JPWO2005063294A1 - γ−セクレターゼ複合体形成阻害剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を有効成分とするγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤、及びそれを製造するためのコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤の使用を提供する。また、本発明は、コレステロールの合成阻害活性を測定すること、又は細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法に関する。さらに、本発明は、細胞内におけるγ−セクレターゼが、その活性複合体を形成するに必要とされるニカストリン（nicastrin）、ＡＰＨ−１、Ｐｅｎ−２などの構成成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質のγ−セクレターゼに対する作用をスクリーニングする方法に関する。
Description
本発明は、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を有効成分とするγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤又はγ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤、及びコレステロールの合成阻害活性を測定すること、又は細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法又はγ−セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法に関する。また、本発明は、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法に関する。さらに、本発明は、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を用いて、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法又はγ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させる方法に関する。また、本発明は、γ−セクレターゼ複合体形成阻害剤又はγ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤を製造するためのコレステロール合成阻害剤，又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤の使用に関する。また、本発明は、細胞内におけるγ−セクレターゼが、その活性複合体を形成するに必要とされるニカストリン（nicastrin）、ＡＰＨ−１、Ｐｅｎ−２などの構成成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質のγ−セクレターゼに対する作用をスクリーニングする方法に関する。
老人性痴呆症の代表的疾患であるアルツハイマー病（ＡＤ）は、脳の萎縮、老人斑の沈着および神経原線維の形成を特徴とする変性疾患で、神経細胞の脱落が痴呆症状を引き起こすと考えられている(N Engl J Med 2003;348:1356)。ＡＤでは、１回膜貫通蛋白であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）が、細胞膜に存在するα−セクレターゼよりも脂質ラフト（lipid rafts：スフィンゴ脂質とコレステロールが集積した細胞膜のミクロドメイン）(J Clin Invest. 2002;110:597-603)に存在するβ−セクレターゼで細胞外部分が切断され、更にγ−セクレターゼによって膜貫通部が切断されてAβ40、Aβ42ペプチドを生じ、これらのペプチドとりわけ凝集性の強いAβ42が脳に沈着して神経細胞が脱落し脳の萎縮が生じる。γ−セクレターゼは、単一の膜貫通蛋白であるβ−セクレターゼと異なり、活性サブユニットであるプレセニリン（presenilin）がニカストリン（nicastrin）、APH-1、Pen-2とγ−セクレターゼ複合体を形成して作用し(生体の科学2003;291-296)、脂質ラフトが、Aβ40、Aβ42産生の場になると考えられている。セクレターゼの活性はコレステロールレベルの影響を受け、コレステロールレベルの増加はα−セクレターゼ活性を低下させ、β−セクレターゼ活性を上昇させるが、γ−セクレターゼの活性には大きな影響を受けないとされている（Biochem Soc Transact 2002；30:525-529）。コレステロール包接剤（J Lipid Res. 1999;40:781-96）による脂質ラフトからのコレステロールの除去ではγ−セクレターゼ活性が消失したという報告(Neurobiol Dis. 2002;9:11-23)と影響がなかったという報告(Biochemistry 2003;42:13977- 86)がある。
コレステロールの生合成過程は、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素によりアセチル−ＣｏＡから生成された３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）が、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素により還元されて、メバロン酸を生成する過程から始まる。生成されたメバロン酸は、活性イソプレン単位と呼ばれるイソペンテニルピロリン酸とされ、ゲラニルピロリン酸を経て、ファルネシルピロリン酸合成酵素によりファルネシルピロリン酸とされる。そして、スクアレン合成酵素によりスクアレンとされ、スクアレンエポキシダーゼにより２，３−エポキシスクアレンとされる。そして、ラノステロール合成酵素によりラノステロールとされてコレステロールの母体構造が形成された後、各種の修飾反応を経てコレステロールが生成される。
ファルネシルピロリン酸合成酵素により生成されたファルネシルピロリン酸の一部は、イソペンテニルピロリン酸と反応してゲラニルゲラニルピロリン酸となり、ゲラニルゲラニル転移酵素によりＲｈｏやＲａｃなどのタンパク質のゲラニルゲラニル化が行われる。
また、ＡＭＰＫはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をリン酸化して失活させるのでＡＭＰＫ活性化剤はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と類似の作用を有している。さらに、ＡＭＰＫはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをリン酸化して失活させる作用も持ち脂肪酸合成も抑制する。また、フィブラートはＡＭＰＫ活性化作用を介してＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素抑制作用をもつことが知られている。
ファルネシルピロリン酸合成酵素により生成されたファルネシルピロリン酸の一部は、イソペンテニルピロリン酸と反応してゲラニルゲラニルピロリン酸となり、ゲラニルゲラニル転移酵素によりＲｈｏやＲａｃなどのタンパク質のゲラニルゲラニル化が行われる。
また、ＡＭＰＫはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素をリン酸化して失活させるのでＡＭＰＫ活性化剤はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤と類似の作用を有している。さらに、ＡＭＰＫはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをリン酸化して失活させる作用も持ち脂肪酸合成も抑制する。また、フィブラートはＡＭＰＫ活性化作用を介してＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素抑制作用をもつことが知られている。
HMG-CoA還元酵素阻害剤は、コレステロール生合成の律速段階、HMG-CoAのメバロン酸への転換を触媒する酵素であるHMG-CoA還元酵素を拮抗阻害する薬剤であり、高コレステロール血症治療剤として知られている。HMG-CoA還元酵素阻害剤を服用している患者はＡＤ罹患率が低いというレトロスペクティブな疫学結果が報告され（Arch Neurol 2000;57:1439-1433）、又、HMG-CoA還元酵素阻害剤はin vitro、in vivoにおけるAβペプチドの生成を低下させたとの結果から、HMG-CoA還元酵素阻害剤がＡＤ治療に有用とする特許が出願されている（WO 02/062824号、WO 01/096311号、WO 01/32161号、WO 00/28981号、WO 99/48488号、USP 6,472,421号、USP 6,440,387号、USP 6,080,778号）。これらの特許明細書では、HMG-CoA還元酵素阻害剤がＡＰＰのプロセシング即ちセクレターゼ活性の調節を介してAβペプチドの産生を低下させた可能性が述べられているが、γ−セクレターゼ活性の低下を論じたものは無い。
γ-セクレターゼ阻害剤は、本酵素がAβ42を産生する酵素であること、活性サブユニットであるプレセニリンの遺伝子変異がＡＤ病の原因となることなどから(Arch Neurol. 2003;60:1541-4)、ＡＤ病治療薬として、現在、盛んに検討が行われている(Adv Drug Deliv Rev. 2002;54:1579-88)。しかし、γ-セクレターゼはＡＰＰの他、Notch、ErbB4、CD44、LRPなどを切断し、活性の強いものは副作用を発現する為（FASEB J 2003;17:79-81）、γ-セクレターゼ阻害剤の開発は必ずしもうまく進んでいない。既存の薬物では、γ-セクレターゼ阻害作用を持つ、一部の非ステロイド性抗炎症剤がAβ42の産生を特異的に阻害し、Notchの切断を阻害しないことが報告されている (J Biol Chem 2003;278:30748-30754, 18664-18670)。その機序についてはRho抑制の関与が示唆されている（Science 2003；302：1215-1217）。
本発明者らは、Aβ40、Aβ42産生の場と考えられている神経細胞の脂質ラフトにおけるγ−セクレターゼ複合体の存在量を蔗糖密度勾配法により検討した結果，コレステロールを除去し脂質ラフトの構造を破壊してしまうメチルβシクロデキストリンのようなコレステロール包接剤だけでなく、驚くべきことに、脂質ラフトのコレステロールを低下させるコレステロール合成阻害剤が、脂質ラフトのコレステロール残量に依存して脂質ラフトのγ−セクレターゼ複合体の存在量を低下させ、その活性を低下させることを見出し、本発明を完成した。従って、本発明は脂質ラフトへのγ−セクレターゼ複合体の分布量を低下させる新しいタイプのγ−セクレターゼ活性抑制剤及びそのスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明者らは、培養細胞に被検物質を添加して、細胞内におけるγ−セクレターゼが、その活性複合体を形成するに必要とされるニカストリン（nicastrin）、APH-1、Pen-2などの成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質のγ−セクレターゼに対する作用をスクリーニングできることを見出した。
また、本発明者らは、培養細胞に被検物質を添加して、細胞内におけるγ−セクレターゼが、その活性複合体を形成するに必要とされるニカストリン（nicastrin）、APH-1、Pen-2などの成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質のγ−セクレターゼに対する作用をスクリーニングできることを見出した。
本発明は、第一に、コレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法、より詳細には、脂質ラフトに蓄積され得るコレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明は、第二に、コレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、γ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法、より詳細には、脂質ラフトに蓄積され得るコレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、γ−セクレターゼのの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明は、第三に、被検物質の存在下に、細胞を培養し、細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明は、第四に、被検物質の存在下に、細胞を培養し、細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなる、γ−セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明は、第二に、コレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、γ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法、より詳細には、脂質ラフトに蓄積され得るコレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、γ−セクレターゼのの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明は、第三に、被検物質の存在下に、細胞を培養し、細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明は、第四に、被検物質の存在下に、細胞を培養し、細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなる、γ−セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明は、第五に、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法、より詳細には脂質ラフトにおけるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明は、第六に、γ−セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法、より詳細には脂質ラフトにおけるγ−セクレターゼの分布を低下させる作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明は、第六に、γ−セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法、より詳細には脂質ラフトにおけるγ−セクレターゼの分布を低下させる作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法を提供するものである。
本発明は、第七に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を有効成分とするγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤を提供するものである。
本発明は、第八に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を有効成分とするγ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤を提供するものである。
本発明は、第九に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を用いて、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法を提供するものである。
本発明は、第十に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を用いて、γ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させる方法を提供するものである。
本発明は、第十一に、γ−セクレターゼ複合体形成阻害剤を製造するためのコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤の使用を提供するものである。
本発明は、第十二に、γ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤を製造するためのコレステロール合成阻害剤，又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤の使用を提供するものである。
さらに、本発明は、培養細胞に被検物質を添加して、細胞内におけるγ−セクレターゼが、その活性複合体を形成するに必要とされるニカストリン（nicastrin）、APH-1、Pen-2などの構成成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質のγ−セクレターゼに対する作用をスクリーニングする方法に関する。
本発明は、第八に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を有効成分とするγ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤を提供するものである。
本発明は、第九に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を用いて、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法を提供するものである。
本発明は、第十に、コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を用いて、γ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させる方法を提供するものである。
本発明は、第十一に、γ−セクレターゼ複合体形成阻害剤を製造するためのコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤の使用を提供するものである。
本発明は、第十二に、γ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤を製造するためのコレステロール合成阻害剤，又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤の使用を提供するものである。
さらに、本発明は、培養細胞に被検物質を添加して、細胞内におけるγ−セクレターゼが、その活性複合体を形成するに必要とされるニカストリン（nicastrin）、APH-1、Pen-2などの構成成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質のγ−セクレターゼに対する作用をスクリーニングする方法に関する。
本発明者らは、後述する実施例において示されるように、細胞にHMG-CoA還元酵素阻害剤を添加することにより、脂質ラフトにおけるコレステロール含有量の顕著な減少が見られるだけでなく（図３参照）、メチルβシクロデキストリンを添加した場合と同様なγ−セクレターゼ活性複合体の構成成分であるニカストリン、プレセニリン１及びプレセニリン2が脂質ラフト分画（フラクション３）から消失する（図３Ａ、Ｂ及びＣ参照）ことを見出した。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤の場合には、フロティリンは脂質ラフト分画に未だ残っており脂質ラフト構造は保たれていた。
このことは、脂質ラフトのコレステロールを低下させるコレステロール合成阻害剤が、脂質ラフトのコレステロール残量に依存して脂質ラフトのγ−セクレターゼ活性複合体の存在量を低下させ、その活性を低下させることを明らかにしたものである。また、Aβの産生を抑制するNSAIDsがRho抑制を介して働くと報じられていること（Science 2003；302：1215-1217）、この実験で使用したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がコレステロールの合成阻害だけでなくタンパク質のゲラニルゲラニル化をも阻害する活性を有していることから、HMG-CoA還元酵素阻害剤がRhoのゲラニルゲラニル化抑制剤として機能していることを包含するものである。
また、本発明者らは、蔗糖密度勾配法などにより細胞の構成要素をフラクション化することにより、γ−セクレターゼ活性複合体の構成成分であるニカストリン、プレセニリン１（ＰＳ１）及びプレセニリン２（ＰＳ２）などの細胞内での分布を解析できることを確立し、このような構成成分の分布を測定することにより、γ−セクレターゼの活性に対して影響を与える物質をスクリーニングできることを明らかにした。
このことは、脂質ラフトのコレステロールを低下させるコレステロール合成阻害剤が、脂質ラフトのコレステロール残量に依存して脂質ラフトのγ−セクレターゼ活性複合体の存在量を低下させ、その活性を低下させることを明らかにしたものである。また、Aβの産生を抑制するNSAIDsがRho抑制を介して働くと報じられていること（Science 2003；302：1215-1217）、この実験で使用したＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤がコレステロールの合成阻害だけでなくタンパク質のゲラニルゲラニル化をも阻害する活性を有していることから、HMG-CoA還元酵素阻害剤がRhoのゲラニルゲラニル化抑制剤として機能していることを包含するものである。
また、本発明者らは、蔗糖密度勾配法などにより細胞の構成要素をフラクション化することにより、γ−セクレターゼ活性複合体の構成成分であるニカストリン、プレセニリン１（ＰＳ１）及びプレセニリン２（ＰＳ２）などの細胞内での分布を解析できることを確立し、このような構成成分の分布を測定することにより、γ−セクレターゼの活性に対して影響を与える物質をスクリーニングできることを明らかにした。
本発明において、コレステロール合成阻害剤とは、生体内のコレステロールの合成を阻害することができる薬剤であり、生体内におけるコレステロールの生合成経路のいずれか１つの段階又は２以上の段階を阻害することができるものであればよい。本発明のコレステロール合成阻害剤としては、例えば、HMG-CoA合成酵素阻害剤(Proc Natl Acad Sci USA.1987;84:7488-92)、HMG-CoA還元酵素阻害剤、スクアレンシンターゼ阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、フィブラート等のAMPK活性化剤(Biochemical Society Transactions.l997;25:S676)、及びビスホスホネート等のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤（Biochem Biophys Res Commun 1999;264:108-111）などが挙げられる。好ましいコレステロール合成阻害剤としては、HMG-CoA還元酵素阻害剤が挙げられる。
また、本発明の蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤としては、生体内のゲラニルゲラニル化タンパク質の生成を阻害又は抑制することができる薬剤であればよく、生体内におけるゲラニルゲラニル化タンパク質の生合成経路のいずれか１の段階又は２以上の段階を阻害又は抑制することができるものであればよい。本発明の蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤としては、例えば、HMG-CoA合成酵素阻害剤、HMG-CoA還元酵素阻害剤、フィブラート等のAMPK活性化剤、ビスホスホネート等のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤、ゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤などが挙げられる。本発明の好ましい蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤としては、HMG-CoA還元酵素阻害剤、ゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤などが挙げられる。
したがって、本発明のコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤としては、HMG-CoA合成酵素阻害剤、HMG-CoA還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、AMPK活性化剤、、ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤及びゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤からなる群から選ばれた１種又は２種以上の薬剤を使用することができる。生体内におけるコレステロールの生合成経路とゲラニルゲラニルピロリン酸の生合成経路は、ファルネシルピロリン酸の合成経路までは同じであることから、ファルネシアピロリン酸の生合成までの経路における酵素活性阻害剤の使用が好ましい。例えば、本発明の好ましいコレステロール合成阻害剤又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤としては、HMG-CoA還元酵素阻害剤が挙げられる。より好ましい薬剤としてはスタチン類が挙げられる。これらの薬剤は、製剤学的に必要であれば、塩や溶媒和物として使用することもできる。
また、本発明の蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤としては、生体内のゲラニルゲラニル化タンパク質の生成を阻害又は抑制することができる薬剤であればよく、生体内におけるゲラニルゲラニル化タンパク質の生合成経路のいずれか１の段階又は２以上の段階を阻害又は抑制することができるものであればよい。本発明の蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤としては、例えば、HMG-CoA合成酵素阻害剤、HMG-CoA還元酵素阻害剤、フィブラート等のAMPK活性化剤、ビスホスホネート等のファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤、ゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤などが挙げられる。本発明の好ましい蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤としては、HMG-CoA還元酵素阻害剤、ゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤などが挙げられる。
したがって、本発明のコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤としては、HMG-CoA合成酵素阻害剤、HMG-CoA還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、AMPK活性化剤、、ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤及びゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤からなる群から選ばれた１種又は２種以上の薬剤を使用することができる。生体内におけるコレステロールの生合成経路とゲラニルゲラニルピロリン酸の生合成経路は、ファルネシルピロリン酸の合成経路までは同じであることから、ファルネシアピロリン酸の生合成までの経路における酵素活性阻害剤の使用が好ましい。例えば、本発明の好ましいコレステロール合成阻害剤又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤としては、HMG-CoA還元酵素阻害剤が挙げられる。より好ましい薬剤としてはスタチン類が挙げられる。これらの薬剤は、製剤学的に必要であれば、塩や溶媒和物として使用することもできる。
本発明における好ましいHMG-CoA還元酵素阻害剤としては、例えば、
ロバスタチン（化学名：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル （Ｓ）−２−メチルブチレート（米国特許第４，２３１，９３８号参照））；
シンバスタチン（化学名：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル ２，２−ジメチルブタノエート（米国特許第４，４４４，７８４号参照））；
プラバスタチン（化学名：（＋）−（３Ｒ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−７−［（１Ｓ，２Ｓ，６Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ヒドロキシ−２−メチル−８−［（Ｓ）−２−メチルブチリルオキシ］−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−１−ナフチル］ヘプタン酸（米国特許第４，３４６，２２７号参照））；
フルバスタチン（化学名：（３ＲＳ，５ＳＲ，６Ｅ）−７−［３−（４−フルオロフェニル）−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸（米国特許第５，３５４，７７２号参照））；
アトルバスタチン（化学名：（３Ｒ，５Ｒ）−７−［２−（４−フルオロフェニル）−５−イソプロピル−３−フェニル−４−フェニルカルバモイル−１Ｈ−ピロル−１−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプタン酸（米国特許第５，２７３，９９５号参照））；
セリバスタチン（化学名：（３Ｒ，５Ｓ）−エリスロ−（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−２，６−ジイソプロピル−５−メトキシメチル−ピリジン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸（米国特許第５，１７７，０８０号参照））；
メバスタチン（化学名：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−７−メチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル （Ｓ）−２−メチルブチレート（米国特許第３，９８３，１４０号参照））；
ロスバスタチン（化学名：７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（N−メチル−N−メタンスルホニルアミノピリミジン）−５−イル］−（３R，５S）−ジヒドロキシ−（E）−６−ヘプテン酸（米国特許第５，２６０，４４０号、日本国特許第２，６４８，８９７号参照））；
ピタバスタチン（（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸（米国特許第５，８５６，３３６号、日本国特許第２，５６９，７４６号参照）） ；
又はそれらの塩などが挙げられる。より好ましくは、ピタバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチンなどが挙げられ、さらに好ましくは、ピタバスタチンが挙げられる。
ロバスタチン（化学名：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル （Ｓ）−２−メチルブチレート（米国特許第４，２３１，９３８号参照））；
シンバスタチン（化学名：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−３，７−ジメチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル ２，２−ジメチルブタノエート（米国特許第４，４４４，７８４号参照））；
プラバスタチン（化学名：（＋）−（３Ｒ，５Ｒ）−３，５−ジヒドロキシ−７−［（１Ｓ，２Ｓ，６Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−６−ヒドロキシ−２−メチル−８−［（Ｓ）−２−メチルブチリルオキシ］−１，２，６，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−１−ナフチル］ヘプタン酸（米国特許第４，３４６，２２７号参照））；
フルバスタチン（化学名：（３ＲＳ，５ＳＲ，６Ｅ）−７−［３−（４−フルオロフェニル）−１−（１−メチルエチル）−１Ｈ−インドール−２−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸（米国特許第５，３５４，７７２号参照））；
アトルバスタチン（化学名：（３Ｒ，５Ｒ）−７−［２−（４−フルオロフェニル）−５−イソプロピル−３−フェニル−４−フェニルカルバモイル−１Ｈ−ピロル−１−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプタン酸（米国特許第５，２７３，９９５号参照））；
セリバスタチン（化学名：（３Ｒ，５Ｓ）−エリスロ−（Ｅ）−７−［４−（４−フルオロフェニル）−２，６−ジイソプロピル−５−メトキシメチル−ピリジン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸（米国特許第５，１７７，０８０号参照））；
メバスタチン（化学名：（＋）−（１Ｓ，３Ｒ，７Ｓ，８Ｓ，８ａＲ）−１，２，３，７，８，８ａ−ヘキサヒドロ−７−メチル−８−［２−［（２Ｒ，４Ｒ）−テトラヒドロ−４−ヒドロキシ−６−オキソ−２Ｈ−ピラン−２−イル］エチル］−１−ナフチル （Ｓ）−２−メチルブチレート（米国特許第３，９８３，１４０号参照））；
ロスバスタチン（化学名：７−［４−（４−フルオロフェニル）−６−イソプロピル−２−（N−メチル−N−メタンスルホニルアミノピリミジン）−５−イル］−（３R，５S）−ジヒドロキシ−（E）−６−ヘプテン酸（米国特許第５，２６０，４４０号、日本国特許第２，６４８，８９７号参照））；
ピタバスタチン（（３Ｒ，５Ｓ，６Ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−３−キノリル］−３，５−ジヒドロキシ−６−ヘプテン酸（米国特許第５，８５６，３３６号、日本国特許第２，５６９，７４６号参照）） ；
又はそれらの塩などが挙げられる。より好ましくは、ピタバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチンなどが挙げられ、さらに好ましくは、ピタバスタチンが挙げられる。
本発明における好ましいコレステロール合成阻害剤としては、HMG-CoA還元酵素阻害剤が挙げられ、当該HMG-CoA還元酵素阻害剤としては、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、アトルバスタチン、ピタバスタチン又はロスバスタチン、及びそれぞれの場合においてその薬学的に許容される塩からなる群から選ばれる化合物が挙げられる。さらに好ましいHMG-CoA還元酵素阻害剤としては、ピタバスタチン又はその塩若しくはその溶媒和物が挙げられる。
本発明は、γ−セクレターゼの活性を抑制すること、より詳細には脂質ラフトにおける活性を抑制することを、その目的のひとつとするものである。したがって、本発明のγ−セクレターゼの活性抑制剤としては、γ−セクレターゼの複合体の形成を阻害することからなるγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤、又はγ−セクレターゼ又はその活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させるためのγ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤のいずれのものであってもよい。
本発明のγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤、又はγ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤は、有効成分としてのコレステロール合成阻害剤及び／又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、並びに製薬上許容される担体を含有することができ、これらの成分を含有してなる医薬組成物として使用することもできる。
また、本発明は、γ−セクレターゼの活性を抑制することが必要とされる患者に、本発明のコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤の有効量を投与することからなるγ−セクレターゼの活性化に伴う疾患を治療又は予防する方法を提供するものである。本発明のγ−セクレターゼの活性を抑制することが必要とされる患者としては、γ−セクレターゼの活性複合体の形成によるAβ40、Aβ42ペプチド、特にAβ42の産生を抑制し、これらのペプチドの沈着に起因する各種の疾患、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）などが挙げられる。
本発明のγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤、又はγ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤は、有効成分としてのコレステロール合成阻害剤及び／又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、並びに製薬上許容される担体を含有することができ、これらの成分を含有してなる医薬組成物として使用することもできる。
また、本発明は、γ−セクレターゼの活性を抑制することが必要とされる患者に、本発明のコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤の有効量を投与することからなるγ−セクレターゼの活性化に伴う疾患を治療又は予防する方法を提供するものである。本発明のγ−セクレターゼの活性を抑制することが必要とされる患者としては、γ−セクレターゼの活性複合体の形成によるAβ40、Aβ42ペプチド、特にAβ42の産生を抑制し、これらのペプチドの沈着に起因する各種の疾患、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）などが挙げられる。
本発明のコレステロール合成阻害剤及び／又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はこれらを含有してなる本発明の医薬組成物の投与経路としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は静脈内注射剤、筋肉内注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点鼻剤等による非経口投与が挙げられる。
またこのような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、この有効成分を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を１種又はそれ以上と適宜組み合わせて用いることができる。
特に、HMG-CoA還元酵素阻害剤は、これらの投与経路のうち、経口投与が好ましい。経口投与用製剤の調製にあたっては、有効成分の安定性を考慮してpHを調整（特開平２−６４０６号、日本国特許第２，７７４，０３７号、ＷＯ９７／２３２００号等参照）するのが好ましい。
これらの医薬の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状等によって異なるが、通常成人の場合、有効成分を一般式（１）で表される化合物として、一日０．０１〜１０００mg、特に０．１〜１００mgを、１回又は数回に分けて経口投与又は非経口投与するのが好ましい。
本発明のγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤又はγ−セクレターゼの活性複合体の脂質ラフト分布低下剤は、脂質ラフトにおけるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する又はγ−セクレターゼ若しくはその活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させることにより、γ−セクレターゼの実質的な活性を抑制し、Aβ40、Aβ42ペプチド、特にAβ42の産生を抑制し、これらのペプチドの沈着に起因する各種の疾患、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）などの予防や治療に有用である。
本発明のγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法又はγ−セクレターゼ若しくはその活性複合体の細胞内における分布を変化させる方法としては、培養細胞や生体系などの被処理系に本発明のコレステロール合成阻害剤，及び／又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を添加することによることにより行うことができる。本発明のこの方法は、特に脂質ラフト上におけるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法又はγ−セクレターゼ若しくはその活性複合体の脂質ラフトにおける分布を低下させる方法を提供するものである。
本発明のコレステロールの合成阻害活性を測定する方法としては、コレステロールの合成量を測定できる方法であればよく、特に細胞中の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定できる方法が好ましい。より具体的には、標識化又は非標識化されたコレステロール合成源を含有する培地中で、スクリーニング物質の存在下又は非存在下で細胞を培養し、所定時間後における細胞中、特に脂質ラフト中におけるコレステロールの含有量を測定することにより行うことができる。標識化としては、生合成に影響を与えず、測定可能なものであれば特に制限はないが、通常は同位体による標識化が好ましい。このようにして、コントロールとの比較により、スクリーニング物質がコレステロール合成阻害活性を有するか否かを決定することができる。そして、本発明によれば、このようにしてスクリーニング物質のコレステロール合成阻害活性を測定することにより、当該スクリーニング物質がγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有するか否かをスクリーニングすることができる。
また、本発明は、被検物質の存在下に、細胞を培養し、細胞の脂質ラフトにおけるコレステロールの蓄積量を測定することからなるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質、又はγ−セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものである。この方法におけるコレステロールの蓄積量の測定法としては、標識化又は非標識化されたコレステロール合成源を含有する培地中で、スクリーニング物質（被検物質）の存在下又は非存在下で細胞を培養し、細胞中、特に脂質ラフト中におけるコレステロールの含有量を測定することにより行うことができる。このようにして、コントロールとの比較により、スクリーニング物質がγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質であるか、又はγ−セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質であるかを判定することができる。
また、本発明のγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定する方法、又はγ−セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を測定する方法としては、例えば、スクリーニング物質の存在下、及び非存在下に細胞を培養し、培養された細胞の脂質ラフトを分離し、その中に含まれるγ−セクレターゼの構成成分を測定する方法が挙げられる。脂質ラフトを分離する具体的方法としては、細胞膜分画を界面活性剤で処理する方法、蔗糖密度勾配法により分画する方法及びそれらの組み合わせが挙げられる。γ−セクレターゼの構成成分を測定する具体的方法としてはプレセニリン、ニカストリン、APH-1又はPen-2を免疫学的に測定する方法が挙げられる。
この方法により、スクリーニング物質が、コレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤としての作用を有しているか否かを判定することができる。
本発明のこれらにスクリーニング方法において使用される細胞としては、脂質ラフトが存在し、培養が容易なものであれば特に制限はないが、例えば、SH-SY5Y細胞（Invitrogen）などが好ましい。
この方法により、スクリーニング物質が、コレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤、又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤としての作用を有しているか否かを判定することができる。
本発明のこれらにスクリーニング方法において使用される細胞としては、脂質ラフトが存在し、培養が容易なものであれば特に制限はないが、例えば、SH-SY5Y細胞（Invitrogen）などが好ましい。
本発明の細胞の成分をフラクション化する方法としては、細胞をプロテアーゼなどを用いて消化して可溶化し、これを蔗糖（スクロース）、塩化セシウム、トリフルオロ酢酸セシウムなどを用いた密度勾配法などによりフラクション化することができる。このようなマクロドメインの生化学的分画法として，細胞を界面活性剤中でホモジネートとし，蔗糖密度勾配遠心法で界面活性剤不溶性画分を得る方法が知られているが、これに限定されるものではない。
脂質ラフトはプロテアーゼなどの消化によっては破壊されないので、脂質ラフトを特定のフラクションとして同定することが可能となり、脂質ラフトのフラクションと他のフラクションにおけるγ−セクレターゼ活性複合体の構成成分の検出、定量化をイムノブロッティング法などにより行うことができる。この場合に、脂質ラフトを同定するためのマーカーとして、フロチリン（flotillin）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
本発明のこの方法によりγ−セクレターゼ活性複合体の各構成成分の細胞内での、より正確には細胞膜における分布を測定することが可能となる。この分布によりγ−セクレターゼ活性複合体の形成を検出、定量化することも可能となり、当該細胞におけるγ−セクレターゼの活性を測定することができる。
したがって、培養細胞に被検物質を添加して、被検物質を添加しない場合をコントロールとして、当該培養細胞におけるγ−セクレターゼ活性複合体の構成成分の分布を前記した本発明の方法で測定することにより、被検物質のγ−セクレターゼに対する作用、例えば、活性促進作用や活性阻害作用をスクリーニングすることができ、本発明はγ−セクレターゼの活性をスクリーニングする新規な方法を提供する。
γ−セクレターゼ活性複合体を形成するに必要とされる構成成分としては、ニカストリン（nicastrin）、ＡＰＨ−１、Ｐｅｎ−２、及びγ−セクレターゼの活性サブユニットであるプレセニリン（presenilin）からなる群、好ましくは ニカストリン（nicastrin）、ＡＰＨ−１、及びＰｅｎ−２からなる群から選ばれる１種又は２種以上を採用することができる。
本発明のこれらにスクリーニング方法において使用される細胞としては、脂質ラフトが存在し、培養が容易なものであれば特に制限はないが、例えば、SH-SY5Y細胞（Invitrogen）などが好ましい。
脂質ラフトはプロテアーゼなどの消化によっては破壊されないので、脂質ラフトを特定のフラクションとして同定することが可能となり、脂質ラフトのフラクションと他のフラクションにおけるγ−セクレターゼ活性複合体の構成成分の検出、定量化をイムノブロッティング法などにより行うことができる。この場合に、脂質ラフトを同定するためのマーカーとして、フロチリン（flotillin）を用いることができるが、これに限定されるものではない。
本発明のこの方法によりγ−セクレターゼ活性複合体の各構成成分の細胞内での、より正確には細胞膜における分布を測定することが可能となる。この分布によりγ−セクレターゼ活性複合体の形成を検出、定量化することも可能となり、当該細胞におけるγ−セクレターゼの活性を測定することができる。
したがって、培養細胞に被検物質を添加して、被検物質を添加しない場合をコントロールとして、当該培養細胞におけるγ−セクレターゼ活性複合体の構成成分の分布を前記した本発明の方法で測定することにより、被検物質のγ−セクレターゼに対する作用、例えば、活性促進作用や活性阻害作用をスクリーニングすることができ、本発明はγ−セクレターゼの活性をスクリーニングする新規な方法を提供する。
γ−セクレターゼ活性複合体を形成するに必要とされる構成成分としては、ニカストリン（nicastrin）、ＡＰＨ−１、Ｐｅｎ−２、及びγ−セクレターゼの活性サブユニットであるプレセニリン（presenilin）からなる群、好ましくは ニカストリン（nicastrin）、ＡＰＨ−１、及びＰｅｎ−２からなる群から選ばれる１種又は２種以上を採用することができる。
本発明のこれらにスクリーニング方法において使用される細胞としては、脂質ラフトが存在し、培養が容易なものであれば特に制限はないが、例えば、SH-SY5Y細胞（Invitrogen）などが好ましい。
実施例
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
参考例１：細胞の培養
SH-SY5Y細胞（Invitrogen）は、完全培地（10%ウシ胎児血清（Sigma）、100 units/mLペニシリンおよび100 mg/mLストレプトマイシンを含むDMEM（Sigma））で37℃で15 cm径ディッシュに継代培養した。
SH-SY5Y細胞（Invitrogen）は、完全培地（10%ウシ胎児血清（Sigma）、100 units/mLペニシリンおよび100 mg/mLストレプトマイシンを含むDMEM（Sigma））で37℃で15 cm径ディッシュに継代培養した。
参考例２：界面活性剤不溶性膜ドメイン（detergent insoluble membrane domain (raft)）の調製
SH-SY5Y細胞を15 cm径のディッシュに培養し、コンフレントになったものについてPBSで洗浄した。さらにセルスクレイパーを用いてPBS中に細胞を回収し、9807 m/s２で、5分間遠心した。沈殿した細胞を200μLの2% CHAPSOとプロテアーゼ混合物（Complete protease mixture ）(Roche) を含むバッファーＲ（buffer R） (20 mM Tris-HCl pH 7.6、150 mM NaCl、1mM EDTA)に懸濁した。氷上に20分間静置することで可溶化を行った。可溶化後、800μLの56.25% 蔗糖を含むバッファーＲ（buffer R）を加え、終濃度が45% 蔗糖、0.4% CHAPSOとなるように希釈し、遠心用チューブの底に添加した。さらにその上に3mLの35% 蔗糖を含むバッファーＲ（buffer R）を重ね、続けて1 mLの5% 蔗糖を含むバッファーＲ（buffer R）を重ねた。ベックマン超遠心器によりSW55ローターで980700 m/s２ (32.000 rpm)で、4℃で16時間遠心後、上部より500μLずつ分取した。
SH-SY5Y細胞を15 cm径のディッシュに培養し、コンフレントになったものについてPBSで洗浄した。さらにセルスクレイパーを用いてPBS中に細胞を回収し、9807 m/s２で、5分間遠心した。沈殿した細胞を200μLの2% CHAPSOとプロテアーゼ混合物（Complete protease mixture ）(Roche) を含むバッファーＲ（buffer R） (20 mM Tris-HCl pH 7.6、150 mM NaCl、1mM EDTA)に懸濁した。氷上に20分間静置することで可溶化を行った。可溶化後、800μLの56.25% 蔗糖を含むバッファーＲ（buffer R）を加え、終濃度が45% 蔗糖、0.4% CHAPSOとなるように希釈し、遠心用チューブの底に添加した。さらにその上に3mLの35% 蔗糖を含むバッファーＲ（buffer R）を重ね、続けて1 mLの5% 蔗糖を含むバッファーＲ（buffer R）を重ねた。ベックマン超遠心器によりSW55ローターで980700 m/s２ (32.000 rpm)で、4℃で16時間遠心後、上部より500μLずつ分取した。
参考例３：SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動とイムノブロティング
前記の参考例２で分取した各画分についてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、イムノブロティングを行った。ニカストリンを認識する抗体としてニカストリン (N-19) (santa cruz)、プレセニリン1のＣ端側を認識する抗体として抗Ｇ１Ｌ３（anti-G1L3）、プレセニリン2のC端側を認識する抗体として抗Ｇ２Ｌ（anti-G2L）、PEN-2を認識する抗体として抗ＰＮＴ（anti-PNT3）、フロティリン-1を認識する抗体としてフロテリン−１（Flotillin-1） (BD sciences)、カルネキシンを認識する抗体としてカルネキシン (BD biosciences)を用いた。
室温で１時間、または４℃で終夜反応させた後、TBS-tween (20 mM Tris-buffered saline, pH7.4, 0.05% Tween 20) で２回洗浄を行った。つぎにHRP結合型抗マウスIgG抗体、または抗ヤギIgG抗体、または抗ウサギIgG抗体で１時間反応させ、TBS-tweenで洗浄した。さらにスーパーシグナルウエストドラ（Supersignal west dura）(pierce)で化学発光させ、X線フィルムに感光させた。
前記の参考例２で分取した各画分についてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、イムノブロティングを行った。ニカストリンを認識する抗体としてニカストリン (N-19) (santa cruz)、プレセニリン1のＣ端側を認識する抗体として抗Ｇ１Ｌ３（anti-G1L3）、プレセニリン2のC端側を認識する抗体として抗Ｇ２Ｌ（anti-G2L）、PEN-2を認識する抗体として抗ＰＮＴ（anti-PNT3）、フロティリン-1を認識する抗体としてフロテリン−１（Flotillin-1） (BD sciences)、カルネキシンを認識する抗体としてカルネキシン (BD biosciences)を用いた。
室温で１時間、または４℃で終夜反応させた後、TBS-tween (20 mM Tris-buffered saline, pH7.4, 0.05% Tween 20) で２回洗浄を行った。つぎにHRP結合型抗マウスIgG抗体、または抗ヤギIgG抗体、または抗ウサギIgG抗体で１時間反応させ、TBS-tweenで洗浄した。さらにスーパーシグナルウエストドラ（Supersignal west dura）(pierce)で化学発光させ、X線フィルムに感光させた。
メチルβシクロデキストリンによる処理（図１、図２参照）
SH-SY5Y細胞を15 cm径のディッシュに培養し、コンフレントになったものについてPBSで洗浄後、メチルβシクロデキストリン(sigma)を最終濃度が０〜２ｍＭとなるように溶かしたDMEMを加え、37℃でさらに30分間培養を行った。これらの細胞について前記した参考例２に記載の方法に準じて分画を行い、イムノブロティングを行った。
結果を図１に示す。また、コレステロール量及びタンパク質量を定量化した結果を図２にグラフ化して示す。図１及び図２における１−１０の番号は細胞のフラクションを示し、脂質ラフトはフラクション３である。
図１は、メチルβシクロデキストリン（ＭβＣＤ）処理後の細胞膜分画のイムノブロティングを示す。図１中の１−１０のフラクションは、蔗糖密度勾配遠心法による細胞ホモジネートの分画の番号で、低比重のものが浮上し先の分画に出てきている。脂質ラフトのマーカーとしてウロチリン−１（flotillin-1）が使用されている（図１Ｅ参照）。図１のＡはニカストリンについてのものであり、Ｂはγ−セクレターゼの活性サブユニットのプレセニリン−１（ＰＳ１）についてのものであり、Ｃはプレセニリン−２（ＰＳ２）についてのものであり、ＤはＰＥＮ−２についてのものであり、Ｅは脂質ラフトのマーカーとしてのフロチリン−１についてのものである。図１中のＰＳ１及びＰＳ２における「ＣＴＦ」はCarboxy Terminal Fragment の意味で、ＰＳ１及びＰＳ２のそれぞれのＣ末端部分を認識する抗体でイムノブロッティングを行ったことを示す。
各々のブロッティングの図は、上からメチルβシクロデキストリンの濃度が０ｍＭ、１ｍＭ、及び２ｍＭのものである。
図２は、メチルβシクロデキストリンによる細胞膜分画のコレステロール及びタンパク質含量の変化を示したグラフである。
この結果、メチルβシクロデキストリンによりコレステロールが脂質ラフト（フラクション３）より除去され（図２の白抜き部分参照）、脂質ラフトのマーカータンパクであるフロティリンが本来の脂質ラフト分画であるフラクション３からフラクション９及び１０に移行した（図１Ｅ参照）。同様にγ−セクレターゼの構成成分であるニカストリン、プレセニリン１、プレセニリン2及びPen-2が脂質ラフト分画（フラクション３）から消失した（図１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ参照）。これによって、メチルβシクロデキストリンは脂質ラフトからコレステロールを引き抜くことによりラフト構造を破壊し、脂質ラフトにおけるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害することが確認された。
SH-SY5Y細胞を15 cm径のディッシュに培養し、コンフレントになったものについてPBSで洗浄後、メチルβシクロデキストリン(sigma)を最終濃度が０〜２ｍＭとなるように溶かしたDMEMを加え、37℃でさらに30分間培養を行った。これらの細胞について前記した参考例２に記載の方法に準じて分画を行い、イムノブロティングを行った。
結果を図１に示す。また、コレステロール量及びタンパク質量を定量化した結果を図２にグラフ化して示す。図１及び図２における１−１０の番号は細胞のフラクションを示し、脂質ラフトはフラクション３である。
図１は、メチルβシクロデキストリン（ＭβＣＤ）処理後の細胞膜分画のイムノブロティングを示す。図１中の１−１０のフラクションは、蔗糖密度勾配遠心法による細胞ホモジネートの分画の番号で、低比重のものが浮上し先の分画に出てきている。脂質ラフトのマーカーとしてウロチリン−１（flotillin-1）が使用されている（図１Ｅ参照）。図１のＡはニカストリンについてのものであり、Ｂはγ−セクレターゼの活性サブユニットのプレセニリン−１（ＰＳ１）についてのものであり、Ｃはプレセニリン−２（ＰＳ２）についてのものであり、ＤはＰＥＮ−２についてのものであり、Ｅは脂質ラフトのマーカーとしてのフロチリン−１についてのものである。図１中のＰＳ１及びＰＳ２における「ＣＴＦ」はCarboxy Terminal Fragment の意味で、ＰＳ１及びＰＳ２のそれぞれのＣ末端部分を認識する抗体でイムノブロッティングを行ったことを示す。
各々のブロッティングの図は、上からメチルβシクロデキストリンの濃度が０ｍＭ、１ｍＭ、及び２ｍＭのものである。
図２は、メチルβシクロデキストリンによる細胞膜分画のコレステロール及びタンパク質含量の変化を示したグラフである。
この結果、メチルβシクロデキストリンによりコレステロールが脂質ラフト（フラクション３）より除去され（図２の白抜き部分参照）、脂質ラフトのマーカータンパクであるフロティリンが本来の脂質ラフト分画であるフラクション３からフラクション９及び１０に移行した（図１Ｅ参照）。同様にγ−セクレターゼの構成成分であるニカストリン、プレセニリン１、プレセニリン2及びPen-2が脂質ラフト分画（フラクション３）から消失した（図１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ参照）。これによって、メチルβシクロデキストリンは脂質ラフトからコレステロールを引き抜くことによりラフト構造を破壊し、脂質ラフトにおけるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害することが確認された。
HMG-CoA還元酵素阻害剤処理による処理（図３、図４参照）
SH-SY5Y細胞を15 cm径のディッシュに培養し、コンフレントになる前の細胞について、PBSで洗浄した。DMEMに5% LPDS、250μＭのメバロン酸を加え、さらにコレステロールの生合成の阻害剤として50μＭのコンパクチンまたは5μＭのピタバスタチンを加えた培地を調製し、48時間培養した。これらの細胞について前記した参考例２に記載の方法に準じて分画を行い、イムノブロティングを行った。
結果を図３に示す。また、コレステロール量及びタンパク質量を定量化した結果をグラフ化して図４に示す。図３及び図４における１−１０の番号は細胞のフラクションを示し、脂質ラフトはフラクション３である。図３は、HMG-CoA還元酵素阻害剤処理後の細胞膜分画のイムノブロティングを示す。図３のＡはニカストリンについてのものであり、ＢはＰＳ１ＣＴＦについてのものであり、ＣはＰＳ２ＣＴＦについてのものであり、Ｄはフロチリン−１についてのものである。各々のブロッティングの図は、上からコントロール、即ち、HMG-CoA還元酵素阻害剤を添加していない場合、中段はコンパクチンを５０μＭ添加した場合、下段はピタバスタチンを５μＭ添加した場合をそれぞれ示す。図４は、HMG-CoA還元酵素阻害剤による細胞膜分画のコレステロール及びタンパク質含量の変化を示したグラフである。四角印（□及び■）はコントロールとしてのメバロン酸２５０μＭの場合を示し、丸印（○及び●）はコンパクチン（メバロン酸２５０μＭ及びコンパクチン５０μＭ）の場合を示し、三角印（△及び▲）はピタバスタチン（メバロン酸２５０μＭ及びピタバスタチン５μＭ）の場合をそれぞれ示す。白抜きの印はコレステロールの量を示し、黒抜きの印はタンパク質の量を示す。
この結果、HMG-CoA還元酵素阻害剤であるコンパクチン及びピタバスタチンにより脂質ラフト（フラクション３）のコレステロールが減少し（図３参照）、実施例１と同様にγ−セクレターゼの構成成分であるニカストリン、プレセニリン１及びプレセニリン２が脂質ラフト分画（フラクション３）から消失した（図３Ａ、Ｂ及びＣ参照）。フロティリンは脂質ラフト分画に未だ残っておりラフト構造は保たれているが、コンパクチン及びピタバスタチンは脂質ラフトにおけるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害することが確認された。
SH-SY5Y細胞を15 cm径のディッシュに培養し、コンフレントになる前の細胞について、PBSで洗浄した。DMEMに5% LPDS、250μＭのメバロン酸を加え、さらにコレステロールの生合成の阻害剤として50μＭのコンパクチンまたは5μＭのピタバスタチンを加えた培地を調製し、48時間培養した。これらの細胞について前記した参考例２に記載の方法に準じて分画を行い、イムノブロティングを行った。
結果を図３に示す。また、コレステロール量及びタンパク質量を定量化した結果をグラフ化して図４に示す。図３及び図４における１−１０の番号は細胞のフラクションを示し、脂質ラフトはフラクション３である。図３は、HMG-CoA還元酵素阻害剤処理後の細胞膜分画のイムノブロティングを示す。図３のＡはニカストリンについてのものであり、ＢはＰＳ１ＣＴＦについてのものであり、ＣはＰＳ２ＣＴＦについてのものであり、Ｄはフロチリン−１についてのものである。各々のブロッティングの図は、上からコントロール、即ち、HMG-CoA還元酵素阻害剤を添加していない場合、中段はコンパクチンを５０μＭ添加した場合、下段はピタバスタチンを５μＭ添加した場合をそれぞれ示す。図４は、HMG-CoA還元酵素阻害剤による細胞膜分画のコレステロール及びタンパク質含量の変化を示したグラフである。四角印（□及び■）はコントロールとしてのメバロン酸２５０μＭの場合を示し、丸印（○及び●）はコンパクチン（メバロン酸２５０μＭ及びコンパクチン５０μＭ）の場合を示し、三角印（△及び▲）はピタバスタチン（メバロン酸２５０μＭ及びピタバスタチン５μＭ）の場合をそれぞれ示す。白抜きの印はコレステロールの量を示し、黒抜きの印はタンパク質の量を示す。
この結果、HMG-CoA還元酵素阻害剤であるコンパクチン及びピタバスタチンにより脂質ラフト（フラクション３）のコレステロールが減少し（図３参照）、実施例１と同様にγ−セクレターゼの構成成分であるニカストリン、プレセニリン１及びプレセニリン２が脂質ラフト分画（フラクション３）から消失した（図３Ａ、Ｂ及びＣ参照）。フロティリンは脂質ラフト分画に未だ残っておりラフト構造は保たれているが、コンパクチン及びピタバスタチンは脂質ラフトにおけるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害することが確認された。
本発明は、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害し、γ−セクレターゼの活性複合体の形成によるＡβ４０、Ａβ４２ペプチド、特にＡβ４２の産生を抑制し、これらのペプチドの沈着に起因する各種の疾患、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）などの治療や予防に有用な医薬組成物を提供するものであり、産業上の利用性を有する。また、本発明は、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法や、γ−セクレターゼの脂質ラフトにおける分布を低下させる作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供するものであり、有用な医薬品としての活性成分を簡便な手法で探索可能な方法を提供するものであり、産業上の利用性を有する。
Claims (23)
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を有効成分とするγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤。
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤が、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、ＡＭＰＫ活性化剤、ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤及びゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤からなる群から選ばれた１種又は２種以上の薬剤である請求項１に記載のγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤。
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤が、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である請求項１に記載のγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤。
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤が、ピタバスタチンである請求項１に記載のγ−セクレターゼ複合体形成阻害剤。
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤を用いて、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法。
- 脂質ラフト上におけるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法である請求項５に記載の方法。
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤が、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、ＡＭＰＫ活性化剤、ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤、及び、ゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤からなる群から選ばれた１種又は２種以上の薬剤である請求項５に記載のγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法。
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤が、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である請求項５に記載のγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法。
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤が、ピタバスタチンである請求項５に記載のγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する方法。
- γ−セクレターゼ複合体形成阻害剤を製造するためのコレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤の使用。
- γ−セクレターゼ複合体形成阻害剤が、脂質ラフト上におけるγ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害するものである請求項１０に記載の使用。
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤が、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、ＡＭＰＫ活性化剤、ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤、ゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤からなる群から選ばれた１種又は２種以上の薬剤である請求項１０に記載の使用。
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤が、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤である請求項１０に記載の使用。
- コレステロール合成阻害剤、又は蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤が、ピタバスタチンである請求項１０に記載の使用。
- コレステロールの合成阻害活性を測定することからなる、γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を有する物質をスクリーニングする方法。
- コレステロールの合成阻害活性が、脂質ラフトに蓄積され得るコレステロールの合成阻害活性である請求項１５に記載のスクリ−ニング方法。
- コレステロールの合成阻害活性が、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の阻害活性、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害活性、スクアレン合成酵素の阻害活性、スクアレンエポキシダーゼの阻害活性、ラノステロール合成酵素の阻害活性、ＡＭＰＫの活性化、及びファルネシルピロリン酸合成酵素の阻害活性からなる群から選ばれたコレステロールの合成阻活性である請求項１５に記載のスクリーニング方法。
- コレステロールの合成阻害活性が、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害活性である請求項１５に記載のスクリーニング方法。
- γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなるコレステロール合成阻害剤、蛋白ゲラニルゲラニル化抑制剤又はＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法。
- γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなる、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、スクアレンエポキシダーゼ阻害剤、ラノステロール合成酵素阻害剤、ＡＭＰＫ活性化剤、ファルネシルピロリン酸合成酵素阻害剤、ゲラニルゲラニル転移酵素阻害剤からなる群から選ばれたコレステロール合成阻害剤をスクリーニングする方法。
- γ−セクレターゼの活性複合体の形成を阻害する作用を測定することからなる、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤をスクリーニングする方法。
- 培養細胞に被検物質を添加して、細胞内におけるγ−セクレターゼが、その活性複合体を形成するに必要とされる構成成分の細胞内における分布を測定することにより、被検物質のγ−セクレターゼに対する作用をスクリーニングする方法
- γ−セクレターゼ活性複合体を形成するに必要とされる構成成分が、ニカストリン、ＡＰＨ−１、及びＰｅｎ−２からなる群から選ばれる１種又は２種以上である請求項２２に記載の方法。
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