KR20140108705A - 재생 및 염증 반응을 제어하기 위한 생체물질의 기능화 - Google Patents

재생 및 염증 반응을 제어하기 위한 생체물질의 기능화 Download PDF

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KR20140108705A
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자비에 가예고 야마스
데이비드 엘. 카플란
브루스 파닐라이티스
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트러스티즈 오브 터프츠 칼리지
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Abstract

본원에 제공된 본 발명은 일반적으로 시험관내 또는 생체내에서 하나 이상의 자극 또는 상태 (예를 들어, 비제한적으로, 조직 손상, 이식가능한 장치 및/또는 시토카인)에 대한 면역 세포의 반응을 제어하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원에 제공된 조성물은 1종 이상의 면역 세포-조절제를 1종 이상의 유형의 면역 세포 (예를 들어, 비제한적으로, 대식세포 및 수지상 세포)의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함하는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 대식세포를 M1 표현형 및/또는 M2 표현형에 대해 선택적으로 편향시킬 수 있으며, 이에 의해 대식세포의 염증 및/또는 재생 반응을 제어하여, 예를 들어 표적 조직을 복구 및/또는 재생시킬 수 있다.

Description

재생 및 염증 반응을 제어하기 위한 생체물질의 기능화{FUNCTIONALIZATION OF BIOMATERIALS TO CONTROL REGENERATION AND INFLAMMATION RESPONSES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2011년 12월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 61/581,364를 우선권 주장하며, 상기 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
본원에 제공된 본 발명은 일반적으로 시험관내 또는 생체내에서 하나 이상의 자극 또는 상태 (예를 들어, 비제한적으로, 조직 손상, 이식가능한 장치 및/또는 시토카인)에 대한 면역 세포의 반응을 제어하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법을 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 하나 이상의 자극 또는 상태 (예를 들어, 비제한적으로, 조직 손상, 이식가능한 장치 및/또는 시토카인)에 대한 대식세포의 반응을 제어하고/거나 편향시킬 수 있다.
생체물질, 예를 들어 조직 공학 스캐폴드로서 사용되는 생체물질에 대한 숙주 반응의 최적화는 조직 재생 및/또는 상처 치유를 촉진하는데 중요하다. 다수의 인자, 예컨대 생체물질의 생분해성, 표면 특성, 크기 및/또는 화학적 조성은 유도되는 염증 반응의 수준에 영향을 미칠 수 있다.
예를 들어, 생체물질의 크기 및/또는 형태는 염증 반응에 기여할 수 있다. 오직 예시적으로, 상이한 크기의 실크 피브로인 입자는 대식세포 상에 시딩된 경우에 다양한 정도의 염증 반응을 유도할 수 있다 (20). 면역화를 위한 아주반트 시스템으로 사용된 폴리(락트산-코-글리콜)산 (PLGA) 입자의 효과에 대한 이전의 보고는 마이크로입자 (~5 μm - ~7 μm)가 나노입자 (~389 nm)에 대해 입증된 바와 동일한 결합력으로 뮤린 대식세포에 의해 포식될 수는 없으나, 대신 세포 막에 부착되어 보다 강력한 염증성 자극에 기여할 수 있다는 것을 보여주었다 (39). 추가로, PLGA (폴리(락트산-코-글리콜산)) 나노입자 (~265 nm)는 대식세포에 의해 래트 활막에서 포식된 후에 국재화된 염증 반응이 거의 없이 조직 밑으로 깊이 전달되지만, PLGA 마이크로구체 (~26.5 μm)는 포식되지 않는 것으로 밝혀졌다 (40). 이전의 또 다른 연구는 염증유발 시토카인의 유전자 발현에 대한 이산화티타늄 나노입자 크기의 효과를 분석하였으며, 마이크로-미만의 큰 티타니아 입자 (~596 nm)가 THP1 (인간 단핵구성 백혈병 세포주) 대식세포 상에서 시험관내에서 작은 입자 (166 nm)와 비교하였을 때 세포 생존율 및 유전자 발현 (IL-6, IL-8, TNF-α)에 대해 보다 큰 영향을 나타내었다고 보고하였다 (33).
생체물질 스캐폴드는 예를 들어 혈관신생, 다능성 전구 세포의 조직 재구축 부위로의 동원, 항미생물 펩티드의 방출 및/또는 면역의 대안적 경로의 활성화를 포함하는 메카니즘을 통해 손상된 조직의 구성적 재형성을 촉진하는데 사용될 수 있다. 그러나, 일반적으로는 생체물질 스캐폴드의 숙주-매개 분해가 8-12주 내에 일어날 수 있어, 스캐폴드의 전체적인 유익한 효과가 실현될 수 없다. 생체물질은 화학적으로 가교되어 숙주-매개 분해에 대한 저항성이 증가할 수 있으며, 조직 통합시에는 스캐폴드 물질이 분해되는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 면역 반응을 선택적으로 제어할 수 있는, 예를 들어 조직 복구 및/또는 재생을 최적화할 수 있는 개선된 생체물질이 요망되고 있다.
표적 자극 (예를 들어, 비제한적으로 조직 손상, 이식물 및/또는 시토카인) 및/또는 생체물질 자체에 대한 1종 이상의 유형의 면역 세포 (예를 들어, 비제한적으로 대식세포 및/또는 수지상 세포)의 반응을 조절하거나 또는 편향시킬 수 있는 1종 이상의 활성제 (예를 들어, 1종 이상의 면역 세포-조절제 및/또는 대식세포-편향제)로 생체물질을 기능화하는 것에 대한 조성물 및 방법이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제 포함)로 기능화된 생체물질을 포함하는 조성물은 면역 세포, 예컨대 대식세포에 의해 매개된 염증을 촉진하거나 감소시킴으로써, 표적 자극 (예를 들어, 비제한적으로 조직 손상, 이식물 및/또는 시토카인) 및/또는 생체물질 자체에 대한 반응 (예를 들어, 염증 또는 재생 유도)을 조절할 수 있다.
본원에 기재된 다양한 측면의 실시양태는 부분적으로 생체물질의 특성 (예를 들어, 생체물질의 형태 및/또는 크기)이 급성 및 만성 면역 반응에 관여하는 면역 세포, 예컨대 대식세포 (
Figure pct00001
) 및/또는 수지상 세포 (DC)의 세포 흡수와 관련될 수 있다는 본 발명자들의 인식에 기초한다. 예를 들어, 생체물질 입자 (예를 들어, 실크 피브로인 입자)의 세포 흡수 경로는 입자 크기 및/또는 표면 특성에 의존할 수 있다. 이러한 물리적 특성은
Figure pct00002
및 DC의 형질 막 상에 존재하는 단백질 (예를 들어, 비제한적으로, 인테그린 및 클라트린)이 이들 입자에 결합하는 방식에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 이어서 이들을 제거하는 이들 세포의 능력 및 유도되는 염증 반응의 정도에 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 생체물질이 프로세싱 동안 또는 프로세싱 후에, 예를 들어 화학적으로 및/또는 적절한 활성제, 특히 면역 세포-조절제 및/또는 대식세포-편향제의 봉입을 통해 변형되어 시험관내 또는 생체내에서 면역 세포 (예를 들어, 대식세포) 및/또는 다른 세포 반응을 조절한다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 염증을 촉진하거나 또는 염증을 감소시킬 수 있는 선택적 화합물을 세포 집단에 도입하는 것은 생체물질의 분해에 영향을 미침으로써 (예를 들어, 생체물질을 보다 빠르게, 보다 느리게 또는 보다 선택적인 방식으로 분해시킴으로써), 예를 들어 생체물질 및/또는 조직에 대한 염증 반응 및/또는 재생 반응을 제어할 수 있다. 면역 반응의 제어는 선택적 면역 세포-조절제 및/또는 대식세포-편향제, 예를 들어 비제한적으로 소분자, 펩티드, 항미생물 펩티드 및/또는 리포폴리사카라이드의 존재 하에 활성화 또는 촉진되는 세포 집단 (예를 들어, 대식세포)의 특성에 의해 매개될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 다양한 측면의 실시양태는 일반적으로 시험관내 또는 생체내에서 면역 반응, 예를 들어 대식세포 반응을 제어하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제를 포함하거나 또는 이로 기능화된 생체물질을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 1종 이상의 면역 세포-조절제는 1종 이상의 면역 세포-조절제와의 접촉시에 1종 이상의 유형의 면역 세포의 활성화 상태를 선택적으로 제어하거나 또는 변경시키기에 충분한 유효량으로 생체물질에 존재한다. 면역 세포 유형의 예는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제는 적어도 수지상 세포의 활성화 상태를 제어하거나 또는 변경하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제, 예를 들어 대식세포-편향제는 적어도 대식세포의 활성화 상태를 제어하거나 또는 변경하도록 선택될 수 있다.
생체적합성인 임의의 생체물질은 본원에 기재된 조성물에 사용될 수 있다. 생체적합성 생체물질의 예는 중합체, 히드로겔, 단백질, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 생분해성일 수 있다. 한 실시양태에서, 생체물질은 단백질-기재 생체물질, 예를 들어 비제한적으로 실크 피브로인, 콜라겐, 젤라틴, 피브린 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 생체물질은 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함할 수 있다.
따라서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)를 포함하거나 또는 이로 기능화된 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 1종 이상의 면역 세포-조절제는 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제와의 접촉시에 면역 세포의 활성화 상태를 선택적으로 제어하거나 또는 변경시키기에 충분한 유효량으로 실크 피브로인-기재 매트릭스에 존재할 수 있다.
본원에 기재된 이러한 측면 및 다른 측면의 일부 실시양태에서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 예를 들어 약 1주 이상, 약 2주 이상, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 약 5주 이상, 약 6주 이상, 약 7주 이상, 약 8주 이상, 약 12주 이상 또는 그 초과의 기간 동안 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)의 지속 방출에 적합할 수 있다.
본원에 기재된 이러한 측면 및 다른 측면의 일부 실시양태에서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 2종 이상의 (예를 들어 3종 이상, 4종 이상 또는 그 초과 포함) 면역 세포-조절제 (예를 들어, 2종 이상의 대식세포-편향제)를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 제1 시점에서 제1 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제1 대식세포-편향제)를 및 제2 시점에서 제2 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제2 대식세포-편향제)를 방출시키기에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 시점 및 제2 시점은 동일하다. 다른 실시양태에서, 제1 시점 및 제2 시점은 상이하다.
생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스에서 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)의 분포는 다수의 요인, 예를 들어 비제한적으로 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)의 수 및/또는 유형, 매트릭스의 형태 (예를 들어, 필름 대 입자), 면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))의 바람직한 방출 프로파일, 본원에 기재된 조성물의 용도, 및 그의 임의의 조합에 따라 달라질 수 있다. 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스에서 균질하게 또는 불균질하게 분산될 수 있다. 본원에 기재된 이러한 측면 및 다른 측면의 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질로 캡슐화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질의 표면 상에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 실크 피브로인-기재 매트릭스로 캡슐화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 실크 피브로인-기재 매트릭스의 표면 상에 존재할 수 있다.
본원에 기재된 이러한 측면 및 다른 측면의 일부 실시양태에서, 상이한 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)가 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스의 개별 층에 분산될 수 있다. 예를 들어, 다중-층의 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 제1 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제1 대식세포-편향제)를 그의 제1 층에 및 제2 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제2 대식세포-편향제)를 그의 제2 층에 포함할 수 있다.
제한되지 않고, 면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들) 포함)는 또한 본원에 기재된 조성물의 일부 실시양태에 분배될 수 있다.
면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))의 선택은 예를 들어 표적화될 면역 세포의 유형 및/또는 본원에 기재된 조성물의 용도에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 시험관내 또는 생체내에서 표적 자극의 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)에 대한 반응을 제어하도록 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 대상체에서 표적 자극에 대한 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 반응을 제어하도록 선택될 수 있다.
표적 자극은 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)가 응답하거나 또는 반응하도록 유발하거나 또는 유도할 수 있는, 예를 들어 염증 반응 및/또는 재생 반응을 유도하는 임의의 시험관내 또는 생체내 상태, 대상 및/또는 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 자극은 대식세포-연관 상태를 포함할 수 있다. 예시적인 대식세포-연관 상태는 박테리아 감염, 조직 재생, 조직 손상, 예를 들어 조직 복구 및/또는 증진 (예를 들어, 연부 조직 복구 및/또는 증진)을 포함하는 조직 재구축, 관절염, 비만, 당뇨병, 동맥경화증, 동종이식편 이식, 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH), 골다공증, 사구체신염, 암, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 표적 자극은 이식가능한 구조물 (예를 들어, 비제한적으로, 스캐폴드, 동종이식편 조직, 의료 장치)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 자극은 시토카인 (예를 들어, 케모카인 포함)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제는 본원에 기재된 특정 유형의 면역 세포를 표적화하도록 선택될 수 있다. 대식세포가 표적화되는 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제(들)는 적어도 1종 이상의 대식세포-편향제를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 이러한 측면 및 다른 측면의 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 1종 이상의 대식세포-편향제를 포함하거나 또는 이로 기능화된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)을 포함할 수 있다. 1종 이상의 대식세포-편향제는 1종 이상의 대식세포-편향제와의 접촉시에 대식세포의 활성화 상태를 선택적으로 제어하거나 또는 변경시키기에 충분한 유효량으로 실크 피브로인-기재 매트릭스에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 대식세포-편향제는 대식세포의 최소 집단을 M1 표현형 상태로 전환시키도록 선택된 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 대식세포-편향제는 대식세포의 최소 집단을 M2 표현형 상태 (예를 들어, M2a, M2b 및 M2c)로 전환시키도록 선택된 작용제를 포함할 수 있다. 대식세포-편향제의 비제한적 예는 글루코코르티코이드 (예를 들어, 덱사메타손); 니코틴; 스타틴 (예를 들어, 심바스타틴); 항미생물 펩티드 (예를 들어, LL-37 펩티드, 아포지단백질 E); LPS; INF-γ; TNF-α; 프로락틴; Notch 활성화제 (예를 들어, 델타 또는 재기드(jagged) 리간드); IL-4; IL-13; IL-10; 인슐린 감작제 및 PPAR-γ 유도제 (예를 들어, 로시글리타존 또는 다른 티아졸리딘디온); HDAC 억제제 (예를 들어, VPA); Notch 신호전달 억제제 (예를 들어, GSI 또는 DAPT); JAK 억제제 (예를 들어, AG490); 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제의 억제제; LiCl; 티모신; PLA2, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및/또는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)은 다양한 용도에 적합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 대식세포-연관 상태의 치료에 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 상처 드레싱으로 사용하기에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 코팅으로 사용하기에, 예를 들어 이식가능한 구조물의 코팅을 형성하기에 적합할 수 있다. 따라서, 용도 및/또는 용도 포맷에 따라, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)은 임의의 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 필름, 섬유, 입자의 수집물, 튜브, 매트, 겔, 메쉬, 직물, 또는 그의 임의의 조합의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 생체물질은 필름, 섬유, 입자의 수집물, 튜브, 매트, 겔, 메쉬, 직물, 또는 그의 임의의 조합의 형태일 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 시험관내 또는 생체내에서 면역 반응, 예를 들어 대식세포 반응을 제어하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 또 다른 측면은, 예를 들어 본원에 기재된 표적 자극에 대한 면역 세포의 반응을 제어하는 방법에 관한 것이다. 예시적인 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 방법은 (a) 본원에 기재된 조성물의 한 실시양태를 표적 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 부위에 위치시키는 것 (여기서, 조성물은 1종 이상의 면역 세포-조절제를 포함하는 생체물질을 1종 이상의 유형의 면역 세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함할 수 있음); 및 (b) 면역 세포-조절제를 표적 부위에 위치시에 생체물질로부터 예정된 속도로 방출시켜, 생체물질 주위의 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비를 변경시키는 것을 포함할 수 있다. 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비가 역치 초과에 도달하는 경우에, 본원에 기재된 생체물질은 염증 반응을 유도할 수 있고; 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비가 역치 미만에 도달하는 경우에, 본원에 기재된 생체물질은 재생 또는 항염증 반응을 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제는 적어도 수지상 세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제는 적어도 대식세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다. 이들 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제는 1종 이상의 대식세포-편향제를 포함할 수 있다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 예를 들어 적어도 대식세포의 반응을 제어하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 (a) 본원에 기재된 조성물의 한 실시양태를 표적 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 부위에 위치시키는 것 (여기서, 조성물은 1종 이상의 대식세포-편향제를 대식세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함하는 생체물질을 포함할 수 있음); 및 (b) 대식세포-편향제를 표적 부위에 위치시에 생체물질로부터 예정된 속도로 방출시켜, 생체물질 주위의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비를 변경시키는 것을 포함할 수 있다. M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 초과인 경우에, 본원에 기재된 생체물질은 염증 반응을 유도할 수 있고; M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 미만인 경우에, 본원에 기재된 생체물질은 재생 또는 항염증 반응을 유도할 수 있다.
M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 초과인 다양한 실시양태에서, 생체물질에 의해 유도되는 염증 반응은 생체물질의 분해를 유도하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질에 의해 유도되는 염증 반응은 표적 부위에 가까이 근접한 및/또는 표적 부위에 있는 조직을 감염 (예를 들어, 박테리아 감염)으로부터 보호하는 것을 포함할 수 있다.
M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 미만인 다양한 실시양태에서, 재생 또는 항염증 반응은 표적 부위에서의 조직 복구 및/또는 재생을 용이하게 하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재생 또는 항염증 반응은 숙주의 면역계에 의한 생체물질의 거부를 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 치료되는 표적 부위는 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 반응이 제어될 본원에 기재된 표적 자극을 포함할 수 있다.
치료되는 표적 부위는 시험관내 또는 생체내에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 표적 자극에 대한 대식세포 반응을 제어하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 1종 이상의 대식세포-편향제를 (a) 대식세포의 최소 집단을 M1 표현형 상태로 전환시켜, 표적 자극에 대한 염증 반응을 유도하거나; (b) 대식세포의 최소 집단을 M2 표현형 상태로 전환시켜, 자극에 대한 재생 반응을 유도하거나; 또는 (c) (a) 및 (b) 둘 다를 유도하기에 충분한 유효량으로 포함하는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 생체물질)을 포함하는 조성물을 표적 자극의 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 자극의 부위에 위치시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 조성물에 사용되는 대식세포-편향제는 대식세포의 활성화 상태를 M1 표현형과 M2 표현형 사이에서 변경시킬 수 있거나 또는 전구 세포 (예를 들어, 단핵구)를 M1 대식세포 또는 M2 대식세포로 분화시킬 수 있는 임의의 작용제를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 1종 이상의 대식세포-편향제는 글루코코르티코이드 (예를 들어, 덱사메타손); 니코틴; 스타틴 (예를 들어, 심바스타틴); 항미생물 펩티드 (예를 들어, LL-37 펩티드, 아포지단백질 E); LPS; INF-γ; TNF-α; 프로락틴; Notch 활성화제 (예를 들어, 델타 또는 재기드 리간드); IL-4; IL-13; IL-10; 인슐린 감작제 및 PPAR-γ 유도제 (예를 들어, 로시글리타존 또는 다른 티아졸리딘디온); HDAC 억제제 (예를 들어, VPA); Notch 신호전달 억제제 (예를 들어, GSI 또는 DAPT); JAK 억제제 (예를 들어, AG490); 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제의 억제제; LiCl; 티모신; PLA2, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
이전에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 방법의 다양한 실시양태에 관련되는 표적 자극은 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)가 응답 또는 반응하도록 유발하거나 또는 유도할 수 있는, 예를 들어 염증 반응 및/또는 재생 반응을 유도할 수 있는 임의의 시험관내 또는 생체내 상태, 대상 및/또는 물질을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 표적 자극은 대식세포-연관 상태를 포함할 수 있다. 대식세포-연관 상태의 비제한적 예는 박테리아 감염, 조직 재생, 조직 손상, 예를 들어 조직 복구 및/또는 증진 (예를 들어, 연부 조직 복구 및/또는 증진)을 포함하는 조직 재구축, 관절염, 비만, 당뇨병, 동맥경화증, 동종이식편 이식, 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH), 골다공증, 사구체신염, 암, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 자극은 이식가능한 구조물 (예를 들어, 비제한적으로, 스캐폴드, 동종이식편 조직, 의료 장치)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 자극은 시토카인 (예를 들어, 케모카인 포함)을 포함할 수 있다.
대식세포-편향제(들)는 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스에 균질하게 또는 불균질하게 분포될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제(들)는, 예를 들어 다중-층의 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스에서, 동일 층에 및/또는 개별 층에 분포될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제(들)는 생체물질로 캡슐화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제(들)는 생체물질의 표면 상에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제(들)는 실크 피브로인-기재 매트릭스로 캡슐화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제(들)는 실크 피브로인-기재 매트릭스의 표면 상에 존재할 수 있다. 제한되지 않고, 대식세포-편향제는 또한 본원에 기재된 조성물의 일부 실시양태에 분배될 수 있다.
본원에 기재된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 조성물은 대식세포-연관 상태의 치료에 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 상처 드레싱으로 사용하기에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 코팅으로 사용하기에, 예를 들어 이식가능한 구조물 또는 장치의 코팅을 형성하기에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 필름, 섬유, 입자의 수집물, 겔, 직물, 메쉬, 또는 그의 임의의 조합의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 필름, 섬유, 입자의 수집물, 튜브, 매트, 겔, 직물, 메쉬, 또는 그의 임의의 조합의 형태일 수 있다.
본원에 기재된 다양한 방법의 실시양태에서, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 생체물질)을 포함하는 조성물은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 표적 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 부위에 위치시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)을 포함하는 조성물은 주사에 의해 위치시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)을 포함하는 조성물은 이식에 의해 위치시킬 수 있다.
추가 측면에서, 1종 이상의 대식세포-편향제를 포함하는 생체물질을 포함하는 조성물로 제1 물질을 코팅하는 것을 포함하는, 생의학 물질을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함한다.
도 1은 ~2 μm-크기의 실크 피브로인 입자 (SP1) 상에 시딩된 분화된 THP1 단핵구로부터의 시토카인 발현 및 분비 및 항염증 약물 (예를 들어, 비제한적으로, 덱사메타손, 심바스타틴, 니코틴)로의 단핵구의 조절의 평가를 위한 실시예 2에 사용된 96-웰 플레이트 설정의 개략도를 도시한다.
도 2a-2c는 SP1 입자 상에 시딩하여 덱사메타손으로 자극한 THP1 대식세포의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 2a는 제1일 및 제3일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출의 그래프이다. 도 2b 및 2c는 각각 제1일 (도 2b) 및 제3일 (도 2c)에서의 TNF-α, TGF-β 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
도 3a-3c는 SP1 입자 상에 시딩하여 심바스타틴으로 자극한 THP1 대식세포의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 3a는 제1일 및 제3일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출의 그래프이다. 도 3b 및 3c는 제1일 (도 3b) 및 제3일 (도 3c)에서의 TNF-α, TGF-β 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
도 4a-4c는 SP1 입자 상에 시딩하여 니코틴으로 자극한 THP1 대식세포의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 4a는 제1일 및 제3일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출의 그래프이다. 도 4b 및 4c는 제1일 (도 4b) 및 제3일 (도 4c)에서의 TNF-α, TGF-β 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
도 5a-5c는 도 2a-2c, 3a-3c 및 4a-4c에서와 동일한 배양 조건 하에 실크 피브로인 필름 상에 시딩하여 다양한 항염증 약물 (예를 들어, 덱사메타손, 심바스타틴, 니코틴)로 자극한 THP1 대식세포의 세포 생존율 및 TNF-α 방출을 보여주는 데이터 그래프이다. 세포를 덱사메타손 (도 5a), 심바스타틴 (도 5b) 또는 니코틴 (도 5c)으로 자극하였다. 제시된 결과는 5회 실험 (20개 샘플)을 대표한다.
도 6은 SP1 입자에 의해 자극되고 1일 또는 3일 후에 다양한 농도의 덱사메타손으로 조절된 THP1 대식세포의 TNF-α 방출 및 세포 생존율의 그래프를 도시한다.
도 7은 SP1 입자 상에 시딩하여 1일 또는 3일 후에 다양한 농도의 덱사메타손으로 자극한 THP1 대식세포의 SEM 영상을 도시한다. 도 7은 또한 단독 (음성 대조군) 및 LPS의 존재 하의 (양성 대조군) 배양 배지에서 SP1 입자 상에 시딩된 THP1 대식세포의 SEM 영상을 도시한다.
도 8은 ~1 μm-크기의 실크 피브로인 입자 (SP0.5) 상에 시딩된 분화된 THP1 단핵구로부터의 시토카인 발현 및 분비 및 항염증 약물 (예를 들어, 비제한적으로, 덱사메타손, 심바스타틴, 니코틴)로의 단핵구의 조절을 평가하기 위한 실시예 3에 사용된 96-웰 플레이트 설정의 개략도를 도시한다.
도 9a-9c는 SP0.5 입자 상에 시딩하여 덱사메타손으로 자극한 1차 대식세포의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 9a는 제1일 및 제5일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출의 그래프이다. 도 9b 및 9c는 제1일 (도 9b) 및 제5일 (도 9c)에서의 TNF-α, IL-1RA 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
도 10은 SP0.5 입자 상에 시딩하여 덱사메타손으로 자극한 1차 대식세포의 SEM 영상을 도시한다. 도 10은 또한 단독 (음성 대조군) 및 LPS의 존재 하의 (양성 대조군) 배양 배지에서 SP0.5 입자 상에 시딩된 1차 대식세포의 SEM 영상을 도시한다.
도 11a-11c는 SP0.5 입자 상에 시딩하여 심바스타틴으로 자극한 1차 대식세포의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 11a는 제1일 및 제5일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출의 그래프이다. 도 11b 및 11c는 제1일 (도 11b) 및 제5일 (도 11c)에서의 TNF-α, IL-1RA 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
도 12는 SP0.5 입자 상에 시딩하여 심바스타틴으로 자극한 1차 대식세포의 SEM 영상을 도시한다. 도 12는 또한 단독 (음성 대조군) 및 LPS의 존재 하의 (양성 대조군) 배양 배지에서 SP0.5 입자 상에 시딩된 1차 대식세포의 SEM 영상을 도시한다.
도 13a-13c는 SP0.5 입자 상에 시딩하여 니코틴으로 자극한 1차 대식세포의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 13a는 제1일 및 제5일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출의 그래프이다. 도 13b 및 13c는 제1일 (도 13b) 및 제5일 (도 13c)에서의 TNF-α, IL-1RA 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
도 14는 SP0.5 입자 상에 시딩하여 니코틴으로 자극한 1차 대식세포의 SEM 영상을 도시한다. 도 14는 또한 단독 (음성 대조군) 및 LPS의 존재 하의 (양성 대조군) 배양 배지에서 SP0.5 입자 상에 시딩된 1차 대식세포의 SEM 영상을 도시한다.
도 15a-15c는 SP0.5 입자 상에 시딩하여 덱사메타손으로 자극한 1차 수지상 세포의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 15a는 제1일 및 제5일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출의 그래프이다. 도 15b 및 15c는 제1일 (도 15b) 및 제5일 (도 15c)에서의 IL-1β, IL-1RA 및 IL-8 유전자 발현을 나타낸다.
도 16은 SP0.5 입자 상에 시딩하여 덱사메타손으로 자극한 1차 수지상 세포의 SEM 영상을 도시한다. 도 16은 또한 단독 (음성 대조군) 및 LPS의 존재 하의 (양성 대조군) 배양 배지에서 SP0.5 입자 상에 시딩된 1차 수지상 세포의 SEM 영상을 도시한다.
도 17a-17c는 SP0.5 입자 상에 시딩하여 심바스타틴으로 자극한 1차 수지상 세포의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 17a는 제1일 및 제5일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출의 그래프이다. 도 17b 및 17c는 제1일 (도 17b) 및 제5일 (도 17c)에서의 IL-1β, IL-1RA 및 IL-8 유전자 발현을 나타낸다.
도 18은 SP0.5 입자 상에 시딩하여 심바스타틴으로 자극한 1차 수지상 세포의 SEM 영상을 도시한다. 도 18은 또한 단독 (음성 대조군) 및 LPS의 존재 하의 (양성 대조군) 배양 배지에서 SP0.5 입자 상에 시딩된 1차 수지상 세포의 SEM 영상을 도시한다.
도 19a-19c는 SP0.5 입자 상에 시딩하여 니코틴으로 자극한 1차 수지상 세포의 반응을 보여주는 막대 그래프이다. 도 19a는 제1일 및 제5일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출의 그래프이다. 도 19b 및 19c는 제1일 (도 19b) 및 제5일 (도 19c)에서의 IL-1β, IL-1RA 및 IL-8 유전자 발현을 나타낸다.
도 20은 SP0.5 입자 상에 시딩하여 니코틴으로 자극한 1차 수지상 세포의 SEM 영상을 도시한다. 도 20은 또한 단독 (음성 대조군) 및 LPS의 존재 하의 (양성 대조군) 배양 배지에서 SP0.5 입자 상에 시딩된 1차 수지상 세포의 SEM 영상을 도시한다.
도 21은 적어도 약 10 μg/ml IL-4 포매된 실크 필름이 M2 표현형을 유도하지만 ~166 ng/ml LPS는 M1 표현형을 유도하지 않는다는 것을 입증하는 그래프를 도시한다. 10 μg/ml 인터류킨-4 (IL-4)를 실크 필름에 첨가하는 것은 THP-1 단핵구에서 M2 대식세포의 마커 (예를 들어, CCL18 및 CD206)를 상향조절할 수 있다. M2 대식세포는 전형적으로 손상된 조직의 재생에 관여한다. LPS는 실크 필름에 첨가된 낮은 수준의 LPS에서 M1 분화를 자극하지 않는다.
도 22는 대식세포 분화 또는 편향에 대한 INF-γ 포매된 실크 필름의 효과를 입증하는 그래프를 도시한다. 실크 필름에서 10 μg/ml 인터페론-감마 (INF-γ)를 사용하면 THP-1 단핵구는 M1 대식세포의 마커 (예를 들어, CCL3 및 CCR7)를 상향조절한다. M2 마커인 CCL18이 또한 상향조절되는 것으로 보이는 반면, M2의 통상적인 마커인 CD206은 대조군에 비해 강하게 하향조절되었다.
도 23은 도 22에 기재된 INF-γ 포매된 실크 필름으로부터의 IFN-γ의 방출 속도를 입증한다. ELISA는 실크 필름으로부터의 INF-γ의 방출 속도를 보여주기 위해 실행하였다. 필름은 (약 2 μg INF-γ의 전제 로딩을 위해) 필름당 사용된 약 10 μg/ml 및 0.2ml의 실크 피브로인 용액으로부터 제조하였다. 1시간 내에 다량의 INF-γ가 방출되지만 전체 로딩의 백분율에 따라 작았으며 4일까지 보다 많은 INF-γ가 방출되었고, 이는 INF-γ의 지속적인 또는 일정한 방출이 존재함을 보여준다. INF-γ 방출의 수준은 낮은 한편, 이들은 생리학적으로 관련이 있다.
예를 들어, 혈관신생, 다능성 전구 세포의 조직 재구축 부위로의 동원, 및/또는 항미생물 펩티드의 방출을 포함하는 메카니즘을 통해, 예를 들어 손상된 조직의 구성적 재형성을 촉진하는 생체물질 스캐폴드의 완전한 유익한 효과를 실현하기 위해, 면역 반응을 선택적으로 제어하여, 예를 들어 생체물질의 숙주-매개 분해 및/또는 조직 복구 및/또는 재생을 최적화할 수 있는 개선된 생체물질이 요망되고 있다. 이러한 목적을 위해, 본 발명자들은 생체물질을 프로세싱 동안 또는 프로세싱 후에 예를 들어 화학적으로 및/또는 적절한 활성제, 특히 면역 세포-조절제 및/또는 대식세포-편향제의 봉입을 통해 변형시켜 시험관내 또는 생체내에서 면역 세포 (예를 들어, 대식세포) 및/또는 다른 세포 반응을 조절할 수 있다는 것을 발견하였다. 예를 들어, 염증을 촉진하거나 또는 염증을 감소시킬 수 있는 선택적 화합물을 세포 집단에 도입하여 생체물질의 분해에 영향을 미칠 수 있으며, 예를 들어 생체물질을 보다 빠르게, 보다 느리게 또는 보다 선택적인 방식으로 분해시켜, 예를 들어 생체물질 및/또는 조직에 대한 염증 반응 및/또는 재생 반응을 제어할 수 있다. 면역 반응의 제어는 선택적 면역 세포-조절제 및/또는 대식세포-편향제, 예를 들어 비제한적으로 소분자, 펩티드, 항미생물 펩티드 및/또는 리포폴리사카라이드의 존재 하에 활성화 또는 촉진된 세포 집단 (예를 들어, 대식세포)의 특성에 의해 매개될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 다양한 측면의 실시양태는 일반적으로 시험관내 또는 생체내에서 표적 자극 (예를 들어, 비제한적으로 조직 손상, 이식물, 및/또는 시토카인) 및/또는 생체물질 그 자체에 대한 1종 이상의 유형의 면역 세포 (예를 들어, 비제한적으로 대식세포 및/또는 수지상 세포)의 반응을 조절하거나 또는 편향시킬 수 있는 1종 이상의 활성제 (예를 들어, 1종 이상의 면역 세포-조절제 및/또는 대식세포-편향제)를 사용하는 생체물질을 기능화시키는 것에 대한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제 포함)로 관능화된 생체물질을 포함하는 조성물은 면역 세포, 예컨대 대식세포에 매개되는 염증을 촉진하거나 또는 감소시켜, 표적 자극 (예를 들어, 비제한적으로 조직 손상, 이식물, 및/또는 시토카인) 및/또는 생체물질 자체에 대한 면역 반응을 조절할 수 있다 (예를 들어, 염증 또는 재생을 유도함).
한 측면에서, 예를 들어 시험관내 또는 대상체에서 면역 반응 (예를 들어, 표적 자극에 대한 대식세포 반응)을 제어하거나, 조절하거나 또는 편향시키는 조성물이 본원에 제공된다. 조성물은 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)로 기능화된 생체물질을 포함하며, 여기서 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)와의 접촉시에 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 활성화 상태를 선택적으로 제어한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 추가의 측면은, 예를 들어 시험관내 또는 대상체에서 면역 반응 (예를 들어, 표적 자극에 대한 대식세포 반응)을 제어하는 방법에 관한 것이다. 방법은 표적 자극에 가까이 근접하게 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 실시양태를 위치시키는 것을 포함한다.
추가 측면에서, 제1 물질을 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 실시양태로 코팅하는 것을 포함하는 생의학 물질을 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함할 수 있다. 제1 물질은 실크 피브로인-기재 매트릭스로 코팅될 수 있는 임의의 대상, 물질 및/또는 조성물을 포함할 수 있다. 제1 물질의 예는 이식가능한 구조물 (예를 들어, 스캐폴드, 동종이식편 조직, 의료 장치), 제약 조성물, 생체물질, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
제1 물질은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 비제한적으로 딥-코팅 및/또는 스프레이 코팅에 의해 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 실시양태로 코팅될 수 있다.
예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 면역 반응을 제어하기 위한 조성물
한 측면에서, 본원에 기재된 1종 이상의 면역 세포-조절제를 포함하거나 또는 이로 기능화된 생체물질을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 1종 이상의 면역 세포-조절제는 본원에 기재된 생체물질에 1종 이상의 면역 세포-조절제와의 접촉시에 1종 이상의 유형의 면역 세포의 활성화 상태를 선택적으로 제어하거나 또는 변경시키기에 충분한 유효량으로 존재한다. 면역 세포 유형의 예는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "선택적으로 제어하거나 또는 변경시키다"는 선택적 면역 세포-조절제가 이것이 비-표적 면역 세포의 활성화 상태를 제어하거나 또는 변경시키는 것 보다 큰 가능성 및/또는 효력으로 표적 면역 세포의 활성화 상태를 제어하거나 또는 변경시키는 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 선택적 제어 또는 변경은 표적 면역 세포를 비-표적 면역 세포에 대한 가능성보다 적어도 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500, 1000배 또는 그 초과만큼 더 큰 가능성으로 제어하거나 또는 변경시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 선택적 제어 또는 변경은 표적 면역 세포를 비-표적 면역 세포에 대한 효력보다 적어도 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500, 1000배 또는 그 초과만큼 더 큰 효력으로 제어하거나 또는 변경시키는 것을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 선택적 면역 세포-조절제는 표적 면역 세포의 활성화 상태를 제어하거나 또는 변경시킬 수 있으나 비-표적 면역 세포는 그렇지 않다.
일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제는 수지상 세포의 활성화 상태를 제어하거나 또는 변경시키도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제, 예를 들어 대식세포-편향제는 대식세포의 활성화 상태를 제어하거나 또는 변경시키도록 선택될 수 있다.
본원에 사용된 용어 면역 세포의 "활성화 상태"는 면역 세포가 상이한 활성화 상태 사이의 단계 또는 활성화 상태와 비-활성화 상태 사이의 단계에 있음을 의미하는 것으로 이해된다. 면역 세포의 활성화 상태에 따라, 면역 세포는 다양한 면역 반응 및/또는 기능을 생성할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 용어 면역 세포의 "활성화 상태"는 면역 세포가 면역 세포의 상태에 따라 특정 기능을 나타내는 능력을 지칭한다. 오직 예시적 방식으로 면역 세포가 대식세포인 경우에, 대식세포는 주변 환경에 존재하는 면역 세포-조절제에 반응하여 활성화되어 다양한 기능을 나타낼 수 있다. Th1 시토카인, 예컨대 IFN-γ 및/또는 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP), 예컨대 LPS에 반응하여, M1 표현형을 채택한 대식세포는 고전적 활성화 표현형을 나타낸다. 이들은 일반적으로 염증유발 시토카인, 예컨대 TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12 및 IL-23을 생산하고, 항증식성 기능을 보유한다 (30, 35-37). 대안적으로, 대식세포는 Th2 시토카인, 예컨대 IL-4 및 IL-13에 의해 활성화될 수 있으며, M2 표현형을 채택한다. M2 대식세포는 3개의 하위세트로 세분될 수 있다: 그의 표현형에 기초하여 M2a, M2b 및 M2c. M1 및 M2b는 일반적으로 염증성 및 살미생물성인 반면, M2a 및 M2c는 일반적으로 항염증 및/또는 조직 복구 특성을 갖고, IL-10, IL-1 길항제 수용체 (IL-1Ra), 및 형질전환 성장 인자 β (TGF-β) 시토카인을 분비한다. M1 대식세포는 염증 반응을 도출하여, 예를 들어 감염으로부터 새로 손상된 조직을 보호할 수 있는 반면, M2 대식세포는 재생 반응을 도출하여, 예를 들어 조직을 재생시킬 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 일부 실시양태에서 M1 상태 및 M2 상태 사이에서 대식세포를 선택적으로 전환시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 대식세포가 염증 반응 또는 재생 반응을 생성하도록 유도하는데 사용될 수 있다.
면역 세포 (예를 들어, 대식세포 및 수지상 세포)의 활성화 상태를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포의 활성화 상태는 현미경검사 및/또는 영상화에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포, 예를 들어 대식세포 및 수지상 세포가 활성화되는 경우에, 그의 형태는 원형 세포에서 위족을 갖는 확장된 세포로 변화될 수 있다. 또한, 활성화된 면역 세포 (예를 들어, 활성화된 대식세포 및 수지상 세포)는 세포외 매트릭스를 생성하여 주변 환경으로 이동하여 보다 용이하게 부착될 수 있다. 염증 반응 동안, 활성화된 면역 세포 (예를 들어, 활성화된 대식세포)는 함께 융합되어 거대 세포를 형성함으로써, 예를 들어 보다 큰 물질을 포식할 수 있다. 이러한 세포 형태는 활성화된 대식세포의 특징이며, 이는 영상화, 예를 들어 SEM 영상화에 의해 분석될 수 있다 (예를 들어, 실시예 1-3 참조). 일부 실시양태에서, 면역 세포의 활성화 상태는 유전자 발현 마커 (예를 들어, M1 대식세포에 대한 특이적 마커 대 M2 대식세포에 대해 특이적인 마커) 및/또는 활성화된 면역 세포의 시토카인 방출 (예를 들어, M1 대식세포에 의해 방출된 TNF-α)의 존재를 검출함으로서 결정될 수 있다 (실시예 1-3 참조).
면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 활성화 상태를 제어하거나 또는 변경시키기 위해, 본원에 기재된 조성물에 함유된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 생체물질)은 1종 이상의 면역 세포-조절제, 예를 들어 1종 이상의 대식세포-편향제를 포함하며, 이는 아래에 상세하게 기재된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 표적 면역 세포 (예를 들어, 대식세포 및/또는 수지상 세포)를 비-표적 면역 세포에 대한 가능성보다 적어도 약 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500, 1000배 또는 그 초과만큼 더 큰 가능성으로 제어하거나 또는 변경시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 표적 면역 세포 (예를 들어, 대식세포 및/또는 수지상 세포)를 비-표적 면역 세포에 대한 효력보다 적어도 약 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500, 1000배 또는 그 초과만큼 더 큰 효력으로 제어하거나 또는 변경시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 적어도 약 10% 또는 그 초과 (예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 그 초과 포함)의 M1 표현형에 대한 표적 자극의 부위에 가까이 근접하게 및/또는 표적 자극의 부위에 유도하기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 표적 자극의 부위에 가까이 근접한 또는 표적 자극의 부위에 있는 M1 대식세포의 수를 1종 이상의 면역 세포-조절제를 투여하지 않거나 또는 위치시키지 않은 경우의 표적 자극의 부위에 가까이 근접한 또는 표적 자극의 부위에 있는 M1 대식세포의 수에 비해 적어도 약 10% 또는 그 초과 (예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 그 초과 포함)만큼 증가시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다.
이론에 제한되지 않고, M1 대식세포는 일반적으로 염증 반응의 유도 및/또는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 분해와 연관된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 표적 자극의 부위와 가까이 근접한 부위 및/또는 표적 자극의 부위에서의 하나 이상의 염증 반응 (예를 들어, 하나 이상의 염증성 인자, 예컨대 TNF-α의 방출)을 1종 이상의 면역 세포-조절제를 투여하지 않거나 또는 위치시키지 않은 경우에 표적 자극의 부위와 가까이 근접한 부위 및/또는 표적 자극의 부위에서 관찰된 염증 반응의 정도보다 적어도 약 10% 또는 그 초과 (예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 그 초과 포함)만큼 증가시키는데 충분한 유효량으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 본원에 기재된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 분해를 면역 세포-조절제를 포함하지 않는 (예를 들어, 대식세포-편향제를 포함하지 않는) 본원에 기재된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 분해에 비해 적어도 약 10% 또는 그 초과 (예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 그 초과 포함)만큼 증가시키는데 충분한 유효량으로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 적어도 약 10% 또는 그 초과 (예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 그 초과 포함)의 대식세포를 M2 표현형에 대한 표적 자극의 부위와 가까이 근접하게 및/또는 표적 자극의 부위에 유도하기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 표적 자극의 부위와 가까이 근접한 부위 및/또는 표적 자극의 부위에 있는 M2 대식세포의 수를 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)를 투여하지 않거나 또는 위치시키지 않은 경우에 표적 자극의 부위와 가까이 근접한 부위 및/또는 표적 자극의 부위에 있는 M2 대식세포의 수에 비해 적어도 약 10% 또는 그 초과 (예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 그 초과 포함)만큼 증가시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다.
이론에 제한되지 않고, M2 대식세포는 일반적으로 항염증 및/또는 재생 반응의 유도와 연관된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 표적 자극의 부위와 가까이 근접한 부위 및/또는 표적 자극의 부위에서의 하나 이상의 항염증 반응 (예를 들어, 하나 이상의 항염증성 인자, 예컨대 IL-10의 방출)을 1종 이상의 면역 세포-조절제를 투여하지 않거나 또는 위치시키지 않은 경우에 표적 자극의 부위와 가까이 근접한 부위 및/또는 표적 자극의 부위에서 관찰된 항염증 반응의 정도에 비해 적어도 약 10% 또는 그 초과 (예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 그 초과 포함)만큼 증가시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 표적 자극의 부위 (예를 들어, 조직 손상의 부위)에서의 기질 세포 (예를 들어, 조직 세포, 예컨대 섬유모세포)의 수 및/또는 증식을 면역 세포-조절제의 부재 하의 표적 자극의 부위 (예를 들어, 조직 손상의 부위)에서의 기질 세포의 수 및/또는 증식에 비해 적어도 약 10% 또는 그 초과 (예를 들어, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 그 초과 포함)만큼 증가시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 2종 이상 (예를 들어, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상 또는 그 초과 포함)의 면역 세포-조절제를 포함할 수 있거나 또는 이로 기능화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 2종 이상 (예를 들어, 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상 또는 그 초과 포함)의 대식세포-편향제를 포함할 수 있거나 또는 이로 기능화될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 제1 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제1 대식세포-편향제)를 제1 시점에 방출시키고 제2 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제2 대식세포-편향제)를 제2 시점에 방출시키는데 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 시점 및 제2 시점은 동일하다. 다른 실시양태에서, 제1 시점 및 제2 시점은 예를 들어, 적어도 약 5분, 적어도 약 15분, 적어도 약 30분, 적어도 1시간, 적어도 약 3시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간 또는 그 초과만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 제2 면역 세포-조절제의 방출을 제1 면역 세포-조절제의 방출 후에 적어도 약 1일, 적어도 약 3일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 1개월 또는 그 초과만큼 지연시키는데 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 제2 면역 세포-조절제의 방출을 제1 면역 세포-조절제의 방출 후에 적어도 약 1일, 적어도 약 3일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 1개월 또는 그 초과만큼 지연시키는데 적합할 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "기능화된"은 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)와 제공된 생체물질을 지칭한다. 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는 생체물질에 임의의 수단에 의해 제공될 수 있다. 본원에 기재된 이러한 측면 및 다른 측면의 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질로 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))는 처리 동안 생체물질 용액 (예를 들어, 실크 피브로인 용액)에 혼합될 수 있거나 또는 형성된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 관류될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 생체물질의 표면 상에 존재할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스) 상에 코팅될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 공유 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질 전구체 (예를 들어, 실크 피브로인)는 예를 들어 유전 공학에 의해 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)에 접합되거나 또는 이와 융합될 수 있으며, 이어서 생체물질 전구체를 사용하여 생체물질을 형성할 수 있다 (예를 들어, 실크 피브로인을 사용하여 실크 피브로인-기재 매트릭스를 형성함).
생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스에서의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)의 분배는 다수의 요인, 예를 들어 비제한적으로 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)의 수 및/또는 유형, 매트릭스의 유형 (예를 들어, 필름 대 입자), 면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))의 원하는 방출 프로파일, 본원에 기재된 조성물의 용도, 생체물질 기능화, 및 그의 임의의 조합에 따라 달라질 수 있다. 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는 균질하게 또는 불균질하게 분산되거나 또는 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스에 구배 방식으로 분산될 수 있다. 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 적어도 대식세포-편향제)를 실크 피브로인-기재 매트릭스에 로딩하는 방법에 대한 추가의 정보는 하기에 추가로 논의된다.
생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 균질 매트릭스, 복합 매트릭스 (예를 들어, 2종 이상의 생체물질의 혼합물) 및/또는 다중-층의 매트릭스를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 적어도 2종 이상의 면역 세포-조절제)는 균질 매트릭스에 분배될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 적어도 2종 이상의 면역 세포-조절제)는 복합 매트릭스 (예를 들어, 매트릭스 중 2종 이상의 생체물질의 혼합물)에 분배될 수 있다. 2종 이상의 면역 세포-조절제가 관련된 이러한 실시양태에서, 제1 면역 세포-조절제는 제1 생체물질에서 제2 생체물질에서보다 높은 용해도 또는 분배 계수를 가질 수 있고, 제2 면역 세포-조절제는 제2 생체물질에서 제1 생체물질에서보다 높은 높은 용해도 또는 분배 계수를 가질 수 있다. 따라서, 제1 면역 세포-조절제는 복합 매트릭스의 제1 생체물질에 우선적으로 분배될 수 있고, 제2 면역 세포-조절제는 복합 매트릭스의 제2 생체물질에 우선적으로 분배될 수 있으며, 이로써 상이한 생체물질에 분배된 2종 이상의 면역 세포-조절제를 포함하는 복합 생체물질이 형성된다.
일부 실시양태에서, 적어도 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 적어도 2종 이상의 면역 세포-조절제)는 다중-층의 생체물질에 분배될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는 다중-층의 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스의 개별 층에 분산될 수 있다. 예를 들어, 다중-층의 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 제1 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제1 대식세포-편향제)를 그의 제1 층에 및 제2 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제2 대식세포-편향제)를 그의 제2 층에 포함할 수 있다. 다중-층의 생체물질을 제조하는 방법, 예를 들어 비제한적으로 층-대-층 침착 또는 침지 방법이 당업계에 공지되어 있다.
본원에 기재된 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 임의의 물질 포맷, 예를 들어 필름, 섬유, 입자, 튜브, 겔, 마이크로구체, 히드로겔, 매트, 메쉬, 직물, 또는 그의 임의의 조합으로 존재할 수 있다. 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)에 대한 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인)의 임의의 비가 사용될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)에 대한 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인)의 비는 약 1:1000 내지 약 1000:1, 약 1:500 내지 약 500:1, 약 1:250 내지 약 250:1, 약 1:125 내지 약 125:1, 약 1:100 내지 약 100:1, 약 1:50 내지 약 50:1, 약 1:25 내지 약 25:1, 약 1:10 내지 약 10:1, 약 1:5 내지 약 5:1, 약 1:3 내지 약 3:1 또는 약 1:1일 수 있다. 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)에 대한 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인)의 비는 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)의 선택, 저장 상태 및 기간, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 농도 및/또는 생체물질 (예를 들어, 실크 매트릭스)의 포맷을 비롯한 다수의 요인에 따라 달라질 수 있다. 당업자는 예를 들어 예를 들어 실시예 1-3에 기재된 바와 같이 관심 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 활성화에 대한 다양한 농도의 면역 세포 조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)의 효과를 결정함으로써 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)에 대한 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 적절한 비를 결정할 수 있다. 면역 세포의 활성화를 결정하는 방법, 예를 들어 현미경검사 및 영상화, 유전자 발현 및/또는 시토카인 방출 분석에 의한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본원에 기재된 이러한 측면 및 다른 측면의 일부 실시양태에서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)의 지속 방출을 위해 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스는 적어도 2종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 적어도 2종 이상의 대식세포-편향제)의 지속 방출을 위해 적합할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "지속 방출"은 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스로부터 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)가 소정의 기간 동안, 예를 들어 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주, 적어도 약 8주, 적어도 약 12주, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 9개월, 적어도 약 12개월 또는 그 초과 동안 전달되는 것을 지칭한다.
면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))는 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스로부터 소정의 기간 동안, 예를 들어 수시간, 수일, 수주 또는 수개월의 기간 동안 계속적으로 또는 간헐적으로 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))는 총 로딩량의 적어도 약 1% (적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 포함)가 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 5시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간 또는 그 초과의 기간에 걸쳐 방출될 수 있는 속도로 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))는 총 로딩량의 적어도 약 10% (적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 그 초과 포함)가 5일의 기간, 1주의 기간, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월 또는 그 초과의 기간에 걸쳐 방출될 수 있는 속도로 방출될 수 있다.
면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))의 선택은, 예를 들어 표적화될 면역 세포의 유형, 의도된 면역 반응 (예를 들어, 염증 반응 대 재생 반응) 및/또는 본원에 기재된 조성물의 용도에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 1종 이상의 유형 (예를 들어, 2종 이상의 유형 또는 그 초과 포함)의 면역 세포, 예를 들어 대식세포의 반응을 제어하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포 조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 시험관내 또는 생체내에서 표적 자극에 대한 1종 이상의 유형 (예를 들어, 2종 이상의 유형 포함)의 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 반응을 제어하도록 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 대상체에서 표적 자극에 대한 1종 이상의 유형 (예를 들어, 2종의 유형 또는 그 초과 포함)의 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 반응을 제어하도록 선택될 수 있다.
아래 "표적 자극" 섹션에 추가로 기재된 바와 같이, 표적 자극은 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 응답 또는 반응을 유발하거나 또는 유도할 수 있는, 예를 들어 염증 반응 및/또는 재생 반응을 유도하는 임의의 시험관내 또는 생체내 상태, 대상 및/또는 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 자극은 대식세포-연관 상태를 포함할 수 있다. 예시적인 대식세포-연관 상태는 박테리아 감염, 조직 재생, 조직 손상, 예를 들어 조직 복구 및/또는 증진 (예를 들어, 연부 조직 복구 및/또는 증진)을 포함하는 조직 재구축, 관절염, 비만, 당뇨병, 동맥경화증, 동종이식편 이식, 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH), 골다공증, 사구체신염, 암, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 표적 자극은 이식가능한 구조물 (예를 들어, 비제한적으로 스캐폴드, 동종이식편 조직, 의료 장치)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 자극은 하나 이상의 시토카인 (예를 들어, 케모카인 포함)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 M1 표현형 대식세포의 존재를 유도하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 M2 표현형 대식세포의 존재를 유도하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 하나 이상의 염증 반응 (예를 들어 비제한적으로 염증성 인자, 예컨대 TNF-α의 방출)을 유도하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 표적 부위에 가까이 근접하게 및/또는 표적 부위에 위치시에 본원에 기재된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 분해를 유도하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 하나 이상의 항염증 반응 (예를 들어 비제한적으로 항염증 인자, 예컨대 IL-10의 방출)을 유도하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 표적 부위 (예를 들어, 손상된 조직)에서의 기질 세포 (예를 들어, 실질 세포)의 증식 및/또는 수를 유도하도록 선택될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및/또는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)은 다양한 용도에 적합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 대식세포-연관 상태의 치료에 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 이들 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 대식세포-연관 상태의 치료, 예를 들어 비제한적으로 조직 재생 및/또는 상처 치유를 위한 1종 이상의 치료제를 포함할 수 있다. 조직 재생 및/또는 상처 치유를 위한 예시적인 치료제는 덱스판테놀; 성장 인자; 효소, 호르몬; 포비돈-아이오다이드; 지방산; 항염증제; 항생제; 항미생물제; 방부제; 시토카인; 트롬빈; 진통제; 오피오이드; 아미녹실; 푸록산; 니트로소티올; 니트레이트 및 안토시아닌; 뉴클레오시드, 예컨대 아데노신; 및 뉴클레오티드, 예컨대 아데노신 디포스페이트 (ADP) 및 아데노신 트리포스페이트 (ATP); 신경전달물질/신경조절물질, 예컨대 아세틸콜린 및 5-히드록시트립타민 (세로토닌/5-HT); 히스타민 및 카테콜아민, 예컨대 아드레날린 및 노르아드레날린; 지질 분자, 예컨대 스핑고신-1-포스페이트 및 리소포스파티드산; 아미노산, 예컨대 아르기닌 및 리신; 펩티드, 예컨대 브라디키닌, 물질 P 및 칼슘 유전자-관련 펩티드 (CGRP); 산화질소; 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
예시적인 성장 인자는 섬유모세포 성장 인자 (FGF), FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-α, FGF-β, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 인슐린-결합 성장 인자 (IGF), IGF-1, IGF-2, 헤파린-결합 성장 인자-1, 헤파린-결합 성장 인자-2, 표피 성장 인자 (EGF), 형질전환 성장 인자 (TGF), TGF-α, TGF-β, 연골 유도 인자-A 및 -B, 유골-유도 인자, 오스테오게닌, 혈관 내피 성장 인자, 골 성장 인자, 콜라겐 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 및 그의 생물학적 활성 유도체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 국소 적용, 직접 적용, 주사, 이식, 또는 임의의 다른 적합한 투여 형태를 위해 제제화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)로 기능화된 생체물질을 포함하는 조성물은 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제로 기능화된 생체물질을 포함하는 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물 또는 생체물질은 상처 드레싱, 또는 상처 드레싱의 일부, 예를 들어 비제한적으로 붕대, 거즈, 테이프, 메쉬, 네트, 반창고, 필름, 막, 패치, 또는 그의 임의의 조합으로 사용하기에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 상기 기재된 바와 같은 상처 치유를 용이하게 하는 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물 또는 생체물질은 코팅으로 사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 이식가능한 구조물, 예를 들어 비제한적으로 스캐폴드, 동종이식편 조직 및/또는 의료 장치, 예를 들어 비제한적으로 스텐트, 포트, 스크류, 카테터, 봉합사, 스테이플, 인공 기관, 신경 자극기, 펌프, 약물 전달 펌프, 박동조율기, 제세동기, 스텐트-이식편, 이식편, 인공 심장 판막, 난원공 폐쇄 장치, 뇌척수액 션트, 박동조율기 전극, 가이드 와이어, 심실 보조 장치, 심폐 우회 회로, 혈액 산화기, 대정맥 필터, 심막내 전기선, 기관내 튜브, 신루설치 튜브 및 정형외과용 장치의 코팅을 형성하기에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약 조성물 또는 약물 전달 비히클을 코팅하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 약물 전달 비히클을 형성하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물 또는 생체물질은 예를 들어 재건 수술 (예를 들어, 비제한적으로 미용 수술, 및 연부 조직 복구 및/또는 증진 포함)에 사용하기 위한 스캐폴드 구조물 (예를 들어, 인공 장치)을 형성하는데 적합할 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물 또는 생체물질은 주사가능한 스캐폴드를 형성할 수 있다. 예를 들어, 주사가능한 실크 피브로인 입자, 예를 들어 2012년 11월 9일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US12/64450에 기재된 것, 및 주사가능한 실크 피브로인 발포체, 예를 들어 2012년 11월 9일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US12/64471에 기재된 것이 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물 또는 생체물질은 편물 스캐폴드 구조물 (예를 들어, 편물 인공 장치)을 형성할 수 있다. 예를 들어, 실크 피브로인-기재 메쉬 및/또는 직물, 예를 들어 미국 특허 출원 번호 US 2012/0221105 및 US 2012/0304702에 기재된 것은 스캐폴드 구조물 (예를 들어, 인공 장치)을 형성하는데 사용될 수 있다. 국제 특허 및 미국 특허 출원의 내용은 모두 본원에 참조로 포함된다.
따라서, 적용 및/또는 적용 포맷에 따라, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)은 임의의 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 필름, 섬유, 입자의 수집물, 튜브, 매트, 겔, 직물, 메쉬, 또는 그의 임의의 조합의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 생체물질은 필름, 섬유, 입자의 수집물, 튜브, 매트, 겔, 직물, 메쉬, 또는 그의 임의의 조합의 형태일 수 있다. 예를 들어, 이식가능한 구조물의 코팅을 형성하기 위해, 조성물 또는 생체물질은 필름을 형성할 수 있다. 조성물이 표적 부위 (예를 들어, 손상된 조직 부위)에서 스캐폴드로 사용되는 다른 실시양태에서, 조성물 및/또는 생체물질은 겔, 튜브, 입자의 수집물, 또는 표적 부위 (예를 들어, 손상된 조직 부위)의 형태 및/또는 크기에 맞춘 3-D 구조물을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)로 기능화된 생체물질을 포함하는 조성물은 코팅을 포함할 수 있다. 코팅은 필름, 섬유, 입자의 수집물, 겔, 메쉬, 직물 또는 그의 임의의 조합의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 코팅은 실크 피브로인-기재 매트릭스, 예를 들어 비제한적으로 실크 피브로인-기재 히드로겔, 실크 피브로인-기재 이식물, 실크 피브로인-기재 직물 또는 섬유, 실크 피브로인-기재 메쉬 또는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 2011/0189773; 2011/0052695; 2011/0009960; 2010/0256756; 및 2010/0209405에 논의된 바와 같은 다른 조직 공학 조성물에 적용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)로 기능화된 생체물질을 포함하는 조성물은 약물 전달 비히클을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제어-방출 제약 조성물을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 주사가능하도록 채택될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "주사가능한"은 일반적으로 최소한의 침습적 절차로 표적 부위에 위치시키거나 또는 투여할 수 있는 조성물을 지칭한다. 용어 "최소한의 침습적 절차"는 피부를 통해 또는 체강 또는 해부학적 개구부를 통해 대상체의 신체에 진입하나, 가능한 최소로 손상시키면서 수행되는 절차 (예를 들어, 소 절개, 주사)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 주사가능한 조성물은 주사에 의해 표적 부위에 투여하거나 또는 위치시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 주사가능한 조성물은 피부 상의 소 절개에 이어 바늘, 캐뉼라 및/또는 튜빙, 예를 들어 카테터의 삽입에 의해 투여하거나 또는 위치시킬 수 있다. 제한되지 않고, 주사가능한 조성물은 수술, 예를 들어 이식에 의해 조직에 투여하거나 또는 위치시킬 수 있다.
제한되지 않고, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제 포함)는 또한 본원에 기재된 조성물의 일부 실시양태에 분배될 수 있다.
예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 면역 반응을 제어하는 방법
본원에 기재된 조성물은 시험관내 또는 생체내에서 면역 반응, 예를 들어 대식세포 반응을 제어하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 또 다른 측면은 예를 들어 본원에 기재된 표적 자극에 대한 면역 세포의 반응을 제어하는 방법에 관한 것이다. 예시적인 면역 세포는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 방법은 (a) 표적 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 부위에 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 실시양태를 위치시키는 것; 및 (b) 표적 부위에 위치하면 면역 세포-조절제를 본원에 기재된 조성물의 생체물질로부터 예정된 속도로 방출시켜, 생체물질 주변의 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비를 변경시키는 것을 포함할 수 있다. 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비가 역치 초과에 도달하는 경우에, 본원에 기재된 생체물질은 염증 반응을 유도할 수 있고; 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비가 역치 미만에 도달하는 경우에, 본원에 기재된 생체물질은 재생 또는 항염증 반응을 유도할 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "가까이 근접한"은 일반적으로 10 cm 이하 (예를 들어, 9 cm 이하, 8 cm 이하, 7 cm 이하, 6 cm 이하, 5 cm 이하, 4 cm 이하, 3 cm 이하, 2 cm 이하, 1 cm 이하, 0.5 cm 이하, 0.1 cm 이하 또는 그 미만 포함)의, 표적 부위 (예를 들어, 표적 자극의 부위)로부터 본원에 기재된 조성물의 위치 또는 투여 부위의 공간 거리를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제는 적어도 수지상 세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제는 적어도 대식세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제는 1종 이상의 대식세포-편향제를 포함할 수 있다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 예를 들어 적어도 대식세포의 반응을 제어하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 (a) 표적 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 부위에 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 실시양태를 위치시키는 것; 및 (b) 표적 부위에 위치하면 대식세포-편향제를 생체물질로부터 예정된 속도로 방출시켜, 생체물질 주변의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비를 변경시키는 것을 포함할 수 있다. M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 초과인 경우에, 본원에 기재된 생체물질은 염증 반응을 유도할 수 있고; M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 미만인 경우에, 본원에 기재된 생체물질은 재생 또는 항염증 반응을 유도할 수 있다.
M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 초과인 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 의해 유도된 염증 반응은 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스) 분해의 유도를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)과 관련하여 사용된 용어 "분해하다" 또는 "분해"는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 부피 또는 크기의 감소를 지칭한다. 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 분해는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 보다 작은 절편으로의 절단 및/또는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스) 또는 그의 단편의 용해를 통해 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는 예를 들어 생체물질 주변의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 최적의 비를 달성하여, 소정의 기간 동안 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)을 위치시키고/거나 이식하였을 때 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)이 그의 본래 부피 (예를 들어, 표적 부위에의 위치 또는 이식 전의 부피)의 80% 이하 (예를 들어, 그의 본래 부피의 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 10% 이하 또는 그 미만 포함)를 분해할 수 있도록 하는 예정된 속도로 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는 예를 들어 생체물질 주변의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 최적의 비를 달성하여, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)을 위치시키고/거나 이식하였을 때 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)이 유의한 분해를 나타내지 않도록 할 수 있는 (예를 들어, 검출가능한 부피 변화가 없음) 예정된 속도로 방출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는, 예를 들어 생체물질 주변의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 최적의 비를 달성하여, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)이 임의의 기간, 예를 들어 수주, 수개월 또는 수년에 걸쳐 그의 본래 부피의 적어도 일부를 분해하기에 적합할 수 있도록 하는 예정된 속도로 방출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는, 예를 들어 생체물질 주변의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 최적의 비를 달성하여, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)이 그의 본래 부피의 적어도 일부, 예를 들어 그의 본래 부피의 50% 이하 (예를 들어, 그의 본래 부피의 40% 이하, 30% 이하, 20% 이하 또는 그 미만 포함)를 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주, 적어도 약 8주, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월, 적어도 약 7개월, 적어도 약 8개월, 적어도 약 9개월, 적어도 약 10개월, 적어도 약 11개월, 적어도 약 1년, 적어도 약 2년, 적어도 약 3년, 적어도 약 4년, 적어도 약 5년 또는 그 초과의 기간 내에 분해하기에 적합할 수 있도록 예정된 속도로 방출될 수 있다. 다른 실시양태에서, 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는 예를 들어 생체물질 주변의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 최적의 비를 달성하여, 적어도 약 3개월 또는 그 초과 동안 위치시키거나 또는 이식하였을 때 유의한 분해가 나타나지 않을 수 있도록 (즉, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 검출가능한 부피 변화가 없음) 예정된 속도로 방출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는, 예를 들어 생체물질 주변의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 최적의 비를 달성하여, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)이 위치한 표적 부위의 조직이 재생되기 시작함에 따라 (여전히 충분한 지지는 제공하면서) 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 본래 부피가 점차적으로 감소하도록 예정된 속도로 방출될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 제1 면역 세포 조절제 (예를 들어, 제1 대식세포-편향제) 및 제2 면역 세포 조절제 (예를 들어, 제2 대식세포-편향제)를 포함할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 제1 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제1 대식세포-편향제)는 재생 반응을 생성하기 위해 (예를 들어, 표적 부위 (예를 들어, 손상된 조직 포함)에서의 세포, 예컨대 실질 세포의 증식을 증가시키기 위해) 예를 들어 생체물질 주변의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 최적의 비를 달성하는 제1의 예정된 속도로 방출될 수 있다. 조직이 재생되기 시작함에 따라, 제2 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는, 예를 들어 생체물질 주변의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 최적의 비를 달성하여, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)이 예정된 기간 (예를 들어, 적어도 약 2주 (적어도 약 6주, 적어도 약 3개월, 적어도 약 6개월 또는 그 초과 포함)의 기간)에 걸쳐 그의 본래 부피의 적어도 약 5% (예를 들어, 그의 본래 부피의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 초과 포함)를 분해하기에 적합할 수 있도록 예정된 속도로 방출될 수 있다. 예를 들어, 제1 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제1 대식세포-편향제) 및 제2 면역 세포-조절제 (예를 들어, 제2 대식세포-편향제)는 본원에 기재된 조성물의 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 상이한 층에 분배될 수 있으며, 여기서 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)의 상응하는 층은 예를 들어 실크 피브로인 중의 β-시트의 양 및/또는 실크 피브로인-기재 매트릭스의 기공률을 변경시키고/거나, 예를 들어 중합체 물질로 층을 코팅하여 층을 변형시킴으로써 각각의 세포-조절제를 예정된 속도로 방출시키는데 적합한다.
M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 초과인 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 의해 유도된 염증 반응은 표적 부위에 가까이 근접한 및/또는 표적 부위에 있는 조직을 감염 (예를 들어, 박테리아 감염)으로부터 보호하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질로부터 방출된 면역 세포-조절제(들)는 표적 부위에 가까이 근접한 및/또는 표적 부위에 있는 조직의 감염 (예를 들어, 박테리아 감염)을 감소시키거나 또는 방지하기 위해 표적 면역 세포가 충분한 양의 항미생물제, 예컨대 항미생물 펩티드를 방출하도록 유도하거나 또는 활성화시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 감염 (예를 들어, 박테리아 감염)을 치료하는데 이용될 수 있다.
M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 미만인 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 의해 유도된 재생 또는 항염증 반응은 표적 부위에서의 조직 복구 및/또는 재생을 용이하게 하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질로부터 방출된 면역 세포-조절제(들)는 표적 조직 (예를 들어, 손상된 조직)의 부위에 가까이 근접한 부위 및/또는 표적 조직의 부위에서의 성장 및/또는 증식을 자극하기 위해 표적 면역 세포가 충분한 양의 증식성 인자, 예컨대 성장 인자 (예를 들어 비제한적으로 TGF-β)를 방출하도록 유도하거나 또는 활성화시킬 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 조직 손상을 치료하는데 이용될 수 있다.
상태, 예를 들어 본원에 기재된 감염 또는 조직 손상의 치료와 관련하여 본원에 사용된 용어 "치료" 및 "치료하다"는 상태의 진행을 방지하는 것 또는 상태의 경과를 변경시키는 것 (예를 들어, 비제한적으로 상태의 진행 또는 악화를 지연시키는 것), 또는 상태의 증상을 반전시키는 것 (예를 들어, 박테리아 감염 또는 조직 손상을 지연시키고/거나 반전시키는 것) 또는 대상체에서 하나 이상의 증상 및/또는 하나 이상의 생화학적 마커를 감소시키는 것, 하나 이상의 증상의 악화 또는 진행을 방지하는 것, 회복을 촉진하는 것 또는 예후를 개선시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 박테리아 감염을 치료하는 경우에, 치유적 치료는 본원에 기재된 조성물의 투여 후에 하나 이상의 염증 반응, 예를 들어 염증성 작용제 (예를 들어, TNF-α) 및/또는 항미생물제 (예를 들어, 항미생물 펩티드)의 방출의 유도를 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 치유적 치료는 박테리아 감염과 연관된 하나 이상의 증상의 완화를 지칭한다. 측정가능한 감소는 치료 후에 측정가능한 마커 또는 증상의 임의의 통계적으로 유의한 감소, 예컨대 열 (화씨 100도가 넘는 체온을 가짐)이 내리는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 박테리아 감염의 하나 이상의 증상은 대조군 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물의 부재 하에서)에 비해 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50% 완화된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 증상은 대조군 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물의 부재 하에서)에 비해 50% 초과, 예를 들어 약 60%, 또는 약 70% 완화된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 증상은 대조군 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물의 부재 하에서)에 비해 약 80% 또는 약 90% 완화된다. 조직 손상을 치료하는 경우에, 치유적 치료는 본원에 기재된 조성물의 투여 후에 하나 이상의 재생 반응, 예를 들어 항염증제 (예를 들어, IL-10) 및/또는 증식성 인자 (예를 들어, TGF-β)의 방출의 유도를 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, 치유적 치료는 조직 손상과 연관된 하나 이상의 증상의 완화를 지칭한다. 측정가능한 감소는 치료 후에 측정가능한 마커 또는 증상의 임의의 통계적으로 유의한 감소, 예컨대 통증 감소를 포함한다. 한 실시양태에서, 조직 손상의 하나 이상의 증상은 대조군 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물의 부재 하에서)에 비해 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 약 40% 또는 약 50% 완화된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 증상은 대조군 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물의 부재 하에서)에 비해 50% 초과, 예를 들어 약 60% 또는 약 70% 완화된다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 증상은 대조군 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물의 부재 하에서)에 비해 약 80% 또는 약 90% 완화된다.
M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 미만인 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 의해 유도된 재생 또는 항염증 반응은 숙주의 면역계에 의한 생체물질의 거부를 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 다양한 방법의 일부 실시양태에서, 치료할 표적 부위는 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 반응이 제어될 본원에 기재된 표적 자극을 포함할 수 있다. 치료할 표적 부위는 시험관내 또는 생체내에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 표적 자극에 대한 대식세포 반응을 제어하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 본원에 기재된 하나 이상의 실시양태를 표적 자극의 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 자극의 부위에 위치시키는 것을 포함하며, 여기서 본원에 기재된 1종 이상의 대식세포-편향제는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 생체물질)에 (a) 대식세포의 최소 집단을 M1 표현형 상태로 전환시켜, 표적 자극에 대한 염증 반응을 유도하거나; (b) 대식세포의 최소 집단을 M2 표현형 상태로 전환시켜, 자극에 대한 재생 반응을 유도하거나; 또는 (c) (a) 및 (b) 둘 다에 충분한 유효량으로 존재한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 다양한 방법의 실시양태에서, 생체물질을 포함하는 조성물 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 생체물질)은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 표적 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 부위에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)을 포함하는 조성물은 주사에 의해 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)을 포함하는 조성물은 이식, 예를 들어 수술에 의해 위치할 수 있다.
본원에 기재된 방법은 면역 반응의 제어가 바람직한 임의의 상황, 예를 들어 본원에 기재된 표적 자극을 포함하는 상황에 이용될 수 있다. 오직 예시적인 방식으로, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 상처 치유를 용이하게 하는데 이용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 방법은 상처 (예를 들어, 외과적 상처 또는 개방성 상처)를 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 실시양태 (예를 들어, 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트 또는 메쉬, 및/또는 주사가능한 실크 피브로인-기재 매트릭스 포함)와 접촉시키는 것; 및 상처에 가까이 근접한 곳 또는 상처에서의 면역 반응을 최적화시켜 상처 치유 과정을 개선시키기 위해 접촉시에 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)를 예정된 속도로 생체물질 (예를 들어, 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트 또는 메쉬, 및/또는 주사가능한 실크 피브로인-기재 매트릭스)로부터 상처로 방출시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 조직 재구축 (예를 들어, 조직 복구 및/또는 증진)을 용이하게 하는데 이용될 수 있다. 조직 재구축은 헤르니아 복구, 골반 기저부 재구축, 요도주위 지지, 예를 들어, 방광 조직 및 슬링, 복막 벽 조직, 혈관 (예를 들어, 동맥), 근육 조직 (복부 평활근, 심장), 지혈, 연골, 골, 피부, 및 무릎 및 어깨의 인대 및 건 뿐만 아니라 외상 또는 장기 마모로 인해 빈번하게 손상되는 다른 구조물의 복구 및/또는 증진, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 연부 조직의 재구축 (예를 들어, 복구 및/또는 증진)을 용이하게 하는데 이용될 수 있다. 연부 조직의 예는 피부, 유방 조직, 건, 인대, 섬유성 조직, 결합 조직, 근육, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서 유방 조직 또는 유방 이식물을 재구축, 강화 또는 지지하는데 이용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 실시양태 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 메쉬 또는 직물, 및/또는 주사가능한 실크 피브로인-기재 매트릭스 포함)를 대상체의 유방 조직에 위치시키는 것; 및 표적 부위에 가까이 근접한 부위 또는 표적 부위에서의 면역 반응을 최적화시켜 조직 재구축 과정을 개선하기 위해 (예를 들어, 비제한적으로 염증 반응의 감소, 및/또는 반흔 형성, 및/또는 조직 재생의 증진 포함), 위치하였을 때 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)를 예정된 속도로 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 메쉬 또는 직물, 및/또는 주사가능한 실크 피브로인-기재 매트릭스)로부터 유방 조직의 표적 부위로 방출시키는 것을 포함할 수 있다. 다양한 재구축 또는 지지 용도로 실크 피브로인-기재 메쉬 또는 직물을 사용하는 방법, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 번호 US 2012/0221105에 기재된 방법이 적합할 수 있으며 본원에 기재된 방법에 이용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 예를 들어 비제한적으로 유방 확대, 유방성형술, 안면 주름제거, 이마 주름제거, 상안검 및 하안검 수술 (안검성형술), 코 재형성 (코성형술), 비강재구축, 피부 조직 확대; 특히 얼굴 및 목의 선, 접힘, 주름, 경미한 안면 함몰 및 구순열의 충전; 손과 다리, 손가락과 발가락에서의 것을 포함하는 노화 또는 질환으로 인한 경미한 변형의 교정; 언어 능력을 회복시키기 위한 성대 또는 성문의 확대; 수면선 및 표정선의 피부 충전; 노화로 인해 손실된 피부 및 피하 조직의 대체; 입술 확대; 눈가의 잔주름 및 눈가의 안와 주름의 충전; 턱 확대; 볼 및/또는 코의 확대; 예를 들어 과잉의 지방 흡인술 또는 다른 외상으로 인한 연부 조직, 피부 또는 피하에서의 함입의 충전; 여드름 또는 외상성 반흔의 충전; 코입술 라인, 코미간 라인 및 구내 라인의 충전, 및 그의 임의의 조합을 비롯한 미용 수술 절차에 사용하기에 적합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 예를 들어 주름을 감소시키고/거나 피부 탄성을 증가시킴으로써 피부 외관 및/또는 상태를 개선하는데 이용될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 실시양태 (예를 들어, 주사가능한 실크 피브로인-기재 조성물)을 그의 필요로 하는 대상체의 피부 영역에 주사하는 것, 및 표적 부위에 가까이 근접한 부위 또는 표적 부위에서의 면역 반응을 최적화하기 위해 주사시에 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)를 예정된 속도로 생체물질 (예를 들어, 주사가능한 실크 피브로인-기재 매트릭스)로부터 피부 영역의 표적 부위로 방출시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법은 주사 후에 표적 부위의 염증을 감소시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 방법은 주사 부위를 감염 및/또는 박테리아 감염으로부터 보호할 수 있다.
생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인 -기재 매트릭스)
본원에 기재된 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)로 기능화된 생체물질에 관한, 예를 들어 면역 반응을 조절하는 방법 및 조성물이 본원에 기재된다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 생체물질은 하나 이상의 개별 생체물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생체물질은 단일 생체물질, 예를 들어 실크 또는 2종 이상의 생체물질, 예를 들어 실크 및 콜라겐을 포함할 수 있다. 생체물질은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 임의의 생체적합성 물질은 본원에 기재된 조성물에서 생체물질로서 사용될 수 있다. 생체적합성 물질의 예는 중합체, 히드로겔, 단백질, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "생체적합성 물질"은 대상체의 생물학적 조직에 이식하거나 또는 이러한 조직에 인접하게 위치시켰을 때 시간 경과에 따라 유의한 면역 반응 또는 유해한 조직 반응, 예를 들어 독성 반응 또는 유의한 자극을 상당히 악화시키지 않고 이를 유도하지 않거나, 또는 이것이 혈액과 접촉하게 되는 경우에 혈액 응고 또는 응고를 유도하는 임의의 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 물질은 급성 또는 만성 염증 반응을 유도하거나 주변 조직의 적절한 분화를 방해하지 않는다. 적합한 생체적합성 물질은 실크 피브로인, 폴리이미드, 폴리비닐 알콜, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐아민, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 폴리디메틸실록산, 폴리이미드, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌, 폴리술폰, 폴리카르보네이트, 폴리메틸펜텐, 폴리프로필렌, 폴리비닐리딘 플루오라이드, 폴리실리콘, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리술폰, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌, 폴리아크릴로니트릴, 폴리부타디엔, 폴리(부틸렌 테레프탈레이트), 폴리(에테르 술폰), 폴리(에테르 에테르 케톤), 폴리(에틸렌 글리콜), 스티렌-아크릴로니트릴 수지, 폴리(트리메틸렌 테레프탈레이트), 폴리비닐 부티랄, 폴리비닐리덴디플루오라이드, 폴리(비닐 피롤리돈)의 유도체 및 공중합체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 생체물질은 생분해성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 생분해성 물질, 예를 들어 생분해성 중합체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된, 용어 "생분해성"은 생리학적 상태 하에 파괴 생성물로 분해될 수 있는 물질을 기재한다. 이러한 생리학적 상태는 예를 들어, 가수분해 (가수분해성 절단을 통한 분해), 효소적 촉매작용 (효소적 분해), 및 기계적 상호작용을 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "생분해성"은 또한 용어 "생체재흡수성"을 포괄하며, 이는 생리학적 조건 하에 분해되어 숙주-유기체로의 생체흡수를 경험하는 생성물, 즉 숙주 유기체의 생화학적 시스템의 대사물이 되는 생성물로 파괴되는 물질을 기재한다.
본원에 사용된 용어 "생분해성 중합체"는 그의 적어도 일부가 생리학적 상태 하에 분해되는 중합체를 지칭한다. 따라서, 중합체는 생리학적 상태 하에 부분적으로 분해되거나 또는 완전하게 분해될 수 있다. 예시적인 생분해성 중합체는 실크; 실크 피브로인 글루코사미노글리칸; 피브린; 콜라겐; 가교 콜라겐; 폴리락트산; 골; 폴리-에틸렌글리콜 (PEG); C2 내지 C4 폴리알킬렌 글리콜 (예를 들어, 프로필렌 글리콜); 폴리히드록시 에틸 메타크릴레이트; 폴리비닐 알콜; 폴리아크릴아미드; 폴리 (N-비닐 피롤리돈); 폴리 글리콜산 (PGA); 폴리 락트산-코-글리콜산 (PLGA); 폴리 e-카르포락톤 (PCL); 폴리에틸렌 옥시드; 폴리 프로필렌 푸마레이트 (PPF); 폴리 아크릴산 (PAA); 가수분해된 폴리아크릴로니트릴; 폴리메타크릴산; 폴리에틸렌 아민; 폴리무수물; 폴리히드록시부티르산; 폴리오르토에스테르; 폴리실록산; 폴리카프로락톤; 폴리(락트산); 폴리(글리콜산); 알긴산; 알긴산의 에스테르; 펙틴산; 펙틴산의 에스테르; 카르복시 메틸 셀룰로스; 히알루론산; 히알루론산의 에스테르; 헤파린; 헤파린 술페이트; 키토산; 카르복시메틸 키토산; 키틴; 풀루란; 겔란; 크산탄; 콜라겐; 카르복시메틸 전분; 카르복시메틸 덱스트란; 콘드로이틴 술페이트; 양이온성 구아; 양이온성 전분 뿐만 아니라 그의 염 및 에스테르를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 생체물질은 단백질-기재 생체물질, 예를 들어 비제한적으로 실크, 실크 피브로인, 콜라겐, 젤라틴, 피브린 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 실크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 누에 실크를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 실크 피브로인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 생체물질은 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함할 수 있다.
따라서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)를 포함하거나 또는 이로 기능화된 실크-기재 매트릭스 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)를 포함하는 조성물이 또한 본원에 제공된다. 1종 이상의 면역 세포-조절제는 실크 피브로인-기재 매트릭스에 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제와의 접촉시에 면역 세포의 활성화 상태를 선택적으로 제어하거나 또는 변경시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다.
실크 피브로인-기재 매트릭스. 실크 피브로인은 예를 들어 그의 다목적 처리, 예를 들어 모든-수성 처리 (문헌 [Sofia et al., 54 J. Biomed. Mater. Res. 139 (2001); Perry et al., 20 Adv. Mater. 3070-72 (2008)]), 상대적으로 용이한 기능화 (문헌 [Murphy et al., 29 Biomat. 2829-38 (2008)]), 및 생체적합성 (문헌 [Santin et al., 46 J. Biomed. Mater. Res. 382-9 (1999)])으로 인해 본원에 기재된 실시양태를 위해 사용되는 특히 흥미로운 생체중합체 후보이다. 예를 들어, 실크는 인간 이식물에서 조직 공학 스캐폴드로서 미국 식품의약품국에 의해 허가되었다. 문헌 [Altman et al., 24 Biomaterials: 401 (2003)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "실크 피브로인"은 누에 피브로인 및 곤충 또는 거미 실크 단백질을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Lucas et al., 13 Adv. Protein Chem. 107 (1958)]을 참조한다. 임의의 유형의 실크 피브로인이 본원에 기재된 상이한 실시양태에 사용될 수 있다. 누에, 예컨대 봄빅스 모리(Bombyx mori)에 의해 생성된 실크 피브로인이 가장 흔하고, 토양-친화적인 재생가능한 자원을 대표한다. 예를 들어, 실크 필름에 사용되는 실크 피브로인은 비. 모리의 고치로부터 세리신을 추출함으로써 얻을 수 있다. 유기 누에 고치는 또한 상업적으로 입수가능하다. 그러나, 거미 실크 (예를 들어, 네필라 클라비페스(Nephila clavipes)로부터 수득한 실크), 트랜스제닉 실크, 유전 공학 실크, 예컨대 박테리아, 효모, 포유동물 세포, 트랜스제닉 동물 또는 트랜스제닉 식물로부터의 실크 (예를 들어, 예를 들어, WO 97/08315; 미국 특허 번호 5,245,012 참조)를 포함하는 많은 상이한 실크, 및 사용될 수 있는 그의 변이체가 존재한다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 다른 공급원, 예컨대 거미, 다른 누에, 벌 및 그의 생체공학 변이체로부터 유래될 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 실크는 누에, 거미로부터, 또는 실크를 생산하도록 조작된 재조합 유기체 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia Coli), 담배 및 감자 식물 또는 염소 (그의 유액에 분비된 실크 단백질))로부터 수득할 수 있다. 누에 실크의 비제한적 예는 거미, 봄빅스 모리, 안테라에아 밀리타(Antheraea mylytta), 에이. 아사멘티스(A. assamentis), 네필라 클라비페스 및 사미아 신티아(Samia cyntia)로부터 수득한 실크를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생체물질은 거미 실크를 포함할 수 있다. 거미 실크의 비제한적 예는 네필라 클라비페스 및 아라네우스 디아데마투스(Araneus diadematus)로부터 수득한 실크를 포함할 수 있다. 거미 실크의 주요 성분은 스피드로인이다. 단일 거미가 다수의 다양한 거미 실크를 생산할 수 있으며, 이들 중 임의의 것이 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 가장 강한 유형의 거미 실크는 플라스크상 분비 기관에 의해 생산된 드래그라인 실크이다. 이는 2종의 주요 단백질로 구성된다: 주요 플라스크상 스피드로인 1 및 2 (MaSp1 및 MaSp2). 엔. 클라비페스로부터의 MaSp1은 주로 아미노산 글리신, 알라닌, 글루탐산, 프롤린 및 아르기닌으로 구성된다. 누에 실크와 같이, β-시트 결정질 도메인은 높은 인장 강도에 기여하지만, MaSp1 및 MaSp2의 도메인은 알라닌 또는 글리신-알라닌의 반복부를 함유한다. 아미노산 조성 및 서열의 차이는 누에 실크에 비해 우수한 기계적 특성으로 이어진다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 스피드로인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 드레그라인 실크를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 주요 플라스크상 스피드로인 1을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체물질은 주요 플라스크상 스피드로인 2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 생체물질은 실크 피브로인을 포함할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 실크 피브로인은 상이한 용도 및/또는 원하는 기계적 또는 화학적 특성 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스에서 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)의 구배의 형성을 촉진하기 위함)을 위해 변형될 수 있다. 당업자는 예를 들어 실크 피브로인의 측기, 실크 피브로인의 원하는 반응성 및/또는 실크 피브로인 상의 원하는 전하 밀도에 따라 실크 피브로인을 변형시키는 적절한 방법을 선택할 수 있다. 한 실시양태에서, 실크 피브로인의 변형은 아미노산 측쇄 화학, 예컨대 공유 결합을 통한 화학적 변형, 또는 전하-전하 상호작용을 통한 변형을 이용할 수 있다. 예시적인 화학적 변형 방법은 카르보디이미드 커플링 반응 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 US 2007/0212730 참조), 디아조늄 커플링 반응 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 US 2009/0232963 참조), 아비딘-비오틴 상호작용 (예를 들어, 국제 출원 번호 WO 2011/011347 참조) 및 PEG 중합체의 화학적으로 활성인 또는 활성화된 유도체에 의한 PEG화 (예를 들어, 국제 출원 번호 WO 2010/057142 참조)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 실크 피브로인은 또한 실크 단백질의 기능을 변경시키기 위해 유전자 변형을 통해 변형될 수 있다 (예를 들어, 국제 출원 번호 WO 2011/006133 참조). 예를 들어, 실크 피브로인은 유전적으로 변형될 수 있으며, 이는 실크의 추가 변형, 예컨대 섬유성 단백질 도메인 및 무기질화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드의 봉입체를 제공할 수 있고, 이는 유기-무기 복합체를 형성시키는데 사용될 수 있다. WO 2006/076711을 참조한다. 또한, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 예를 들어 매트릭스의 가요성에 영향을 미치는 글리세롤과 같은 화학물질과 배합될 수 있다. 예를 들어, WO 2010/042798 (Modified Silk films Containing Glycerol)를 참조한다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 활성제 (예를 들어, 면역 세포-조절제 또는 대식세포-편향제)와 접합되도록 유전적으로 조작될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "실크 피브로인-기재 매트릭스"는 일반적으로 실크 피브로인을 포함하는 매트릭스를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 어구 "실크 피브로인-기재 매트릭스"는 실크 피브로인이 전체 조성물의 적어도 약 30% (전체 조성물의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 그 초과 포함)를 구성하는 매트릭스를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 실질적으로 실크 피브로인으로부터 형성될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 실질적으로 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)를 포함하는 실크 피브로인으로부터 형성될 수 있다.
본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트릭스는 임의의 형태, 예를 들어 구형, 다각형, 타원형, 원통형, 관형, 또는 임의의 업계-인지된 형태에 적합할 수 있다. 실크 피브로인-기재 매트릭스의 크기는 적용의 유형, 이식을 위한 표적 부위의 크기 및/또는 실크 피브로인-기재 매트릭스의 원하는 특성, 예를 들어 분해 프로파일을 포함하나 이에 제한되지는 않은 다수의 요인에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 표적 부위에 소정의 크기의 공동 또는 결함 (예를 들어, 조직 손상)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 본원에 기재된 이식가능한 구조물의 코팅을 형성하기에 충분한 표면적을 가질 수 있다.
실크 피브로인-기재 매트릭스는 수성-기재 또는 유기 용매-기재 실크 피브로인 용액으로부터 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유기 용매-기재 실크 피브로인 용액으로부터 생산된 실크 피브로인-기재 매트릭스는 수성-기재 실크 피브로인-기재 매트릭스보다 분해에 대한 저항성이 더 클 수 있다. 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트릭스의 제조를 위해 사용된 수성- 또는 유기 용매-기재 실크 피브로인 용액은 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 실크 피브로인-기재 매트릭스를 제조하는데 사용된 용액 중 실크 피브로인의 농도는 필요에 따라 맞출 수 있다. 오직 예시적 방식으로, 조직 복구 또는 증진을 위해, 용액 중 실크 피브로인의 농도를 특정한 분해 프로파일에 맞출 수 있으며, 예를 들어 보다 높은 농도의 실크 피브로인 용액의 분해에 대한 보다 높은 저항성이 원하는 조직 복구 또는 증진인 경우에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트릭스의 제조를 위한 실크 피브로인 용액은 약 0.1% (w/v) 내지 약 30% (w/v) (포함)에서 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 약 0.5% (w/v) 내지 약 10% (w/v)에서 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 약 1% (w/v) 내지 약 6% (w/v)에서 달라질 수 있다. 실크 피브로인 용액을 제조하기에 적합한 방법이 예를 들어 미국 특허 번호 US 7635755; 및 국제 출원 번호 WO/2005/012606; 및 WO/2008/127401에 개시되어 있다. 마이크로-여과 단계가 본원에 이용될 수 있다. 예를 들어, 제조된 실크 피브로인 용액은 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트릭스로의 추가의 처리 전에 예를 들어 원심분리 및/또는 시린지 기재 마이크로-여과에 의해 추가로 처리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 실크 피브로인은 또한 본원에 기재된 다른 생체적합성 및/또는 생분해성 중합체와 혼합되어, 실크 피브로인을 포함하는 혼합된 중합체 매트릭스를 형성할 수 있다. 1종 이상의 생체적합성 및/또는 생분해성 중합체 (예를 들어, 2종 이상의 생체적합성 중합체)를 실크 피브로인 용액에 첨가할 수 있다. 본원에 사용될 수 있는 생체적합성 중합체는 폴리에틸렌 옥시드 (PEO), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 콜라겐, 피브로넥틴, 케라틴, 폴리아스파르트산, 폴리리신, 알기네이트, 키토산, 키틴, 히알루론산, 펙틴, 폴리카프로락톤, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리히드록시알카노에이트, 덱스트란, 폴리무수물, 중합체, PLA-PGA, 폴리무수물, 폴리오르토에스테르, 폴리카프로락톤, 폴리푸마레이트, 콜라겐, 키토산, 알기네이트, 히알루론산 및 다른 생체적합성 및/또는 생분해성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 그의 내용이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 번호 WO 04/062697; WO 05/012606을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트릭스로의 추가의 처리 전에 실크 피브로인 용액에 첨가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 실크 피브로인 내에 균질하게 또는 불균질하게 분산될 수 있거나, 또는 예를 들어 미국 특허 출원 번호 US 2007/0212730에 기재된 카르보디이미드-매개 변형을 이용하여 구배 방식으로 분산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 먼저 형성된 후에 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)와 접촉하여 (예를 들어, 이에 침지됨) 매트릭스의 개방 또는 노출된 표면이 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)로 코팅될 수 있도록 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트릭스는, 예를 들어 천연 조직의 구조적 형태을 모방하기 위해, 실크 피브로인-기재 매트릭스의 분해 속도를 조절하기 위해 및/또는 그 안에 포매된 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)의 방출 프로파일을 조절하기 위해, 다공성 구조를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "다공성" 및 "기공률"은 일반적으로 그의 부피에 걸쳐 공극 또는 빈 공간 (이는 예를 들어 개구부, 틈새 공간 또는 다른 채널일 수 있음)의 연결된 네트워크를 갖는 구조를 기재하기 위해 사용된다. 용어 "기공률"은 물질 중 빈 공간의 척도이며, 0 내지 100%의 백분율 (또는 0 내지 1)로서 총 부피에 대한 빈 공간 부피의 분율이다.
일부 실시양태에서, 피브로인-기재 매트릭스는 원하는 특성에 따라 임의의 기공률을 갖도록 설정될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 피브로인-기재 매트릭스는 적어도 약 1%, 적어도 약 3%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 그 초과의 기공률을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 기공률은 약 70% 내지 약 99%, 또는 약 80% 내지 약 98%의 범위일 수 있다. 기공 크기 및 전체 기공률 값은 당업자에게 공지된 통상의 방법 및 모델을 이용하여 정량화될 수 있다. 예를 들어, 기공 크기 및 기공률은 표준화된 기술, 예컨대 수은 기공측정 및 질소 흡착에 의해 측정될 수 있다. 당업자는 다양한 목적을 위해 실크 피브로인-기재 매트릭스의 최적 기공률을 결정할 수 있다. 예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스의 기공률 및/또는 기공 크기는 실크 피브로인-기재 매트릭스의 원하는 분해 속도 또는 부피 유지율, 실크 피브로인-기재 매트릭스로부터의 활성제의 방출 프로파일 및/또는 복구 또는 확대시키고자 하는 조직의 구조적 형태에 기초하여 최적화될 수 있다.
기공은 임의의 형태, 예를 들어 원형, 타원형 또는 다각형을 갖기에 적합할 수 있다. 다공성 실크 피브로인-기재 매트릭스는 나노미터 내지 마이크로미터 범위의 기공 크기를 갖기에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 다공성 실크 피브로인-기재 매트릭스는 약 1 nm 내지 약 1000 μm, 약 50 nm 내지 약 900 μm, 약 100 nm 내지 약 800 μm, 약 500 nm 내지 약 700 μm, 약 1 μm 내지 약 600 μm, 약 10 μm 내지 약 500 μm, 약 50 μm 내지 약 400 μm, 또는 약 75 μm 내지 약 250 μm의 기공 크기를 갖기에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 1000 μm 초과의 기공 크기를 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 다공성일 필요는 없다. 이러한 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스의 기공 크기는 10 nm 미만이거나 또는 검출불가능할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "기공 크기"는 기공의 치수를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 기공 크기는 기공의 최장 치수, 예를 들어 원형 단면을 갖는 기공의 직경, 또는 비-원형 단면을 갖는 기공을 가로질러 구성될 수 있는 최장 단면 현의 길이를 지칭할 수 있다. 다른 실시양태에서, 기공 크기는 기공의 최단 치수를 지칭할 수 있다.
실크 피브로인-기재 매트릭스 내부에 다공성 구조를 생성하는 방법, 예를 들어 동결-건조 방법, 포로겐-침출 방법 (예를 들어, 염-침출) 및 기체 발포 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 그의 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 US 7842780; 및 미국 특허 출원 번호 US 2010/0279112; 및 US 2010/0279112에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 다공성 실크 피브로인-기재 동결-건조 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, US 7842780, 및 US 2010/0279112를 참조한다. 이러한 실시양태에서, 비-점착성 용기에 넣은 실크 피브로인 용액은 영하의 온도, 예를 들어 약 -80℃ 내지 약 -20℃에서 적어도 약 12시간, 적어도 약 24시간 또는 그 초과 동안 동결시킨 후에 동결건조시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 실크 피브로인 용액을 한 방향으로부터 동결시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 용액은 염을 함유하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 알콜, 예컨대 15%-25%의 메탄올 또는 프로판올을 실크 피브로인 용액에 첨가할 수 있다.
특정 실시양태에서, 다공성 실크 피브로인-기재 매트릭스는 실크 피브로인 용액을 약 -1℃ 내지 약 -20℃ 또는 약 -5℃ 내지 -10℃ 범위의 온도에서 적어도 약 2일, 적어도 약 3일 또는 그 초과 동안 동결시킨 후에 적어도 약 2일, 적어도 약 3일 또는 그 초과 동안 동결건조시킴으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, WO 2012/145594를 참조한다. 동결 온도 및/또는 지속기간, 및/또는 동결건조 지속기간은 다양한 다공성 구조 및/또는 기계적 특성의 실크 피브로인-기재 매트릭스가 생성되도록 조정될 수 있다.
실크 피브로인을 포함하는 생체물질 조성물의 생분해성은 실크 피브로인의 구조 및 분자량을 변경함으로써 제어될 수 있으며, 여기서 이론에 제한되지 않고, 대부분의 단백질분해 효소는 저분자량 및 비-치밀 구조를 갖는 실크 피브로인을 분해하는데 보다 우수하다 (22). 실크 피브로인 조성물은 결정화도 (β-시트의 양의 증가 또는 감소에 의함), 기공 크기, 기공률, 분자량 분포를 변화시키고/거나 실크의 물리적 기하학의 제어함으로써 변경될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트릭스는 하나 이상의 실크 피브로인 특성에 영향을 미치게 될 후-처리에 적용될 수 있다. 예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스의 후-처리는 실크 피브로인 특성, 예컨대 β-시트 함량, 용해도, 활성제 로딩 용량, 분해 시간, 약물 투과성, 또는 그의 임의의 조합에 영향을 미칠 수 있다. 실크 후-처리 옵션은 제어된 느린 건조 (문헌 [Lu et al., 10 Biomacromolecules 1032 (2009)]), 물 어닐링 (문헌 [Jin et al., Water-Stable Silk Films with Reduced β-Sheet Content, 15 Adv. Funct. Mats. 1241 (2005)]), 스트레칭 (문헌 [Demura & Asakura, Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor, 33 Biotech & Bioengin. 598 (1989)]), 압착, 및 에탄올 (문헌 [Hofmann et al., 2006]), 에탄올 (문헌 [Miyairi et al., 1978]), 글루타르알데히드 (문헌 [Acharya et al., 2008]) 및 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) (문헌 [Bayraktar et al., 2005])를 비롯한 용매 함침을 포함한다.
일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스의 후-처리, 예를 들어 물-어닐링 또는 용매 함침은 실크 피브로인-기재 매트릭스로부터의 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)의 방출을 제어하는 것을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스의 후-처리, 예를 들어 물-어닐링 또는 용매 함침은 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용된 실크 피브로인-기재 매트릭스의 분해 또는 용해도 특성을 조절하는 것을 허용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스의 후-처리, 예를 들어 물-어닐링 또는 용매 함침은 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용된 실크 피브로인-기재 매트릭스의 분해 특성을 조절하는 것을 허용할 수 있으며, 여기서 분해는, 예를 들어 염증 반응에 의해 유도된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트릭스는, 예를 들어 실크 피브로인-기재 매트릭스의 분해 특성을 조절하고/거나 실크 피브로인-기재 매트릭스로부터 방출되는 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)의 속도를 조절하기 위해, 코팅, 예를 들어 하나 이상의 층의 본원에 기재된 생체적합성 및/또는 생분해성 중합체로 코팅된 코팅을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체적합성 및/또는 생분해성 중합체는 또한 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트릭스는 변형될 수 있으며, 예를 들어 세포 부착 분자 또는 펩티드, 예를 들어 비제한적으로 피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌, 콜라겐, RGD 펩티드, 임의의 업계-인지된 세포외 매트릭스 분자, 및 그의 임의의 조합으로 코팅될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실크 피브로인-기재 매트릭스는 멸균될 수 있다. 생의학 장치를 위한 멸균 방법 (비제한적으로, 감마선 또는 자외선 방사, 오토클레이빙 (예를 들어, 열/스팀); 알콜 멸균 (예를 들어, 에탄올 및 메탄올); 및 기체 멸균 (예를 들어, 에틸렌 옥시드 멸균) 포함)은 당업계에 널리 공지되어 있다.
또한, 본원에 기재된 실크 피브린 매트릭스는 실크 피브로인을 기능화시키기 위해 개발된 다수의 기술 (예를 들어, 활성제, 예컨대 염료 및 센서)의 이점을 취할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,287,340 (Bioengineered anterior cruciate ligament); WO 2004/000915 (Silk Biomaterials & Methods of Use Thereof); WO 2004/001103 (Silk Biomaterials & Methods of Use Thereof); WO 2004/062697 (Silk Fibroin Materials & Use Thereof); WO 2005/000483 (Method for Forming inorganic Coatings); WO 2005/012606 (Concentrated Aqueous Silk Fibroin Solution & Use Thereof); WO 2011/005381 (Vortex-Induced Silk fibroin Gelation for Encapsulation & Delivery); WO 2005/123114 (Silk-Based Drug Delivery System); WO 2006/076711 (Fibrous Protein Fusions & Uses Thereof in the Formation of Advanced Organic/Inorganic Composite Materials); 미국 출원 공개 번호 2007/0212730 (Covalently immobilized protein gradients in three-dimensional porous scaffolds); WO 2006/042287 (Method for Producing Biomaterial Scaffolds); WO 2007/016524 (Method for Stepwise Deposition of Silk Fibroin Coatings); WO 2008/085904 (Biodegradable Electronic Devices); WO 2008/118133 (Silk Microspheres for Encapsulation & Controlled Release); WO 2008/108838 (Microfluidic Devices & Methods for Fabricating Same); WO 2008/127404 (Nanopatterned Biopolymer Device & Method of Manufacturing Same); WO 2008/118211 (Biopolymer Photonic Crystals & Method of Manufacturing Same); WO 2008/127402 (Biopolymer Sensor & Method of Manufacturing Same); WO 2008/127403 (Biopolymer Optofluidic Device & Method of Manufacturing the Same); WO 2008/127401 (Biopolymer Optical Wave Guide & Method of Manufacturing Same); WO 2008/140562 (Biopolymer Sensor & Method of Manufacturing Same); WO 2008/127405 (Microfluidic Device with Cylindrical Microchannel & Method for Fabricating Same); WO 2008/106485 (Tissue-Engineered Silk Organs); WO 2008/140562 (Electroactive Biopolymer Optical & Electro-Optical Devices & Method of Manufacturing Same); WO 2008/150861 (Method for Silk Fibroin Gelation Using Sonication); WO 2007/103442 (Biocompatible Scaffolds & Adipose-Derived Stem Cells); WO 2009/155397 (Edible Holographic Silk Products); WO 2009/100280 (3-Dimensional Silk Hydroxyapatite Compositions); WO 2009/061823 (Fabrication of Silk Fibroin Photonic Structures by Nanocontact Imprinting); WO 2009/126689 (System & Method for Making Biomaterial Structures)을 참조한다.
대안적 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 광열 요소를 형성하는 플라스몬 나노입자를 포함할 수 있다. 이러한 접근법은 실크 피브로인의 보다 우수한 도핑 특성의 이점을 취한다. 예를 들어, 그의 내용이 본원에 참조로 포함된 WO/2012/031282 ("Plasmonic nanoparticle-doped silk materials")르 참조한다. 열 요법은 다양한 작용제의 전달을 돕는 것으로 밝혀졌으며, 문헌 [Park et al., Effect of Heat on Skin Permeability, 359 Intl. J. Pharm. 94 (2008)]을 참조한다. 한 실시양태에서, 제한된 지역에 대한 단기 열 방출을 이용하여, 주위 조직에 대한 유해 효과는 최소로 하면서 투과성은 최대화할 수 있다. 따라서, 플라스몬 입자-도핑된 실크 피브로인-기재 매트릭스는 광을 집중 조사하여 단지 실크 피브로인-기재 매트릭스를 통해 열을 국소적으로 생성함으로써 열 요법에 특이성을 부가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 광열 작용제, 예컨대 금 나노입자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 실크 피브로인-기재 매트릭스는 친양쪽성 펩티드를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 실크 피브로인-기재 매트릭스는 친양쪽성 펩티드를 배제할 수 있다. "친양쪽성 펩티드"는 친수성 및 소수성 특성을 둘 다 보유한다. 일반적으로, 친양쪽성 분자는, 친수성 부분은 수성 환경에 노출시킨 채로 소수성 부분을 지질 막에 삽입하여 생물학적 막과 상호작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 친양쪽성 펩티드는 RGD 모티프를 포함할 수 있다. 친양쪽성 펩티드의 예는 하기 아미노산 서열을 갖는 23RGD 펩티드이다: HOOC-Gly-ArgGly-Asp-Ile-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-SerArg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Arg-NH2. 친양쪽성 펩티드의 다른 예는 그의 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 번호 US 2011/0008406에 개시된 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 생체물질은 비. 모리 누에로부터의 실크를 포함할 수 있다. 비. 모리 누에로부터의 실크섬유는 2종 유형의 단백질성 중합체, 피브로인 및 세리신으로 구성된다. 피브로인은 내부-코어 단백질 필라멘트이며, 전체 분자량의 최대 90 %를 차치하는 소수성 아미노산으로 이루어진다. 이는 고도로 반복적인 1차 서열: 글리신-알라닌-글리신-알라닌-글리신-세린 (GAGAGS)을 특징으로 한다. 이러한 반복부는 2차 구조, 역평뱅 β-시트 구조에서 유의한 균질성으로 이어진다. 이러한 구조가 고유의 실크 탄성 및 인장 강도를 담당한다. 이들 β-시트는 고도로 결정질이고, 강한 분자내 및 분자간 수소 결합 뿐만 아니라 적층된 β-시트 사이의 반 데르 발스 상호작용을 통해 단백질을 본질적으로 가교시킨다 (10). 이러한 특정한 구조는 물질 인상적 기계적 특성을 부여한다. 예를 들어, 실크 피브로인은 대등한 인장 강도의 섬유보다 큰 탄성을 나타낸다 (예를 들어, 케블라(Kevlar)™ 49보다 6-7배 더 높음) (11). 일부 실시양태에서, 생체물질 조성물은 피브로인을 포함할 수 있다.
비. 모리 실크, 세리신에서 발견된 다른 단백질은 실크섬유 주위에 소수성 코트를 형성하는 글루-유사 단백질이다. 이는 실크 단백질의 25-30%를 구성하고, 2개의 피브로인 실과 함께 결합한다 (12-14). 세리신 단백질은 코딩으로서 가교되거나 또는 사용되어 그의 항박테리아 특성 및 UV 및 산화성 분해에 대한 그의 저항성을 증진시킬 수 있다 (15). 세리신은 상처 치료제, 생체접착제, 및 주름방지 및 노화방지 보습제와 같이 미용 및 제약 산업에서 다양한 용도를 갖는다 (16). 일부 실시양태에서, 생체물질 조성물은 세리신을 포함할 수 있다.
세리신은 일부 대상체에서 알레르기 반응을 일으킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 생체물질 또는 조성물은 세리신을 포함하지 않으며, 예를 들어 세리신은 생체물질 조성물에 함유된 실크 단백질의 약 1% 이하, 예를 들어, 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.1% 이하, 또는 약 0.01% 이하의 양이다. 일부 실시양태에서, 생체물질 또는 조성물은 피브로인을 포함할 수 있으나, 세리신을 포함하지 않으며, 예를 들어 세리신은 생체물질 또는 조성물에 함유된 실크 단백질의 약 1% 이하, 예를 들어 약 1% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.1% 이하, 또는 약 0.01% 이하의 양이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 생체물질 또는 조성물은 임의의 검출가능한 수준의 세리긴을 포함한다. 세리신을 제거하여 항원 효과가 없는 실크 피브로인을 수득하는 정제 프로토콜은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비제한적 예의 방식으로, 세리신은 봄빅스 고치를 작은 조각으로 절단하여 약 0.02 M 탄산나트륨의 수용액에 30분 동안 비등시킴으로써 제저될 수 있다. 대안적으로, 세리신은, 예를 들어 실시예 1에 기재된 바와 같이 약 9.3 M LiBr의 수용액에서 고치를 비등시킴으로써 제거될 수 있다.
일부 실시양태에서, 생체물질은 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함할 수 있다. 실크 피브로인-기재 매트릭스는 필름, 섬유, 입자의 수집물, 매트, 튜브, 겔, 직물, 메쉬, 또는 그의 임의의 조합의 형태일 수 있다. 실크 피브로인-기재 매트릭스는 하기 프로토콜 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 따라 생산될 수 있다. 실크로부터 세리신을 제거한 후에, 피브로인 용액이 생산된다. 실크 피브로인 용액을 특정 생의학 용도, 예컨대 상처 드레싱 및 조직 공학용 스캐폴드에 적합한 다양한 형태로 처리하기 위한 몇몇 프로토콜이 개발되었다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함된 미국 특허; 6,175,053 및 미국 특허 공개 2011/0111031; 2003/0165548; 2011/0171239 참조). 피브로인 용액은 전기방사되어 나중에 실로 감겨질 수 있는 섬유를 생산할 수 있다 (본원에 참조로 포함된 문헌 [Altman et al. 2003, Biomaterials, Vols. Volume 24, Issue 3, pp. 401-416] 참조). 그의 가장 단순한 형태로, 실크 피브로인이 필름으로 재생되거나 또는 다른 물질 상에 코팅될 수 있다. 또한, 이는 다른 물질, 예컨대 젤라틴과 조합하여 사용되어 골 재생을 위한 실크 다공성 스캐폴드의 제조를 위해 히드로겔, 예를 들어 히드록시아파타이트를 생성할 수 있다 (본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 2011/0046686 참조). 실크 피브로인은 또한 아미노산 측쇄를 통해 화학적으로 변형되어 표면 특성을 변경시키거나 또는 RGD (아르기닌-글리신-아스파르트산) 서열 또는 세포 부작 및 증식을 증진시키기 위한 다른 세포 성장 인자를 고정화시킬 수 있다 (본원에 참조로 포함된 문헌 [Kearns et al. Silk-based Biomaterials for Tissue Engineering. Eds. N Ashammakhi, R Reis, & F Chiellini s.l.: Tissue Engineering, 2008. Vol. 4] 참조). 실크 피브로인은 수성으로 처리되고, 크기, 2차 구조 및 제타 잠재성 제어될 수 있다 (본원에 참조로 포함된 문헌 [Lammel et al. Biomaterials, 2010 Jun, Vol. 31(16), pp. 4583-91] 참조). 수성 염 (인산칼륨) 분리 과정의 이용은 실크 피브로인 농도에 따라 제어되고 재생가능한 크기를 갖는 입자의 생산을 가능하게 한다. 또한, 2차 구조는 오토클레이브 또는 에탄올 및 메탄올 처리에 의한 멸균시에 안정하게 유지된다. 일부 실시양태에서, 오직 예시적 방식으로, 수성 처리가 다음과 같이 수행될 수 있다.
세리신의 제거 후에, 추출된 실크 피브로인을 증류수에서 20분마다 3회 완전하게 세정하여 탄산나트륨을 제거할 수 있다. 공기 건조 적어도 12시간 후에, 추출된 실크 피브로인을 ~9.3 M LiBr 용액에 ~60℃에서 최소 약 4시간 동안 용해시킬 수 있다. 완전히 용해되면, 용액을 3일 동안 슬라이드-a-용해기 투석 카세트 (MWCO 3500, 피어스(Pierce))를 이용하여 증류수에 대해 투석 (제1일에 3회, 제2일에 2회 및 제3일에 1회)하여 염을 제거할 수 있다. 이어서, 용액을 (5-10)℃에서 ~20분 동안 10,000 rpm으로 2회 원심분리하여 실크 응집체 뿐만 아니라 본래 고치로부터의 잔해물을 제거할 수 있다. 실크 피브로인 수용액의 최종 농도는 예를 들어 약 1 ml의 용액을 칭량하고, 건조시키고, ~60℃에서 건조시킨 후에 그의 잔류 고체에 대해 비교하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 입자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 나노입자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 마이크로입자를 포함할 수 있다. 입자는 예를 들어 상 분리를 유도하는 인산칼륨 용액을 사용한 수성 염 분리 과정을 이용함으로써 제조될 수 있다 (27). 일반적으로, 실크 피브로인 입자의 크기는 사용된 실크 피브로인 수용액의 농도와 상관될 수 있다. 사용된 실크 피브로인 용액의 농도는 생성된 입자의 크기를 결정할 수 있다; 예를 들어 증류수에 희석된 약 1 %의 실크 피브로인 원액은 ~2 μm 크기의-입자를 생성할 수 있고; 약 0.5 % 원액은 ~1 μm 입자를 생성할 수 있고, 약 0.1% 원액은 500 nm보다 작은 입자를 생성할 수 있다. 간략하게, ~1.5 M K2HPO4 (pH 8)의 용액을 제조할 수 있다. 적절한 농도를 갖는 실크 피브로인 용액은 원액을 증류수로 희석하여 제조할 수 있다. 이어서, 실크 피브로인 용액을 피펫을 사용하여 빠르게 예정된 부피비, 예를 들어 약 1:5의 부피 비로 인산칼륨 용액에 첨가할 수 있다. 생성된 입자는 약 2시간 내지 밤새 ~4℃에 저장할 수 있다. 이어서, 용액을 예를 들어, 4회: 증류수 중에서 3회 및 70 % 에탄올 중에서 1회 약 15분 동안 2500xg에서 원심분리할 수 있다. 각각의 원심분리 후에, 상청액을 제거할 수 있으며, 실크 입자를 적절한 용액에 재분산시킬 수 있다. 에탄올 중에서의 마지막 원심분리 후에, 상청액을 제거할 수 있으며, 입자 펠릿을 예를 들어 약 70℃의 온도에서 건조시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 필름을 포함할 수 있다. 예를 들어, 필름은 증류수 중에 약 2 % w/v 실크 피브로인을 갖는 실크 피브로인 용액을 사용하여 제조될 수 있다. 용액을 증발시키고 메탄올로 재구성하여 β-시트 형성에 의해 실크 단백질을 가교시킬 수 있다. 잉여량의 메탄올을 제거한 후에, 실크 필름은 UV 광에 노출시키고 건조시켜 멸균될 수 있다.
일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 실크 피브로인-기재 메쉬 및/또는 실크 피브로인-기재 직물을 포함할 수 있다. 실크 피브로인-기재 메쉬 및 실크 피브로인-기재 직물을 생산하는 방법, 예를 들어 실크 피브로인-기재 실을 미리 결정된 패턴으로 짜는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 실크 피브로인-기재 실은 실크섬유 (예를 들어, 원료 실크섬유 또는, 예를 들어 전기방사에 의해, 실크 피브로인 용액으로부터 형성된 실크섬유)로부터 생산될 수 있다. 한 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 실은 실크 실 또는 섬유 및 비-실크 실 또는 섬유, 예를 들어 인공 실 또는 섬유, 예컨대 비제한적으로 초고분자량 폴리에틸렌 실 (예를 들어, 다이니마(DYNEEMA)®)의 조합으로부터 생산될 수 있다. 실크 실 또는 섬유와 조합된 비-실크 실 또는 섬유의 사용은 예를 들어 실크 피브로인-기재 실의 기계적 특성을 증진시킬 수 있으며, 메쉬를 생성한다. 실크 피브로인-기재 메쉬 및/또는 실크 피브로인-기재 직물은 예를 들어 씨실-편물 및/또는 날실-편물일 수 있다. 한 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 메쉬 및 직물 뿐만 아니라 그의 제조 방법 (예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 출원 번호 US 2012/0304702 및 US 2012/0221105에 기재됨)이 본원에 기재된 조성물 및 방법에 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 스폰지 또는 다공성 스폰지를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 상처 드레싱을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스 골 조직 스캐폴드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 히드로겔을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 부직 매트를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 연골 조직 스캐폴드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 섬유를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 인대 조직 공학, 건 조직 공학, 간 조직 공학, 결합 조직 공학, 내피 조직 공학, 혈관 공학, 및/또는 항혈전형성에 사용하기에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 하나 이상의 실크 피브로인 히드로겔, 실크 피브로인 이식물, 실크 피브로인 직물 또는 섬유, 또는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 공개 2011/0189773; 2011/0052695; 2011/0009960; 2010/0256756; 및 2010/0209405에 기재된 다른 조직 공학 조성물을 포함할 수 있다.
면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향 제 )
본원에 기재된 조성물 및 방법은 1종 이상의 면역 세포-조절제 생체물질에 관한 것이다. 면역 세포-조절제는 1종 이상의 면역 세포 유형, 예를 들어 비제한적으로 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 그의 임의의 조합의 활성화 상태를 변경할 수 있는 임의의 작용제일 수 있다.
용어 "작용제"는 일반적으로 정상적으로 존재하지 않거나 또는 세포, 조직 또는 대상체에게 투여되는 수준에서 존재하지 않는 임의의 엔티티를 지칭한다. 면역 세포-조절제의 예는 단백질 (예를 들어, 폴리펩티드), 펩티드, 항원, 면역원, 항체 또는 그의 부분 (예를 들어, 항체-유사 분자), 효소, 핵산 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, siRNA, shRNA), 압타머, 박테리아, 바이러스, 소분자, 기능적 단편, 및 그의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
면역 세포-조절제(들) (예를 들어, 대식세포-편향제(들))의 선택은 예를 들어 표적화될 면역 세포의 유형, 및/또는 본원에 기재된 조성물의 용도를 비롯한 다수의 요인에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 특정 유형의 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 활성화 상태를 제어하도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제(들)는 시험관내 또는 생체내에서 본원에 기재된 표적 자극에 대한 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 반응을 제어하도록 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 1종 이상의 대식세포-편향제)는 대상체에서 본원에 기재된 표적 자극에 대한 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 반응을 제어하거나 변경시키도록 선택될 수 있다. 표적 자극에 대한 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 반응의 예는 염증 반응 (예를 들어, 염증유발 또는 염증성 인자, 예컨대 TNF-α의 방출), 생체물질 이식물의 분해, 재생 반응, 세포 생존율, 식세포작용, 세포 융합, 항염증 인자, 예컨대 IL-10의 방출, 표적 자극에 대한 반응에서 세포 형태의 변화 (예를 들어, 위족을 갖거나 또는 갖지 않는 원형 세포 또는 확장된 세포), 세포외 매트릭스의 생산, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
대식세포 반응 및 분화. 외인성 공급원으로부터 유래된 (즉, 숙주로부터 유래되지 않은) 생체물질은 생체내 이식 후에 어느 정도 수준의 이물 반응을 도출할 것이다. 이식 후에, 유도된 제1 단계는 호중구 및/또는 대식세포에 의해 개시되는 염증 반응이다. 수지상 세포와 함께, 림프구가 활성화되어 복합적인 경우에 적합한 반응으로 이어진다. 예를 들어, 필름 또는 섬유 형태의 실크 피브로인은 낮은 수준의 염증 반응을 유도하지만, 유의한 대식세포 활성화는 유도하지 않는다 (20).
단지 며칠만 지속되는 염증 반응은 급성 염증으로 지칭되며, 보다 긴 지속기간 (수주 내지 수개월 내지 수년)의 반응은 만성 염증으로 지칭된다. 대식세포 (
Figure pct00003
) 및 수지상 세포 (DC)는 생체물질 이식물에 대한 숙주 반응에서 중요한 역할을 수행하는 결정적인 항원 제시 세포 (APC)이다. 또한,
Figure pct00004
및, DC는 상호작용하여 헬퍼 T 세포를 자극하며, 이는 또한 중요한 역할을 수행한다.
식세포 (호중구 포함), 단핵구 및
Figure pct00005
는 침입 병원체의 인식 및 제거에 의한 숙주 방어에서 결정적인 역할을 수행한다.
Figure pct00006
는 일반적으로 식세포작용 소형 물질 또는 이들을 빠르게 제거하는 외래 성분이다. 이들은 반응성 산소 종 (ROS), 염증성 시토카인 및 케모카인을 생산하며, 박테리아 사멸, 동원, 및 추가의 면역 세포의 활성화로 이어진다 (30).
조직
Figure pct00007
는 추가의-혈관화 동안 및 시험관내에서 PMA (포르보112-미리스테이트 13-아세테이트)를 통해 미세환경 인자, 예컨대 대식세포 콜로니-자극 인자 (M-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 IL-3에 반응하여 순환 단핵구로부터 유래된다 (31-34). 분화시에,
Figure pct00008
는 세포외 신호에 의해 추가로 활성화될 수 있으며, 환경에서 시토카인 및 미생물 산물에 반응하여 다양한 기능을 나타낸다. 2가지 유형의
Figure pct00009
가 존재한다: 고전적으로 활성화된 대식세포 (M1) 및 대안적으로 활성화된
Figure pct00010
(M2). Th1 시토카인, 예컨대 IFN-γ 및 병원체-연관 분자 패턴 (PAMP), 예컨대 LPS에 반응하여, M1 대식세포는 고전적 활성화 표현형을 나타낸다. 이들은 주로 염증유발 시토카인, 예컨대 TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12 및 IL-23을 생산하고, 항증식성 기능을 보유한다 (30, 35-37). 대안적으로,
Figure pct00011
는 Th2 시토카인, 예컨대 IL-4 및 IL-13에 의해 활성화될 수 있다. M2는 3종의 하위세트로 세분된다: 그의 표현형에 기초하여 M2a, M2b 및 M2c. M1 및 M2b는 염증성 및 살미생물성인 반면 M2a 및 M2c는 항염증 및 조직 복구 특성을 갖고 IL-10, IL-1 길항체 수용체 (IL-1Ra), 및 형질전환 성장 인자 β (TGF-β) 시토카인을 분비한다. M1 대식세포는 일반적으로 염증 반응을 도출하여, 예를 들어 감염으로부터 새로 손상된 조직을 보호할 수 있다. 일부 실시양태에서, M1 대식세포에 의해 도출된 염증 반응은 조직 재형성에 바람직하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, M1 대식세포에 의해 도출된 염증 반응은 생체물질, 예컨대 실크의 빠른 분해를 위해 이용될 수 있다.
면역 세포, 예를 들어 대식세포에 의해 발현된 세포 표면 마커가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 대식세포는 일반적으로 세포 표면 마커, 예를 들어 비제한적으로, CD11b 및 F4/80 (마우스)을 발현한다. M1 대식세포는 세포 표면 마커, 예를 들어 비제한적으로 MCP-1, CCR7 및 CCL3을 발현하고; M2 대식세포는 세포 표면 마커, 예를 들어 CD206 및 CCL18을 발현한다. 예를 들어, 인간 및 마우스에서 대식세포 및 수지상 세포에서 일부 특정한 마커에 대해 하기 표 1을 참조한다. 세포 또는 세포의 집단 상의 이들 마커의 존재를 검출하는 수단은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 유전자 검정, PCR, 정량적 PCR, FACS, 웨스턴 블롯, 및 그의 임의의 조합).
Figure pct00012
대식세포-편향 제 . 일부 실시양태에서, 면역 세포-조절제(들)는 본원에 기재된 표적 자극에 대한 대식세포의 반응을 제어하거나 변경시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포-조절제는 M1 대식세포 표현형을 유도하도록 선택될 수 있거나; 또는 대안적으로, 면역 세포-조절제(들)는 M2 대식세포 표현형 (예를 들어, M2a, M2b 및 M2c)을 유도하도록 선택될 수 있다. 이들 실시양태에서, 면역 세포-조절제는 1종 이상의 대식세포-편향제 (예를 들어 2종 이상의, 3종 이상의 또는 그 초과의 대식세포-편향제 포함)를 포함할 수 있다.
따라서, 또한 1종 이상의 대식세포-편향제로 기능화된 생체물질 조성물에 관한 방법 및 조성물이 본원에 기재된다. 1종 이상의 대식세포-편향제는 실크 피브로인-기재 매트릭스 중에 1종 이상의 대식세포-편향제와의 접촉시에 대식세포의 활성화 상태를 선택적으로 제어하거나 변경시키기에 충분한 유효량으로 존재할 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용할 대식세포-편향제는 M1 표현형과 M2 표현형 사이의 대식세포의 활성화 상태를 변경시킬 수 있거나 또는 전구체 세포 (예를 들어, 단핵구)를 M1 대식세포 또는 M2 대식세포로 분화시킬 수 있는 임의의 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 대식세포의 M1 또는 M2 표현형으로의 분화 또는 대식세포의 최소 집단의 M1 또는 M2 표현형 상태로의 전환을 촉진할 수 있는 작용제일 수 있다. 특정한 표현형으로의 분화의 촉진은 그 표현형을 나타내는 세포의 전체 수의 증가; 그 표현형을 나타내는 세포의 집단의 백분율의 증가, 또는 세포가 그 표현형으로 분화되는 속도의 증가일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 대식세포의 최소 집단을 M1 또는 M2 표현형 상태로 전환시키는 작용제일 수 있다. 본원에 사용된 "최소 집단"은 2개 이상의 대식세포, 예를 들어 2개의 대식세포, 100개의 대식세포, 1000개의 대식세포, 1 x105개의 대식세포 또는 그 초과를 포함한다. 본원에 사용된 대식세포의 집단의 예를 들어 M1 표현형으로의 "전환"은 성숙한 활성화 대식세포의 단핵구 또는 다른 전구체의 성숙한 활성화 M1 또는 M2 표현형으로의 분화, M1 대식세포가 M2 대식세포로 되는 것, 및/또는 M2 대식세포가 M1 대식세포로 되는 것을 포괄할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 작용제에 노출된 대식세포의 활성화 상태를 선택적으로 제어하는 작용제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 M1 및/또는 M2 표현형의 대식세포의 증식을 촉진하는 작용제일 수 있다.
대식세포-편향제의 비제한적 예는 글루코코르티코이드 (예를 들어, 덱사메타손); 니코틴; 스타틴 (예를 들어, 심바스타틴); 항미생물 펩티드 (예를 들어, LL-37 펩티드, 아포지단백질 E); LPS; INF-γ; TNF-α; 프로락틴; Notch 활성화제 (예를 들어, 델타 또는 재기드 리간드); IL-4; IL-13; IL-10; 인슐린 감작제 및 PPAR-γ 유도제 (예를 들어, 로시글리타존 또는 다른 티아졸리딘디온); HDAC 억제제 (예를 들어, VPA); Notch 신호전달 억제제 (예를 들어, GSI 또는 DAPT); JAK 억제제 (예를 들어, AG490); 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제의 억제제; LiCl; 티모신; PLA2, 및 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 대식세포-편향제는 대식세포의 최소 집단을 M1 표현형 상태로 전환시키도록 선택된 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 M1 표현형의 분화를 촉진하는 작용제일 수 있다. 일부 실시양태에서, M1 표현형의 분화를 촉진하는 대식세포-편향제는 염증 반응을 유도할 수 있다. 이러한 작용제의 비제한적 예는 LPS; INF-γ; TNF-α; 프로락틴; 항미생물 펩티드 (예를 들어) LL-37 펩티드 및 델타 또는 재기드 리간드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 대식세포-편향제는 대식세포의 최소 집단을 M2 표현형 상태 (예를 들어, M2a, M2b 및 M2c)로 전환시키도록 선택된 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 M2 표현형 (예를 들어, M2a, M2b 및 M2c)의 분화를 촉진하는 작용제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, M2 표현형의 분화를 촉진하는 대식세포-편향제는 재생 반응을 유도할 수 있다. 이러한 작용제의 비제한적 예는 IL-4; IL-13; IL-10; 로시글리타존 ((RS)-5-[4-(2-[메틸(피리딘-2-일)아미노]에톡시)벤질]티아졸리딘-2,4-디온; 아반디아(Avandia); 화학식 II; 케이만 케미칼(Cayman Chemical); 미시간주 앤 아버 카탈로그 번호 71740); 또는 다른 티아졸리딘디온 (인슐린 감작화 및 PPAR-γ 유도) (예를 들어, 피오글리타존 ((RS)-5-(4-[2-(5-에틸피리딘-2-일)에틸옥시]벤질)티아졸리딘-2,4-디온; 악토스(Actos); 케이만 케미칼; 미시간주 앤 아버; 카탈로그 번호 71745); 트로글리타존 ((RS)-5-4-[(6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-일)메톡시]벤질)티아졸리딘-2,4-디온; 레줄린(Rezulin); 케이만 케미칼; 미시간주 앤 아버; 카탈로그 번호 71750); 네토글리타존 (5-[[6-[(2-플루오로페닐)메톡시]나프탈렌-2-일]메틸]-1,3-티아졸리딘-2,4-디온; MCC-555;); 리보글리타존 ((5-[[4-[2-(메틸-2-피리디닐아미노)에톡시]페닐]메틸]-2,4-티아졸리딘디온); 시글리타존 (5-(4-[(1-메틸시클로헥실)메톡시]벤질)-1,3-티아졸리딘-2,4-디온; 케이만 케미칼; 미시간주 앤 아버; 카탈로그 번호 71730); 및 발라글리타존 (5-[[4-[(3,4-디히드로-3-메틸-4-옥소-2-퀴나졸리닐)메톡시]페닐]메틸]-2,4-티아졸리딘디온); HDAC 억제제 (예를 들어, VPA); Notch 신호전달 억제제 (예를 들어, GSI 또는 DAPT); 항미생물 펩티드 (예를 들어, 아포지단백질 E (ApoE)); 또는 JAK 억제제 (예를 들어, AG490)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
HDAC 억제제의 비제한적 예는 발프로산 (VPA), 히드록삼산 유도체, 단쇄 지방산, 예컨대 부티레이트, 4-페닐부티레이트 또는 발프로산; 히드록삼산, 예컨대 수베로일아닐리드 히드록삼산 (SAHA), 비아릴 히드록사메이트 A-161906, 비시클릭 아릴N-히드록시카르복스아미드, CG-1521, PXD-101, 술폰아미드 히드록삼산, LAQ-824, 옥삼플라틴, 스크립타이드, m-카르복시 신남산 비스히드록삼산, 트라폭신-히드록삼산 유사체, 트리코스타틴 A, 트리코스타틴 C, m-카르복시신남산 비스-히드록스아미데옥삼플라틴 (CBHA), ABHA, 스크립타이드, 피록스아미드, 프로펜아미드; 에폭시케톤-함유 시클릭 테트라펩티드, 예컨대 트라폭신, 아피디신, 뎁시펩티드, HC-독소, 클라마이도신, 디헤테로펩틴, WF-3161, Cyl-1 및 Cyl-2; 벤즈아미드 또는 비-에폭시케톤-함유 시클릭 테트라펩티드, 예컨대 FR901228, 아피시딘, 시클릭-히드록삼산-함유 펩티드 (CHAP), 벤즈아미드, MS-275 (MS-27-275), 및 CI-994; 데푸데신; PXD101; 유기황 화합물; 아로일피롤릴히드록시-아미드 (APHA), SAHA (졸린자(Zolinza)), 트리코스타틴 A, MS-275, LBH-589, PXD-101, MGCD-0103, JNJ-26481585, R306465 (J&J), 및 부티르산나트륨을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
Notch 신호전달 억제제의 비제한적 예는 감마 세크레타제 억제제 (GSI), LY-411575, DAPT (LY-374973, N-[N-(3,5-디플루오로페나세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르), 아릴술폰아미드 (AS), 디벤즈아제핀 (DBZ), 벤조디아제핀 (BZ), L-685,458 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 및 MK0752 (머크(Merck))를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
JAK 억제제의 비제한적 예는 티르포스틴, 티르포스틴 AG490 및 2-나프틸 비닐 케톤을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
델타 및/또는 재기드 리간드의 비제한적 예는 델타-1, 델타-2, 델타-3, 델타-4, 재기드-1 및 재기드-2 (문헌 [Mumm J. S. et al., Dev. Biol., 228, 151-165, 2000]) 및 그의 기능성 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있다.
대식세포-편향제의 추가의 비제한적 예는 글루코코르티코이드 (예를 들어, 덱사메타손, 프레드니손, 메틸프레드니손, 히드로코르티손, 코르티손 아세테이트, 베타메타손, 트리암시놀론, 세블로메타손, 플루드로코르티손 아세테이트, 데옥시코르티코스테론 아세테이트 및 알도스테론); 니코틴; 심바스타틴; 스타틴; 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제의 억제제; LiCl; 티모신, 또는 PLA2를 포함할 수 있다.
HMG-CoA 리덕타제 억제제의 비제한적 예는 아토르바스타틴 메바코르(MEVACOR)® (로바스타틴), 조코르(ZOCOR)® (심바스타틴), 프라바콜0(PRAVACHOL0) (프라바스타틴), 레스콜(LESCOL)® (플루바스타틴), 및 리바스타틴 또는 본원에 참조로 포함된 하기 특허 공개에 기재된 임의의 화합물: 미국 특허 번호 4,231,938 (예를 들어, 로바스타틴 포함); EP0033538 (예를 들어, 심바스타틴 포함); GB2077264 (예를 들어, 프라바스타틴 포함); EP0114027 (예를 들어, 플루바스타틴 포함); EP0247633 (예를 들어, 아토르바스타틴 포함); 미국 특허 번호 3,983,140 (예를 들어, 메바스타틴 포함); EP0491226 (예를 들어, 리바스타틴; 세르(세리)바스타틴 포함); 미국 특허 번호 5,011,930 (예를 들어, 피타바스타틴, 닛산(Nissan)/산쿄(Sankyo)의 니스바스타틴 (NK-104) 또는 이타바스타틴 포함); 미국 특허 번호 5,260,440 (예를 들어, 시오노기-아스트라/제네카(Shionogi-Astra/Zeneca)의 로수바스타틴 또는 비사스타틴 (ZD-4522) 포함); 및 미국 특허 번호 5,753,675 (상기 기재된 스타틴과 관련된 스타틴 포함)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
추가의 대식세포-편향제는 대식세포의 집단을 후보 작용제와 접촉시키고 대식세포의 M1 또는 M2 표현형으로의 분화의 증가가 있는지를 결정하여 확인할 수 있다. M1 및 M2 표현형의 확인을 위한 마커는 당업계에 공지되어 있으며, 일부 마커는 본원에서 상기에 논의된다.
일부 측면에서, 생체물질에 의해 유도된 염증 반응은 항염증 또는 항미생물 활성제에 의해 균형을 이룰 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 염증 반응을 유도하는 작용제 및 염증 반응의 균형을 이루는 항염증제 또는 항미생물제를 포함할 수 있다. 이들 작용제는 둘 다 상이한 시간 및/또는 상이한 속도로 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)로부터 방출될 수 있다.
이전에 기재된 바와 같이, 대식세포-편향제(들)는 임의의 방식으로 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스에 존재할 수 있다. 대식세포-편향제(들)는 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스에 균질하게 또는 불균질하게 분배될 수 있거나 또는 구배 방식으로 분배될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제(들)는 예를 들어 다중-층의 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스에서 동일 층 및/또는 개별 층에 분배될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 생체물질 조성물로 캡슐화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 생체물질을 대식세포-편향제의 용액에 침지시킴으로써 생체물질 조성물의 표면 상에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 실크 피브로인-기재 매트릭스로 캡슐화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는, 예를 들어 실크 피브로인-기재 매트릭스를 대식세포-편향제의 용액에 침지시킴으로써 실크 피브로인-기재 매트릭스 상에 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 생체물질 조성물에 결합하거나 또는 가교될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포-편향제는 실크 피브로인-기재 매트릭스에 결합하거나 또는 가교될 수 있다. 제한되지 않고, 대식세포-편향제는 또한 본원에 기재된 조성물의 일부 실시양태에서 분배될 수 있다.
표적 자극
일부 실시양태에서, 표적 자극에 대한 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 반응을 제어하는 것에 관한 방법 및 조성물이 본원에 기재된다. 본원에 사용된 표적 자극은 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 응답 또는 반응을 유발하거나 또는 유도할 수 있는, 예를 들어 염증 반응 및/또는 재생 반응을 유도하는 임의의 시험관내 또는 생체내 대상, 조성물, 질환, 장애, 상태 또는 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 자극은 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)의 집단의 활성화 상태의 변화를 유발할 수 있거나 또는 M1 또는 M2 표현형에 의해 특성화된 세포의 집단에서 대식세포의 수 또는 백분율의 변화를 유발할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 표적 자극에 대한 면역 세포의 반응, 및/또는 표적 자극에 의해 유도된 면역 세포의 활성화 상태의 변화를 감소시키거나 또는 균형을 이룰 수 있는 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 자극은 대식세포-연관 상태를 포함할 수 있다. 면역 세포 (예를 들어, 대식세포)가 반응하도록 유도할 수 있고/거나 대식세포의 집단의 활성화 상태의 변화를 유발할 수 있고/거나 M1 또는 M2 표현형에 의해 특성화된 대식세포의 수 또는 백분율의 변화를 유발할 수 있는 상태, 질환 및 장애가 당업계에 널리 공지되어 있다. 대식세포-연관 상태의 비제한적 예는 박테리아 감염, 조직 재생, 조직 손상, 예를 들어 조직 복구 및/또는 증진 (예를 들어, 연부 조직 복구 및/또는 증진)을 포함하는 조직 재구축, 관절염, 비만, 당뇨병, 동맥경화증, 동종이식편 이식, 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH), 골다공증, 사구체신염, 암, 상처 치유, 및 그의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 자극은 이식가능한 구조물, 예를 들어 대상체의 조직 또는 공동에 이식될 수 있는 임의의 구조물을 포함할 수 있다. 이식가능한 구조물의 비제한적 예는 스캐폴드, 스텐트, 이식편, 동종이식편 조직 및 의료 장치를 포함할 수 있다.
이식편의 비제한적 예는 자가이식, 에피셀(Epicel)® 배양된 표피 자가이식편 (젠자임 캠브리지(Genzyme Cambridge), 매사추세츠주); 인테그라(Integra)™ 이중층 매트릭스 상처 드레싱 (인테그라 라이프사이언스 홀딩스 코포레이션(Integra Lifescience Holdings Corp.), 캐나다 온타리오); 알로덤(Alloderm)® 무세포성 피부 매트릭스 (라이프셀 코포레이션(LifeCell Corp.), 뉴저지주 브랜치버그); 오르셀(OrCel)® 이중층 세포 매트릭스 (포르티셀 바이오사이언스, 인크.(Forticell Bioscience, Inc.), 뉴욕주 뉴욕); 및 아플리그라프(Apligraf)® 살아있는 피부 패치 (오르가노제네시스 인크.(Organogenesis Inc.), 매사추세츠주 캔톤)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 자극은 실크섬유 기재 매트릭스, 실크 피브로인 히드로겔, 실크 피브로인 이식물, 실크 피브로인 직물 또는 섬유, 또는 참조로 포함된 미국 특허 공개 2011/0189773; 2011/0052695; 2011/0009960; 2010/0256756; 및 2010/0209405에 논의된 바와 같은 다른 조직 공학 조성물을 포함할 수 있다.
의료 장치의 비제한적 예는 스텐트, 포트, 카테터, 봉합사, 스테이플, 인공 기관, 신경 자극기, 펌프, 약물 전달 펌프, 박동조율기, 제세동기, 스텐트-이식편, 이식편, 인공 심장 판막, 난원공 폐쇄 장치, 뇌척수액 션트, 박동조율기 전극, 가이드 와이어, 심실 보조 장치, 심폐 우회 회로, 혈액 산화기, 대정맥 필터, 심막내 전기선, 기관내 튜브, 신루설치 튜브 및 정형외과용 장치를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 자극은 시토카인을 포함할 수 있다. 시토카인의 비제한적 예는 케모카인 인터류킨, 인터페론, 콜로니 자극 인자, IL-la, IL-10, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, 백혈구 억제 인자 (LIF), IFN-α, IFN-γ, TNF, TNF-α, TGF-β, G-CSF, M-CSF, GM-CSF; C-케모카인, CC-케모카인, CXC케모카인, CX3C-케모카인, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-lo/P, IP-10, MIG, IL-8, RANTES, 림포탁틴 및 그의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 시토카인은 시험관내 또는 생체내에서 외인성으로 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토카인는 계내에서, 예를 들어 대식세포-연관 상태 및/또는 이식물에 대한 반응에서 또는 이와 연관하여 생산될 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 자극은 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 코팅을 갖는 장치를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 자극은 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 실시양태를 포함할 수 있다. 예를 들어, 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스), 및/또는 생체물질에 존재하는 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는 각각 독립적으로 표적 자극을 구성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 표적 자극으로서 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제), 및 표적 자극의 효과, 예를 들어 비제한적으로 표적 자극에 의해 유도되는 염증 반응을 감소시키거나 이와 균형을 이루는 작용제로서 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)를 포함할 수 있다.
제약 조성물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 생체내 투여될 수 있다. 선택된 투여 경로에 따라, 조성물은 임의의 형태, 예를 들어 비제한적으로 스캐폴드, 겔, 정제, 캡슐, 로젠지, 현탁액, 자유-유동 분말 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 주사가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 주사가능한 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비에 상응하여 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합한 해당 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 담체"는 본원에 기재된 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)의 투여를 위한 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클를 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 면역 세포-조절제의 활성과 호환가능하며 대상체에 대해 생리학상 허용되는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체로서 역할을 수행할 수 있는 물질의 일부 예는 다음을 포함한다: (i) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (ii) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (iii) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (iv) 분말화 트라가칸트; (v) 맥아; (vi) 젤라틴; (vii) 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 소듐 라우릴 술페이트 및 활석; (viii) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; (ix) 오일, 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (x) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (xi) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); (xii) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (xiii) 한천; (xiv) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (xv) 알긴산; (xvi) 발열원 무함유 물; (xvii) 등장성 염수; (xviii) 링거액; (xix) 에틸 알콜; (xx) pH 완충 용액; (xxi) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리무수물; (xxii) 벌킹제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산 (xxiii) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; (xxiv) C2-C12 알콜, 예컨대 에탄올; 및 (xxv) 제약 제제에 사용되는 다른 비-독성 호환성 물질. 습윤제, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제, 퍼퓸제, 보존제 및 항산화제가 또한 제제에 존재할 수 있다. 경구로 투여되는 본원에 기재된 조성물의 경우에, 제약상 허용되는 담체는 제약상 허용되는 부형제, 예컨대 불활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 불활성 희석제는 탄산나트륨 및 탄산칼슘, 인산나트륨 및 인산칼슘, 및 락토스를 포함하고, 한편 옥수수 전분 및 알긴산은 적합한 붕해제이다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함할 수 있고, 한편 윤활제는 존재하는 경우에, 일반적으로 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 것이다. 원하는 경우에, 정제는 위장관에서의 흡수를 지연시키기 위해 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 물질로 코팅될 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 투여 경로 및 제제에 따라 본원에 기재된 조성물에서 달라질 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 숙련된 진료의에게 공지된 임의의 투여 방식을 통해 전달될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물은 비제한적으로 경구, 및 비경구, 예를 들어 정맥내, 근육내, 복강내, 피내 및 피하와 같은 투여 경로를 통해 전신 방식으로 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 주사에 적합한 형태이다.
비경구로 투여하는 경우에, 본원에 기재된 조성물은 일반적으로 단위 투여량 주사가능한 형태 (용액, 현탁액, 에멀젼)로 제제화될 수 있다. 주사에 적합한 조성물은 멸균 수용액 또는 분산액을 포함한다. 담체는 예를 들어 물, 세포 배양 배지, 완충제 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수), 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 담체는 완충 용액 (예를 들어, PBS)일 수 있다.
조성물은 또한 투여 경로 및 원하는 제제에 따라 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 겔화 또는 점도 증진 첨가제, 보존제, 착색제 등을 함유할 수도 있다. 본원에 참조로 포함되는 표준 텍스트, 예컨대 문헌 ["REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985]은 과도한 실험 없이도 적합한 제제를 제조하는데 도움을 줄 수 있다. 그러나, 본원에 기재된 조성물과 관련하여, 사용되는 임의의 비히클, 희석제 또는 첨가제는 본원에 기재된 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)와 생체적합성이어야 한다. 당업자는 조성물의 성분이 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)에 대해 생체적합성이도록 선택되어야 한다는 것을 인지할 것이다. 이는 화학 및 제약 이론의 숙련자에게 어떠한 문제도 제시하지 않을 것이거나 또는 표준 텍스트를 참조하거나 간단한 실험에 의해 (과도한 실험은 포함하지 않음) 문제를 용이하게 방지할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 에멀젼 또는 겔로 제제화될 수 있다. 이러한 겔 조성물은 대상체의 표적 부위 (예를 들어, 이환된 또는 손상된 조직)와 가까이 근접하여 또는 이 표적 부위에 국부적으로 이식될 수 있다.
본원에 기재된 주사가능한 조성물은 전달 장치, 예를 들어 시린지로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 조성물의 지속-방출 또는 제어 방출을 위해 이식물, 예컨대 마이크로칩, 스캐폴드, 동종이식편 조직, 또는 의료 장치의 일부를 형성할 수 있다.
본원에 기재된 조성물의 일부 실시양태에서, 실크 피브로인-기재 매트릭스는 그 자체로 그의 분해를 제어하여 면역 세포-조절제의 방출을 제어하도록, 예를 들어 방출이 수시간 내지 수일 또는 수개월 범위의 기간에 걸쳐 일어나도록 이전에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물은 당업자에게 이용가능하고 공지되어 있어 다른 유형의 전달 시스템과 조합될 수 있다. 예를 들어, 1종 이상의 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)는 생체물질 (예를 들어, 실크 피브로인-기재 매트릭스)에 분산되기 전에 개별 전달 시스템, 예를 들어 실크 피브로인-기재 입자, 중합체-기재 입자, 및/또는 비-중합체 기재 입자로 캡슐화될 수 있다. 다른 유형의 전달 시스템은 예를 들어 중합체-기재 시스템, 예컨대 폴리락트산 및/또는 폴리글리콜산, 폴리무수물, 폴리카프로락톤, 코폴리옥살레이트, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산 및/또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 다른 예는 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대 모노-, 디- 및 트리글리세리드를 포함하는 지질-기반 비중합체 시스템; 히드로겔 방출 시스템; 리포솜-기반 시스템; 인지질 기반-시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기반 시스템; 또는 부분적으로 융합된 이식물을 포함한다. 구체적 예는 조성물이 매트릭스 내의 형태로 함유되는 부식 시스템, 또는 활성 성분 (예를 들어, 면역 세포-조절제 또는 대식세포-편향제)이 방출 속도를 제어하는 확산 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제제는 예를 들어 마이크로구체, 히드로겔, 중합체 저장소, 콜레스테롤 매트릭스 또는 중합체 시스템에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스템은 예를 들어 조성물을 함유하는 제제의 확산 또는 부식/분해 속도의 제어를 통해 조성물의 지속 또는 제어 방출이 일어나도록 허용할 수 있다. 또한, 펌프-기재 하드웨어 전달 시스템이 본원에 기재된 조성물의 하나 이상의 실시양태를 전달하기 위해 이용될 수 있다. 장기간 지속 방출 제제 또는 이식물의 사용이 만성 상태, 예컨대 당뇨병, 상처 치유 및/또는 조직 재생의 치료에 특히 적합하다. 본원에 사용된 장기간 방출은 제제 또는 이식물이 본원에 기재된 조성물을 치료 수준으로 30일 이상 또는 60일 이상 동안 전달하기 위해 만들어지고 배열되는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 장기간 방출은 제제 또는 이식물이 면역 세포-조절제 (예를 들어, 대식세포-편향제)를 치료 수준으로 수개월에 걸쳐 전달하기 위해 구성되는 것을 지칭한다.
본원에 기재된 다양한 측면의 실시양태는 아래의 번호가 붙은 단락으로 예시될 수 있다.
1. 1종 이상의 면역 세포-조절제를 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제와의 접촉시에 1종 이상의 유형의 면역 세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함하는 생체물질을 포함하는 조성물.
2. 제2단락에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
3. 제1단락 또는 제2단락에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 대식세포를 포함하는 것인 조성물.
4. 제1단락 내지 제3단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 수지상 세포를 포함하는 것인 조성물.
5. 제1단락 내지 제4단락 중 어느 한 단락에 있어서, 생체물질이 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제의 지속 방출에 적합한 것인 조성물.
6. 제1단락 내지 제5단락 중 어느 한 단락에 있어서, 생체물질이 2종 이상의 면역 세포-조절제를 포함하는 것인 조성물.
7. 제6단락에 있어서, 생체물질이 제1 면역 세포-조절제 및 제2 면역 세포-조절제를 상이한 시점에 방출시키기에 적합한 것인 조성물.
8. 제7단락에 있어서, 생체물질이 제1 면역 세포-조절제를 제1 층에 및 제2 면역 세포-조절제를 제2 층에 포함하는 것인 조성물.
9. 제1단락 내지 제8단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제가 생체물질로 캡슐화된 것인 조성물.
10. 제1단락 내지 제9단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제가 생체물질의 표면 상에 존재하는 것인 조성물.
11. 제1단락 내지 제10단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제가 대식세포-편향제를 포함하는 것인 조성물.
12. 제1단락 내지 제11단락 중 어느 한 단락에 있어서, 생체물질이 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 것인 조성물.
13. 제1단락 내지 제12단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제가 대상체에서 표적 자극에 대한 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포의 반응을 제어하도록 선택되는 것인 조성물.
14. 1종 이상의 대식세포-편향제를 상기 1종 이상의 대식세포-편향제와의 접촉시에 대식세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함하는 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 조성물.
15. 제14단락에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 대식세포의 최소 집단을 M1 표현형 상태로 전환시키도록 선택된 작용제를 포함하는 것인 조성물.
16. 제14단락 또는 제15단락에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 대식세포의 최소 집단을 M2 표현형 상태 (예를 들어, M2a, M2b, M2c)로 전환시키도록 선택된 작용제를 포함하는 것인 조성물.
17. 제14단락 내지 제16단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 글루코코르티코이드 (예를 들어, 덱사메타손); 니코틴; 스타틴 (예를 들어, 심바스타틴); 항미생물 펩티드 (예를 들어, LL-37 펩티드, 아포지단백질 E); LPS; INF-γ; TNF-α; 프로락틴; Notch 활성화제 (예를 들어, 델타 또는 재기드 리간드); IL-4; IL-13; IL-10; 인슐린 감작제 및 PPAR-γ 유도제 (예를 들어, 로시글리타존 또는 다른 티아졸리딘디온); HDAC 억제제 (예를 들어, VPA); Notch 신호전달 억제제 (예를 들어, GSI 또는 DAPT); JAK 억제제 (예를 들어, AG490); 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제의 억제제; LiCl; 티모신; PLA2, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
18. 제14단락 내지 제17단락 중 어느 한 단락에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 상기 1종 이상의 대식세포-편향제의 지속 방출에 적합한 것인 조성물.
19. 제14단락 내지 제18단락 중 어느 한 단락에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 2종 이상의 대식세포-편향제를 포함하는 것인 조성물.
20. 제14단락 내지 제19단락 중 어느 한 단락에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 제1 대식세포-편향제 및 제2 대식세포-편향제를 상이한 시점에 방출시키기에 적합한 것인 조성물.
21. 제20단락에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 제1 대식세포-편향제를 제1 층에 및 제2 대식세포-편향제를 제2 층에 포함하는 것인 조성물.
22. 제14단락 내지 제21단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 대상체에서 표적 자극에 대한 대식세포 반응을 제어하도록 선택되는 것인 조성물.
23. 제13단락 내지 제22단락 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 자극이 대식세포-연관 상태를 포함하는 것인 조성물.
24. 제23단락에 있어서, 대식세포-연관 상태의 치료에 사용하기 위해 제제화된 조성물.
25. 제23단락 또는 제24단락에 있어서, 대식세포-연관 상태가 박테리아 감염, 조직 재생, 조직 손상, 예를 들어 조직 복구 및/또는 증진 (예를 들어, 연부 조직 복구 및/또는 증진)을 포함하는 조직 재구축, 관절염, 비만, 당뇨병, 동맥경화증, 동종이식편 이식, 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH), 골다공증, 사구체신염, 암, 상처 치유, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
26. 제1단락 내지 제25단락 중 어느 한 단락에 있어서, 재건 수술에 사용하기에 적합한 조성물.
27. 제26단락에 있어서, 재건 수술이 미용 수술을 추가로 포함하는 것인 조성물.
28. 제1단락 내지 제27단락 중 어느 한 단락에 있어서, 연부 조직 복구 및/또는 증진에 사용하기에 적합한 조성물.
29. 제28단락에 있어서, 연부 조직이 피부, 유방 조직, 건, 인대, 섬유성 조직, 결합 조직, 근육, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
30. 제1단락 내지 제29단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상처 드레싱으로 사용하기에 적합한 조성물.
31. 제13단락 내지 제30단락 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 자극이 이식가능한 구조물 (예를 들어, 스캐폴드, 동종이식편 조직, 의료 장치)을 포함하는 것인 조성물.
32. 제31단락에 있어서, 이식가능한 구조물의 코팅을 형성하는 조성물.
33. 제13단락 내지 제32단락 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 자극이 시토카인 (예를 들어, 케모카인 포함)을 포함하는 것인 조성물.
34. 제1단락 내지 제33단락 중 어느 한 단락에 있어서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스가 필름, 섬유, 입자의 수집물, 튜브, 매트, 겔, 메쉬, 직물, 또는 그의 임의의 조합의 형태인 조성물.
35. 제1단락 내지 제34단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제 또는 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 실크 피브로인-기재 매트릭스로 캡슐화된 것인 조성물.
36. 제1단락 내지 제35단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제 또는 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 실크 피브로인-기재 매트릭스의 표면 상에 존재하는 것인 조성물.
37. 1종 이상의 면역 세포-조절제를 1종 이상의 유형의 면역 세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함하는 생체물질을 표적 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 부위에 위치시키는 것; 및
면역 세포-조절제를 표적 부위에 위치시에 생체물질로부터 예정된 속도로 방출시켜, 생체물질 주위의 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비를 변경시키는 것
을 포함하며, 여기서 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비가 역치 초과에 도달하는 경우에, 생체물질은 염증 반응을 유도하고; 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비가 역치 미만에 도달하는 경우에, 생체물질은 재생 또는 항염증 반응을 유도하는 것인 방법.
38. 제37단락에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
39. 제37단락 또는 제38단락에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 대식세포를 포함하는 것인 방법.
40. 제37단락 내지 제39단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 수지상 세포를 포함하는 것인 방법.
41. 제37단락 내지 제40단락 중 어느 한 단락에 있어서, 면역 세포-조절제가 대식세포-편향제를 포함하는 것인 방법.
42. 1종 이상의 대식세포-편향제를 대식세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함하는 생체물질을 표적 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 부위에 위치시키는 것; 및
대식세포-편향제를 표적 부위에 위치시에 생체물질로부터 예정된 속도로 방출시켜, 생체물질 주위의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비를 변경시키는 것
을 포함하며, 여기서 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 초과인 경우에, 생체물질은 염증 반응을 유도하고; M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 미만인 경우에, 생체물질은 재생 또는 항염증 반응을 유도하는 것인 방법.
43. 제37단락 내지 제42단락 중 어느 한 단락에 있어서, 염증 반응이 생체물질의 분해를 유도하는 것을 포함하는 것인 방법.
44. 제37단락 내지 제43단락 중 어느 한 단락에 있어서, 염증 반응이 표적 부위에 가까이 근접한 및/또는 표적 부위에 있는 조직을 감염으로부터 보호하는 것을 포함하는 것인 방법.
45. 제37단락 내지 제44단락 중 어느 한 단락에 있어서, 재생 또는 항염증 반응이 표적 부위에서의 조직 복구 및/또는 재생을 용이하게 하는 것을 포함하는 것인 방법.
46. 제37단락 내지 제45단락 중 어느 한 단락에 있어서, 재생 또는 항염증 반응이 숙주의 면역계에 의한 생체물질의 거부를 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
47. 제37단락 내지 제46단락 중 어느 한 단락에 있어서, 생체물질이 상기 1종 이상의 대식세포-편향제의 지속 방출에 적합한 것인 방법.
48. 제37단락 내지 제47단락 중 어느 한 단락에 있어서, 생체물질이 2종 이상의 대식세포-편향제를 포함하는 것인 방법.
49. 제48단락에 있어서, 생체물질이 제1 대식세포-편향제 및 제2 대식세포-편향제를 상이한 시점에 방출시키기에 적합한 것인 방법.
50. 제49단락에 있어서, 생체물질이 제1 대식세포-편향제를 제1 층에 및 제2 대식세포-편향제를 제2 층에 포함하는 것인 방법.
51. 제37단락 내지 제50단락 중 어느 한 단락에 있어서, 생체물질을 주사에 의해 위치시키는 것인 방법.
52. 제37단락 내지 제50단락 중 어느 한 단락에 있어서, 생체물질을 이식에 의해 위치시키는 것인 방법.
53. 제37단락 내지 제52단락 중 어느 한 단락에 있어서, 생체물질이 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 것인 방법.
54. 제37단락 내지 제53단락 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 부위가 표적 자극을 포함하는 것인 방법.
55. 1종 이상의 대식세포-편향제를 (a) 대식세포의 최소 집단을 M1 표현형 상태로 전환시켜, 자극에 대한 염증 반응을 유도하기에 충분하거나; (b) 대식세포의 최소 집단을 M2 표현형 상태로 전환시켜, 자극에 대한 재생 반응을 유도하기에 충분하거나; 또는 (c) (a) 및 (b) 둘 다에 충분한 유효량으로 포함하는 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 조성물을 표적 자극에 가까이 근접하게 또는 표적 자극의 부위에 위치시키는 것을 포함하는, 대상체에서 표적 자극에 대한 대식세포 반응을 조절하는 방법.
56. 제55단락에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 상기 1종 이상의 대식세포-편향제의 지속 방출에 적합한 것인 방법.
57. 제55단락 또는 제56단락에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 2종 이상의 대식세포-편향제를 포함하는 것인 방법.
58. 제57단락에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 제1 대식세포-편향제 및 제2 대식세포-편향제를 상이한 시점에 방출시키기에 적합한 것인 방법.
59. 제58단락에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 제1 대식세포-편향제를 제1 층에 및 제2 대식세포-편향제를 제2 층에 포함하는 것인 방법.
60. 제42단락 내지 제59단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 글루코코르티코이드 (예를 들어, 덱사메타손); 니코틴; 스타틴 (예를 들어, 심바스타틴); 항미생물 펩티드 (예를 들어, LL-37 펩티드, 아포지단백질 E); LPS; INF-γ; TNF-α; 프로락틴; Notch 활성화제 (예를 들어, 델타 또는 재기드 리간드); IL-4; IL-13; IL-10; 인슐린 감작제 및 PPAR-γ 유도제 (예를 들어, 로시글리타존 또는 다른 티아졸리딘디온); HDAC 억제제 (예를 들어, VPA); Notch 신호전달 억제제 (예를 들어, GSI 또는 DAPT); JAK 억제제 (예를 들어, AG490); 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제의 억제제; LiCl; 티모신; PLA2, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
61. 제54단락 내지 제60단락 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 자극이 대식세포-연관 상태를 포함하는 것인 방법.
62. 제61단락에 있어서, 조성물 또는 생체물질을 대식세포-연관 상태의 치료에 사용하기 위해 제제화하는 것인 방법.
63. 제61단락 또는 제62단락에 있어서, 대식세포-연관 상태가 박테리아 감염, 조직 재생, 조직 손상, 예를 들어 조직 복구 및/또는 증진 (예를 들어, 연부 조직 복구 및/또는 증진)을 포함하는 조직 재구축, 관절염, 비만, 당뇨병, 동맥경화증, 동종이식편 이식, 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH), 골다공증, 사구체신염, 암, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
64. 제37단락 내지 제63단락 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물 또는 생체물질이 재건 수술에 사용하기에 적합한 것인 방법.
65. 제64단락에 있어서, 재건 수술이 미용 수술을 추가로 포함하는 것인 방법.
66. 제37단락 내지 제65단락 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물 또는 생체물질이 연부 조직 복구 및/또는 증진에 사용하기에 적합한 것인 방법.
67. 제66단락에 있어서, 연부 조직이 피부, 유방 조직, 건, 인대, 섬유성 조직, 결합 조직, 근육, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
68. 제37단락 내지 제67단락 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물 또는 생체물질이 상처 드레싱으로 사용하기에 적합한 것인 방법.
69. 제54단락 내지 제68단락 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 자극이 이식가능한 구조물을 포함하는 것인 방법.
70. 제69단락에 있어서, 조성물 또는 생체물질이 이식가능한 구조물의 코팅을 형성하는 것인 방법.
71. 제54단락 내지 제70단락 중 어느 한 단락에 있어서, 표적 자극이 시토카인 (예를 들어, 케모카인 포함)을 포함하는 것인 방법.
72. 제42단락 내지 제71단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 실크 피브로인-기재 매트릭스 또는 생체물질로 캡슐화된 것인 방법.
73. 제42단락 내지 제72단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 실크 피브로인-기재 매트릭스 또는 생체물질의 표면 상에 존재하는 것인 방법.
74. 제37단락 내지 제73단락 중 어느 한 단락에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스 또는 생체물질이 필름, 섬유, 입자의 수집물, 튜브, 매트, 겔, 직물, 메쉬, 또는 그의 임의의 조합의 형태인 방법.
75. 제37단락 내지 제74단락 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물 또는 생체물질을 주사에 의해 위치시키는 것인 방법.
76. 제37단락 내지 제75단락 중 어느 한 단락에 있어서, 조성물 또는 생체물질을 이식에 의해 위치시키는 것인 방법.
77. 1종 이상의 면역 세포-조절제를 포함하는 생체물질을 포함하는 조성물로 제1 물질을 코팅하는 것을 포함하는, 생의학 물질을 생산하는 방법.
78. 제77단락에 있어서, 생체물질이 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 것인 방법.
79. 제77단락 또는 제78단락에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제가 대식세포-편향제를 포함하는 것인 방법.
80. 1종 이상의 대식세포-편향제를 포함하는 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 조성물로 제1 물질을 코팅하는 것을 포함하는, 생의학 물질을 생산하는 방법.
81. 제1단락 내지 제36단락 중 어느 한 단락에 있어서, 대식세포-연관 상태의 치료를 위한 제약 조성물의 제조에 사용하기 위한 조성물.
82. 제81단락에 있어서, 대식세포-연관 상태가 박테리아 감염, 조직 재생, 조직 손상, 예를 들어 조직 복구 및/또는 증진 (예를 들어, 연부 조직 복구 및/또는 증진)을 포함하는 조직 재구축, 관절염, 비만, 당뇨병, 동맥경화증, 동종이식편 이식, 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH), 골다공증, 사구체신염, 암, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
83. 제1단락 내지 제36단락 중 어느 한 단락에 있어서, 상처 드레싱의 제조에 사용하기 위한 조성물.
84. 제1단락 내지 제36단락 중 어느 한 단락에 있어서, 이식가능한 구조물의 제조에 사용하기 위한 조성물.
85. 제81단락 내지 제84단락 중 어느 한 단락에 있어서, 제약 조성물의 코팅, 상처 드레싱 또는 이식가능한 구조물을 형성하는 조성물.
86. 제84단락 또는 제85단락에 있어서, 이식가능한 구조물이 스캐폴드, 동종이식편 조직, 의료 장치, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 조성물.
87. 제84단락 내지 제86단락 중 어느 한 단락에 있어서, 이식가능한 구조물이 재건 수술에 사용하기 적합한 것인 조성물.
88. 제87단락에 있어서, 재건 수술이 미용 수술을 추가로 포함하는 것인 조성물.
89. 제84단락 내지 제88단락 중 어느 한 단락에 있어서, 이식가능한 구조물이 연부 조직 복구 및/또는 증진에 사용하기에 적합한 것인 조성물.
90. 제89단락에 있어서, 연부 조직이 피부, 유방 조직, 건, 인대, 섬유성 조직, 결합 조직, 근육, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
일부 선택된 정의
편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에서 본원에 사용된 특정 용어가 여기에 집결되어 있다. 달리 언급되지 않는 한, 또는 문맥으로부터 함축적으로, 하기 용어 및 어구는 하기 제공된 의미를 포함한다. 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 또는 문맥으로부터 분명하게, 하기 용어 및 어구는 이 용어 또는 어구가 이것이 속하는 업계에서 획득한 의미를 배제하지 않는다. 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 의해서만 제한되기 때문에, 정의는 특정한 실시양태를 기재하는 것을 돕기 위해 제공되며, 청구된 본 발명을 제한하고자 의도되지 않는다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 방법 또는 조성물에 필수적인 조성물, 방법 또는 그의 각각의 성분(들)과 관련하여 사용되나, 필수적이든 그렇지 않든 특정되지 않은 요소의 포함에 대해 개방되어 있다.
본원에 사용된 용어 "본질적으로 이루어진"은 주어진 실시양태에 대해 요구되는 요소를 지칭한다. 용어는 그 실시양태의 기초적 및 신규 또는 기능적 특징(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다.
용어 "로 이루어진"은 실시양태의 기재에 언급되지 않은 임의의 요소를 제외한 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 그의 각각의 성분을 지칭한다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재되고/거나 본 개시내용 등을 읽을 때 당업자에게 명백해질 유형의 하나 이상의 방법, 및/또는 단계를 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥상 명백하게 지시되지 않는 한 "및"을 포함하도록 의도된다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에 기재된다. 약어 "e.g."는 라틴어 'exempli gratia'로부터 유래되며, 비제한적 예를 나타내기 위해 본원에 사용된다. 따라서, 약어 "e.g."는 용어 "예를 들어"와 동의어이다.
세포 생물학 및 분자 생물에서 통상적인 용어의 정의는 문헌 ["The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); The ELISA guidebook (Methods in molecular biology 149) by Crowther J. R. (2000); Fundamentals of RIA and Other Ligand Assays by Jeffrey Travis, 1979, Scientific Newsletters; Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006. Definitions of common terms in molecular biology can also be found in Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) 및 Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds.]에서 찾아볼 수 있다.
용어 "감소하다", "감소시키다", "감소된", "감소", "감소하다" 및 "억제하다"는 모두 일반적으로 참조물에 비해 통계적으로 유의한 양의 감소를 의미하도록 본원에 사용된다. 그러나, 의문을 피하기 위해, "감소시키다", "감소" 또는 "감소하다" 또는 "억제하다"는 전형적으로 참조 수준에 비해 적어도 10% 감소하는 것을 의미하며, 예를 들어 참조 수준에 비해 주어진 엔티티 또는 파라미터의 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 까지의 감소 (및 예를 들어 완전한 부재 포함), 또는 참조 수준에 비해 10-99%의 임의의 감소를 포함할 수 있다.
용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "증진시키다" 또는 "활성화시키다" 또는 "촉진하다"는 모두 일반적으로 통계적으로 유의한 양의 증가를 의미하도록 본원에 사용되며; 임의의 의문을 피하기 위해, 용어 "증가된", "증가시키다" 또는 "증진시키다" 또는 "활성화시키다" 또는 "촉진하다"는 참조 수준에 비해 적어도 10%의 증가, 예를 들어 참조 수준에 비해 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 이들까지의 증가 (및 100% 증가 포함) 또는 10-100%의 임의의 증가, 또는 참조 수준 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 또는 그 초과의 임의의 증가를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 인접한 아미노산 잔기의 알파-아미노 및 카르복시 기 사이에서 펩티드 결합에 의해 다른 잔기에 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지칭하는데 교환가능하게 사용된다. 본원에서 교환가능하게 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 그의 크기 또는 기능에 관계없이 단백질 아미노산, 예컨대 변형된 아미노산 (예를 들어 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체의 중합체를 지칭한다. "단백질" 및 "폴리펩티드"는 종종 비교적 큰 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 반면 용어 "펩티드"는 종종 작은 폴리펩티드와 관련하여 사용되지만, 당업계에서의 이들 용어의 용법은 중복된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 유전자 산물 및 그의 단편에 대해 언급하는 경우에 본원에서 교환가능하게 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 산물, 자연 발생 단백질, 상동체, 오르토로그, 파라로그, 단편 및 상기 언급된 것의 다른 등가물, 변이체, 단편 및 유사체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA), 적절한 경우에, 리보핵산 (RNA), 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생 뉴클레오티드과 유사한 방식으로 대사 작용하는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만이 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열까지도 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축중성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되어 있는 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다 (문헌 [Batzer, et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985), 및 Rossolini, et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]). 용어 "핵산"은 또한 등가물로서 뉴클레오티드 유사체로부터 생성된 RNA 또는 DNA의 유도체, 변이체 및 유사체, 및 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "짧은 간섭 RNA" (siRNA) (또한 본원에서 "소형 간섭 RNA"로서 지칭됨)는 예를 들어 RNAi에 의해 표적 유전자의 발현을 억제하는 기능을 하는 작용제로서 정의된다. siRNA는 화학적으로 합성될 수 있으며, 이는 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있거나, 또는 이는 숙주 세포 내에서 생성될 수 있다. siRNA 분자는 또한 이중 가닥 RNA의 절단에 의해 생성될 수 있으며, 여기서 1개의 가닥은 불활성화되는 메세지와 동일하다. 용어 "siRNA"는 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 유도하는 작은 억제 RNA 듀플렉스를 지칭한다. 이들 분자는 길이가 다양할 수 있으며 (일반적으로 18-30개 염기 쌍), 안티센스 가닥에 그의 표적 mRNA에 대해 다양한 정도의 상보성을 가질 수 있다. 전부는 아니지만 몇몇 siRNA는 센스 60 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 5' 또는 3' 말단에 쌍을 형성하지 않은 돌출된 염기를 갖는다. 용어 "siRNA"는 2개의 개별 가닥의 듀플렉스, 뿐만 아니라 듀플렉스 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일 가닥을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "shRNA"는 RNAi 및/또는 siRNA 종과 같이 기능하지만 shRNA 종이 안정성 증가를 위한 이중 가닥 헤어핀-유사 구조인 점에서 상이한 짧은 헤어핀 RNA를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "RNAi"는 간섭 RNA를 지칭하거나, 또는 RNA 간섭 분자는 유전자 발현을 억제하는 핵산 분자 또는 그의 유사체, 예를 들어 RNA-기재 분자이다. RNAi는 선택적 전사후 유전자 침묵의 수단을 지칭한다. RNAi는 특정한 mRNA의 파괴, 또는 RNA, 예컨대 mRNA의 프로세싱 또는 번역의 방해를 초래할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "효소"는 반응의 완결시 파괴되지 않거나 실질적으로 변형되지 않고 다른 물질의 화학 반응을 촉매하는 단백질 분자를 지칭한다. 용어는 자연 발생 효소 및 생명공학적 효소 또는 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 효소 패밀리의 예는 키나제, 데히드로게나제, 옥시도리덕타제, GTPase, 카르복실 트랜스퍼라제, 아실 트랜스퍼라제, 데카르복실라제, 트랜스아미나제, 라세마제, 메틸 트랜스퍼라제, 포르밀 트랜스퍼라제 및 케토데카르복실라제를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "압타머"는 선택된 비-올리고뉴클레오티드 분자 또는 분자의 기를 특이적으로 인식할 수 있는 단일-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 부분적으로 이중-가닥 또는 이중-가닥인 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 일부 실시양태에서, 압타머는 비-올리고뉴클레오티드 분자 또는 분자의 기를 왓슨-크릭 염기 쌍형성 또는 삼중체 형성 이외의 메카니즘에 의해 인지한다. 압타머는 비제한적으로 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 및 백본 변형, 분지점 및 비-뉴클레오티드 잔기, 기 또는 브리지를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 규정된 서열 절편 및 서열을 포함한다. 분자에 대한 결합을 위한 압타머를 선택하는 방법은 당업계에 널지 공지되어 있으며 당업자가 용이하게 이용가능하다.
본원에 사용된 용어 "항체" 또는 "항체들"은 무손상 이뮤노글로불린을 지칭하거나 또는 Fc (결정화가능한 단편) 영역 또는 Fc 영역의 FcRn 결합 단편을 갖는 모노클로날 또는 폴리클로날 항원-결합 단편을 지칭한다. 용어 "항체"는 또한 "항체-유사 분자", 예컨대 항체의 단편, 예를 들어 항원-결합 단편을 포함한다. 항원-결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. "항원-결합 단편"은 특히, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, 및 상보성 결정 영역 (CDR) 단편, 단일-쇄 항체 (scFv), 단일 도메인 항체, 키메라 항체, 디아바디, 및 폴리펩티드에 대해 특이적인 항원 결합을 제공하기에 충분한 최소한의 이뮤노글로불린 부분을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 선형 항체는 또한 본원에 기재된 목적에 포함된다. 용어 Fab, Fc, pFc', F(ab')2 및 Fv는 표준 면역학적 의미로 사용된다 (문헌 [Klein, Immunology (John Wiley, New York, N.Y., 1982); Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York); 및 Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)]). 다양한 항원에 대해 특이적인 항체 또는 항원-결합 단편은 판매사, 예컨대 R&D 시스템즈(R&D Systems), BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), (e-바이오사이언시스(e-Biosciences) 및 밀테니(Miltenyi)로부터 상업적으로 입수가능하거나, 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 이들 세포-표면 마커에 대해 발생시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 그의 존재가 항원 결합에 필요한 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 식별되는 3개의 CDR 영역을 갖는다. 각각의 상보성 결정 영역은 카바트(Kabat)에 의해 정의된 바와 같은 "상보성 결정 영역"으로부터의 아미노산 잔기 (즉, 대략 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 이들 잔기 (즉, 대략 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)])를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상보성 결정 영역은 카바트에 따라 규정된 CDR 영역 및 초가변 루프 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 수 있다.
표현 "선형 항체"는 문헌 [Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 탠덤 Fd 절편의 쌍 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하며, 항원 결합 영역의 쌍을 형성한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본원에 사용된 표현 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 의미하도록 의도된다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. (문헌 [Plueckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]).
본원에 사용된 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH - VL)에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. (EP 404,097; WO 93/11161; 문헌 [Hollinger et ah, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, P0:6444-6448 (1993)]).
본원에 사용된 용어 "소분자"는 몰당 약 10,000 그램 미만의 분자량을 갖는 펩티드, 펩티드모방체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 압타머, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 유기 또는 무기 화합물 (즉, 이종유기 및 유기금속 화합물을 포함함), 몰당 약 5,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰당 약 1,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰당 약 500 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르, 및 다른 제약상 허용되는 형태를 포함하나 이에 제한되지는 않는 천연 또는 합성 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "박테리아"는 박테리아의 모든 변이체, 예를 들어 원핵 유기체 및 시아노박테리아를 포함하도록 의도된다. 박테리아는 작고 (약 1 m의 전형적 선형 치수), 비-구획화되어 있으며, 원형 DNA 및 70S의 리보솜을 갖는다.
본원에 사용된 용어 "항원"은 선택적 결합제, 예컨대 항체에 의해 결합될 수 있고, 추가로 그 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체의 생산을 도출하기 위해 동물에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 용어 "항원"은 또한 MHC 분자에 의해 제시되는 경우에 항체 또는 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 결합될 수 있는 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "항원"은 또한 T-세포 에피토프를 포괄한다. 항원은 추가로 면역계에 의해 인지될 수 있고/거나, B- 및/또는 T-림프구의 활성화로 이어지는 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나, 이는 적어도 특정 경우에 항원이 Th 세포 에피토프를 함유하거나 또는 이에 연결되고, 아주반트에 주어질 것을 요구할 수 있다. 항원은 하나 이상의 에피토프 (B- 및/또는 T-에피토프)를 가질 수 있다. 상기에 언급된 특정 반응은 항원이 바람직하게는 전형적으로 고도로 선택적인 방식으로 그의 상응하는 항체 또는 TCR과 반응할 것이고 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 다수의 다른 항체 또는 TCR과는 그렇지 않을 것임을 나타내도록 의도된다. 본원에 사용된 항원은 또한 몇몇 개별적 항원의 혼합물일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "바이러스"는 단백질에서 포막된 핵산으로 구성된 감염원를 지칭한다. 이러한 감염원은 자율적 복제가 불가능하다 (즉, 복제는 숙주 세포의 기작의 사용을 요구함). 바이러스 게놈은 단일-가닥 (ss) 또는 이중-가닥 (ds), RNA 또는 DNA일 수 있고, 역전사효소 (RT)를 사용할 수 있거나 또는 사용할 수 없다. 추가로, ssRNA 바이러스는 센스 (+) 또는 안티센스 (-)일 수 있다. 예시적인 바이러스는 dsDNA 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스), ssDNA 바이러스 (예를 들어, 파르보바이러스), dsRNA 바이러스 (예를 들어, 레오바이러스), (+)ssRNA 바이러스 (예를 들어, 피코르나바이러스, 토가바이러스), (-)ssRNA 바이러스 (예를 들어, 오르토믹소바이러스, 라브도바이러스), ssRNA-RT 바이러스, 즉 라이프사이클에 DNA 중간체를 갖는 (+)센스 RNA (예를 들어, 레트로바이러스) 및 dsDNA-RT 바이러스 (예를 들어, 헤파드나바이러스)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 또한 야생형 (천연) 바이러스, 사멸된 바이러스, 살아있는 감쇠된 바이러스, 변형된 바이러스, 재조합 바이러스 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 바이러스의 다른 예는 외피보유 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 비-외피보유 바이러스, 박테리오파지, 재조합 바이러스 및 바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "박테리오파지"는 박테리아를 감염시킨 바이러스를 지칭한다.
용어 "치료제"는 당업계에 인정되며, 임의의 대상체에서 국소적으로 또는 전신적으로 작용하는 생물학적, 생리학적, 또는 약리학적 활성 물질인 화학적 모이어티를 지칭한다. 또한 "약물"로 지칭되는 치료제의 예는 공지된 참조 문헌, 예를 들어 머크 인덱스(Merck Index), 의사 처방 참고집, 및 치료제의 약리학적 기초(The Pharmacological Basis of Therapeutics)에 기재되어 있으며, 이들은 의약; 비타민; 미네랄 보충제; 질환 또는 질병의 치료, 예방, 진단, 치유 또는 완화에 사용하기 위한 물질; 신체의 구조 또는 기능에 영향을 주는 물질; 또는 생물학적으로 활성화되거나 또는 생리학적 환경에 놓아둔 후 더 활성화되는 전구-약물을 비제한적으로 포함한다. 다양한 형태의 치료제가 사용될 수 있으며, 대상체에의 투여 후 대상 조성물로부터 인접한 조직 또는 유체 내에 방출될 수 있다. 예는 스테로이드 (예를 들어, 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토스테론, 안드로스테론, 콜레스테롤, 노르에틴드론, 디곡시게닌, 콜산, 데옥시콜산, 및 케노데옥시콜산) 및 스테로이드의 에스테르, 붕소-함유 화합물 (예를 들어, 카르보란), 화학요법제 뉴클레오티드, 약물 (예를 들어, 항생제, 항바이러스, 항진균제), 에네디인 (예를 들어, 칼리케아미신, 에스페라미신, 디네미신, 네오카르지노스타틴 발색단, 및 케다르시딘 발색단), 중금속 복합체 (예를 들어, 시스플라틴), 호르몬 길항제 (예를 들어, 타목시펜), 비-특이적 (비-항체) 단백질 (예를 들어, 당 올리고머), 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 표적 핵산 서열 (예를 들어, mRNA 서열)에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드), 펩티드, 단백질, 항체, 광역학적 작용제 (예를 들어, 로다민 123), 방사성핵종 (예를 들어, I-131, Re-186, Re-188, Y-90, Bi-212, At-211, Sr-89, Ho-166, Sm-153, Cu-67 및 Cu-64), 독소 (예를 들어, 리신), 및 전사-기반 제약을 포함한다.
본원에 사용된 "대상체"는 인간 또는 동물을 의미한다. 통상적으로 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥 동물이다. 영장류는 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 거미 원숭이 및 마카크, 예를 들어 레서스를 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 우드척, 페릿, 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 사냥 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종, 예를 들어 집고양이, 개 종, 예를 들어 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어 닭, 에뮤, 타조 및 어류, 예를 들어 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 환자 또는 대상체는 상기한 것의 임의의 하위세트, 예를 들어, 상기한 것 모두를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어 인간이다.
바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있으나, 이들 예로 제한되지는 않는다.
작업 실시예 이외에, 또는 달리 표시되지 않은 경우에, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 바와 같이 이해되어야 한다. 용어 "약"은 백분율과 관련되어 사용되는 경우에 ±1%를 의미할 수 있다.
본 개시내용의 실시양태의 기재는 완전하거나 본 개시내용이 개시된 정확한 형태로 제한되도록 의도하지 않는다. 본 개시내용의 구체적 실시양태 및 이에 대한 실시예는 설명 목적을 위해 본원에 기재되며, 관련 분야의 숙련자들이 인지하는 바와 같이 다양한 등가의 변경이 본 개시내용의 범위 내에서 가능하다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서대로 제시되는 한편, 대안적 실시양태는 기능을 다른 순서대로 수행할 수 있거나 또는 기능이 실질적으로 공동으로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 적절하게 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 실시양태는 조합하여 추가의 실시양태를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 측면은 필요에 따라 상기 참조물의 조성, 기능 및 개념, 및 본 개시내용의 추가의 실시양태를 제공하기 위한 적용을 이용하기 위해 변형될 수 있다. 상세한 설명에 비추어 본 개시내용에 대해 이들 및 다른 변화가 이루어질 수 있다.
임의의 상기 실시양태의 특정 요소는 조합되거나 다른 실시양태에서의 성분으로 치환될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 특정 실시양태와 연관된 이점이 이러한 실시양태와 관련하여 기재되었으며, 다른 실시양태도 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있고, 본 개시내용의 범위 내에 포함되기 위해 모든 실시양태가 이러한 이점을 반드시 나타낼 필요는 없다.
확인된 모든 특허 및 기타 간행물은 본 발명과 함께 사용될 수 있는 이같은 간행물에 기술된 방법론을 예를 들어 기술하고 개시하기 위한 목적으로 본원에 명확하게 참고로 포함된다. 이들 간행물은 본원의 출원일 전에 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 이와 관련하여 어느 것도 본 발명자들은 종래 발명으로 인한 또는 임의의 다른 이유 때문에 상기 개시보다 선행할 권리를 가지지 않는 인정으로서 해석되어서는 안된다. 이들 문헌의 일자에 대한 모든 진술, 또는 이들 문헌의 내용에 관한 설명은 본 출원인에게 가용한 정보에 기초되고, 이들 문헌의 일자 또는 내용의 정확함에 관한 인정으로서 성립되지 않는다.
개시된 방법을 이해하고 이용하기에 필요한 물질, 절차 및 고려사항이 본원에 기재된 방법 및 조성물의 다양한 실시양태를 입증하고 설명하는 실험적 결과 및 비제한적 실시예로서 본원에 기재된다. 본원에 기재된 다양한 측면의 일부 실시양태는 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
생체물질의 형태학적 및 화학적 특성의 역할이 이식물의 수준에서 염증 반응의 조절에 작용하는지 연구하는 실험이 본원에 기재된다. 3가지 상이한 크기의 실크 피브로인 입자 (2 μm, 1 μm, 및 500 nm 미만)에 의해 유도된 염증 반응의 조절을 평가하였다. 3가지 항염증 약물을 염증 반응을 감소시키는지에 대해 연구하였다: 덱사메타손, 널리-공지된 항염증 글루코코르티코이드; 심바스틴, 혈중지질저하 약물; 및 니코틴, 최근 항염증 특성을 갖는 것으로 밝혀진 정신자극제 및 진통제. 이러한 약물은 특유의 작용 메카니즘 및 이차 효과를 갖는다. 염증 반응을 평가하기 위해, 말초 혈액으로부터 추출된 단핵구로부터 분화된 불멸화된 대식세포 (예를 들어, THP1), 1차 대식세포, 및 수지상 세포 (DC) 상에서 시험관내 연구를 수행하였다. 시토카인 및 케모카인 생산, 유전자 발현 및 세포 형태를 평가하였다.
본원에 기재된 실험의 한 가지 목적은 시험관내에서
Figure pct00013
("대식세포"에 대한 표준) 거동 (예를 들어, 비제한적으로, 형태, 시토카인 분비 및 발현)의 평가에 의해 및 생체내에서 조직 조직학 및 세포 분류를 이용하는 염증 세포의 확인에 의해 염증 반응에 대한 실크 입자 크기 (3가지 크기: 2μm, 1 μm, 및 <500nm)의 효과를 조사하는 것이었다. 추가의 목적은 입자에 구속된 항염증 약물 및 펩티드를 이용하여 입자에 의해 유도된 염증 반응을 조절하는데 집중하였다. 시험관내에서
Figure pct00014
및 DC의 거동은 그의 형태, 시토카인 분비 및 유전자 발현을 조사함으로써 관찰하였다.
시험관내 및 생체내에서의 실크 피브로인 입자에 대한 염증 반응에 관한 정보가 본원에 기재된다. 그의 염증 작용을 감소시키고 치유 및 조직 재형성을 촉진하기 위한 실크 피브로인 입자의 기능화가 본원에 추가로 기재된다. 시험관내 실험을 THP1 분화된
Figure pct00015
(인간 단핵구성 백혈병 세포주) 및 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리된 인간 1차
Figure pct00016
및 DC 상에서 수행하였다.
실시예 1. 염증 반응에 대한 실크 매트릭스와 연관된 후보 약물의 효과를 평가하기 위한 예시적인 물질 및 방법
방법. 실크 입자와 연관된 약물의 염증 반응에 대한 효과를 평가하기 위한 실험을 설계하였다. 약물 및 대식세포-편향제 (예를 들어, LPS)를 배지에 첨가하여 염증유발 표현형으로의 활성화를 우선하는 감염성 환경을 자극하였다. 일부 실시양태에서, 실크 피브로인 입자 및 항염증 약물은 함께 혼합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항염증 약물은 실크 피브로인 입자 상에 흡착될 수 있다. 이러한 실시양태에서, 약물은 실크로부터 배지로 서서히 방출될 수 있으며, 이에 따라 세포 반응은 이후의 시점에서 모니터링할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염증성 약물은 실크 피브로인 입자 또는 필름에 비-공유 부착될 수 있다.
일반적으로 실크 피브로인-기재 매트릭스 (예를 들어, 실크 피브로인 입자)는 단독으로 낮은 수준의 염증 반응을 유도하므로, 염증 반응을 증가시키는 것은 약물 효과의 평가를 용이하게 하였다. 또한, 음성 및 양성 대조군을 실험에 첨가하여 상이한 실험군을 비교 및 평가하였다. 음성 대조군은 세포 배지만을 함유하였고, 양성 대조군은 대식세포-편향제 (예를 들어, LPS)를 함유하였으나 항염증 약물은 함유하지 않은 세포 배지를 함유하였다. 하기 분석을 2개의 시점, 예를 들어 1일 및 3일에 수행하여, 즉각적 및 지연된 약물 효과를 평가하였다.
염증 반응을 다양한 실크 피브로인-기재 매트릭스, 예를 들어 실크 피브로인 입자 및 필름 상에서 분석하였다. 실크 피브로인 필름 상에서 수행된 실험이 대조군으로서의 역할을 하였으며, 이는 이들에 의해 유도된 염증 반응이 널리-특성화되어 있기 때문이었다. 이러한 확립된 데이터는 염증 반응에 대한 형태의 효과 및 그의 조절되는 능력의 비교를 허용하였다.
시토카인 및 케모카인 발현: ELISA 및 RT - PCR 방법. 염증 반응을 평가하기 위해, THP1 분화된 세포 및 1차
Figure pct00017
및 DC에 의해 발현 및 생산된 시토카인 및 케모카인의 대규모 스크린을 분석하였다. 이들의 생산 및 배지 환경으로의 방출은 ELISA 샌드위치 기술을 이용하여 평가하였다. 이러한 널리 이용되는 기술은 모노클로날 항체를 사용하며, 이는 검정의 감수성을 직접 또는 간접 ELISA 기술보다 2 내지 5배 더 크게 하였다. 본원에 기재된 실험에서는 TNF-α 시토카인 방출을 선택하였으며, 이는 이것이
Figure pct00018
뿐만 아니라 DC에 의해 생산되는 통상적인 염증유발 시토카인이기 때문이다. 그러나, 다른 염증-연관 시토카인이 또한 측정될 수도 있다.
이론에 제한되지 않고, 시토카인 및 케모카인의 유전자 발현을 RT-PCR에 의해 평가하였으며, 이는 단백질이 생산 및 분비되기 전에 상류 지점에서의 반응 평가를 허용하기 때문이다. 따라서, 시토카인 및 케모카인 발현은 단백질 생산 및 세포 반응과 상관될 수 있다. 시토카인 유전자의 발현이 반드시 시토카인의 생산을 의미하지는 않는다는 것에 주목해야 한다. 예를 들어, 세포는 전사되고, 불활성 형태로 저장된 후에, 이후에 필요에 따라 빠르게 방출되는 다수의 유전자를 생산할 수 있다.
Figure pct00019
의 경우에, TNF-α 유전자 발현을 분석하여 그의 분비와 상관시켰다. 다른 시토카인의 유전자 발현을 또한 분석하였다. 예를 들어, TGF-β 유전자 발현을 분석하였으며, 여기서 TGF-β는 세포 증식을 촉진하는 시토카인이고, 치유 및 재형성 경로에 보다 많이 관여한다. IL-10을 분석하였고, 여기서 IL-10은 항염증 시토카인이며, 심바스타틴 및 덱사메타손 자극에 대한 노출시에 발현된다. DC의 경우에, IL-1β 유전자 발현을 평가하였으며, 여기서 IL-1β는 DC에 의해 보다 많은 양으로 분비되는 염증유발 시토카인이다. IL-1RA는 IL-1에 대한 길항제 수용체로서, 이는 일반적으로 IL-1β 유전자 발현을 방해할 수 있으며, 이에 따라 IL-1RA 및 IL-1β의 유전자 발현을 분석할 수 있다. IL-8 유전자 발현을 분석하였으며, 여기서 IL-8은 DC와 연관된 물질을 향한 저항성의 메카니즘에 연관된 케모카인이다. 하기 표 2는 일부 공지된 시토카인 및 케모카인 기능을 요약한 것이다.
Figure pct00020
세포 형태 및 입자 크기: SEM 방법.
Figure pct00021
및 DC는 식세포작용에 의해 작은 이물질 (최대 20 μm)에 대해 작용할 수 있으므로 (69), 그의 세포 형태의 변화를 평가하였다. 실제로,
Figure pct00022
및 DC가 활성화되어 이물질에 대한 식세포작용을 시작하였을 때, 그의 형태는 원형 세포에서 위족을 갖는 확장된 세포로 변화하였다. 활성화된
Figure pct00023
및 DC는 세포외 매트릭스 (ECM)를 생산하여, 예를 들어 보다 용이하게 주위 물질로 이동하고/거나 이에 부착된다. 염증 반응 동안, 는 함께 융합하여 거대 세포를 형성함으로써 보다 큰 물질을 포식할 수 있다. 이러한 형태는 활성화된 대식세포의 특징 중 하나이다. 세포 형태는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, SEM 영상화를 이용하여 세포 형태 및 시토카인 발현과 분비의 상관관계를 평가할 수 있다. SEM 영상화는 또한 세포 수의 감소가 사멸 또는 세포 부착의 결여로 인한 것인지 여부에 대한 정보를 제공할 수 있으므로 세포 생존율을 평가하는데 이용될 수 있다. 또한, SEM 영상화는 크기 및 응집의 측면에서 실크 피브로인 입자의 품질 조사를 허용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 실크 피브로인 입자의 식세포작용 및/또는 분해는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 특성화될 수 있다.
물질. 본원에 기재된 실시예에 사용된 동충하초분말은 타지마 쇼지 캄파니 리미티드(Tajima Shoji Co. Ltd) (일본 요코하마)에서 공급하였다. RPMI 1640 배지, 태아 소 혈청 (FBS), DMEM 배지, 페니실린-스트렙토마이신 (Pen-Strep), 포스페이트 완충 염수 (PBS), 둘베코 변형 PBS, 및 울트라 정제수는 인비트로젠(Invitrogen) (캘리포니아주 칼스배드)으로부터 구입하였다. 림폴라이트(Lympholyte)®를 어큐레이트 케미칼(Accurate Chemical) (뉴욕주 웨스트버리)로부터 구입하였다. 에스케리키아 콜라이 EH100으로부터의 리포폴리사카라이드 (LPS), 에틸렌디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 탄산나트륨, 및 브로민화리튬을 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) (미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다. 덱사메타손, 니코틴 (페스타날(PESTANAL)®) 및 심바스타틴을 또한 시그마 알드리치 (미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하고, 1mg/ml, 50mg/ml 및 5mM μg/ml의 원액을 각각 -20℃에 저장하였다.
일부 실시양태에서, 항염증 분자, 예컨대 덱사메타손, 니코틴 및 심바스타틴 뿐만 아니라, 항염증 펩티드 (예를 들어, 비제한적으로 항-미생물 LL-37 펩티드 및 아포지단백질 E)를 또한 사용할 수 있다.
실크 제조. 약 5 g의 봄빅스 모리 분말을 우선 작은 조각으로 절단하고, 이전에 기재된 바와 같이 ~0.02 M 탄산나트륨의 수용액에서 ~30분 동안 비등시켜 접착제-유사 세리신 단백질을 제거하였다 (70). 이어서, 추출된 실크 피브로인을 증류수에서 20분마다 3회 완전하게 세정하여 탄산나트륨을 제거하였다. 공기 건조 적어도 약 12시간 후에, 추출된 실크 피브로인을 ~9.3 M LiBr 용액에서 60℃에서 최소 4시간 동안 용해시켰다. 완전히 용해되면, 용액을 3일 동안 슬라이드-a-용해기 투석 카세트 (MWCO 3500, 피어스)를 이용하여 증류수에 대해 투석하여 염을 제거하였다 (제1일에 3회, 제2일에 2회 및 제3일에 1회). 이어서, 용액을 약 5-10℃에서 20분 동안 10,000 rpm에서 2회 원심분리하여 실크 응집체 뿐만 아니라 본래 분말로터의 잔해물을 제거하였다. 실크 피브로인 수용액의 최종 농도는 1 ml의 용액을 칭량하고, 건조시키고, 60℃에서의 건조 후에 그의 잔류 고체에 대해 비교하여 결정하였다. 수성 실크 피브로인 용액은 대략 8% (w/v)이다. 수성 실크 피브로인 용액은 벌꿀색으로 보였으며, 이는 우수한 추출을 나타낸다. 원액 실크 용액을 ~4℃에 저장하였으며, 약 4주 이상 동안 안정하였다.
실크 입자 제조. 실크 피브로인 입자를 이전에 기재된 바와 같이 상 분리를 유도하는 인산칼륨 용액을 사용하는 수성 염 추출 공정을 이용하여 제조하였다 (27). 실크 피브로인 입자의 크기는 사용된 실크 피브로인 수용액의 용액과 직접 관련될 수 있다. 상이한 크기의 실크 피브로인 입자, 예를 들어 SP1로 지칭되는 ~2 μm 크기의-입자 (증류수에 희석된 ~1%의 실크 피브로인 원액), SP0.5로 지칭되는 1 μm 크기의-입자 (증류수에 희석된 ~0.5%의 실크 피브로인 원액) 및 SP0.1로 지칭되는 500 nm 미만의 크기의-입자 (증류수에 희석된 ~0.1%의 실크 피브로인 원액)를 평가하였다. 예를 들어, 약 1.5 M K2HPO4 (pH ~8)의 용액을 제조하고, ~10 mL를 ~15 mL 팔콘 튜브에 부었다. 적절한 농도를 갖는 ~2 mL의 실크 피브로인 용액은 원액을 증류수로 희석하여 제조하였다. 이어서, 실크 피브로인 용액을 피펫을 사용하여 빠르게 인산칼륨 용액에 1:5의 부피비로 첨가하였다. 생성된 실크 피브로인 입자를 ~2시간 내지 밤새 ~4℃에 저장하였다. 실크 피브로인 입자를 세정하여 입자 합성에 사용된 용매를 제거하였다. 예를 들어, 실크 피브로인 입자를 함유하는 용액을 4회: 증류수에서 3회 및 ~70% 에탄올에서 1회 15분 동안 2500xg에서 원심분리하였다. 각각의 원심분리 후에, 상청액을 제거하고, 실크 입자를 적절한 용액에 재분산시켰다. 에탄올에서의 마지막 원심분리 후에, 상청액을 조심스럽게, 예를 들어 피펫으로 제거하고, 입자 펠릿을 ~70℃에서 건조시켰다. 펠릿이 건조되었을 때, 이들을 칭량하고, 적절한 부피의 70% 에탄올을 첨가하여 실크 피브로인 입자의 각각의 용액에 대해 20 mg/mL의 최종 농도로 만들었다. 용액을 실온에서 단단히 밀봉된 튜브에 저장하여 에탄올의 증발을 방지하고 오염을 방지하였다. 세포를 시딩하기 적어도 4시간 전에, 30 ul의 입자 용액을 96-웰 조직 플레이트에 플레이팅하여 조직 배양 후드 하에서 건조시켰다. 완전히 건조되면, 실크 입자를 함유하는 플레이트를 세포 시딩을 위해 준비하였다.
실크 필름 제조. 원액 실크 피브로인 용액으로부터, ~2% 용액을 증류수로 만들었다. 세포를 시딩하기 전날에, ~30 μl의 실크 피브로인 용액을 96-웰 조직 플레이트의 웰에 플레이팅하여 조직 배양 후드 하에서 밤새 건조시켰다. 다음날, ~50 μl의 메탄올을 각각의 웰에 첨가하고, 약 0.5-1시간 동안 후드 하에서 인큐베이션하여 실크 단백질을 β-시트 형성에 의해 가교시켰다. 잉여량의 메탄올을 제거한 후에, 실크 필름을 UV 광 아래에 약 30분 동안 노출시킴으로써 멸균시키고, 약 4시간 동안 후드 하에서 건조시켰으며, 그 후에 이들을 세포 시딩을 위해 준비하였다.
THP1 세포 배양. 인간 단핵구성 백혈병 세포주 THP-1 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), 버지니아주 마나사스)을 5% CO2에서 10% 태아 소 혈청 (인비트로젠) 및 항생제 (50 U/L 페니실린 G (나트륨 염), 50 mg/mL 스트렙토마이신) (인비트로젠)가 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 배양하였다. 본원에 기재된 실험을 위해, THP-1 세포를 처음에 96-웰 마이크로플레이트에 유사한 밀도 (예를 들어, 대략 1x106개 세포/웰 (~200μl))로 시딩하고, 5% CO2 및 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포의 수는 예를 들어 실험 시작시에 세포를 카운팅하고, 시딩 후에 알라마르 블루 방법을 이용하여 결정하였다. 당일에 세포를 적절한 수로 시딩하고, 포르보112-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)를 약 100 ng/ml의 최종 농도로 배지에 첨가하여 THP-1 단핵구를 THP-1 대식세포로 분화시켰다. 이어서, 플레이트를 약 48시간 동안 37℃ 및 ~5% CO2에서 인큐베이션하였다.
1차 단핵구 추출 및
Figure pct00025
및 DC 로의 분화. 공여자 (블러드 컴포넌트 캄파니(Blood Component company), 매사추세츠주 보스턴)로부터의 ~50 mL의 말초 혈액을 DPBS/EDTA에 (예를 들어, 약 5:1의 비로) 희석하였다. 이어서, 예를 들어 튜브의 바닥에 배치된 유리 피펫의 도움으로 1차 피콜(Ficoll) 구배를 실현시켰다. 림포라이트(Lympholyte)® (비 2:1)를 피펫에 매우 천천히 부어 명확하게 분리된 2개의 상을 수득하였다. 이어서, 블렌드를 ~400xg에서 ~20분 동안 실온에서 원심분리하였다. 혈장 및 피콜 상 사이의 백색 세포 상을 수집하고, ~1mM의 EDTA (v/v)가 포함된 DPBS로 희석한 후에 다시 ~150xg에서 약 10분 동안 실온에서 원심분리하였다. 이전 단계와 동일한 조건에 따라 또 다른 세정을 수행하였다. 이후에, 펠릿을 RPMI 1640 배지에 재현탁시키고, 2차 구배를 이전에 기재된 바와 동일한 방법에 따라 퍼콜(Percoll) (v/v)로 실현시켜 단핵구를 추출하였다. 이어서, 블렌드를 ~400xg에서 ~30분 동안 실온에서 원심분리하였다. 단핵구를 함유하는 백색 고리를 수집하고, ~1mM의 EDTA (v/v)가 포함된 빙냉 DPBS로 희석하고, ~150xg에서 ~10분 동안 ~4℃에서 원심분리 브레이크를 이용하여 원심분리하였다. 이어서, 펠릿을 빙냉 PBS에 재현탁시키고, 150xg에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 최종적으로, 펠릿을 10% 태아 소 혈청 (인비트로젠) 및 항생제 (50 U/L 페니실린 G (나트륨 염), 50 mg/mL 스트렙토마이신) (인비트로젠)가 보충된 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다. 세포를 200 μL의 배지 중에 웰당 50,000개 세포로 시딩하고, 5% CO2 및 37℃에서 인큐베이션하였다. 단핵구를 대식세포 및 수지상 세포로 분화시키기 위해, 배지에 각각 GM-CSF, 및 IL-4 플러스 GM-CSF를 보충하였다. 이어서, 플레이트를 약 48시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
리포폴리사카라이드 ( LPS ) 및 약물 자극 (덱사메타손, 심바스타틴 , 니코틴). 각 유형의 세포 (예를 들어, 대식세포 및 수지상 세포)의 경우, 분화 48시간 후에, 배양 배지를 RPMI 1640 배지 (음성 대조군) 또는 대식세포-편향제 (예를 들어, 200 ng/ml의 LPS)가 보충된 RPMI 1640 배지 (양성 대조군) 또는 대식세포-편향제 (예를 들어, 200 ng/ml의 LPS) 및 상이한 농도의 덱사메타손, 심바스타틴 또는 니코틴이 보충된 RPMI 1640 배지로 교체하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 5% CO2 중에 ~24시간 및 ~72시간 동안 인큐베이션하였다. 96-웰 조직 플레이트 설정의 개략도는 도 1을 참조한다. 플레이트 내의 처음 2개의 열은 각각 음성 및 양성 대조군을 포함하였다. 대식세포-편향제 (예를 들어, LPS) 및 약물 자극 1일 및 3일 후에, 배지에서의 대식세포 종양 괴사 인자 α (TNF-α)의 분비를, 예를 들어 5 pg/mL의 검출 한계를 갖는 ELISA 키트 (R&D 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 제조업제의 지침에 따라 결정하였다. 키트는 샌드위치 ELISA 방법을 이용하며, 여기서는 예를 들어 인간 TNF-α에 대한 마우스 모노클로날 항체를 96-웰 마이크로플레이트 상에 고정화시켜 세포 배양 상청액에 함유된 TNF-α에 결합시킨다.
상청액을 첨가하기 전에, PBS 중 1% 소 혈청 알부민 (BSA)의 용액을 웰에서 인큐베이션하여 플레이트 부위에 대한 비특이적 결합을 차단하였다. 상청액의 인큐베이션 및 세척 후에, 비오티닐화 염소 폴리클로날 항-인간 TNF-α 항체를 첨가한 다음 양고추냉이-퍼옥시다제에 접합된 스트렙타비딘을 첨가하였다. 샘플을 세척하고, 기질을 첨가하고, 웰을 20분 동안 인큐베이션하였다. 1 M의 황산 (H2SO4)을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응 생성물을 450 nm에서 측정하고 (570 nm에서의 플레이트 흡광도에 대해 정규화됨), 약 62.5 내지 약 2,000 pg/mL 범위의 농도에 걸쳐 선형 표준 곡선을 이용하여 TNF-α의 농도 (pg/mL)로 전환시켰다. TNF-α 방출은, 예를 들어 알라마르블루 검정 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)에 의해 결정된 샘플 부피 및 세포 수에 대해 정규화하였다. 알라마르블루 시약은 생존 세포에 의해 분홍색으로 변환되는 생체 시약으로서, 표준물을 참조하여 세포 수를 정량화할 수 있다. 시험은 일반적으로 세포 사멸 및 세포 부착의 결여로 인한 세포 수의 감소를 구분하지 않는다. 모든 세포 배양물 측정은 각각 3회 반복하여 수행하였다.
RNA 단리 및 실시간 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 ( RT - PCR ). 대식세포-편향제 (예를 들어, LPS) 및 약물 자극 1일 및 3일 후에, TNF-α, TGF-1β 및 IL-10 유전자 발현을 THP1 활성화 대식세포; 1차
Figure pct00026
로부터의 TNF-α, IL-1RN 및 IL10; 및 1차 DC로부터의 IL-1RN, IL-1β 및 IL-8로부터 분석하였다. 알라마르블루 검정 후에, RNeasy® 미니 키트를 제조업체의 프로토콜 (퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아)에 따라 사용하여 세포로부터 RNA를 단리하였다. RNA 샘플을 고용량 cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied biosystems))를 이용하여 역전사시켰다. 관심 유전자의 발현을 표 3에 주어진 바와 같이 택맥(Taqman)® 유니버셜 PCR 마스터 믹스 및 프라이머 (어플라이드 바이오시스템즈, 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 PCR에 의해 정량화하였다.
Figure pct00027
PCR 반응 조건은 ~50℃에서 ~2분, ~95℃에서 ~10분, 이어서 ~95℃에서 ~15초 동안 약 50 사이클, 및 ~60℃에서 ~1분이었다. 발현 데이터를 액틴-β, 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 정규화하였다. 인간 액틴-β에 대한 프라이머 서열은 다음과 같다:
Figure pct00028
주사 전자 현미경검사 ( SEM ). 알라마르 블루 검정 후에, ~1:25의 부피비로 희석된 ~100 μl의 글루타르알데히드를 웰에 첨가하고, 밤새 ~4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 증가하는 농도의 에탄올이 포함된 수성 에탄올 용액 중에서 각각 약 15분 동안 탈수시켰다 (10%, 30%, 60%, 80%, 90%, 및 100% 에탄올의 2개의 배스). 샘플을 밤새 건조시킨 후에, 절단하고, 탄소 테이프를 사용하여 SEM 샘플 조각에 부착시켰다. 이어서, 샘플을 대략 60초 동안 40 mA에서 백금/팔라듐 (Pt/Pd)으로 스퍼터 코팅하였다. 영상화를 자이스(ZEISS) 슈프라(Supra) 55 VP SEM 및 자이스에서 수행하였다.
일부 실시양태에서, LDH 세포독성 시험을 (예를 들어, 알라마르 블루 및 SEM 영상화에 부가하여) 수행하여 세포독성에 대한 정량적 결과를 생성할 수 있었다.
생체내 실험: PBS에서 제조한 다양한 크기의 실크 피브로인 입자 (예를 들어, ~2 μm, ~1 μm, 또는 500 nm 미만)를 마우스의 등에 피하로 주사하였다. 세포 분류 분석 (예를 들어, FACS 분석) 및 조직학적 분석을 위해 각 크기에 대해 3회 반복 시험을 이용하였다. 이들 분석을 3개의 시점: 제2 주사 후 ~1일, ~7일 및 ~3일에 수행하여, 각각 급성 및 만성 염증 반응 뿐만 아니라 관련된 면역 기억 효과를 평가하였다.
통계적 분석. 데이터의 통계적 분석을 2개의 샘플의 T-시험에 의해 수행하여 이분산을 평가하였다. p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. *는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타낸다.
실시예 2. ~2 μm-크기의 실크 피브로인 입자 ( SP1 ) 상에 시딩된 분화된 THP1 단핵구로부터의 시토카인 발현 및 분비 및 항염증 약물로의 조절.
도 2a-2c, 3a-3c, 4a-4c 및 6은 SP1 입자 (~2 μm) 상에 시딩하여 배양한 분화된 THP1 단핵구의 실험 결과를 나타낸다. 도 2a, 3a 및 4a는 THP1 대식세포를 다양한 항염증 약물 (예를 들어, 덱사메타손, 심바스타틴, 니코틴)에서 배양하였을 때 세포당 방출된 TNF-α의 농도 (pg/ml), 및 음성 대조군 (배지 단독)의 백분율로 표현된 세포 생존율을 보여준다. ELISA 및 알라마르 블루 결과는 약 20회 반복 웰의 평균이다. 도 2b-2c, 3b-3c 및 4b-4c는 THP1 대식세포를 각각 약 1일 및 3일 동안 배양하였을 때 TNF-α, TGF β 및 IL-10 유전자 발현은 양성 대조군 (대식세포-편향제, 예를 들어 LPS가 포함된 배지)과 비교한 변화 배수로 표현된다. RT-PCR 결과는 약 15개 샘플의 평균이다.
덱사메타손으로 자극한 SP1 입자 상에 시딩된 THP1 대식세포의 세포 생존율 및 이로부터의 시토카인 방출이 도 2a-2c에 제시된다. 1일 및 3일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출을 도 2a에서 합하였다. 도 2b 및 2c는 1일 및 3일에 TNFα, TGF-β 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
세포 생존율: 도 2a에 나타난 바와 같이, THP1 대식세포의 양이 사용된 2가지 최고 덱사메타손 농도, 즉 ~100 μg/ml 및 ~50 μg/ml에서 80 내지 90% 감소하였다. 덱사메타손 농도가 감소할수록 (예를 들어, ~12.5μg/ml 이하), 세포의 수는 2개의 대조군: 배지 및 LPS의 약 100%로 증가하였다. 이에 따라 2가지 보다 높은 농도 (예를 들어, ~100 μg/ml 및 ~50 μg/ml)의 덱사메타손이 세포독성이었으며, 보다 낮은 농도 (예를 들어, ~12.5μg/ml 이하)의 덱사메타손은 세포 생존을 허용하였다. 동일한 프로파일이 1일 및 3일 둘 다에서 관찰되었다.
TNF -α 방출: 도 2a에 나타난 바와 같이, 1일 및 3일 둘 다에서, 양성 및 음성 대조군은 서로 유의하게 상이하였으며, 여기서 보다 많은 TNF-α가 LPS 자극된 환경에서 방출되었다. 세포독성 농도 (~100 μg/ml 및 ~50 μg/ml)의 덱사메타손의 경우에, 양쪽 시점은 양성 대조군에 비해 보다 많은 양의 방출된 TNF-α를 보여주었다. 이론에 제한되지 않고, 사멸된 세포는 일반적으로 폭발적인 시토카인 방출을 일으킬 수 있다. 약 25 내지 3.125 μg/ml의 덱사메타손 농도로부터, 양쪽 시점에서, TNF-α 방출은 약 0.05 pg/ml로 안정하였으나, LPS 대조군보다 유의하게 적게 발현되지는 않았다.
유전자 발현: 도 2b에 나타난 바와 같이, ~25 내지 ~3.125 μg/ml의 농도의 덱사메타손에 대한 노출 1일 후에, TNF-α 및 TGF-β의 발현은 LPS 및 배지 대조군에 비해 하향조절되었고; IL-10은 배지 대조군에 비해 상향조절되었으며, 약 12.5 μg/ml의 덱사메타손 농도에서 (양성 대조군에 비해) 1 초과의 발현 변화 배수를 가졌다. 2가지 보다 낮은 농도, 6.25 및 3.125 μg/ml의 덱사메타손은 배지 대조군에서 관찰된 것보다 증가된 항염증 프로파일을 발생시켰다.
도 2c에 나타난 바와 같이, 다양한 농도의 덱사메타손에 대한 노출 3일 후에, LPS 대조군에 비해 TNF-α의 염증유발 반응의 유의한 감소가 나타나지 않았다. 세포독성 농도의 덱사메타손 (예를 들어, 100 μg/mL)에서, IL-10 유전자 발현이 매우 크게 상향조절되었으며, 그 결과 (양성 대조군에 비해 ~1011배-변화)는 도 2c에서 그래프 상에 나타낼 수 없었다. TGF-β가 또한 ~25 μg/ml을 제외한 모든 덱사메타손 농도에서 매우 크게 상향조절되었다. 그러나, 12.5 μg/mL 이하의 덱사메타손 농도는 배지 대조군과 유사한 프로파일을 보여주었으며, 이는 이들 농도에서 항염증 효과가 없음을 나타낼 수 있다. 유사한 방출 프로파일이 1일 및 3일에 관찰되었으나, 유전자 발현 프로파일은 전체적으로 상이하였다. 방출에는 반영되지 않을지라도 우수한 생존율을 나타내는 농도에서 유전자 발현에 대한 덱사메타손의 항염증 효과가 존재하는 것으로 추측할 수 있다. TNFα 유전자 발현이 특히 1일에 음성 대조군에서 보다 낮았으므로 약물은 실크 피브로인 입자에 의해 유도된 염증 반응을 감소시켰다.
심바스타틴으로 자극된 SP1 입자 상에 시딩된 THP1 대식세포의 세포 생존율 및 이로부터의 시토카인 방출은 도 3a-3c에 제시된다. 1일 및 3일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출을 도 3a에서 합하였다. 도 3b 및 3c는 1일 및 3일에서의 TNF-α, TGF-β 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
세포 생존율: 도 3a에 나타난 바와 같이, THP1 대식세포의 양이 사용된 최고 심바스타틴 농도, 즉 ~250 μg/ml (양쪽 시점) 및 ~125 μg/ml (오직 제3일 시점)에서 80 내지 90% 감소하였다. 심바스타틴 농도가 감소할수록, 세포의 수는 세포를 약 62.5μg/ml의 농도의 심바스타틴에 약 1일 동안 노출시켰을 때 또는 세포를 약 31.25 μg/ml의 농도의 심바스타틴에 약 3일 동안 노출시켰을 때 2개의 대조군: 배지 및 LPS에 비해 대략 90%로 증가하였다. 250 μg/ml 심바스타틴 농도는 세포독성이지만, 보다 낮은 농도는 배양 기간에 따라 우수한 생존율을 나타낼 수 있다. 예를 들어, THP1 대식세포를 약 1일 동안 배양하는 경우에 125 μg/ml 및 62.5 μg/ml 농도가 사용될 수 있다.
TNF -α 방출: 도 3a에 나타난 바와 같이, 2개의 대조군 (음성: 배지 및 양성: 배지+LPS)은 오직 1일에 유의하게 상이하였다. 보다 높은 심바스타틴 농도에서, TNF-α 방출은 양성 대조군보다 높았다. ~125 μg/ml 심바스타틴에서, TNF-α 방출은 1일에 음성 대조군으로부터 방출된 양보다 적었으며, TNF-α 방출은 3일에서는 예를 들어 높은 사멸 세포 수로 인해 여전히 매우 높았다. ~31.5μg/ml 심바스타틴 및 그 미만에서, TNF-α 방출은 약 0.07pg/ml에서 안정하였으나, 양성 대조군과 유의하게 상이하지는 않았다.
유전자 발현: 도 3b에 나타난 바와 같이, 1일에, 모든 심바스타틴 농도에서, TNF-α 및 TGF-β의 발현은 양성 대조군에 비해 하향조절되었고, IL-10은 양성 대조군에 비해 상향조절되었다. 62.5μg/ml 심바스타틴 치료에 해당하는 유전자 발현 프로파일은 IL-10, 항염증 시토카인의 증가된 발현이 존재하는 것을 제외하고는 음성 대조군과 거의 동일하였다.
도 3c에 나타난 바와 같이, 3일에, IL-10의 발현이 보다 높은 것을 제외하고는 항염증 시토카인에서 1일에 측정된 것과 유사한 유전자 발현 프로파일이 결정되었다. IL-10 유전자 발현은 250μg/ml 심바스타틴에서 (양성 대조군에 비해) 약 107배 변화하며 상향조절되었고, 최저 농도에서는 (양성 대조군에 비해) 약 1배-변화하며 점차적으로 감소하였다.
도 3a-3c의 결과는 함께 유전자 발현에 대한 심바스타틴의 항염증 효과를 보여준다. 음성 대조군에 비해 증가된 IL-10의 발현은 심바스타틴이 IL-10 발현을 활성화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 그러나, TNF 방출은 심바스타틴에 의해 감소되지 않았다.
니코틴으로 자극된 SP1 입자 상에 시딩된 THP1 대식세포의 세포 생존율 및 이로부터의 시토카인 방출이 도 4a-4c에 제시된다. 1일 및 3일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출을 도 4a에서 합하였다. 도 4b 및 4c는 1일 및 3일에서의 TNF-α, TGF-β 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
세포 생존율: 도 4a에 나타난 바와 같이, 세포 생존율은 양쪽 시점에서 유사한 것으로 관찰되었다. 3 mg/ml 니코틴 처리는 양쪽 시점에서 세포독성이었으며, ~1.5 mg/ml에서는 3일에 세포독성이 되었다. THP1 대식세포를 약 1.5 mg/ml 내지 93.75 μg/ml 니코틴에서 약 1일 동안 배양하거나 또는 약 750 μg/ml 내지 98.75 μg/ml에서 약 3일 동안 배양하였을 때, 생존 THP1 대식세포의 백분율은 ~90% - ~120%에 도달하였다. 양성 및 음성 대조군 둘 다에서보다 약물로 처리된 배양물에 보다 많은 세포가 존재하였으므로 니코틴은 증식 효과를 갖는 것으로 보였다. 니코틴은 또한 단핵구의 대식세포로의 분화를 방지하여, 보다 긴 증식 기간을 허용할 수 있다. 750μg/ml 미만의 니코틴 농도를 사용하여 니코틴의 항염증 효과를 평가할 수 있다.
TNF -α 방출: 도 4a에 나타난 바와 같이, 2개의 대조군은 1일 및 3일 후에 유의하게 상이하지 않았다. 보다 높은 농도 (예를 들어, 750 μg/ml 초과)의 니코틴에서, 양성 대조군 (임의의 연관 약물이 없는 LPS)보다 많은 TNF-α가 양쪽 시점에서 방출되었다. 양쪽 시점에서 750 μg/ml 미만의 니코틴 농도의 경우에, TNF-α 방출은 양성 대조군 수준 뿐만 아니라 음성 대조군 (대략 0.06 pg/ml 수준)에 비해 감소하였다.
유전자 발현: 도 4b에 나타난 바와 같이, 1일에, 우수한 세포 생존율을 나타내는 니코틴 농도 (~98.75 μg/ml 내지 ~1.5 mg/ml)는 ~375 μg/ml 및 ~187.5 μg/ml에서 TNF-α의 하향조절을 나타내었으며, 이는 음성 대조군에서 발현된 수준에 근접하였다. 세포독성 및 생존 환경 둘 다에서, TGF-β 및 IL-10의 유전자 발현은 대조군에 비해 조절되지 않았다. IL-10 유전자 발현은 대조군에 비해 TGF-β보다 훨씬 큰 정도로 증가하였다.
도 4c에 나타난 바와 같이, 3일에 유사한 패턴의 TNF-α 발현이 결정되었으며, 여기서 TNF-α 발현은 음성 대조군보다 높았다. TGF-β 및 IL-10 유전자는 1일에 동일한 농도에 비해 하향조절되었다.
도 4a-4c의 결과에 기초하여, 니코틴의 항염증 효과는 덱사메타손 및 심바스타틴보다 덜 명확한 것으로 보인다. 일부 실시양태에서, 니코틴은 항염증 효과보다는 오히려 증식 효과를 유도할 수 있다.
도 5a-5c는 세포를 실크 피브로인 필름 상에 시딩하는 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 동일한 조건 하에 실크 피브로인 입자를 사용하여 THP1 대식세포를 배양한 5회 실험 (20개 샘플)으로부터의 세포 생존율 및 TNF-α 방출 결과를 도시한다.
세포 생존율: 도 5a-5c에 나타난 바와 같이, THP1 대식세포는 SP1 입자로부터 수득한 데이터에 비해 유사한 프로파일의 세포 생존율을 나타내었다. 실크 입자 실험에서 세포독성인 항염증 약물의 농도는 실크 필름 실험에서 세포독성을 유지하였다.
TNF -α 방출: 1일 및 3일을 비교하여, 2개의 대조군은 양쪽 시점 및 모든 항염증 약물 데이터 세트에서 유의하게 상이하였다. 도 5a는 ~25 μg/ml 및 ~12.5 μg/ml의 덱사메타손의 존재 하에 (LPS 대조군에 비해) TNF-α 방출의 유의한 감소를 보여준다. THP1 대식세포가 심바스타틴 및 니코틴의 경우에 SP1 입자 또는 실크 피브로인 필름과 접촉하였을 때 이들 세포에서 동일한 또는 유사한 프로파일이 관찰되었다 (도 5b-5c 대 도 3a 및 4a).
SP1 및 실크 피브로인 필름 중 THP1 대식세포의 배양물 사이의 하나 이상의 차이는 세포로부터 방출된 TNF-α의 농도가 SP1 상에서 배양된 것보다 작다는 것이다. 음성 대조군 (배지)에서 방출된 TNF-α의 농도는 SP1 상에 시딩된 세포에서 0.04 pg/ml였던 것에 비해 실크 피브로인 필름 상에 시딩된 세포에서는 약 0.02 pg/ml였다. 농도가 매우 낮더라도 SP1 입자가 실크 필름보다 더 염증유발 반응을 유도한다는 것이 흥미로웠다. 이와 같이, 물질의 형태는 그 자체로도 염증 반응에 영향을 미칠 수 있었으며, 여기서 마이크로-입자는 염증유발 경로를 촉진하는 것으로 보였다. 대조군은 실크 피브로인 입자 상에서보다 실크 피브로인 필름 상에서 보다 우수한 결과를 나타내었으며, 이는 필름 상에 시딩된 세포로부터 수득한 결과가 보다 재현가능하다는 것을 나타낼 수 있다.
항염증 약물의 농도 범위는 생존 세포 환경 및 염증유발 시토카인의 유의한 감소를 제공하도록 조정될 수 있다. 덱사메타손, 심바스타틴 및 니코틴은 TNF-α 방출의 유의한 감소를 보이지 않았으나, 덱사메타손은 유전자 발현에 대한 항염증 프로파일을 나타내었다. 또한, 양성 및 음성 대조군은 SP1 입자 상의 유전자 발현에 있어 유의하게 상이하지 않았으나, 이들은 실크 피브로인 필름 상에 있었다.
SEM 현미경에 의해 시각화된 대식세포 형태: 본 섹션은 SP1 입자 상에 시딩된 THP1 대식세포의 세포 생존율, TNF-α 방출 및 SEM 영상에 대한 데이터를 보여준다. 이들 세포를 배지, 대식세포-편향제 (예를 들어, ~200ng/ml의 LPS), 또는 대식세포-편향제 (예를 들어, ~200ng/ml의 LPS)를 함유하는 배지 중에 희석시킨 덱사메타손과 배양하였다. 다른 약물에 대한 SEM 영상은 이들이 덱사메타손에서 나타난 결과와 유사하였으므로 제시하지 않았다. SEM 영상은 입자 크기 분포를 보여주며, 세포 사멸 및/또는 비부착 세포로 인한 것인지를 결정하기 위한 세포 생존율 감소 연구를 허용한다. 또한, 이러한 영상은 대식세포의 형태가 활성화 특성의 측면에서 TNF-α 방출 및 유전자 발현 결과와 잘 매치된다는 것을 보여준다.
SP1 입자에 의해 자극되고 다양한 농도의 덱사메타손으로 조절된 THP1 대식세포의 TNF-α 방출 및 세포 생존율이 도 6에 제시된다. TNF-α 방출 및 세포 생존율에 대해 유사한 프로파일이 이전에 도 2a에 나타난 바와 같이 관찰되었다. 또한, 3.125 μg/ml의 덱사메타손에서 TNF-α 방출의 유의한 감소가 결정되었다. 도 7은 각각 1일 (A1-G1) 및 3일 (A3-G3)에 다양한 덱사메타손 농도에서의 SP1 입자 상에서 배양된 THP1 대식세포의 형태를 보여주는 SEM 영상의 세트를 보여준다. 음성 및 양성 대조군 사이의 대식세포 형태에서 예상된 차이가 1일 (도 7: A1,B1) 및 3일 (도 7: A3, B3)에 관찰되었다. 실제로, TNF-α 방출에서 나타난 바와 같이, 양성 대조군으로부터의 대식세포는 음성 대조군에서보다 더 활성화된다. 배지 대조군에서 (도 7: A1, A3), THP1 대식세포는 낮은 수준, 예를 들어 입자에 대한 부착을 허용하기에 충분한 수준의 ECM 생산과 함께 정상적인 둥근 형태를 나타내었다. 대조적으로, LPS가 포함된 양성 대조군에서는 (도 7: B1, B3), ECM의 증진된 생산 및 심지어는 3일에 일부 세포 융합이 존재하였으며 (도 7: B3), 이들은 둘 다 감염성 환경에 반응하여 활성화된 대식세포의 특성이다.
세포독성 농도 (도 7: C1, D1 및 C3, D3)의 덱사메타손의 경우에, 형태가 없는 및/또는 완벽하게 둥근 형태를 갖는 (세포가 비부착되어 사멸할 것임을 나타냄) 사멸 세포가 관찰되었다. 약 25 μg/ml (도 7: E1) 및 약 12.5μg/ml (도 7: F1)의 덱사메타손 농도에서, 생존한 활성화된 세포가 관찰되었으나, 양성 대조군보다는 적은 정도였다. 이러한 농도에서, THP1 대식세포는 그의 활성화를 보여주는 위족을 갖지만, 이들은 양성 대조군에서보다 적은 ECM을 분비한다. 흥미롭게도, 약 3.125 μg/ml의 덱사메타손 농도에서 (도 7: G1), 배지 대조군에서와 마찬가지로 보다 둥근 세포가 관찰되었으나, 이들 세포는 또한 그의 활성화를 보여주는 작은 위족을 갖는다. TNF-α 방출은 유의하게 감소하였으며, 음성 대조군에서 검출된 수준에 근접하였다. 3일에, 25μg/ml에서 (도 7: E3), 불규칙한 형태를 갖는 비-생존 세포 및 ECM 생산이 관찰되었다. 덱사메타손 농도가 12.5 μg/ml로부터 3.125 μg/ml로 감소함에 따라, 보다 많은 ECM 생산 및 큰 위족과 연관된 대식세포 활성화의 증가가 검출되었다. 세포는 ~12.5μg/ml에서보다 ~3.125 μg/ml 덱사메타손에서 보다 많은 TNF-α를 생산하였으며, 이는 세포의 형태가 그의 활성화의 정확한 지표일 수 있으며 ELISA 결과와 우수하게 일치한다는 것을 나타낸다. 또한, SEM 영상은 도 7:C1, E1 및 F3 (~2 μm의 스케일)에 나타난 바와 같이 SP1 입자가 조직 배양 플레이트 상에 잘 분산되며 이들이 약 2 μm의 균질한 크기를 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 3: ~1 μm-크기의 실크 피브로인 입자 ( SP0 .5) 상에 시딩된 분화된 1차 대식세포 및 수지상 세포로부터의 시토카인 발현 및 방출의 항염증 약물 조절
1일 및 5일 후에 1차 대식세포 및 수지상 세포의 배양물로부터 수득한 결과가 본 실시예에 기재된다. 세포를 SP0.5 입자 (크기 ~1 μm) 상에 시딩하고, 도 8에 나타낸 도식에 상세하게 기재된 바와 같이 다양한 농도의 덱사메타손, 심바스타틴 또는 니코틴으로 처리하였다. 도 9a, 11a 및 13a는 세포당 방출된 TNF-α의 농도 (pg/ml) 뿐만 아니라 1차 대식세포 배양물에서 음성 대조군 (배지)의 백분율로 표현된 세포 생존율을 도시하는 한편, 도 15a, 17a 및 19a는 세포당 방출된 TNF-α의 농도 (pg/ml) 뿐만 아니라 수지상 세포 (DC) 배양물에서 음성 대조군 (배지)의 백분율로 표현된 세포 생존율을 도시한다. 도 9b, 9c, 11b, 11c, 13b 및 13c는 1차 대식세포에서의 TNF-α, IL1-RA 및 IL-10 유전자 발현을 도시하는 한편, 도 15b, 15c, 17b, 17c, 19b 및 19c는 DC에서의 IL1-β, IL1-RA 및 IL-8을 도시하며, 여기서 변화 배수는 양성 대조군 (LPS)과 비교하여 표현하고, 이는 1로 정규화된다. 본 실시예는 SP0.5 입자, ~400 ng/mL LPS를 사용하였으며, 배양물은 이후의 시점, 5일에 조사하여 세포가 분화 및 반응하기에 충분한 시간을 제공하였다.
1차 대식세포 데이터 세트
도 9a-9c는 SP0.5 입자 상에 시딩하여 다양한 농도의 덱사메타손으로 자극한 1차 대식세포로부터의 데이터를 도시한다. 도 9a는 1일 및 5일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출을 보여준다. 도 9b 및 9c는 각각 1일 및 5일에서의 TNF-α, IL-1RA 및 IL-10 유전자 발현을 보여준다.
세포 생존율: 도 9a에 나타난 바와 같이, 세포 생존율은 1일 및 5일 사이에 상이하였다. 1일에서, 1차 대식세포의 생존율은 세포를 약 ~25 μg/ml 내지 ~1.6 μg/ml의 농도의 덱사메타손의 존재 하에 배양하였을 때 1일에 최대 80%인 반면, 세포 생존율은 5일에 대략 55%에서 일정하게 유지되었다. 1-일 배양물을 THP1 대식세포 및 1차 대식세포와 비교하였을 때, 80% 세포 생존율이 1차 대식세포의 경우에는 25 μg/ml 이하의 덱사메타손 농도에서 및 THP1 대식세포의 경우에는 12.5 μg/ml 이하에서 관찰되었다.
TNF -α 방출: 도 9a에 나타난 바와 같이, 1일 및 5일 둘 다에서, 양쪽 대조군은 TNF-α 방출이 유의하게 상이하였다. 또한 덱사메타손 농도를 양쪽 시점에서 ~25 μg/ml로부터 ~1.5625 μg/ml로 감소시켰을 때 TNF-α 방출이 유의하게 감소하였다. 또한, SP1 음성 대조군 결과와 비교하여, SP0.5 상의 음성 대조군으로부터 방출된 TNF-α의 농도가 예를 들어 절반으로 감소하였다는 것에 유의한다. LPS의 농도를 2배로 하는 것은 입자 크기에 관계없이 유사한 TNF-α 방출 (약 0.05 pg/mL)을 발생시킨다.
유전자 발현: 도 9b에 나타난 바와 같이, 1일에, 낮은 TNF-α 유전자 발현 및 IL-10의 높은 유전자 발현을 나타내는 항염증 유전자 프로파일이 관찰되었다. ELISA에 의해 측정시에 낮은 TNF-α 유전자 발현은 TNF-α 방출을 지지한다. 이러한 결과는 덱사메타손이 항염증 단백질, 예컨대 IL-10을 코딩하는 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, 음성 대조군에서 (양성 대조군에 비해) 1 초과의 배수-변화를 갖는 높은 수준의 TNF-α 유전자 발현이 관찰되었으며, 이에 따라 양성 대조군보다 더 컸다. 이러한 발견은 염증유발 프로파일에 보다 더 상응하며, ELISA 결과에 의해 뒷받침되지 않았다. 도 9c에 나타난 바와 같이, 5일에, 보다 낮은 TNF-α 유전자 발현 및 훨씬 더 높은 IL-10 유전자 발현을 나타내는 항염증 프로파일이 관찰되었다. 음성 대조군에서 대략 동일하게 높은 수준의 TNF-α 유전자 발현이 1일 및 5일에 관찰되었으나, 5일에는 또한 IL-1RA의 높은 유전자 발현이 존재하였다. 이러한 결과는 항염증 경로가 염증유발 경로와 균형을 이루기 위해 작용할 수 있다는 것을 나타낸다. 덱사메타손은 유전자 발현 및 TNF-α 방출에 의해 결정된 바와 같이 1차 대식세포에 대해 항염증 효과를 나타낼 수 있다. 효과적인 덱사메타손 농도의 범위는 약 25 μg/ml 내지 약 1.6 μg/ml 범위일 수 있다.
세포 형태: 도 10은 각각 1일 (A1-H1) 및 5일 (A5-H5)에서의 SP0.5 입자 상의 덱사메타손과 배양된 1차 대식세포의 형태를 도시하는 SEM 영상이다. 실시예 2에서의 THP1 대식세포로부터의 결과와 유사하게, 음성 및 양성 대조군 사이에서 대식세포 형태의 차이가 1일 (도 10: A1, B1) 및 5일 (도 10: A5, B5)에 관찰되었다. 양성 대조군에서 1차 대식세포가 보다 더 활성화되었으며, 음성 대조군에서보다 많은 융합을 나타내었다. 예를 들어, 도 10 (B5)은 대략 70μm의 길이를 측정한 세포를 보여준다. ~50μg/ml 덱사메타손에서 (도 10: C1, C5), 괴사성 세포가 관찰되었다. 도 10: E1, F1 및 G1에 나타낸 SEM 영상은 보다 높은 배율로 촬영하였으며, 세포가 보다 작고, 보다 둥글며, 낮은 수준의 ECM을 발현한다는 것을 보여주었고, 이는 이들이 배지 대조군에서보다 덜 활성화되었다는 것을 나타낸다. 그러나, 고배율 영상은, 특히 ~12.5 μg/ml 덱사메타손 농도에서 약간의 위족을 보여주었다 (도 10: E1). 최저 덱사메타손 농도에서 (도 10: H1), 대식세포는 보다 더 연장되었고 보다 많은 ECM을 침착시켰다. 5일에, 동일한 활성화 프로파일이 다양한 덱사메타손 농도에서 관찰되었고, 단 1일에서보다 5일에 더 많은 ECM이 존재한다는 것은 예외였으며, 이는 동일한 시점에서 대조군에 비해 5일에 보다 높은 TNF-α 방출을 나타낸다. 덱사메타손을 사용한 1차 대식세포는 5일에 배지 대조군에서보다 덜 활성화되는 것으로 보였으며, 1차 대식세포의 형태는 ELISA 및 RT-PCR 결과에 잘 상응하였다. SP0.5 입자는 도 10:C1 (~1 μm의 스케일)에 나타난 바와 같이 조직 배양 플레이트 상에 잘-분산되고, 약 1 μm의 균질한 크기를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
SP0.5 입자 상에 시딩된 1차 대식세포의 심바스타틴 자극으로부터 데이터는 도 11a-11c에 주어진다. 1일 및 3일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출을 도 11a에서 합하였다. 도 11b 및 11c는 1일 및 5일에서 바스타틴 자극 후에 1차 대식세포의 TNF-α, IL-1RA 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
세포 생존율: 도 11a에 나타난 바와 같이, 5일에, 1차 대식세포의 생존율은 다양한 심바스타틴 농도에서, 예를 들어 30% 미만으로 낮았으나, 1일에는, 세포 생존율이 125 μg/ml 이하의 심바스타틴 농도에서 100% 초과 (예를 들어, 적어도 약 120%)였다. 이러한 프로파일은 THP1 대식세포에서 SP1 입자 상에서 관찰된 것보다 상이하였다. 5일은 심바스타틴으로 자극된 1차 대식세포에서 너무 긴 지연일 수 있을 것으로 추측된다.
TNF -α 방출: 도 11a에 나타난 바와 같이, 양성 및 음성 대조군이 양쪽 시점에서 유의하게 상이하다는 것에 주목해야 한다. 또한, 심바스타틴 농도가 1일에 약 250 μg/ml로부터 약 31.25 μg/ml로 감소할수록 TNF-α 방출이 유의하게 감소하였다. 제5일에서의 불량한 세포 생존율 때문에, TNF-α 방출이 모든 농도에서 상대적으로 높았던 한편, TNF-α 방출은 보다 낮은 농도의 심바스타틴에서 감소하였으며 세포 생존율은 약간 증가하였다. 음성 대조군에서 TNF-α 방출은 낮았고 (~0.01 pg/ml), SP1 입자에서 수득한 수준보다 작았다.
유전자 발현: 도 11b에 나타난 바와 같이, 1일에, ELISA 결과와 상관시킨 낮은 TNF-α 유전자 발현을 나타내는 항염증 프로파일이 125 μg/ml 내지 31.25 μg/ml 범위의 심바스타틴 농도를 사용하였을 때 관찰되었다. 놀랍게도, IL-10 유전자 발현의 증가가 관찰되지 않았다. 덱사메타손에서 수득한 결과와는 대조적으로, 항염증 시토카인 IL-1RA 유전자 발현이 증가하였다. TNF-α 발현은 배지 대조군에서 높았다.
도 11c에 나타난 바와 같이 심바스타틴 자극 후에 1차 대식세포의 유전자 발현 데이터는 덱사메타손 자극 후의 세포와 상이하였으며, 이는 부분적으로 1차 대식세포의 세포 생존율이 5일 동안 심바스타틴 자극 후에 낮았기 때문이다. 덱사메타손에서 관찰된 바와 같이, IL-10의 발현은 5일에 증가한 반면 TNF-α는 상대적으로 낮은 수준의 발현을 유지하였다. 이러한 발견은 심바스타틴과의 5일 배양이 1차 대식세포를 손상시킬 수 있다는 것을 보여준다. 그러나, 심바스타틴은 IL-10 유전자 발현의 수준이 문헌 (49)과 상관되지 않는다는 사실에도 불구하고, 시토카인 생산 뿐만 아니라 유전자 발현에 대해 중간 또는 짧은-기간 항염증 효과를 나타낸다. 심바스타틴에 효과적인 농도의 범위는 약 125 내지 약 31.25 μg/ml 범위일 수 있다.
세포 형태: 도 12는 각각 1일 (I1-P1) 및 5일 (I5-P5)에서의 SP0.5 입자 상의 심바스타틴과 배양된 1차 대식세포의 형태를 도시하는 SEM 영상이다. 음성 및 양성 대조군의 활성화 특성에서 차이가 관찰되었다 (도 12: I1, J1 및 I5, J5). 다양한 심바스타틴 농도에서 5일의 SEM 영상은 다수의 부착 세포가 존재하지 않는다는 것을 보여주고, 부착된 것은 생존한 것으로 보이지 않았다. 그러나, 1일에, 낮은 심바스타틴 농도 (예를 들어, 약 31.25 μg/ml 내지 약 7.8125 μg/ml)에서 (도 12: N1, O1, P1), 세포는 상대적으로 작았고, 둥근 형태를 가졌으며, 낮은 수준의 ECM을 생산하였다. 입자 표면 상에 확장된 세포는 위족을 갖지 않았다.
도 13a-13c는 SP0.5 입자 상에 시딩하여 니코틴으로 자극한 1차 대식세포로부터 수득한 실험 데이터를 보여준다. 1일 및 5일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출을 도 13a에서 합하였다. 도 13b 및 13c는 1일 및 5일에서의 니코틴으로 자극된 1차 대식세포의 TNF-α, IL-1RA 및 IL-10 유전자 발현을 나타낸다.
세포 생존율: 도 13a에 나타난 바와 같이, 니코틴으로의 처리는 배양물에서 1일 및 5일 사이에 1차 대식세포의 세포 생존율의 감소로 이어진다. 덱사메타손 및 심바스타틴 처리와는 대조적으로, 1차 대식세포는 5일에 생존을 유지하였으며, 세포 생존율은 니코틴 농도를 약 187.5 μg/ml로부터 46.87 μg/ml로 감소시켰을 때 약 90%에 도달하였다. SP1 입자 상의 THP1 세포의 배양물과 유사하게, 세포 생존율은 1일에 약 187.5 μg/ml 내지 약 46.87 μg/ml 범위의 니코틴 농도 범위에서 100% 초과였다.
TNF -α 방출: 도 13a에 나타난 바와 같이, 양성 및 음성 대조군은 양쪽 시점에서 유의하게 상이하였다. TNF-α 방출은 덱사메타손 또는 심바스타틴 자극으로부터의 데이터 세트에 비해 양쪽 대조군에서 보다 낮았다. 어느 한쪽 시점에서 LPS 대조군에 비해 TNF-α 방출의 유의한 감소는 나타나지 않았다.
유전자 발현: 도 13b에 나타난 바와 같이, 1일 및 187.5 및 93.75 μg/ml의 니코틴 농도에서, 1차 대식세포의 TNF-α 유전자 발현은 하향조절되었으나, 항염증 프로파일을 가정할만큼 충분하게 낮지 않을 수 있다. 1.5 mg/ml 내지 375μg/ml의 니코틴 농도는 ELISA에 의해 검출된 높은 수준의 TNF-α에 의해 나타난 것보다 더 세포독성인 것으로 보인다. 그러나, 약 750 μg/ml 내지 약 275 μg/ml에서 보다 우수한 생존율이 관찰되었으며, 이들 농도 사이에서, 세포는 염증 반응을 IL-1RA 및 IL-10의 높은 유전자 발현과 균형을 이루도록 하였다. 1일에 음성 대조군에서, 높은 수준의 TNF-α 유전자 발현과 낮은 IL1-RA 및 IL-10 유전자 발현이 나타났다.
도 13c에 나타난 바와 같이, 5일에, 시토카인 발현의 수준이 보다 높은 것을 제외하고 1일에서와 유사한 유전자 발현 프로파일이 관찰되었다. 또한, 다른 약물로 처리된 음성 대조군에 대해 동일한 프로파일이 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 니코틴은 불멸화 및 1차 대식세포 둘 다에 대한 항염증 효과보다 더 큰 증식성 효과를 제공한다. 대조군에서 TNF 방출 및 유전자 발현의 가변성으로 인해, SP0.5 입자는 SP1 입자에 비해 이들 실험의 재현성을 개선시키지 않았다. 그러나, 이러한 데이터 세트에서 양성 및 음성 대조군은 유의하게 상이하였으며, 이는 LPS의 농도를 2배로 하는 것이 그의 관련성의 문제를 해결할 수 있다는 것을 나타낸다.
세포 형태: 도 14는 각각 1일 (Q1-X1) 및 5일 (Q5-X5)에서의 SP0.5 입자 상의 니코틴과 배양된 1차 대식세포의 형태를 도시하는 SEM 영상이다. 음성 및 양성 대조군 (도 14:Q1, R1 및 Q5, R5)은 이전의 덱사메타손 또는 심바스타틴 데이터 세트와 동일한 활성화 특성을 보여준다. 양쪽 시점에서, 세포의 수는 도 13a에서의 세포 생존율 결과에 따라 증가하였다. 또한, 1차 대식세포는 보다 확장되고 보다 많은 ECM을 생산하는 것으로 보였다. 또한, 도 14:V5 및 W5에 나타난 바와 같이 보다 많은 세포 융합이 존재하였다. 덱사메타손 데이터 세트와 대조적으로, 검출가능한 위족이 관찰되지 않았으나, 일부 활성화 특성을 나타내는 크게 확장된 세포가 관찰되었다.
1차 수지상 세포 데이터 세트
SP0.5 입자 상에 시딩하여 덱사메타손으로 자극한 1차 수지상 세포의 데이터가 본원에 제시된다. 1일 및 5일에서 세포 생존율 및 TNF-α 방출을 도 15a에서 합하였다. 도 15b 및 15c는 각각 1일 및 5일에서의 수지상 세포의 IL-1β, IL-1RA 및 IL-8 유전자 발현을 나타낸다.
세포 생존율: 도 15a에 나타난 바와 같이, 세포 생존율은 1차 대식세포와 동일한 프로파일에 따른다.
TNF -α 방출: 도 15a에 나타난 바와 같이, 1일 및 5일 둘 다에서, 2개의 양성 및 음성 대조군은 유의하게 상이하였다. 1차 대식세포 데이터와 유사하게, 양쪽 시점에 다양한 덱사메타손 농도에서 TNF-α의 유의한 감소가 측정되었다.
유전자 발현: 도 15b에 나타난 바와 같이, 1일에, 항염증 프로파일이 다양한 덱사메타손 농도에서 나타났다. IL-1β 유전자 발현은 (양성 대조군에 비해) 낮았으며, 변화 배수는 0.1 내지 0.2 범위였다. IL-1RA는 1차 대식세포에서보다 1차 수지상 세포에서 훨씬 더 큰 정도로 발현되었으며, 이는 낮은 IL-1β 수준을 설명할 수 있다. 흥미롭게도, 1차 수지상 세포에서 IL-1RA의 수준은 1차 대식세포에서 검출된 수준과 동일하거나 또는 유사하였으며, 이는 또한 IL-1β와 동일한 또는 유사한 수준이었고 염증유발 경로와 균형을 이루도록 작용하였다.
도 15c에 나타난 바와 같이, 5일에, 동일한 또는 유사한 프로파일이 관찰되었으나, IL-1β의 발현은 배지 대조군에서 2.5배 더 높았다. 수지상 세포는 유전자 발현에서보다 적은 가변성과 함께 대식세포와 동일한 또는 유사한 TNF-α 방출 프로파일을 제공한다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포에서 TNF-α 및 IL-10 유전자 발현을 분석하여 모든 결과와 상관시킬 수 있다.
세포 형태: 도 16에 나타난 바와 같이, 양성 및 음성 대조군은 다양한 세포 형태의 수지상 세포를 보여주며, 여기서 세포는 양성 대조군에서 보다 많은 ECM을 생산하며 보다 길게 연장되었으나 (도 16: B5) 음성 대조군에서는 더 작았다 (도 16: A5). 또한 수지상 세포 및 대식세포 사이에 활성화 특성의 차이가 존재하였다. 융합이 대식세포에서 활성화 마커인 것으로 밝혀졌으며, 다수의 위족을 갖는 세포가 수지상 세포에서 활성화의 특성이었다 (도 16: B5, D5, H5). 수지상 세포의 특성 중 하나는 이들이 일반적으로 함께 융합하지 않는다는 것이다. 또한, 이러한 유형의 형태를 고려하여, 수지상 세포는 다양한 덱사메타손 농도에서 양성 대조군에서보다 적게 활성화되었으며, 이는 상기 기재된 시토카인 방출 및 유전자 발현과 상관된다.
SP0.5 입자 상에 시딩하여 심바스타틴으로 자극한 1차 수지상 세포로부터의 데이터를 도 17a-17c 및 도 18에 제시한다. 1일 및 5일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출을 도 17a에서 합하였다. 도 17b 및 17c는 1일 및 5일에서 심바스타틴으로 자극된 수지상 세포의 IL1β, IL-1RA 및 IL-8 유전자 발현을 나타낸다.
세포 생존율: 도 17a에 나타난 바와 같이, 심바스타틴으로 자극된 1차 대식세포의 것과 동일한 또는 유사한 세포 생존율 프로파일이 양쪽 시점에서 관찰되었다.
TNF -α 방출: 도 17a에 나타난 바와 같이, LPS 대조군에 비해 유의한 감소가 존재하지 않는다는 것을 제외하고, 심바스타틴으로 자극된 1차 대식세포의 것과 동일한 또는 유사한 TNF-α 방출 프로파일이 양쪽 시점에서 관찰되었다. 또한, 양성 및 음성 대조군은 유의하게 상이하였다.
유전자 발현: 도 17b에 나타난 바와 같이, 1일에, 흥미롭게도 항염증 유전자 IL-1RA 및 IL-8이 심바스타틴 농도가 감소함에 따라 증가하면서 발현되었다. 우수한 세포 생존율을 나타내는 심바스타틴 농도 (예를 들어, 약 125 μg/ml 내지 약 7.8 μg/ml)의 경우에, ~62.5μg/ml에서 항염증 프로파일이 관찰되었다. 음성 대조군은 덱사메타손 데이터 세트로부터 음성 대조군과 동일한 또는 유사한 프로파일을 갖는다.
5일 동안 심바스타틴으로 자극된 수지상 세포의 세포 생존율이 낮은 것과 마찬가지로, 도 17c에 나타낸 유전자 발현 데이터는 달라졌다. 그러나, 음성 대조군에서는 이전 덱사메타손 데이터에서와 동일한 또는 유사한 프로파일이 관찰되었다. IL-1RA 변화 배수 (양성 대조군에 비함)는 1 미만이었다. 또한, 심바스타틴과 세포를 5일 배양하는 것은 대식세포 및 수지상 세포를 손상시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 다양한 대조군 샘플 사이에 유전자 발현에 대해 약간의 가변성이 존재하였다.
세포 형태: 도 18에서, SEM 영상은 세포 사멸 및 활성화 형태 특성이 1차 대식세포 상에서의 실험과 유사하다는 것을 보여준다.
SP0.5 입자 상에 시딩하여 니코틴으로 자극한 1차 수지상 세포로부터의 데이터가 도 19a-19c 및 도 20에 주어진다. 1일 및 5일에서의 세포 생존율 및 TNF-α 방출을 도 19a에서 합하였다. 도 19b 및 19c는 1일 및 5일에서의 니코틴으로 자극된 수지상 세포의 IL1β, IL-1RA 및 IL-8 유전자 발현을 나타낸다.
세포 생존율: 도 19a에 나타난 바와 같이, 세포 생존율은 1차 대식세포에서 관찰된 것과 동일한 또는 유사한 프로파일에 따르며, 여기서 약 187.5 μg/ml 내지 약 46.87μg/ml 범위의 니코틴 농도는 양쪽 시점에서 85% 내지 100%보다 큰 세포 생존율을 나타내었다.
TNF -α 방출: 도 19a에 나타난 바와 같이, 수지상 세포에서 관찰된 프로파일은 대식세포에서 관찰된 것과 동일하였으며, 대조군은 양쪽 시점에서 유의하게 상이하였다.
유전자 발현: 도 19b에 나타난 바와 같이, 1일에 3가지 보다 높은 니코틴 농도 (약 375 μg/ml 내지 약 1.5 mg/ml)에서 1차 대식세포 데이터 세트에 비해 유전자 발현에서 보다 큰 가변성이 존재하였으며, 여기서 세포 생존율은 낮으면서 다양하였다. 또한, 보다 낮은 3가지 니코틴 농도 (약 46.87 μg/ml 내지 약 187.5 μg/ml)에서는 항염증 프로파일이 존재하지 않았다.
도 19c에 나타난 바와 같이, 5일에, 1차 대식세포에서 관찰된 것과 동일한 프로파일이 관찰되었으며, 이는 항염증 프로파일이 존재하지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, 이전에 기재된 바와 같이, 음성 대조군의 경우의 결과는 덱사메타손의 경우와 동일하였다. 수지상 세포와 대식세포 사이에 약간의 차이가 존재하였으나, 2종의 세포 유형으로부터의 데이터는 유사하였다. 이러한 실험으로부터, 니코틴은 어떠한 항염증 효과도 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다.
세포 형태: 도 20은 1일 또는 5일에서의 니코틴으로 자극된 수지상 세포의 SEM 영상을 보여주며, 그의 세포 형태는 1차 대식세포 데이터 세트에서의 것과 동일하거나 또는 유사하였다. 확장 형태 및 ECM 생산을 갖는 수지상 세포의 수는 니코틴 농도의 감소에 따라 증가하였다.
논의
실시예 2-3에 기재된 발견을 표 4에 요약하였다. 특히, 표 4는 양성 대조군 (배지+LPS)과 관련하여 TNF-α 방출 및 다양한 유전자 발현의 결과를 요약한다. 본원에 기재된 발견에 기초하여, 덱사메타손은 염증유발 시토카인 생산을 감소시킬 뿐만 아니라 항염증 유전자 발현 프로파일을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 특정 심바스타틴 농도에서 1차 대식세포 또는 수지상 세포를 사용한 실험이 항염증 유전자 발현 프로파일을 나타낸 바와 같이, 심바스타틴이 또한 항염증 유전자 발현 프로파일을 유도할 수 있었다. 니코틴은 항염증 효과를 갖는 것으로 보이지 않았으나, 증식 특성은 갖는 것으로 보였다. 또한, 결과는 SP0.5 입자 (크기 ~1 μm)가 SP1 입자 (크기 ~2 μm)보다 온화한 염증 반응을 유도하였다는 것을 보여주었다.
Figure pct00029
다양한 크기의 실크 입자에 의해 유도된 염증 반응이 어떻게 최적화될 수 있는지를 입증하는 실험이 본원에 기재된다. 상이한 특성, 작용 메카니즘 및 부작용을 갖는 3가지 널리 공지된 약물을 평가하였다. 그의 항염증 특성에 대해 공지되어 있으며 본 연구에 참조로 사용된 약물인 덱사메타손은 염증유발 시토카인 생산의 재현가능한 감소 뿐만 아니라 항염증 유전자 발현 프로파일의 유도의 측면에서 가장 우수한 결과를 보여주었다 (표 4). 심바스타틴은 또한 1차 세포 상에서의 연구가 여러 농도에서 항염증 프로파일을 나타내었으므로 유망한 것으로 밝혀졌다. 니코틴은 관련 항염증 효과를 나타내지는 않았으며, 대신 증식에 훨씬 더 큰 정도로 영향을 미쳤다. 또한, 염증 반응에 대한 입자의 크기 효과를 고려하고, SP1 (크기 ~2μm) 및 SP0.5 (크기 ~1μm) 데이터 세트 사이에서 음성 대조군을 비교하여, SP0.5 입자가 염증 반응을 SP1 입자보다 적게 유도하는 것으로 밝혀졌다. LPS 농도를 증가시키는 것은 대조군의 관련성을 개선시켰다. 그러나, 입자의 크기를 변화시키는 것은 대조군으로부터의 결과의 재현성을 개선시키지는 않았다. 필름이 재현가능한 제어를 보여주었으며 실험 조건 (입자 건조 조건, 실크 및 입자의 보다 큰 배치 등)에서의 다른 변화가 입자 실험에서 재현성을 개선시키지 않았으므로, 재현성에 관한 도전은 입자 그 자신일 수 있다. 그러나, 1차 세포에서 생체내 조건에 근접하게 하는 것은 결과에 대한 재현성을 개선시키는 것으로 보였다.
실시예 2-3에서, 발견은 실크 입자에 의해 유도된 염증 반응이 조절될 수 있다는 것을 보여주었다. 덱사메타손은, 예상된 바와 같이, 입자에 의해 유도된 염증 반응의 감소에 있어 시험된 다른 2종의 약물보다 우수한 효과를 보여주었다.
실시예 4. 대식세포-편향 제로 기능화된 실크 필름을 사용하여 제어된 대식세포 분화 및 편향
생체물질은 처리 동안 또는 처리 후에 예를 들어 화학적으로 및/또는 적절한 화합물 또는 분자의 봉입을 통해 변형되어 시험관내 또는 생체내에서 대식세포 및/또는 다른 세포 반응을 조절할 수 있다. 예를 들어, 생체물질의 분해에 영향을 미침으로써 (예를 들어 생체물질을 보다 빠르게, 보다 느리게 또는 보다 선택적인 방식으로 분해시킴으로써), 예를 들어 생체물질 및 조직에 대한 염증 반응 또는 재생 반응을 제어하기 위해 염증을 촉진할 수 있거나 또는 염증을 감소시킬 수 있는 선택적인 화합물을 세포 집단에 도입시킨다. 제어 과정은 선택적 화합물, 예를 들어 비제한적으로 소분자, 펩티드 및 LPS의 존재 하에 활성화되거나 또는 촉진된 세포 집단 (예를 들어, 대식세포)의 특성에 의해 매개될 수 있다.
일부 실시양태에서, 실크 매트릭스는 M2 대식세포의 1종 이상의 마커를 선택적으로 상향조절시킬 수 있는 대식세포-편향제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 실크 매트릭스는 M1 대식세포의 1종 이상의 마커를 선택적으로 상향조절시킬 수 있는 대식세포-편향제를 포함할 수 있다. 도 21에 나타난 바와 같이, 다양한 대식세포-편향 후보 작용제 (예를 들어, ng/ml 내지 μg/ml 범위의 농도)를 실크 필름에 첨가하였으며, 이어서 이를 THP-1 단핵구와 배양하였다. 도 21은 약 10mg/ml 인터류킨-4 (IL-4)를 실크 필름에 첨가하는 것이 THP-1 단핵구에서 M2 대식세포의 1종 이상의 마커 (예를 들어, 비제한적으로, CCL18 및 CD206)를 상향조절시킬 수 있었다는 것을 보여준다. 따라서, 한 실시양태에서, 적어도 약 10 μg/ml의 IL-4가 M2 대식세포 표현형 분화를 유도할 수 있었다. 이론에 제한되지 않고, M2 대식세포는 전형적으로 손상된 조직을 재생시키는데 도움을 줄 수 있다.
그러나, 실크 필름에 첨가된 낮은 수준의 LPS는 M1 분화를 자극하기에 충분하지 않았다. 대식세포 분화는 실크 매트릭스에 존재하는 대식세포-편향제의 농도 및/또는 양에 의존할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 실크 필름에서의 LPS 수준은 M1 분화를 자극하기에 충분한 수준으로 증가시킬 수 있다.
도 22는 THP-1 단핵구가 인터페론-감마 (INF-γ)를 포함하는 실크 필름과 접촉하였을 때 M1 대식세포 및 M2 대식세포의 마커의 발현을 보여주는 막대 그래프이다. 약 10 μg/ml 인터페론-감마 (INF-γ)를 실크 필름에 로딩하거나 또는 포매시켰다. 일부 실시양태에서, 로딩 후에 실크 필름의 세척 단계는 피하는 것이 바람직할 수 있다. THP-1 단핵구를 실크 필름과 접촉시켜 배양하였다. 도 22에 나타난 바와 같이, M1 대식세포 (예를 들어, 비제한적으로, CCL3 및 CCR7)의 1종 이상의 (예를 들어, 적어도 2종 이상의) 마커가 THP-1 단핵구에서 상향조절되었다. 따라서, 한 실시양태에서, 적어도 약 10 μg/ml INF-γ가 M1 대식세포 분화를 유도할 수 있었다. M2 대식세포 마커인 CCL-18이 또한 상향조절되었다. M2 대식세포의 통상적인 마커인 CD206은 대조군에 비해 강하게 하향조절되었다. 이론에 제한되지 않고, M1 대식세포는 염증 반응을 도출하여 새로 손상된 조직을 감염으로부터 보호할 수 있다. M1 대식세포는 조직 재형성에 바람직하지 않을 수 있으나, 이들은 생체물질, 예를 들어 비제한적으로 실크의 신속한 분해를 위해 사용될 수 있다.
도 23은 실크 필름으로부터의 INF-γ의 방출 속도를 보여주는 선 그래프이다. 실크 필름을 약 10 μg/ml의 농도에서 실크 용액으로부터 제조하고, 필름당 약 0.2 ml의 실크 용액을 사용하였다 (약 2 μg INF-γ를 로딩함). 도 23의 표에 나타난 바와 같이, 1시간 내에 약 400 pg/ml INF-γ의 양이 방출되었으며, 이는 전체 로딩의 약 0.02%이다. 4일까지 보다 많은 INF-γ가 방출되었으며, 이는 INF-γ의 지속적인 또는 일정한 방출이 존재함을 나타낸다. INF-γ 방출의 수준은 낮은 것으로 보였으며, 이 때 수준은 생리학상 적절하였다.
일부 실시양태에서, 실크 매트릭스, 예를 들어 실크 필름은 1종 이상의 M1 대식세포 분화제 (예를 들어, 비제한적으로, INF-γ) 및 1종 이상의 M2 대식세포 분화제 (예를 들어, 비제한적으로, IL-4)를, 예를 들어 예정된 비로 포함하여, 예를 들어 실크 매트릭스의 분해를 (예를 들어, 그를 필요로 하는 표적 부위로의 이식시에) 제어하고 조직 재생을 용이하게 할 수 있다. M1 및 M2 대식세포 분화제는 실크 매트릭스에 균질하게 또는 불균질하게 분포될 수 있다. 일부 실시양태에서, M1 및 M2 대식세포 분화제는 실크 매트릭스의 상이한 층에 분포되어, 예를 들어 다중-층의 실크 매트릭스를 형성할 수 있으며, 여기서 제1 층은 M1 대식세포 분화제를 포함할 수 있고, 제2 층은 M2 대식세포 분화제를 포함할 수 있다.
참고문헌
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034

Claims (90)

1종 이상의 면역 세포-조절제를 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제와의 접촉시에 1종 이상의 유형의 면역 세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함하는 생체물질을 포함하는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 대식세포를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 수지상 세포를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질이 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제의 지속 방출에 적합한 것인 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질이 2종 이상의 면역 세포-조절제를 포함하는 것인 조성물.
제6항에 있어서, 생체물질이 제1 면역 세포-조절제 및 제2 면역 세포-조절제를 상이한 시점에 방출시키기에 적합한 것인 조성물.
제7항에 있어서, 생체물질이 제1 면역 세포-조절제를 제1 층에 및 제2 면역 세포-조절제를 제2 층에 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제가 생체물질로 캡슐화되는 것인 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제가 생체물질의 표면 상에 존재하는 것인 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제가 대식세포-편향제를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질이 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제가 대상체에서 표적 자극에 대한 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포의 반응을 제어하도록 선택되는 것인 조성물.
1종 이상의 대식세포-편향제를 상기 1종 이상의 대식세포-편향제와의 접촉시에 대식세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함하는 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 조성물.
제14항에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 대식세포의 최소 집단을 M1 표현형 상태로 전환시키도록 선택된 작용제를 포함하는 것인 조성물.
제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 대식세포의 최소 집단을 M2 표현형 상태 (예를 들어, M2a, M2b, M2c)로 전환시키도록 선택된 작용제를 포함하는 것인 조성물.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 글루코코르티코이드 (예를 들어, 덱사메타손); 니코틴; 스타틴 (예를 들어, 심바스타틴); 항미생물 펩티드 (예를 들어, LL-37 펩티드, 아포지단백질 E); LPS; INF-γ; TNF-α; 프로락틴; Notch 활성화제 (예를 들어, 델타 또는 재기드(jagged) 리간드); IL-4; IL-13; IL-10; 인슐린 감작제 및 PPAR-γ 유도제 (예를 들어, 로시글리타존 또는 다른 티아졸리딘디온); HDAC 억제제 (예를 들어, VPA); Notch 신호전달 억제제 (예를 들어, GSI 또는 DAPT); JAK 억제제 (예를 들어, AG490); 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제의 억제제; LiCl; 티모신; PLA2, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 상기 1종 이상의 대식세포-편향제의 지속 방출에 적합한 것인 조성물.
제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 2종 이상의 대식세포-편향제를 포함하는 것인 조성물.
제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 제1 대식세포-편향제 및 제2 대식세포-편향제를 상이한 시점에 방출시키기에 적합한 것인 조성물.
제20항에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 제1 대식세포-편향제를 제1 층에 및 제2 대식세포-편향제를 제2 층에 포함하는 것인 조성물.
제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 대상체에서 표적 자극에 대한 대식세포 반응을 제어하도록 선택되는 것인 조성물.
제13항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 자극이 대식세포-연관 상태를 포함하는 것인 조성물.
제23항에 있어서, 대식세포-연관 상태의 치료에 사용하기 위해 제제화된 조성물.
제23항 또는 제24항에 있어서, 대식세포-연관 상태가 박테리아 감염, 조직 재생, 조직 손상, 예를 들어 조직 복구 및/또는 증진 (예를 들어, 연부 조직 복구 및/또는 증진)을 포함하는 조직 재구축, 관절염, 비만, 당뇨병, 동맥경화증, 동종이식편 이식, 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH), 골다공증, 사구체신염, 암, 상처 치유, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 재건 수술에 사용하기에 적합한 조성물.
제26항에 있어서, 재건 수술이 미용 수술을 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 연부 조직 복구 및/또는 증진에 사용하기에 적합한 조성물.
제28항에 있어서, 연부 조직이 피부, 유방 조직, 건, 인대, 섬유성 조직, 결합 조직, 근육, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상처 드레싱으로 사용하기에 적합한 조성물.
제13항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 자극이 이식가능한 구조물 (예를 들어, 스캐폴드, 동종이식편 조직, 의료 장치)을 포함하는 것인 조성물.
제31항에 있어서, 이식가능한 구조물의 코팅을 형성하는 조성물.
제13항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 자극이 시토카인 (예를 들어, 케모카인 포함)을 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질 또는 실크 피브로인-기재 매트릭스가 필름, 섬유, 입자의 수집물, 튜브, 매트, 겔, 메쉬, 직물, 또는 그의 임의의 조합의 형태인 조성물.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제 또는 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 실크 피브로인-기재 매트릭스로 캡슐화되는 것인 조성물.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제 또는 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 실크 피브로인-기재 매트릭스의 표면 상에 존재하는 것인 조성물.
1종 이상의 면역 세포-조절제를 1종 이상의 유형의 면역 세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함하는 생체물질을 표적 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 부위에 위치시키는 것; 및
면역 세포-조절제를 표적 부위에 위치시에 생체물질로부터 예정된 속도로 방출시켜, 생체물질 주위의 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비를 변경시키는 것
을 포함하며, 여기서 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비가 역치 초과에 도달하는 경우에, 생체물질은 염증 반응을 유도하고; 불활성화된 면역 세포에 대한 활성화된 면역 세포의 비가 역치 미만에 도달하는 경우에, 생체물질은 재생 또는 항염증 반응을 유도하는 것인 방법.
제37항에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 대식세포를 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 유형의 면역 세포가 수지상 세포를 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포-조절제가 대식세포-편향제를 포함하는 것인 방법.
1종 이상의 대식세포-편향제를 대식세포의 활성화 상태를 선택적으로 변경시키기에 충분한 유효량으로 포함하는 생체물질을 표적 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 부위에 위치시키는 것; 및
대식세포-편향제를 표적 부위에 위치시에 생체물질로부터 예정된 속도로 방출시켜, 생체물질 주위의 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비를 변경시키는 것
을 포함하며, 여기서 M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 초과인 경우에, 생체물질은 염증 반응을 유도하고; M2 대식세포에 대한 M1 대식세포의 비가 역치 미만인 경우에, 생체물질은 재생 또는 항염증 반응을 유도하는 것인 방법.
제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 염증 반응이 생체물질의 분해를 유도하는 것을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 염증 반응이 표적 부위에 가까이 근접한 및/또는 표적 부위에 있는 조직을 감염으로부터 보호하는 것을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 재생 또는 항염증 반응이 표적 부위에서의 조직 복구 및/또는 재생을 용이하게 하는 것을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 재생 또는 항염증 반응이 숙주의 면역계에 의한 생체물질의 거부를 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질이 상기 1종 이상의 대식세포-편향제의 지속 방출에 적합한 것인 방법.
제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질이 2종 이상의 대식세포-편향제를 포함하는 것인 방법.
제48항에 있어서, 생체물질이 제1 대식세포-편향제 및 제2 대식세포-편향제를 상이한 시점에 방출시키기에 적합한 것인 방법.
제49항에 있어서, 생체물질이 제1 대식세포-편향제를 제1 층에 및 제2 대식세포-편향제를 제2 층에 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질을 주사에 의해 위치시키는 것인 방법.
제37항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질을 이식에 의해 위치시키는 것인 방법.
제37항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 생체물질이 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 부위가 표적 자극을 포함하는 것인 방법.
1종 이상의 대식세포-편향제를 (a) 대식세포의 최소 집단을 M1 표현형 상태로 전환시켜, 자극에 대한 염증 반응을 유도하기에 충분하거나; (b) 대식세포의 최소 집단을 M2 표현형 상태로 전환시켜, 자극에 대한 재생 반응을 유도하기에 충분하거나; 또는 (c) (a) 및 (b) 둘 다에 충분한 유효량으로 포함하는 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 조성물을 표적 자극의 부위에 가까이 근접하게 또는 표적 자극의 부위에 위치시키는 것을 포함하는, 대상체에서 표적 자극에 대한 대식세포 반응을 제어하는 방법.
제55항에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 상기 1종 이상의 대식세포-편향제의 지속 방출에 적합한 것인 방법.
제55항 또는 제56항에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 2종 이상의 대식세포-편향제를 포함하는 것인 방법.
제57항에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 제1 대식세포-편향제 및 제2 대식세포-편향제를 상이한 시점에 방출시키기에 적합한 것인 방법.
제58항에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스가 제1 대식세포-편향제를 제1 층에 및 제2 대식세포-편향제를 제2 층에 포함하는 것인 방법.
제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 글루코코르티코이드 (예를 들어, 덱사메타손); 니코틴; 스타틴 (예를 들어, 심바스타틴); 항미생물 펩티드 (예를 들어, LL-37 펩티드, 아포지단백질 E); LPS; INF-γ; TNF-α; 프로락틴; Notch 활성화제 (예를 들어, 델타 또는 재기드 리간드); IL-4; IL-13; IL-10; 인슐린 감작제 및 PPAR-γ 유도제 (예를 들어, 로시글리타존 또는 다른 티아졸리딘디온); HDAC 억제제 (예를 들어, VPA); Notch 신호전달 억제제 (예를 들어, GSI 또는 DAPT); JAK 억제제 (예를 들어, AG490); 3-히드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A (HMG-CoA) 리덕타제의 억제제; LiCl; 티모신; PLA2, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 자극이 대식세포-연관 상태를 포함하는 것인 방법.
제61항에 있어서, 조성물 또는 생체물질이 대식세포-연관 상태의 치료에 사용하기 위해 제제화되는 것인 방법.
제61항 또는 제62항에 있어서, 대식세포-연관 상태가 박테리아 감염, 조직 재생, 조직 손상, 예를 들어 조직 복구 및/또는 증진 (예를 들어, 연부 조직 복구 및/또는 증진)을 포함하는 조직 재구축, 관절염, 비만, 당뇨병, 동맥경화증, 동종이식편 이식, 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH), 골다공증, 사구체신염, 암, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제37항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 생체물질이 재건 수술에 사용하기에 적합한 것인 방법.
제64항에 있어서, 재건 수술이 미용 수술을 추가로 포함하는 것인 방법.
제37항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 생체물질이 연부 조직 복구 및/또는 증진에 사용하기에 적합한 것인 방법.
제66항에 있어서, 연부 조직이 피부, 유방 조직, 건, 인대, 섬유성 조직, 결합 조직, 근육, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제37항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 생체물질이 상처 드레싱으로 사용하기에 적합한 것인 방법.
제54항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 자극이 이식가능한 구조물을 포함하는 것인 방법.
제69항에 있어서, 조성물 또는 생체물질이 이식가능한 구조물의 코팅을 형성하는 것인 방법.
제54항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 자극이 시토카인 (예를 들어, 케모카인 포함)을 포함하는 것인 방법.
제42항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 실크 피브로인-기재 매트릭스 또는 생체물질로 캡슐화되는 것인 방법.
제42항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 대식세포-편향제가 실크 피브로인-기재 매트릭스 또는 생체물질의 표면 상에 존재하는 것인 방법.
제37항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 실크 피브로인-기재 매트릭스 또는 생체물질이 필름, 섬유, 입자의 수집물, 튜브, 매트, 겔, 직물, 메쉬, 또는 그의 임의의 조합의 형태인 방법.
제37항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 생체물질을 주사에 의해 위치시키는 것인 방법.
제37항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 생체물질을 이식에 의해 위치시키는 것인 방법.
1종 이상의 면역 세포-조절제를 포함하는 생체물질을 포함하는 조성물로 제1 물질을 코팅하는 것을 포함하는, 생의학 물질을 생산하는 방법.
제77항에 있어서, 생체물질이 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 것인 방법.
제77항 또는 제78항에 있어서, 상기 1종 이상의 면역 세포-조절제가 대식세포-편향제를 포함하는 것인 방법.
1종 이상의 대식세포-편향제를 포함하는 실크 피브로인-기재 매트릭스를 포함하는 조성물로 제1 물질을 코팅하는 것을 포함하는, 생의학 물질을 생산하는 방법.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 대식세포-연관 상태의 치료를 위한 제약 조성물의 제조에 사용하기 위한 조성물.
제81항에 있어서, 대식세포-연관 상태가 박테리아 감염, 조직 재생, 조직 손상, 예를 들어 조직 복구 및/또는 증진 (예를 들어, 연부 조직 복구 및/또는 증진)을 포함하는 조직 재구축, 관절염, 비만, 당뇨병, 동맥경화증, 동종이식편 이식, 랑게르한스 세포 조직구증 (LCH), 골다공증, 사구체신염, 암, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상처 드레싱의 제조에 사용하기 위한 조성물.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 이식가능한 구조물의 제조에 사용하기 위한 조성물.
제81항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 조성물의 코팅, 상처 드레싱 또는 이식가능한 구조물을 형성하는 조성물.
제84항 또는 제85항에 있어서, 이식가능한 구조물이 스캐폴드, 동종이식편 조직, 의료 장치, 또는 그의 임의의 조합을 포함하는 것인 조성물.
제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 이식가능한 구조물이 재건 수술에 사용하기 적합한 것인 조성물.
제87항에 있어서, 재건 수술이 미용 수술을 추가로 포함하는 것인 조성물.
제84항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 이식가능한 구조물이 연부 조직 복구 및/또는 증진에 사용하기에 적합한 것인 조성물.
제89항에 있어서, 연부 조직이 피부, 유방 조직, 건, 인대, 섬유성 조직, 결합 조직, 근육, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201113856D0 (en) * 2011-08-11 2011-09-28 Oxford Biomaterials Ltd Medical device
KR20160046858A (ko) * 2013-08-22 2016-04-29 알러간, 인코포레이티드 주입형 의료 디바이스들
US20160199450A1 (en) * 2013-08-26 2016-07-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Scaffolds containing cytokines for tissue engineering
US10925999B2 (en) * 2013-10-08 2021-02-23 Trustees Of Tufts College Tunable covalently crosslinked hydrogels and methods of making the same
WO2015077401A1 (en) 2013-11-20 2015-05-28 Drexel University Compositions and methods for macrophage conversion
WO2015081253A1 (en) 2013-11-26 2015-06-04 Biomet Biologics, Llc Methods of mediating macrophage phenotypes
GB201415681D0 (en) 2014-09-04 2014-10-22 Cambridge Entpr Ltd And President And Fellows Of Harvard College Protien Capsules
US20180326080A1 (en) * 2015-10-27 2018-11-15 Purdue Research Foundation Polymer-based therapeutics for inductive browning of fat
US11617815B2 (en) 2016-10-31 2023-04-04 Sofregen Medical, Inc. Compositions comprising silk fibroin particles and uses thereof
WO2018095264A1 (zh) * 2016-11-22 2018-05-31 陈艳丽 Notch信号通路调控剂调节骨生成
WO2018156613A1 (en) * 2017-02-21 2018-08-30 Trustees Of Tufts College Silk fibroin tracheal stent
EP3630215A1 (en) * 2017-05-26 2020-04-08 Association for the Advancement of Tissue Engineering and Cell based Technologies & Therapies (A4TEC) - Associação Ionic-doped composition methods and uses thereof
WO2019094702A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Cocoon Biotech Inc. Ocular applications of silk-based products
PT3721006T (pt) * 2017-12-05 2021-12-14 Univ Studi Di Roma La Sapienza Composição para utilização no acabamento, preservação, restauro de fabricações
EP3737415A4 (en) * 2018-01-12 2021-06-30 President and Fellows of Harvard College COMPOSITIONS AND PROCEDURES RELATED TO MACROPHAGE AND / OR MONOCYTE WITH ATTACHED PARTICLES
WO2021076798A1 (en) 2019-10-15 2021-04-22 Sofregen Medical, Inc. Delivery devices for delivering and methods of delivering compositions
CN111888522B (zh) * 2020-09-22 2022-12-20 中山大学附属口腔医院 一种具有免疫调控功能的牙周再生材料及其制备方法
CN112451732A (zh) * 2020-11-27 2021-03-09 山东大学 一种单侧负载银的丝素蛋白抗菌敷料及制备方法和应用
CN115487350B (zh) * 2021-06-17 2023-10-31 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种调节免疫炎症微环境水凝胶支架及其制备方法和应用
CN113813445A (zh) * 2021-10-08 2021-12-21 苏州大学 一种丝素蛋白复合多孔支架及其制备方法

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5612114B2 (ko) 1974-06-07 1981-03-18
US4231938A (en) 1979-06-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
AU548996B2 (en) 1980-02-04 1986-01-09 Merck & Co., Inc. Tetrahydro-2h-pyran-2-one derivatives
DK149080C (da) 1980-06-06 1986-07-28 Sankyo Co Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af ml-236b-carboxylsyre
WO1984002131A1 (en) 1982-11-22 1984-06-07 Sandoz Ag Analogs of mevalolactone and derivatives thereof, processes for their production, pharmaceutical compositions containing them and their use as pharmaceuticals
US4681893A (en) 1986-05-30 1987-07-21 Warner-Lambert Company Trans-6-[2-(3- or 4-carboxamido-substituted pyrrol-1-yl)alkyl]-4-hydroxypyran-2-one inhibitors of cholesterol synthesis
JP2569746B2 (ja) 1987-08-20 1997-01-08 日産化学工業株式会社 キノリン系メバロノラクトン類
US5753675A (en) 1989-03-03 1998-05-19 Novartis Pharmaceuticals Corporation Quinoline analogs of mevalonolactone and derivatives thereof
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5245012A (en) 1990-04-19 1993-09-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Method to achieve solubilization of spider silk proteins
US5177080A (en) 1990-12-14 1993-01-05 Bayer Aktiengesellschaft Substituted pyridyl-dihydroxy-heptenoic acid and its salts
JP2648897B2 (ja) 1991-07-01 1997-09-03 塩野義製薬株式会社 ピリミジン誘導体
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
WO1996013275A1 (en) * 1994-10-31 1996-05-09 Tkb Associates Limited Partnership Methods and products for enhancing immune responses
AU7152996A (en) 1995-08-22 1997-03-19 Richard M. Basel Cloning methods for high strength spider silk proteins
US6841543B1 (en) * 1996-01-31 2005-01-11 President And Fellows Of Harvard College Methods of inhibiting production of T helper type 2 cytokines in human immune cells
CN1116904C (zh) 1997-06-18 2003-08-06 独立行政法人农业生物资源研究所 以丝心蛋白和丝胶蛋白为主的创伤用被敷材料及其制法
US6287340B1 (en) 1999-05-14 2001-09-11 Trustees Of Tufts College Bioengineered anterior cruciate ligament
JP2001163899A (ja) 1999-12-09 2001-06-19 Natl Inst Of Sericultural & Entomological Science 機能性絹フィブロインの製造方法とその利用
US20110009960A1 (en) 2001-11-16 2011-01-13 Allergan, Inc. Prosthetic fabric structure
US6902932B2 (en) 2001-11-16 2005-06-07 Tissue Regeneration, Inc. Helically organized silk fibroin fiber bundles for matrices in tissue engineering
WO2004000915A2 (en) 2002-06-24 2003-12-31 Tufts University Silk biomaterials and methods of use thereof
AU2003253690A1 (en) 2002-06-24 2004-01-06 Massachusetts Institute Of Technology Silk biomaterials and methods of use thereof
US7842780B2 (en) 2003-01-07 2010-11-30 Trustees Of Tufts College Silk fibroin materials and use thereof
WO2005012606A2 (en) 2003-04-10 2005-02-10 Tufts University Concentrated aqueous silk fibroin solution and use thereof
WO2005000483A1 (en) 2003-06-06 2005-01-06 Tufts University Method for forming inorganic coatings
WO2005123114A2 (en) 2004-06-11 2005-12-29 Trustees Of Tufts College Silk-based drug delivery system
WO2006042287A2 (en) 2004-10-12 2006-04-20 Trustees Of Tufts College Method for producing biomaterial scaffolds
WO2006076711A2 (en) 2005-01-14 2006-07-20 Trustees Of Tufts College Fibrous protein fusions and use thereof in the formation of advanced organic/inorganic composite materials
US9290579B2 (en) 2005-04-20 2016-03-22 Trustees Of Tufts College Covalently immobilized protein gradients in three-dimensional porous scaffolds
EP1915436B1 (en) 2005-08-02 2011-09-28 Trustees Of Tufts College Methods for stepwise deposition of silk fibroin coatings
WO2007103442A1 (en) 2006-03-06 2007-09-13 Board Of Supervisors Of Louisiana State Universityand Agricultural And Mechanical College Biocompatible scaffolds and adipose-derived stem cells
US20100028451A1 (en) * 2006-09-26 2010-02-04 Trustees Of Tufts College Silk microspheres for encapsulation and controlled release
CA2704768A1 (en) 2006-11-03 2008-10-23 Trustees Of Tufts College Biopolymer sensor and method of manufacturing the same
WO2008127405A2 (en) 2006-11-03 2008-10-23 Trustees Of Tufts College Microfluidic device with a cylindrical microchannel and a method for fabricating same
CA2704769C (en) 2006-11-03 2016-01-12 Trustees Of Tufts College Nanopatterned biopolymer optical device and method of manufacturing the same
US8195021B2 (en) 2006-11-03 2012-06-05 Tufts University/Trustees Of Tufts College Biopolymer optical waveguide and method of manufacturing the same
US20100046902A1 (en) 2006-11-03 2010-02-25 Trustees Of Tufts College Biopolymer photonic crystals and method of manufacturing the same
US8975073B2 (en) 2006-11-21 2015-03-10 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Microfluidic device comprising silk films coupled to form a microchannel
WO2008085904A1 (en) 2007-01-05 2008-07-17 Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Biodegradable electronic devices
CA2678618C (en) * 2007-02-21 2019-03-12 Vaccinex, Inc. Modulation of nkt cell activity with antigen-loaded cd1d molecules
EP2129772B1 (en) 2007-02-27 2016-07-27 Trustees Of Tufts College Tissue-engineered silk organs
ES2527125T3 (es) 2007-05-29 2015-01-20 Trustees Of Tufts College Método para la gelificación de fibroína de seda usando sonicación
WO2009061823A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Trustees Of Tufts College Fabrication of silk fibroin photonic structures by nanocontact imprinting
US20110218143A1 (en) * 2007-11-20 2011-09-08 University Of Florida Research Foundation Compositions and methods for tissue repair
EP2249886A4 (en) 2008-02-07 2013-05-22 Tufts College THREE DIMENSIONAL HYDROXYAPATITIS AND SILK COMPOSITIONS
US8206774B2 (en) 2008-03-13 2012-06-26 Trustees Of Tufts College Diazonium salt modification of silk polymer
WO2009126689A2 (en) 2008-04-08 2009-10-15 Trustees Of Tufts College System and method for making biomaterial structures
US20110135697A1 (en) 2008-06-18 2011-06-09 Trustees Of Tufts College Edible holographic silk products
US8976938B2 (en) * 2008-07-07 2015-03-10 Centurylink Intellectual Property Llc Deluxe emergency notification
US8501172B2 (en) 2008-09-26 2013-08-06 Trustees Of Tufts College pH-induced silk gels and uses thereof
BRPI0920453A2 (pt) 2008-10-09 2015-12-22 Tufts College pelicula de seda, construção para engenharia de tecido, metodos para preparar uma película de seda, para cobrir uma superfície de um substrato com uma composição de seda, e para embutir pelo menos um agente ativo em uma película de seda, e, substrato coberto com película de sedal
US9427499B2 (en) 2008-11-17 2016-08-30 Trustees Of Tufts College Surface modification of silk fibroin matrices with poly(ethylene glycol) useful as anti-adhesion barriers and anti-thrombotic materials
AU2009330647B2 (en) 2008-12-15 2015-05-07 Allergan, Inc. A prosthetic device and method of manufacturing the same
US20120052124A1 (en) * 2009-03-04 2012-03-01 Trustees Of Tufts College Silk fibroin systems for antibiotic delivery
US20110111031A1 (en) 2009-04-20 2011-05-12 Guang-Liang Jiang Drug Delivery Platforms Comprising Silk Fibroin Hydrogels and Uses Thereof
ES2414879T4 (es) 2009-04-20 2013-10-30 Allergan, Inc. Hidrogeles de fibroína de seda y usos de éstos
US20110052695A1 (en) 2009-04-20 2011-03-03 Allergan, Inc. Drug delivery platforms comprising silk fibroin hydrogels and uses thereof
US20120070427A1 (en) 2009-06-01 2012-03-22 Trustees Of Tufts College Vortex-induced silk fibroin gelation for encapsulation and delivery
CA2805403A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Trustees Of Tufts College Bioengineered silk protein-based nucleic acid delivery systems
WO2011011347A2 (en) 2009-07-21 2011-01-27 Trustees Of Tufts College Functionalization of silk material by avidin-biotin interaction
WO2011031854A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Allergan, Inc. Prosthetic device and method of manufacturing the same
CN101891962B (zh) * 2010-07-22 2012-06-06 苏州大学 丝素蛋白多孔三维材料的制备方法
WO2012031282A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Tufts University/Trustees Of Tufts College Plasmonic nanoparticle-doped silk materials
US20140378661A1 (en) 2011-04-20 2014-12-25 Trustees Of Tufts College Molded regenerated silk geometries using temperature control and mechanical processing

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