移行能を測定することによる血管治療剤のスクリーニング方法に関する。

ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）は内在性のＧＴＰ加水分解活性をもつタンパク質の総称であり、ｍＲＮＡの翻訳に関与するＧタンパク質群、７回膜貫通型レセプターに共役する三量体Ｇタンパク質群、低分子量Ｇタンパク質群などが知られている(実験医学2003；21：137-145)。この内、低分子量Ｇタンパク質群はサブユニット構造をもたない分子量が２万〜３万のタンパク質として、これまで１００種類以上報告されており、イソプレニル化を受けた後に細胞膜に移行することで、ＧＴＰ結合型（ｏｎ）／ＧＤＰ結合型（ｏｆｆ）として細胞内シグナル伝達に関与している。

低分子量Gタンパク質群は、さらに、Ｒａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｂ、Ａｒｆ及びＲａｎの五つのスーパーファミリーに分けられる(Physiol. Rev., 2001;81:153-208)。この内、Ｒｈｏファミリーは、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２などのサブファミリーにさらに分けられる。Ｒｈｏファミリーはアクチン細胞骨格の再編成を介して細胞機能を制御し、Ｒａｓファミリーと同様に遺伝子発現の調節に関与している。そして、Ｒｈｏはアクチンストレスファイバ−や接着斑の、Ｒａｃはラメリポディアの、Ｃｄｃ４２は糸状突起（フィロポディア）の形成を誘導する。

Ｒｈｏファミリーに属する低分子量Ｇタンパク質であるＣｄｃ４２は、分子量２１ｋＤａのタンパク質で、糸状突起の形成、細胞接着、細胞運動、細胞極性、遺伝子発現の制御などの種々の細胞活動に関与するＧタンパク質である。ＧＴＰと結合した活性型（ＧＴＰ結合型）Ｃｄｃ４２の標的タンパク質としては、ＰＡＫ（p21-activated kinase）、ＭＲＣＫ（myotonic dystrophy kinase-related Cdc42 binding kinase）、ＷＡＰＳ、及びＩＱＧＡＰ１などが知られている。すなわち、Ｃｄｃ４２は、ＰＡＫの活性化によるＭＡＰキナーゼカスケードを介して種々の遺伝子の発現を制御し、ＷＡＳＰやＭＲＣＫと関連して接着斑（focal contact）及び糸状突起（フィロポディア）の形成に関与し、またＩＱＧＡＰ１と関連して細胞間接着を制御している。

一方、ＨＭＧ−ＣｏＡ（３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡ）還元酵素阻害剤は、コレステロールの生合成における早期律速段階、すなわちＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への転換を触媒する酵素の阻害剤であり、高コレステロール血症治療剤として知られている。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、大規模試験において動脈硬化疾患の発症を低下させることが検証されているが、オーバーラップ解析などから、この発症低下には、肝臓においてＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害することで発揮されるコレステロール低下作用とは別に、血管壁において発揮される作用が関与していることが示されてきている。

すなわち、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、血管壁細胞においてＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素を阻害しイソプレノイド生成の低下作用を介して低分子量Ｇタンパク質の活性を低下させ、細胞機能に様々な影響を及ぼし、血管壁において抗炎症反応を示すことで、動脈硬化を抑制すると考えられている。

さらに、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、内皮細胞活性化の抑制、内皮機能の改善、単球／マクロファージの接着や泡沫化の抑制または改善、平滑筋の遊走・増殖の抑制、プラークの安定化などの作用を有しているが、これらの作用には、Ｒｈｏサブファミリーの低分子量Ｇタンパク質であるＲｈｏ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２が関与することが報告されている。特に、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の内皮機能改善効果は、服用開始後短期間で著明に発現し、諸作用の中で重要と考えられている。

最近、血管壁におけるアンジオテンシンII、ＰＤＧＦ、トロンビン、エンドセリン、ロイコトリエンＢ４などが介在するシグナル伝達にＲａｃが関与し、ＮＡＤＰＨの活性を亢進して、血管病の進展に重要な役割を果たすことが明らかにされた（Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2003;285:C723-734）が、Ｃｄｃ４２についても、血管内皮細胞の増殖及びバリアー機能の回復（J. Cell Sci., 2001;114:1343-55、J. Biol. Chem., 2002;277:4003-9.、Circ. Res., 2004;94:159-166）、さらにエンドセリンのシグナル伝達(J. Biol. Chem., 2003;278:29890-900）に関与していることが報告されるようになった。

さらに本発明者らは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤であるピタバスタチンの血管内皮細胞における遺伝子発現に及ぼす影響を検討し、ピタバスタチンが炎症性サイトカインＩＬ−８やＭＣＰ−１の発現、エンドセリンの発現、ＰＡＩ−１の発現をそれぞれ抑制する一方、血管拡張・収縮に関与するＮＯシンターゼの発現、凝固線溶系のトロンボモジュリンの発現を促進すること（J. Atheroscler. Thromb., 2002;9:178-183）、またPTX3（TFの発現を促進、動脈硬化進展の指標になる）の発現を抑制すること（J. Atheroscler. Thromb., 2004;11:62-183）を見出してきた。

発明者らは、鋭意研究の結果、驚くべきことに、イソプレノイド合成阻害剤及び／又はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤処理、特にＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤処理により、ＲａｃとＣｄｃ４２が核内に移行することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、イソプレノイド合成阻害剤及び／又はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤、好ましくはイソプレノイド合成阻害剤、より好ましくはイソプレノイド合成阻害剤の１種であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤からなるＣｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤に関する。

また本発明は、イソプレノイド合成阻害剤及び／又はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤の、好ましくはイソプレノイド合成阻害剤の、より好ましくはイソプレノイド合成阻害剤の１種であるＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤としての使用に関し、またイソプレノイド合成阻害剤及び／又はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤を細胞に投与することからなる、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内への移行を促進させる方法を提供する。

さらに本発明は、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤を有効成分とする血管治療剤、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤及び製薬上許容される担体を含有してなる血管治療用の医薬組成物を提供する。

また本発明は、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤の血管治療剤の製造のための使用、及び治療・予防に必要な有効量のＣｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤を血管障害の予防・治療を必要とする患者に投与することからなる血管障害の治療・予防方法を提供する。

さらに本発明は、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内への移行を測定することを特徴とする血管治療剤のスクリーニング方法を提供する。より詳細には、Ｃｄｃ４２タンパク質を発現している細胞に被検物質を添加し、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内への移行を測定することからなる、血管治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。

緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とＣｄｃ４２との融合タンパク質をコードする遺伝子を導入して、ピタバスタチンの非存在下で培養した形質転換細胞を蛍光顕微鏡で観察した写真である。 ＧＦＰとＣｄｃ４２との融合タンパク質をコードする遺伝子を導入して、ピタバスタチンの存在下で培養した形質転換細胞を蛍光顕微鏡で観察したときの写真である。 ＧＦＰとＣｄｃ４２との融合タンパク質をコードする遺伝子を導入して、ピタバスタチンの存在下で培養し、さらに核染色色素ヘキスト（Hoechst）を添加して核を染色（赤色）した形質転換細胞を蛍光顕微鏡で観察したときの写真である。

本発明者らは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、特にピタバスタチンを用いて、ＨＵＶＥＣにおけるＣｄｃ４２タンパク質の挙動を測定した。そのために、Ｃｄｃ４２と蛍光タンパク質であるＧＦＰとの融合タンパク質をコードする遺伝子をＨＵＶＥＣに導入し、ＧＦＰ-Ｃｄｃ４２融合タンパク質が発現する形質転換細胞を調製した。この形質転換細胞を培養し、ピタバスタチンの有無による細胞内Ｃｄｃ４２の分布状態を、ＧＦＰによる蛍光として観察した。これらの結果を図１〜図３に示す。

図１は、ピタバスタチンの非存在下で培養した形質転換細胞におけるＣｄｃ４２の分布状態を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す、図面に代わる写真である。図１ではＧＦＰによる蛍光が細胞のほぼ全域にわたって観察でき、Ｃｄｃ４２タンパク質が形質転換細胞全域に分布していることが分かる。

一方、ピタバスタチンの存在下で培養した形質転換細胞におけるＣｄｃ４２の分布状態を蛍光顕微鏡で観察した結果を、図２として図面に代わる写真で示す。図２では、ＧＦＰによる蛍光が細胞のある一箇所に局在していることが観察できる。このＣｄｃ４２の細胞内局在位置をさらに確認するために、上記細胞をヘキスト（Hoechst）（Lydon M., et al., J. Cell Physiol., 102,175-181 (1980); Sriram M., et al., Biochemistry, 31,11823-11834 (1992)）で染色した結果を、図３として図面に代わる写真で示す。図３では、ヘキストで染色された核が赤く観察されているが、これはＧＦＰによる蛍光が局在化している部位と一致していた。

ここで使用したヘキストは、細胞膜透過性を有する蛍光色素であり、ＤＮＡの副溝のＡＴ配列に特異的に結合するものである。以上の実験から、血管内皮細胞をピタバスタチンで処理すると、ＧＦＰ−Ｃｄｃ４２が核染色色素ヘキストによる染色部位と同位置に、すなわち核に移行することが示された。この様に、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、細胞内のＣｄｃ４２タンパク質を核に移行させる作用を有していることが判明した。

本発明のＣｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤は、Ｃｄｃ４２タンパク質の関わる作用：細胞運動、細胞極性、細胞内シグナル伝達、遺伝子発現などの制御、特に血管壁細胞における遺伝子発現の制御に重要な影響を及ぼし、血管治療剤、特に内皮細胞機能改善剤、細胞接着阻害剤として有用であると考えられる。

本発明におけるＣｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤であるイソプレノイド合成阻害剤としては、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素阻害剤(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1987;84:7488-92)、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、フィブラート等のＡＭＰＫ活性化剤(Biochem. Soc. Trans., 1997;25:S676)、Ｎ含有ビスホスホネート等のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤(Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999;264:108-111)などを挙げることができる。また、本発明におけるＣｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤であるゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤としては、公知の文献、例えばBiochemical Pharmacology 2000; 60:1061-1068等に記載されたものなどを挙げることができる。これらの酵素阻害剤は、対象となる酵素の活性を完全に又は部分的に阻害することができる活性を有するものであればよい。

より具体的には、以下の化合物を挙げることができる。
ロバスタチン（化学名：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル （Ｓ）−２−メチルブチレート（米国特許第４，２３１，９３８号参照））；
シンバスタチン（化学名：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル ２，２−ジメチルブタノエート（米国特許第４，４４４，７８４号参照））；
プラバスタチン（化学名：（＋）−（３Ｒ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−７−［（１Ｓ，２Ｓ，６Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ヒドロキシ−２−メチル−８−［（Ｓ）−２−メチルブチリルオキシ］−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−１−ナフチル］ヘプタン酸（米国特許第４，３４６，２２７号参照））；
フルバスタチン（化学名：（３ＲＳ，５ＳＲ，６Ｅ）−７−［３−（４−フルオロフェニル）−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸（米国特許第５，３５４，７７２号参照））；
アトルバスタチン（化学名：（３Ｒ，５Ｒ）−７−［２−（４−フルオロフェニル）−５−イソプロピル−３−フェニル−４−フェニルカルバモイル−１Ｈ−ピロル−１−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプタン酸（米国特許第５，２７３，９９５号参照））；
セリバスタチン（化学名：（３Ｒ，５Ｓ）−エリスロ−（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−２，６−ジイソプロピル−５−メトキシメチル−ピリジン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸（米国特許第５，１７７，０８０号参照））；
メバスタチン（化学名：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−７−メチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル （Ｓ）−２−メチルブチレート（米国特許第３，９８３，１４０号参照））；
ロスバスタチン（化学名：７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（N−メチル−N−メタンスルホニルアミノピリミジン）−５−イル］−（３R，５S）−ジヒドロキシ−（E）−６−ヘプテン酸（米国特許第５，２６０，４４０号、日本国特許第２，６４８，８９７号参照））；
ピタバスタチン（（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸（米国特許第５，８５６，３３６号、日本国特許第２，５６９，７４６号参照））
これらは、製剤学的に必要であれば塩や溶媒和物として使用することもできる。特に好ましい阻害剤はピタバスタチンである。

また、もうひとつの本発明である、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内移行を測定することを特徴とする血管治療剤のスクリーニング方法としては、Ｃｄｃ４２タンパク質を標識又は染色し、その核内移動を同定する方法などが挙げられる。Ｃｄｃ４２タンパク質を標識する方法としては、遺伝学工学的手法が挙げられる。具体的には、ＧＦＰ（宮脇敦史：蛍光バイオイメージングで細胞内現象を可視化する．理研ニュース２５５：２００２年９月）をはじめとする蛍光タンパク質ＢＦＰ、ＣＦＰ及びＹＦＰなどを利用して、これらとＣｄｃ４２タンパク質との融合タンパク質を利用する方法が挙げられる。また、Ｃｄｃ４２タンパク質を染色する方法としては、免疫学的手法などが挙げられる。具体的には、蛍光抗体又は酵素抗体の利用が挙げられる。特に、遺伝学工学的手法により、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質とＣｄｃ４２タンパク質との融合タンパク質を用意し、該融合タンパク質の核内移行を視覚的に同定する方法が好ましい。

本発明のＣｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤は、医薬として血管障害の治療・予防に使用されるだけでなく、各種の細胞を用いた試験においてＣｄｃ４２タンパク質を細胞の核内に局在させておきたいときの試薬として使用することもできる。即ち、医薬における有効成分として使用されるだけでなく、実験用の試薬や診断薬における試薬などとして使用することもできる。

本発明の血管治療剤としては、前記した本発明のＣｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤を用いるか、あるいは同核内移行促進剤と製薬学的に許容される担体とからなる血管治療用の医薬組成物が挙げられる。

本発明の血管治療剤の投与経路としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、又は静脈内注射剤、筋肉内注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等による非経口投与が挙げられる。

また、このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、この有効成分を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を１種又はそれ以上と適宜組み合わせて用いることができる。

特に、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の投与経路としては経口投与が好ましい。経口投与用製剤の調製にあたっては、有効成分の安定性を考慮してｐＨを調整（特開平２−６４０６号、日本国特許第２，７７４，０３７号、ＷＯ９７／２３２００号等。これらの文献を参照して本明細書に取り込む。）するのが好ましい。

これらの医薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状等によって異なるが、通常成人の場合、有効成分をイソプレノイド合成阻害剤及び／又はゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤として、一日０．０１〜１０００ｍｇ、特に０．１〜１００ｍｇを、１回又は数回に分けて経口投与するのが好ましい。

実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこの実施例により何ら限定されるものではない。

ＧＦＰと所望のタンパク質との融合タンパク質を調製するための市販プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ１の所定の位置に、Ｃｄｃ４２の翻訳領域の全領域をコードする遺伝子を導入して、ＧＦＰ−Ｃｄｃ４２遺伝子を含有するプラスミドを構築した。
１×１０ 個のＨＵＶＥＣを６ウエルのプレートに播種した後、１夜ＥＧＭ−２培地で培養した。この細胞に、フゲネ６（Fugene6）を用いて、前記で調製したプラスミド構築物ＤＮＡを１ウエル当たり０．８μｇ添加した。さらに２１時間ＥＧＭ−２培地で培養した後、ＧＦＰによる蛍光を蛍光顕微鏡で観察した結果を図１に示す。
一方、プラスミド構築物ＤＮＡを添加したＨＵＶＥＣの培養を開始してから６時間後に、ピタバスタチンを最終濃度が１μＭとなるように添加し、さらに静置して１５時間培養した細胞をプレパラート上に固定し、蛍光顕微鏡で観察した結果を図２に示す。さらに、この細胞を核染色色素ヘキストで染色した結果を図３に示す。

本発明は、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内移行促進剤に関するものであり、Ｃｄｃ４２タンパク質は、血管内皮細胞の増殖及びバリアー機能の回復、又エンドセリンのシグナル伝達に関与していることが知られており、又、血管収縮・拡張、炎症、血液凝固・線溶に関わる種々の遺伝子の発現調節を介して血管病の進展に重要な役割を果しているものであることから、本発明の薬剤は、各種の血管病の治療や予防のための医薬として産業上の極めて有用なものである。
また、本発明は、Ｃｄｃ４２タンパク質の核内への移行を測定することを特徴とする血管治療剤のスクリーニング方法を提供するものであり、血管病の新たな治療薬や予防薬を開発するための手法として産業上有用である。

Claims (3)

1. 標識したＣｄｃ４２タンパク質を発現しているＨＵＶＥＣに被検物質を添加し、標識したＣｄｃ４２タンパク質の核内への移行を測定することからなる、Ｃｄｃ４２タンパク質の作用に起因する血管壁の障害を改善する物質のスクリーニング方法。
2. 標識したＣｄｃ４２タンパク質が蛍光蛋白質との融合タンパク質の形態であり、核内への移行の測定が蛍光として観察される、請求項１に記載のスクリーニング方法。
3. 被検物質を添加した場合の核内で観察される標識量を、被検物質未添加の場合の標識量と比較する工程を含む、請求項１または２に記載のスクリーニング方法。

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