DE2132445C2

DE2132445C2 - Ester der Antibiotika B5050 und Tetrahydro-B-5050 und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2132445C2
Application number: DE2132445A
Authority: DE
Inventors: Setsuo Harada; Motoo Osaka Izawa; Toyokazu Nara Kishi; Masayuki Muroi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1970-07-02
Filing date: 1971-06-30
Publication date: 1982-10-07
Also published as: NL160272B; CH574452A5; SE401678B; DK143068C; CA963898A; DE2132445A1; YU172071A; YU35145B; PH9735A; FR2100856B1; GB1353069A; US3853842A; NO135318B; FI56187C; NL160272C; FR2100856A1; ES392787A1; DK143068B; FI56187B; NL7109126A

Description

A) 9-Monoester des Antibiotikums B-5050 B) ^-Diester des Antibiotikums B 5050, c)

C) 9,2'-Diester des Antibiotikums Tetrahydro-B-5050,

D) 9,13-Diester des Antibiotikums Tetrahydro-B-5050,

E) 9,2',13-Triester des Antibiotikums d) Tetrahydro-B-5050.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ^M in Gegenwart von Pyridin, Chinolin oder Picolin

a) B 5050 mit einem Carbonsäurehalogenid bei 5° C oder einer niedrigeren Temperatur umsetzt und den entsprechenden 9-Monoester A) aus dem Reaktionsgemisch isoliert oder B-5050 oder Tetrahydro-B-5050 mit einem Carbonsäurehalogenid oder -anhydrid bei 15°C oder einer höheren Temperatur und einer längeren Reaktionszeit als gemäß Verfahrensstufe a) umsetzt und die entsprechenden 9,2'-Diester B) oder C) isoliert oder Tetrahydro-B-5050 oder einen 9-Monoester von Tetrahydro-B-5050 mit einem Carbonsäurehalogenid bei 5° C oder einer niedrigeren Temperatur in Gegenwart von Pyridin umsetzt und die 9,13-Diester D) isoliert oder Tetrahydro-B-5050 oder einen seiner Mono- oder Diester bei 15° C oder einer höheren Temperatur mit einem Carbonsäur ^halogenid oder -anhydrid umsetzt,

wobei die Acylgruppen der Carbonsäurehalogenide und -anhydride stets die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben und man die Veresterung auch mehrstufig und mit voneinander verschiedenen Acylgn^:ppen durchführen kann.

Die Erfindung betrifft pharmazeutisch wertvolle 30 Kulturbrühe angehäuft wird (BE-PS 7 54 819). Die als Ester der Antibiotika B-5050 und Tetrahydro-B-5050 B-5050A, B₁ C, D, E und F bezeichneten neuen

und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Antibiotika gehören zur Makrolid-Gruppe, die grampo-

Es wurde gefunden, daß eine Gruppe von neuen sitive Bakterien hemmt und durch die folgende An:;biotika durch einen zur Gattung Streptomyces allgemeine Formel dargestellt werden kann:

gehörenden Mikroorganismus gebildet und in der

CH, CH₂CHO

I ι

HO

CH₃

Die 9-StelIung wird auch mit «-Stellung und die 2'-Stellung mit ^-Stellung bezeichnet Hierin stehen Ri und R₂ für die folgenden Reste:

	^R!	R₂
Β-5Ο5Ο-Λ	Propionyl	i-Valeryl
B-5O5O-B	Acetyl	i-Valeryl
B-5O5O-C	Propionyl	Propionyl
B-5O5O-D	Acetyl	Propionyl
B-5O5O-E	Propionyl	Acetyl
B-5O5O-F	Acetyl	Acetyl

Diese Antibiotika werden mit dem Sammelbegriff »B-5050« bezeichnet. (In der folgenden Beschreibung sowie in diesen Ansprüchen werden diese einzelnen Antibiotika sowie Gemische von zwei oder mehreren dieser Antibiotika ebenfalls einfach als »B-5050«

bezeichnet, falls nicht anders angegeben.)

B-5050 enthält zwei sekundäre Hydroxylgruppen in den 9- und 2'-Stellungen. Diese beiden sekundären Hydroxylgruppen werden nachstehend einfach als «- bzw. /J-Hydroxylgruppe bezeichnet Wenn die «- oder

beide dieser«- und ^-Hydroxylgruppen selektiv und auf einmal oder stufenweise unter bestimmten Bedingungen verestert werden, entstehen die «-Monoester, oder «^-Diester von B-5050.

B-5050 enthält ferner eine Doppelbindung in der Stellung 10 und 11 und eine Epoxygruppe in den Stellungen 12,13.

Es wurde ferner gefunden, daß durch katalytische Reduktion von B-5050 die Doppelbindung hydriert und gleichzeitig die Epoxygruppe reduktiv gespalten wird, wobei das entsprechende Tetrahydro-B-5050 erhalten wird, das eine neu gebildete Hydroxylgruppe in der 13-Stellung enthält In der folgenden Beschreibung und in den Ansprüchen werden die einzelnen Antibiotika Tetrahydro-B-5050 A, B, C, D, E und F und Gemische von zwei oder mehreren dieser Antibiotika einfach mit dem Sammelbegriff »Tetrahydro-B-5050« bezeichnet, falls nicht anders angegeben. »Tetrahydro-B-5050« ist gegen Säuren beständiger als »B-5050«. Das in dieser Weise hergestellte Tetrahydro-B-5050 enthält drei sekundäre Hydroxylgruppen in den Stellungen 9,2' bzw. 13 und hat die folgende Formel:

CH₃

CH₂CHO

HO

CH,

Diese drei sekundären Hydroxylgruppen werden nachstehend einfach als «-, ß- und /-Hydroxylgruppe bezeichnet Wenn meiere dieser α-, ß- und y-Hydroxylgruppen selektiv oder nicht selektiv und einstufig oder mehrstufig unter bestimmten Bedingungen verestert werden, können die «^-Diester. «,y-Diester und a,/3,)>-Triester von Tetrahydro-B-5050 hergestellt werden.

Diese Ester von B-5050 und Tetrahydro-B-5050 können direkt oder durch Chromatographie oder nach anderen an sich bekannten Verfahren in der gewünschten Reinheit gewonnen werden. Sie zeigen verbesserte therapeutische Wirkungen.

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen dargelegten Gegenstände.

B-5050, eines der Ausgangsmaterialien für das Verfahren gemäß der Erfindung, wird, wie in der BE-PS 7 54 819 beschrieben, durch Kultivierung eines zur Gattung Streptomyces gehörenden und das Antibiotikum B-5050 bildenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen und verwertbare Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen bis zu einer starken Anhäufung des Antibiotikums B-5050 in der Kulturbrühe und Gewinnung des angehäuften B-5050 aus der Kulturbrühe hergestellt. Zu den bei diesem Verfahren verwendeten, B-5050 bildenden Mikroorganismen gehört Streptomyces hygroscopicus (IFO 12 995) als typisches Beispiel.

Tetrahydro-B-5050, ein weiteres Ausgangsmaterial, wird hergestellt, indem das Antibiotikum B-5050 einer an sich bekannten katalytischen Reduktion unterworden wird. Das Antibiotikum B-5050 ist fettlöslich und demgemäß in organischen Lösungsmitteln wie Methanol, Äthanol und Athylacetat löslich. Wenn somit B-5050 vorher in einem solchen Lösungsmittel gelöst und dann mit Wasserstoff in Gegenwart eines Katalysators wie Palladiumkohle und Platinoxyd katalytisch reduziert wird, wird Tetrahydro-B-5050 in guter Ausbeute erhalten.

Das andere Ausgangsmaterial, die «-Ester von Tetrahydro-B-5050, wird hergestellt durch Veresterung von B-5050 nach einem Verfahren gemäß der Erfindung und anschließende katalytische Reduktion der hierbei erhaltenen «-Ester von B-5050 in der oben beschriebe-

nen Weise. Es ist zu bemerken, daß B-5050 und seine Ester in den Stellungen 10 und 12 katalytisch reduziert, jedoch in anderen Stellungen nicht beeinflußt werden.

Zur Veresterung werden die entsprechenden Säurehalogenide und Säureanhydride eingesetzt, die sich von

gesättigten Monocarbonsäuren mit 2 b;r. 7 C-Atomen wie Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure, Isobuttersäure, n-Valeriansäure, Isovaleriansäuri., tert-Buttersäure, Pivalinsäure sowie von Crotonsäure ableiten. Bei Durchführung der Veresterung verwendet man

vorzugsweise ein Lösungsmittel, das die Veresterungsreaktion nicht stört, z. B. Pyridin, Tetrahydrofuran und Aceton, die gewöhnlich als Reaktionsmittel verwendet werden, oder Gemische solcher Lösungsmittel. Wenn die «-Ester selektiv synthetisiert werden sollen,

so ist es zweckmäßig, das Ausgangsmaterial mit einem organischen Säurehalogenid bei etwa 5° C oder einer niedrigeren Temperatur in Gegenwart eines Reaktionslösungsmittels wie Pyridin, Chinolin oder Picolin umzusetzen. Es wurde gefunden, daß hierbei die

«-Hydroxylgruppe allein selektiv in guter Ausbeute verestert wird. Das gewünschte Produkt kann daher sehr leicht und in guter Ausbeute aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, ohne daß besondere Arbeitsgänge zur Abtrennung des «^-Esters, des /?-Esters und/oder

von nicht umgesetztem Ausgangsmaterial notwendig sind.

Zur Herstellung der /J-Mönöester als Zwischenprodukt ist es zweckmäßig, das als Ausgangsmaterial verwendete Antibiotikum B-5050 bzw. Tetrahydro-B-

5050 mit einem Anhydrid oder Halogenid einer organischen Säure bei etwa 5°C oder niedriger in Gegenwart eines Lösungsmittels wie Aceton, Äthylacetat, Methanol oder Tetrahydrofuran umzusetzen.

Zur Herstellung der a^-Diester wird die Reaktion vorzugsweise bei «twa 15"C oder einer höheren Temperatur für eine längere Zeit (z. B. 10 bis 30 Stunden) als für die Herstellung der «-Ester durchgeführt Beispielsweise kann das gewünschte Ergebnis erhalten werden, wenn die Reaktion über Nacht bei etwa 20° C durchgeführt wird.

Die «,y-Diester von Tetrahydro-B-5050 werden zweckmäßig durch Umsetzung von Tetrahydro-B-5ö50 oder «-Estern von Tetrahydro-B-5050 mit einem organischen Säurehalogenid bei etwa 5°C oder einer niedrigeren Temperatur in Gegenwart eines Lösungsmittels wie Pyridin hergestellt

Zur Herstellung der «^,y-Triester von Tetrahydro-B-5050 aus Tetrahydro-B-5050 oder den Mono- oder Diestern ist es zweckmäßig, die Reaktion bei etwa 15" C oder einer höheren Temperatur als bei der Herstellung der Mono- und Diester durchzuführen. Beispielsweise

Täbeile 1

können die o^.y-Ester erhalten werden, wenn die Reaktion über Nacht bei etwa 15° C oder einer höheren Temperatur durchgeführt wird.

Zur Herstellung der Di- oder Triester kann die Veresterung in zwei oder drei Stufen durchgeführt werden. Wenn beispielsweise eine «- oder 0-Monoveresterung vorgenommen wird, wird anschließend eine weitere Veresterung zur Einführung einer solcher» Acylgruppe durchgeführt, die von der zuerst eingeführten Acylgruppe verschieden ist, wobei ein Diester erhalten wird, in dem die Wasserstoffatome der «- und ^-Hydroxylgruppen durch unterschiedliche Acylgruppen ersetzt sind.

Die verschiedenen Ester von B-5050 oder Tetrahydro-B-5050, die gemäß der Erfindung herstellbar sind, können durch ihre Verschiebung von NMR-Signalen (100 MHz in CDCl₃) identifiziert werden, wie die folgende Tabelle zeigt

NMR (d, ppm)

B-5050

Ester von B-5050
α-Ester
«,/-Diester

Tetrahydro-B-5050

Ester von Tetrahydro-B-5050
«-Ester

a, ^Diester
α, β, ^THester

Eine weitere Möglichkeit der Identifizierung ist dadurch gegeben, daß einerseits der PKa'-Wert von B-5050 oder Tetrahydro-B-5050, das eine basische

Tabelle 2

5,66, 6,03
(olefinisches Proton)

4,00 -~ etwa 5,0
ί 3,52 - etwa 5,0
14,00

Verschwinden der
olefinischen Protone

3,9 - etwa 5,0
etwa 3,9 - etwa 5,0
3,5 — etwa 5,0
3,9 -~ etwa 5,0
etwa 3,95 - etwa 5,0
2,5 - 2,4

Substanz ist etwa 6,6 bis 6.9 beträgt, während PKa'-Wert der «^-Ester bzw. der αφ,γ-Ester etwa 4,7 bis 4,8 beträgt wie Tabelle 2 zeigt

	PKa'
B-5050	etwa 6,9
Ester von B-5050 α-Ester «,/-Diester	etwa 6,6 etwa 4,7
Tetrahydro-B-5050	etwa 6,8
Ester von Tetrahydro- B-5050 «-Ester a, ^-Diester α,β, jf-Triester	etwa 6,6 etwa 6,6 etwa 4,8

Die verschiedenen Ester, die gemäß der Erfindung wicklerlösungsmittel verwendet wird, treten B-5050,

hergestellt werden können, haben verschiedene Rf- 65 sein «-Propionat /?-Propionat und «^-Dipropionat bei

Werte bei der Dünnschichtchromatographie, so daß das Rf-Werten von 0,1 bis 0,2,037 bis 0,52,0,25 bis 0,30 bzw.

Reaktionsprodukt leicht fraktioniert werden kann. 0,67 bis 0,80 auf.

Wenn beispielsweise Chloroform-Methanol als Ent- Wenn ein Gemisch von B-5050, seinem

/?-Ester und/oder α,/9-Diester erhalten wird, kann die Trennung durch Säulenchromatographie an Kieselgel oder Aluminiumoxyd unter Verwendung beispielsweise von Chloroform-Methanol, Benzol-Aceton oder Benzol-Äthylacetat als Lösungsmittel vorgenommen werden.

Die gemäß der Erfindung hergestellten Ester von B-5050 und Tetrahydro-B-5050 hemmen stark grampositive Bakterien in vitro und haben ferner ausgezeichnete therapeutische Wirkungen bei Versuchen mit infizierten Tieren gezeigt. Durch Bestimmung ihrer

Tabelle 3

Konzentrationen im Blut wurde ferner gefunden, daß diese Ester von der Körperflüssigkeit wirksam absorbiert werden. Einige dieser Ester sind ferner beständiger gegen Säuren als das eingesetzte B-5050 und löslicher in Fetten, so daß sie sich für die Herstellung von Salben eignen.

Die folgende Tabelle veranschaulicht die verbesserten physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften einiger erfindungsgemäß hergestellter Ester von B-5050 und Tetrahydro-B-5050.

Verbindung	Therapeutische	Konzentration	Akute	Säure-
	Wirkung gegen	im Blut von	Toxizitiit	beständigkeit
	gegen	Ratten (oralI	bei der Maus
	Staphylococcus		(in.)
	aureus (oral!
B-5050 (Kontrolle)	1	I	I	I
B-5050-n-acetat	2 fach	2-3fach	1/2	ungefähr
				gleich
B-5050-a-propionat	2-3 lach	2-3fach	1/2	etwas
				beständiger
B-5050-n-n-butyrat	2-3fach	2fach	1/2	2fach
B-5050-a-isobutyrat	2fach	-	-	2fach
B-5050-c-Crotonat	2 räch	-	-	2fach
B-5O5O-a.y?-Diacetat	2fach	2fach	1/2 oder	ungefähr
			weniger	gleich
B-5050-fl-propionyl-/>-acetat	2fach	-	-	2fach
B-5050-a,/?-diproprionat	2rach	3 fach	1/2 oder	l,5-2,OYach
			weniger
Tetrahydro-B-5050	1	1	-	2fach
Tetrahydro-B-5050	3 fach	3 fach	1/2 oder	3 fach
a,ß. )>-triacetat			weniger
Tetrahydro-B-5050	etwas	gleich	-	3fach
a.ß, y-tripropionat	stärker

Zu den obengenannten Vorteilen kommt der weitere Vorteil, daß die Ester gemäß der Erfindung günstiger für die orale Verabreichung sind, da sie weniger bitter sind

als die Ausgangsverbindungen.

Folgende Vergleichsversuche wurden durchgeführt:

a) Ergebnisse

Therapeutische Wirkung von a-Propionat des Antibiotikums B-5050 und anderer Makrolidantibiotika bei oraler Verabreichung von intraperitöneal mit S. aureus 308 A-I infizierten CF,/H-Mäusen >)

Antibiotikum CED₅₀) mg/kg

a-Propionat von B-5050	Kitasamycin	Acetylspiramycin	Erythrömycin-
lJ6/ig/ml2)	I.56//g/m\|2)	1.56 //g/ml²!	estolat
154	284		179
282	357		282
		282
308	282		282
	400	449
179	800		357
		400
230,8	424,6	377,0	275
Durchschnitt	Durchschnitt	Durchschnitt	Durchschnitt

^!) 5 Mäusen jeder Gruppe wurden intraperitöneal OJ ml einer 5%igen Muciniösung injiziert, die0,i Voi einer Suspension des Testorganismus enthielt. Das Anübiotikum wurde als einmalige Dosis unmittelbar nach der Injektion vsrabreicht.

²I MinimaJ-Hemmkonzentration.

b) Methode

Zum Hervorrufen von experimentellen Infektionen bei Mäusen wurden die Tiere intraperitoneal mit 0,5 ml Bakteriensuspension von Staphylococcus aureus 308 A-I infiziert.

Die auf intradermalem Wege infizierten Mäuse wurden mit einer einzigen oralen Dosis des Antibiotikums unmittelbar nach der Infektion behandelt. Die Haut jedes Versuchstiers wurde 48 Stunden nach der Infektion abgezogen und der Durchmesser von Hautläsionen wurde in zwei rechtwinklig voneinander verlaufenden Richtungen gemessen.

Für die Produkte

α-Acetat von B-5050 (1)
(X-Propionat von B-5050(2)
Λ-n-Butyrat von B-5050 (3)
Λ-Isobutyrat von B-5050 (4)
Λ-Crotonat von B-5Ö5Ö (5)
a^-Diacetat von B-5050(6)
Λ-Propionyl-P-acetat von B-5050(7)
Λ^-Dipropionat von B-5050(8)
A,|3,y-Triacetat von Tetrahydro-B-5050 (9) und
a^8.y-Tripropionat von Tetrahydro-B-5050 (10)

werden nachstehend die Ergebnisse von Vergleichsversuchen hinsichtlich des therapeutischen Effekts dieser Ester des Antibiotikums B-5050 oder des Antibiotikums Tetrahydro-B-5050 gegeben.

5U%ige mittlere effektive Dosis (ED₅₀) der Ester von Antibiotikum B-5050 oder Tetrahydro-B-5050 bei oraler Verabreichung gegen S. aureus-Infektion bei CF,/H-Mäusen

Ester	Verbindung-	(9)	ED_5n
	Nr.	(10)	(mg/kg)
von B-5050
ίτ-Acetat	(1)	352
n-Propionft	(2)	255
fi-n-Butyrat	(3)	255
σ-i-Butyrat	(4)	311
n-Crotonat	(5)	348
(T,/-Diacetat	(6)	337
ii-Propionyl-^s-acetat	(7)	352
fl\/-Dipropionat	(8)	339
Ester von Tetrahydro-B-5050
a,ß, y-Triacetat	230
a,ß, y-Tripropionat	564

B-5050-KontrolIe

662

Die Erfindung wird durch die nachstehend beschriebenen Versuche und Beispiele weiter erläutert. Hierin verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Versuch 1

in 2000-ml-Sakaguchi-K.olben werden je 500 ml eines Vorimpfkulturmediums (pH 7,0) gegeben, das aus 2,0% Glucose, 3,0% löslicher Stärke, 1,0% Sojabohnenmehl, 1,0% Maisquellwasser, 0,5% Caseinhydrolysat, das von Daigo Nutritive Chemicals Ltd, Osaka, Japan, hergestellt wird, 03% Natriumchlorid, 03% Calciumcarbonat und Wasser besteht, und sterilisiert Das sterilisierte Medium wird mit einer Schlaufenmenge von Strepto-

myces hygroscopicus (IFO-12 995) aus einer Agar-Schrägkultur geimpft, die wenigstens 4 Tage kultiviert worden ist, und 48 Stunden bei 28⁰C auf einer hin- und hergehenden, mit 115UpM rotierenden Schüttelvorrichtung mit einem Hub von 10 cm bebrütet. Die erhaltene Brühe wird in einer Menge von 1000 ml als Vorimpfkultur verwendet.

Die Vorimpfkultur wird in 100 I eines Kulturmediums (pH 7,0) gegeben, das in einem 200-1-Tank aus nichtrostendem Stahl enthalten ist, und sterilisiert. Das Medium besteht aus 3% Glucose, 0,5% Maisquellwasser, 1,0% entfettetem Sojabohnenmehl, 0,5% Natriumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,3% Calciumsulfat und Wasser. Die Bebrütung wird 24 Stunden bei 28⁰C unter Rühren mit 200 UpM und unter Belüftung mit 100 l/Minute durchgeführt.

100 I der erhaltenen Impfkultur werden in 1000 I eines sterilisierten Hauptkulturmediums gegeben, das die gleiche Zusammensetzung hat wie das für die inipikuluii verwendete Ku!turmcdiii~i und sn cittern 2000-1-Tank aus nichtrostendem Stahl enthalten ist. Die Bebrütung wird 66 Stunden bei 28"C unter Belüftung mit 1000 l/Minute und unter Rühren mit einem Kreiselmischer mit 120UpM fortgesetzt. Während der Bebrütung wird ein Polyoxypropylentriolgemisch mit einer OH-Zahl von 56 (hergestellt von der Anmelderin) als Schaumverhütungsmittel in einer Konzentration von etwa 0,05%, bezogen auf das gesamte Medium, zugesetzt. Die hierbei erhaltene Kulturbrühe hat eine antibiotische Wirksamkeit von 350 Einheiten, gerechnet als Verdünnungseinheiten, gegen Bacillus subtilis als Testmikroorganismus.

Die Kulturbrühe wird filtriert. Die filtrierte Brühe (950 I) wird mit wäßriger 2 n-NaOH-Lösung auf pH 8,5 eingestellt und mit Äthylacetat (3001) extrahiert Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt mit Wasser gewaschen und zweimal mit je 70 1 0,005 n-HCl extrahiert. Die wäßrigen Extrakte werden vereinigt mit verdünntem wäßrigem Ammoniak auf pH 8,5 eingestellt und erneut zweimal mit je 45 I Äthylacetat extrahiert Die Extrakte werden mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter Vakuum auf 50 ml eingeengt. Zum Konzentrat werden 750 ml η-Hexan gegeben, wobei 95 g eines rohen pulverförmigen Gemisches von Antibiotikum B-5050 erhalten werden.

D?s pulverförmige Produkt wird in 450 ml Benzol gelöst, während erwärmt wird. Nach Zusatz von 2 g Aktivkohle zur erwärmten Lösung wird das Gemisch filtriert. Das Filtrat wird der Abkühlung überlassen, wobei sich 19,0 g Antibiotikum B-5050-Gemisch in Form von farblosen Nadeln abscheiden.

10 g des kristallinen Gemisches von Antibiotikum B-5050 werden in 50 ml Äthylacetat gelöst Die Lösung wird der Säulenchromatographie an Kieselgel unterworf en (450 g, Hersteller Merck AG, Teilchengröße 0,05 bis 0,2 mm). Die eingesetzten Materialien werden mit einem Gemisch von Äthylacetat und Benzol (Volumenverhältnis 2:1) entwickelt und eluiert Die ersten 600 ml des Eluats, das antibiotische Wirksamkeit zeigt, werden zur Trockene eingedampft Der Rückstand wird in heißem Benzol gelöst Die Lösung wird stehengelassen, wobei sich 1 g farblose Kristalle abscheiden, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-A bestehen.

Die Säule wird mit 4 I^ Äthylacetat-Benzol-Gemisch und dann weiter mit 31 Äthylacetat eluiert Die Eluate werden aufgefangen und dann unter Vakuum eingeengt Der Rückstand wird in heißem Benzol gelöst Die Lösung wird stehengelassen, wobei sich 550 mg farblose

20

Kristalle abscheiden, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-F bestehen.

500 mg der hauptsächlich aus Antibiotikum B-5O5O-A bestehenden Kristalle werden in 1,5 ml Äthylacetat gelöst und erneut an einer Kieselgelsäule (50 g des obengenannten Produkts) chromatographiert. Das aufgegebene Material wird mit einem Gemisch von Äthylacetat und Benzol (Volumenverhältnis 1:1) eluiert, wobei verschiedene Fraktionen aufgefangen werden. Jede Fraktion wird auf die darin enthaltenen aktiven Bestandteile durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel getestet (Merck), wobei ein Gemisch von Benzol und Aceton (Volumenverhältnis 3 :2) als Entwickler verwendet wird. Die Fraktionen, die ausschließlich Antibiotikum B-5O5O-A als aktives Ingrediens enthalten, werden aufgefangen und unter Vakuum eingeengt Der Rückstand wird aus Benzol kristallisiert, wobei 88,5 mg Antibiotikum B-505U-A in Form von farblosen Prismen erhalten werden.

350 mg der hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-F bestehenden Kristalle werden der Säulenchromatographie an Kieselgel (50 g) in der oben beschriebenen Weise unterworfen. Die Säule wird mit 700 ml Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 2:1) und dann mit einem Gemisch von Äthylacetat und Benzol (Voiumenverhältnis 3 :1) eluiert, worauf durch Dünnschichtchromatographie die aktiven Ingredientien in jeder Fraktion ermittelt werden. Die Fraktionen, die ausschließlich Antibiotikum B-5050-F als aktives Ingrediens enthalten, werden aufgefangen und unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand, wird kristallisiert, wobei 75,6 mg B-5050-F als farblose Prismen erhalten werden.

Versuch 2

In 2-1-Sakaguchi-Kolben werden je 500 ml eines sterilisierten Vorimpfkulturmediums der gleichen Zusammensetzung wie beim Versuch 1 mit Streptomyces hygroscopicus (IFO-12 995) geimpft Die geimpften Kolben werden auf die gleiche Weise wie beim Versuch 1 zur Herstellung einer Vorimpfkultur bebrütet

In einem 500-1-Tank aus nichtrostendem Stahl werden 2001 eines Kulturmediums der gleichen Zusammensetzung wie beim Versuch 1 für die Impfkultur hergestellt Das Kulturmedium wird 20 Minuten bei 12TC sterilisiert und mit 2 I der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Vorimpfkultur geimpft Die Bebrütung wird 24 Stunden bei 28° C unter Belüftung mit 200 l/Minute und unter Rühren mit 200 UpM durchgeführt, um die Impfkultur für die Hauptfermentation herzustellen.

Die so hergestellte Impfkultur wird in einer Menge von 2001 in 4000 1 eines Hauptkulturmediums überführt das die obengenannte Zusammensetzung hat und in einem 6000-1-Tank aus nichtrostendem Stahl enthalten ist Die Kultivierung wird 48 Stunden bei 28° C unter Belüftung mit 2400 l/Minute und unter Rühren mit einem Kreiselmischer bei 180UpM durchgeführt Während der Bebrütung wird das obengenannte Schaumverhütungsmittel »Actocol« verwendet

Dis Kulturbrühe wird filtriert Die filtrierte Brühe (40001) wird mit 2 n-NaOH auf pH 9 eingestellt, mit 13301 Äthylacetat extrahiert und dann mit Wasser gewaschen, wobei 10521 Äthylacetatextrakt erhalten werden. Die Äthylacetatlösung wird unter Vakuum auf 1001 eingeengt Die eingeengte Lösung wird zweimal mit je 50 ΐ einer ipmoiaren wäßrigen KH₂FOi-LoSUHg extrahiert, die vorher mit Phosphorsäure auf pH 4,0 eingestellt worden ist Die Extrakte werden vereinigt, mit verdünnter wäßriger Ammoniaklösung auf pH 8,5 eingestellt und mi: 501 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatlösung wird mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck zu einem Sirup eingeengt. Durch Zusatz von 3 I η-Hexan zum Sirup werden 330 g eines pulverförmigen rohen Produkts erhalten. 300 g des Pulvers werden in 1,1 1 Benzol unter Erwärmen gelöst Die Lösung wird der Abkühlung überlassRn, wobei 117 g Kristalle, die hauptsächlich aus den Antibiotika B-5050-C, B-5050-D und B-5050-E (Kristall I) bestehen, erhalten werden.

Die Äthylacetatschicht, die mit der Phosphatlösung extrahiert worden ist, wird weiterhin zweimal mit je 50 1 0,005 n-H2SC>4 extrahiert. Die wäßrigen Schichten werden vereinigt, mit verdünnter wäßriger Ammoniaklösung auf pH 8 eingestellt und dreimal mit je 30 I Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter Vakuum zu einem Sirup eingeengt Durch Zusatz von 1,51 η-Hexan zum Sirup werden 160 g eines pulverförmigen rohen Produkts gebildet. 150 g des Pulvers werden aus heißem Benzol kristallisiert, wobei 72,5 g Kristalle erhalten werden, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-505O-A und B-5050-B mit einer geringen Menge Antibiotikum B-5050-C (Kristal! II) bestehen.

2,0 g Kristalle II werden in 20 ml Äthylacetat gelöst. Zur Lösung werden 14 ml Benzol gegeben. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an Kieselgel (Merck, Teilchengröße 0,05 bis 0,2 mm) unterworfen. Die Säule ist vorher mit einem Gemisch aus gleichen Raumteilen Benzol und Äthylacetat gefüllt worden. Das Chromatogramm wird zuerst mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 1:1) entwickelt, wobei 200 ml Eluat aufgefangen werden. Dann wird mit Äthylacetat-Benzol (Voiumenverhältnis 3 :2) entwickelt wobei Fraktionen erhalten werden, die antibiotisch gegen Bacillus subtilis wirken. Die Fraktionen, die den gleichen Bestandteil enthalten, werden vereinigt, eingeengt und aus Benzol kristallisiert, wobei 435 mg Kristalle von Antibiotikum B-5050-A einerseits und 185 mg Kristalle von Antibiotikum B-5050-B andererseits erhalten werden.

10 g Kristall I werden in 50 ml Äthylacetat gelöst, worauf 25 ml Benzol zugesetzt werden. Die Lösung wird an Kieselgel (400 g) in der oben beschriebenen Weise chromatographiert Die Säule wird zuerst mit 3 1 Äthylacetat-Benzol (Voiumenverhältnis 1:1) und dann mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 2:1) eluiert Das Eluat wird in Fraktionen von 500 ml

so aufgefangen. Die mit dem 1 :1-Gemisch erhaltenen Fraktionen enthalten die Antibiotika B-5050-A und B-5050-B. Die erste Fraktion, die mit dem 2 :1-Gemisch erhalten wird, enthält die Antibiotika B-5050-B und B-5050-C Die zweite Fraktion enthält die Antibiotika B-5050-C und B-5050-D. Die dritte Fraktion enthält die Antibiotika B-5050-D und B-5050-E, während die letzte Fraktion die Antibiotika B-5050-E und B-5050-F enthält 2 g der Kristalle, die aus der die Antibiotika B-5050-B und B-5050-C enthaltenden Fraktion erhalten worden sind, werden erneut in 15 ml Äthylacetat gelöst, worauf 10 ml Benzol zugesetzt werden. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an 250 g Kieselgel unterworfen. Die Säule wird mit Äthylacetat-Benzol (Voiumenverhältnis 3 :2) eluiert Das Eluat wird in Fraktionen von je 20 ml zerlegt Die Fraktionen, die die gleiche Komponente enthalten, werden vereinig^ eingeengt und aus Benzol oder einem Gemisch von Äthylacetat und η-Hexan kristallisiert, wobei 83 mg Kristalle von

Antibiotikum B-5050-B, 940 mg Kristalle von Antibiotikum B-5050-C und 75 mg Kristalle von Antibiotikum B-5050-D erhalten werden.

In der gleichen Weise werden 1,2 g der die Antibiotika B-5050-D und B-5O5O-E enthaltenden Fraktion der .Säulenchromatographie an Kieselgel unterworfen, wobei 600 mg Kristalle von Antibiotikum B-5050-E erhalten werden.

Die Fraktion, die anschließend an die die Antibiotika B-5050-B und B-5O5O-C enthaltende Fraktion erhalten wird, enthält Antibiotikum B-5050-C als Hauptbestandteil. 770 mg der erhaltenen rohen Kristalle werden erneut in 5 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an 100 g Kieselgel in der oben beschriebenen Weise unterworfen, wobei 220 mg Antibiotikum B-5050-C in Form von Kristallen erhalten werden.

Versuch 3

Die bei der Hauptfermentation des Versuchs 2 erhaltene nitrierte Kulturbrühe wird in e^;ner Menge von 4000 1 auf pH 8,0 eingestellt und mit 1/3 ihres Volumens an Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird auf etwa 100 1 eingeengt. Das Konzentrat wird mit 50 I Wasser gewaschen und dreimal mit je 501 einer wäßrigen 3molaren KH2PO4-Lösung extrahiert, die vorher mit Phosphorsäure auf pH 3,0 eingestellt worden ist. Die wäßrigen Extrakte werden vereinigt, mit einer wäßrigen 8 η-Ammoniaklösung auf pH 9—10 eingestellt und mit 75 1 Äthylacetat extiahiert. Der Äthylacetatextrakt wird dreimal mit je 25 I Wasser gewaschen und dann auf etwa 1,5 1 eingeengt. Durch Zusatz von etwa 30 1 η-Hexan zum Konzentrat werden 522 g eines rohen Pulvers erhalten. Die Kristallisation des Pulvers aus Benzol ergibt 272 g Kristalle des Antibiotikum b-5050-Gemisches.

Bei dem vorstehend beschriebenen Versuch wird bei Verwendung einer wäßrigen 0,2 n-Essigsäurelösung an Stelle der KH2PO«-Lösung im wesentlichen das gleiche Ergebnis erhalten. 19 g des so erhaltenen Gemisches von Antibiotikum B-5050 werden in 75 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an 800 g Kieselgel (das obengenannte Produkt von Merck) unterworden. Die Säule wird mit 3000 ml Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 1:1) eluiert, wobei 7,25 g Kristalle, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-A und B-5050-B bestehen, erhalten werden. Die Säule wird dann mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 2:1) eluiert. Die mit 1100 ml des Entwicklers eluierte erste Fraktion wird in der gleichen Weise behandelt, wobei 2,22 g Kristalle, die hauptsächlich aus Antibiotika B-5050-B und B-5050-C bestehen, erhalten werden. Die anschließend erhaltene Fraktion von 200 ml ergibt 030 g Kristalle, die hauptsächlich aus Antibiotikum B-5050-C bestehen. Aus den folgenden 300 ml werden 1,4 g eines Gemisches erhalten, das hauptsächlich aus Antibiotika B-5050-C und B-5050-D besteht Aus der aus den Setzten 600 ml bestehenden Fraktion werden 1,99 g Kristalle erhalten, die hauptsächlich aus Antibiotika B-5050-D und -E bestehen. Die Säule wird dann mit 600 ml Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 3:1) eluiert, wobei 0,645 g Kristalle erhalten werden, die hauptsächlich aus Antibiotika B-5050-D und -E bestehen. Aus der letzten Fraktion, die mit 1600 ml Äthylacetat eluiert worden ist, werden 2,09 g Kristalle erhalten, die haptsächiieh aus Antibiotikum B-505Q-F bestehen.

Die in der oben beschriebenen W°ise erhaltenen kristallinen Antibiotika B-505O-A und -B(7,25 g) weiden in 40 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an 400 g Kieselgel unterwor-

-> fen, wobei mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 1 : 1) eluiert wird. Hierbei werden 1,5 g Kristalle der Antibiotika B-5050-A und 0,65 g Kristall~ von Antibiotikum B-5050-B erhalten.

Die so erhaltenen Kristalle der Antibiotika B-5050-B

^|ri und -C (2,22 g) werden in 20 ml Aceton gelöst und der Säulenchromatographie an 300 g Kieselgel unterworfen, wobei mit Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 3:1) eluiert wird. Hierbei werden 0,398 g Kristalle von B-5050-B erhalten. Die weitere Elution mit Benzol-Ace-

i-> ton (Volumenverhältnis 2:1) ergibt 0,269 g Kristalle von B-5050-C.

Die hauptsächlich aus B-5050-C bestehenden Kristalle (0,90 g) werden in 5 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird der Säulenchromatographie an 100 g Kieselgel

-¹" unterworfen, worauf mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 2:1) eluiert wird. Hierbei werden 0,258 g Kristalle von B-5050-C erhalten.

Die Kristalle von B-5050-C und B-5050-D (1,40 g) werden in 10 ml Aceton gelöst und an einer mit 150 g

-⁵ Kieselgel gefüllten Säule Chromatographien, worauf mit Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 2:1) eluiert wird. Hierbei werden 0,596 g Kristalle von B-5050-C und 0,187 g Kristalle von B-5050-D erhalten.

Die Kristalle von B-5050-D und B-5050-E (1,99 g)

JO werden in 30 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird an einer Säule von 300 g Kieselgel Chromatographien und dann mit Benzol-Aceton (Volumenverhältnis 2:1) eluiert, wobei 0,304 g Kristalle von B-5050-D und 0,187 g Kristalle von B-5050-E erhalten werden.

^J:> Die hauptsächlich aus B-5050-F bestehenden Kristalle (2,09 g) werden in 15 ml Aceton gelöst Die Lösung wird an einer Säule von 250 g Kteselgel Chromatographien und dann mit Äthylacetat-Benzol (Volumenverhältnis 3:1) eluiert, wobei 0,585 g Kristalle von B-5050-F erhalten werden.

Versuch 4
Herstellung von Tetrahydro-B-5050

In 400 ml Äthanol werden 40 g Kristalle von B-5050 gelöst. Zur Lösung werden 12 g 10%ige Palladiumkohle als Katalysator (Engelhard) gegeben. Bei dieser katalytischen Reduktion werden 2 Mol Wasserstoff in 7 Stunden aufgenommen. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des Katalysators filtriert und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand wir¹ η-Hexan gegeben, wobei eine pulverförmige Fällung erhalten wird. Ausbeute 36,6 g.

Elementaranalyse:	C	H	N
Berechnet für C₄₁H₇₁NO₁₆.	59,05	8,58	1,68
Gefunden:	58,88	8,72	1.60

[a]% -57,0° (c = 1,0 in CHCl₃)

Versuch 5
Herstellung von «-Estern von Tetrahydro-B-5050

In 40 ml Äthanol werden 900 mg Ä-Propionyl-B-5050 und 300 mg 10%ige Palladiumkohle als Katalysator (Merck) gegeben. Bei dieser katalytischen Reduktion werden 2 Mol Wasserstoff in etwa 8 Stunden aufgenommen. Das Reakiionsgemisch wird zur Entfer-

nung des Katalysators filtriert Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in Benzol gelöst und dann mit n-Kexen versetzt Hierbei

werden 465 mg «-Propionyltetrahydro-B-5050 in Pulverform erhalten.

Elementaranalyse:	C	H	/V
Berechnet fur C₄₄H₇₅NO₁₇:	59,37	8,49	1,58
Gefunden:	59,05	8,57	1,55

[.7$ -64.4° (c = 1,0, EtOH)

Τλ der gleichen Weise können auch die anderen α-Ester von Tetrahydro-B-5050 hergestellt werden.

Versuch 6
Herstellung der αφ- Diester von Tetrahydro-B-5050

In 60 ml Äthanol werden 1,9 g o^-Dipropionyl-B-5050 gelöst Zur Lösung werden 600 mg lOVoige Palladiumkohle als Katalysator gegeben. Bei der

Elementaranalyse:

ocTcCiiilci lüT

Gefunden:

TJ XW

7117011V katalytischen Reduktion werden etwa 2 Mol Wasserstoff in etwa 7 Stunden aufgenommen. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft Der Rückstand wird in einer kleinen Acetonmenge gelöst Nach Zusatz des lOfachen Volumens an η-Hexan wird die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft Hierbei werden 133 g «^-DipropionyItetrahydro-B-5050 erhalten.

CHN
59,68 836 1,48
59,98 8,88 1,86

[a\g -1

(c = 0,99, EtOH)

In der gleichen Weise können auch die anderen «^-Diester von Tetrahydro-B-5050 hergestellt werden.

Versuch 7
Herstellung von «-Estern von Tetrahydro-B-5050

In 40 ml Äthanol werden 900 mg a-Propionyl-B-5050 gelöst Die katalytische Reduktion wird mit Wasserstoff in Gegenwart von 90 mg Platinoxyd durchgeführt Hierbei werden 2 Mol Wasserstoff in etwa 5,5, Stunden aufgenommen.

Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des Katalysators filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in einer kleinen Äthermenge gelöst. Zur Lösung wird n-Hexan gegeben. Hierbei werden 547 mg «-Propionyltetrahydro-B-5050 in Pulverform erhalten.

Die Eigenschaften dieses Produkts sowie die Rf-Werte bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel, das tnfrarotabsorptionsspektrum und das kernmagnetische Resonanzspektrum stimmen gut mit den Werten für das gemäß Beispiel 2 hergestellte «-Propionyltetrahydro-B-5050 überein.

Versuch 8

Gewinnung der einzelnen Bestandteile
aus einem Reaktionsprodukt

1) 450 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten «-Propionats von B-5050 werden in einem Lösungsmittelgemisch aus 500 ml Aceton und 1000 ml η-Hexan gelöst und aus

■35 diesem Lösungsmittel umkristallisiert, wobei 73,7 g Kristalle I erhalten werden. Die Mutterlauge wird eingeengt Das Konzentrat wird in 1,8 I Methanol gelöst und nach Zusatz von 1,11 Wasser stehengelassen. Hierbei werden 159 g Kristalle (II) erhalten. Die zweite Mutterlauge wird weiter eingeengt und das Konzentrat aus einem Lösungsmittelgemisch aus n-Hexan und Petroläther umkristallisiert, wobei 183 g eines Pulvers erhalten werden.

2) Je 70 g der Kristalle (I) und (II) werden in 300 ml Benzol gelöst Die Lösung wird an einer mit 6 kg Kieselgel (Merck, 0,05 bis 0,20 mm) in Benzol gefüllten Säule Chromatographien und mit einem Lösungsmittelgemisch aus Benzol und Aceton eluiert.

Verhältnis	stalle (II)	Menge des	Ingrediens	Ausbeute	4,0
Benzol zu		Elutions-	(o-Propionat	g	23,5
Aceton		mittels. I	von)		1,0
Kristalle (I)
5:	49,3	B-5050-B	15.8
4:	26	B-5050-D	16.2
3:	40	B-5O5O-F	3 3
Kri
5:	46.1	B-5O5O-A
4:	22	B-5O5O-C
3:	32	B-5O5O-F,

3) Die physikalischen und chemischen Eigenschaften Tabelle zusammengestellt.

der hierbei erhaltenen Antibiotika sind in der folgenden

230 240/25

α-Propionat von B-5050 -F	-E
186-189	179-181
Diäthyläther -67,0 c = 0,97	Diäthyläther n-Hexan -63,9 c= 1,00
58,79 7,87 1,63	59,23 7,98 1,61
58,89 8,05 1,49	59,14 7,81 1,59

-D

-B

-A

Schmelzpunkt °C (Zere.)

Lösungsmittel für Umkristallisation

in CHCl₃

Elementaianalyse berechnet: C H

gefunden: C H

Chemische Formel

C₄₂H₆₇NO₁₇

C₄₃H₆₉NO₁₇

180-183 Aceton

-64,3 c = 0,99

59,23 7,98 1,61

58,26 7,81 1,51

C₄₃H₆₉NO₁₇

191-193

Äthylacetat
n-Hexan
-61,3
c = 1,00

C₄₄H₇₁NO₁₇

140-142

Diäthyläther n-Hexan -66,3 c= 1,01

60,05 8,18 1,56

59,69 8,23 1,31

C₄₅H₇₃NO₁₇

198-201 Diäthyläther

-62,5 C=I₁OO

60,44 8,27 1,53

60,28 8,36 1,40

Q₆H₇₅NO₁₇

19

Aus der nachfolgenden tabellarischen Zusammenstellung ersieht man die in den folgenden Beispielen verwendeten Ausgangs-Antibiotika und die erhaltenen Endprodukte.

Beispiel Ausgangs-Antibiütikum Endprodukt

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)

9
10
11
12
13

B-5050*) B-5050») B-5050»)

8-5050»)

B-5050»)

B-5050-A")

Β-5050-ΒΌ

B-5050-A und -B«)

B-5050-A und -B«¹)

B-5O5O-C9

B-5050»)

B-5050*)

B-5050")

B-5050³)

B-5050»)

B-5050· \ und -B»)

B-5050-A und -B")

B-5050-A")

B-5O5O-A")

B-5050-B^c)

B-5O5O-C=)

B-5050-O)

B-5050»)

Tetrahydro-B-50500

Tetrahydro-B-50500 α-Propionat von B-5050
Λ-Acetat von B-5050
a-n-Butyrat von B-5050
a-Isobutyiat von B-5050
a-n-Valerat von B-5050
a-i-Valerat von B-5050
α-Acetat von B-505O-A
a-Propioaat von B-5050-A
α-Propionat von B-5050-B
α-Acetat von B-5050-A und -B
a-Propionat von B-5050-A und -B
a-Propionat von B-5050-C
α-Acetat von B-5050-C
a-Crotonat von B-5050
a,/-Diacetat von B-5Ö5Ö
a,/-Dipropionat von B-5050
a,/-Dicrotonat von B-5050
a,/-di-n-Butyrat von B-5050
a,/-Diacetat von B-5050-A und -B
a,/-Dipropionat von B-5050-A und -B a,/-Diacetat von B-5050-A
«,/-Dipropionat von B-5050-A
<x,/-Diacetat von B-5050-B
a,/-Diacetat von B-5050-C
a,/-Dipropionat von B-5050-C
a-Acetyl-jS-monopropionat von B-5050 a-Propionyl-jS-acetat von B-5050
/-Acetat von Tetrahydro-B-5050«)
/-Propionat von Tetrahydro-B-5050«) a,/-Dipropionat von Tetrahydro-B-5050 a,/-Di-n-Butyrat von Tetrahydro-B-5050 a,ß, y-Triacetat von Tetrahydro-B-5050 a,ß, y-Tripropionat von Tetrahydro-B-5G50 a,ß, y-Tripropionat von Tetrahydro-B-5050 a,/-Diacetat von Tetrahydro-B-5050 α,/, ^Tripropionat von tetrahydro-B-5050 a,/-Dipropionat von Tetrahydro-B-5050 a,/-Dipropionat von Tetrahydro-B-5050

^a) Das Gemisch von B-5050-A bis -F, erhalten wie auf S. 16, 3. Absatz der Beschreibung beschrieben.

") Die Verbindung wird erhalten wie auf S. 20, Zeile 9/10 beschrieben.

^r) Die Verbindung wird erhalten wie auf S. 20, Zeile 10/11 beschrieben.

<0 Das Gemisch von B-5050-A und -B wird wie auf S. 19, Zeilen 23-25 beschrieben erhalten.

^e) Die Verbindung wurde wie auf S. 20, letzte Zeile und S. 21,-Zeilen 1/2 beschrieben erhalten.

0 Das Gemisch von Tetrahydro-B-5050-A bis -F wird w c auf S. 23/24, Versuch 4, beschrieben erhalten.

β) Zwischenprodukt.

In den obengenannten Versuchen wurden die Antibiotika gemäß vorliegender Erfindung nach den in der Beschreibung offenbarten Methoden erhalten, während Kitasamycin, Acetylspiramycin und Erythromycinestolat aus ihren im Handel erhältlichen Präparationen extrahiert worden sind.

Beispiel 1 Herstellung des a-Propionats von B-5050

In 480 Raumteilen Pyridin werden 120 Gew.-Teile Kristalle von Antibiotikum B-5050 gelöst. Zur Lösung werden allmählich 40 Raumteile Propionylchlorid gegeben, während mit Eis gekühlt und gerührt wird. Das 55 Gemisch wird weitere 20 Minuten bei 0 bis 5° C gerührt und dann 2 Stunden in einem Kühlschrank stehengelassen. Es wird dann in 5000 Raumteile Eiswasser gegossen und 2mal mit je 2500 Raumteilen Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser, einer l%igen

60 wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und dann dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt.

Der Rückstand wird in 100 Raumteilen Aceton gelöst. Zur Lösung werden 5000 Raumteile Petroläther

h5 gegeben, wobei 108 Gewichtsteile eines weißen kristallinen Pulvers erhalten werden. Dieses Pulver wird aus einem Gemisch von Aceton und η-Hexan umkristallisiert.

21

Elementaranalyse: C

Berechnet fur C₄₄H₇₁NO₁₇: 59,65 Gefunden: 59,39

[a$ -61,4° (c =1,0, CHCl₃) -68,6° (c = 1,0, EtOH)

H N 8,08 1,58 8,07 1,73

H	N
8,18	1,56
8,15	1,75

H	N
8,18	1,56
8,23	1,57

In der oben beschriebenen Weise, jedoch unter Verwendung anderer Veresterurgsmittel, werden die folgenden Verbindungen erhalten:

1) α-Acetat von B-5050
Veresterungsmittel: Acetylchlorid Elementaranalyse: C HN Berechnet fflr C₄₃H₆^NO₁₇: 59,23 7,98 1,61 Gefunden: 58,94 8,04 1,86

[a]£ -62,6° (c = 1, CHCi₃)

2) ß-n-Butyrat von B-5050 Veresterungsmittel: n-ButyrylchJorid Elementaranalyse: C Berechnet für C₄₅H₇₃NO₁₇: 60,05 Gefunden: 60,05

Mg -643° (C= 1,CHCl₃)

3) a-Isobutyrat von B-5050 Veresterungsmittel: Isobutyryichlorid Elementaranalyse: C Berechnet fur C₄₅H₇₃NO₁₇: 60,05 Gefunden: 59,69

[egg -62,8° (c =1,0, CHCI₃)

4) a-n-Valerat von B-5050 Veresterungsmittel: n-Valeroylchlorid Elementaranaiyse: C Berechnet Tür C₄₆H₇₅NO₁₇: 60,44 Gefunden: 60,46

[α]»-59,9° (c =1,0, CHCl₃)

5) ct-Isovalerat von B-5050 Veresterungsmittel: Isovaleroylchlorid Elementaranalyse: C Berechnet Tür C₄₆H₇₅NO_n: 60,44 Gefunden: 60,38

K³-58,0° (C= 1,CHCl₃)

6) α-Acetat von B-5050-A Veresterungsmittel: Acetylchlorid Elementaranalyse: C Berechnet für C₄₅H₇₃NO₁₇: 60,05 Gefunden: 59,61

[qlg -62,5° (c = 1,0, CHCI₃)

H	N
8,27	143
8,37	1,76

8,27 8,07

7) a-Propionat von B-5050-A Veresterungsmittel.· Propionyichlorid Elementaranalyse: C Berechnet fur C₄₆H₇₅NO₁₇: 60,44 Gefunden: 59,30

[a]² _D ³ -62,7° (c = 1,00, CHCl₃)

8) α-Propionat von B-5O5O-B Veresterungsmittel: Propionyichlorid Elementaranalyse: C Berechnet für C₄₅H₇₃NO_n: 60,05 Gefunden: 59,29

[α]»-65,8° (t - 1,0, CHCI₃)

8,27 8,46

8,18 8.17

1,63

H	N
8,18	1,56
8,48	1,40

iV

1,53

1,59

1,56

1,55

9) α-Acetat von B-5050-A und -B
Veresterungsmittel: Acetylchlorid
Elementaranaiyse: C

Gefunden: 58,97

59,04

[α]«-63,1° (C= 1,02,CHCI₃)

10) α-Propionat von B-5050-A und -B
Veresterungsmittel: Propionyichlorid
Elementaranalyse: . C

Gefunden: 59,54

[a]g -61,2° (c = 0,98, CHCl₃)

11) α-Propionat von B-5050-C

Veresterungsmittel: Propionyichlorid
Elementaranalyse: C

Berechnet für C₄₉H₇,NO₁₇: 59,66
Gefunden: 59,34

[α]« -60,8° (c = 0,97, CHCI₃)

!2) α-Acetat von B-5050-C

Veresterungsmittel: Acetylchlorid
Elementaranaiyse: C

Berechnet fur C₄₃H₆₉NO,,: 59,23
Gefunden: 59,47

8,34
8,52

8,16
8,3S

8,02

8,23

H	N
7,98	1,61
8,09	1,77

Beispiel 2

Herstellung von «-Crotonat von B-5050

Das «-Crotonat von B-5050 wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt

Elementaranalyse: C H

Berechnet für C₄₅H₇,NO₁₇: 60,19 7,97

Gefunden: . 59,81 7,98

[aß -73,1° (c =1,0, CHCl₃)

Beispiel 3
Herstellung von a,/?-Diacetat von B-5050

In 10 Raumteilen Pyridin werden 5,0 Gew.-Teile Kristalle von Antibiotikum B-5050 gelöst Zur Lösung

werden bei Raumtemperatur unter Rühren 5,0 Raumteile Essigsäureanhydrid gegeben. Das Gemisch wird 15 Stunden stehengelassen und dann in 300 Raumteile Eiswasser gegossen. Die erhaltene Fällung wird abfiltnert und mit Wasser gewaschen. Die Mutterlauge

5b wird mit der Waschflüssigkeit vereinigt Das Gemisch wird 2mal mit je 200 Raumteilen Äthyla^etat extrahiert Der Extrakt wird mit Wasser, einer wäßrigen 2 n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, dehydratisiert und unier vermindertem Druck eingeengt Die vorher isolierte Fällung wird in Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wird dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt Die beiden Konzentrate werden vereinigt und aus Methylenchlorid-n-Hexan Aceton-n-Hexan oder Methylenchlorid-n-Hexan-Petroläther umkristallisiert Hierbei wet dm 4,65 Gew.-Teile des «^-Diacetats von B-5050 vom Schmelzpunkt 127 bis 132° C (Zers.) erhalten.

Flementaranalyse: C

Berechnet für ά^Η-,ΝΟ,,: 59.13 Gefunden: 59.25

[α)"-84,9° (c = I. CHCI,)

7.S3

[α]»-81,7° (C= 1.0. CHCl₁)

2) π, ß-Dicrotonat von B-50S0 Veresterungsmittel. Crotonsäureanhydrid Elementaranalyse: C H Berechnet für C₄,H-,NO„: 60.92 7.82 Gefunden: 60.55 7.76

[ag -92.0° (c = I. CHCI.-,)

3) α, ß-Di-n-Butyrat von B-5050 Veresterungsmittel: Buttersaureanhvdrid Elementaranalyse: C H Berechnet TUrC₄₉HgNOi,: 60.66 8.21 Gefunden: 60.37 8.30

Ia]_n ³ -74.9° (c = 1.0. CHCI₁)

4) o. ß-Diacetat von Β-5Ο5Ο-Λ und -B Veresterungsmittel: Essigsäureanhydrid Schmelzpunkt: 131-!35°C (Zers.) Elementaranalyse: C H Gefunden: ' 59.01 8.05

59.26 7.91

[ag -83,7° (c = 1. CHCI₅)

5) α, ß-Dipropionat von B-5050-A und -B Vertsterungsmittel: Propionsäureanhydrid Schmelzpunkt: IO4-1O7°C (Zers.) Elementaranalyse: C H Gefunden: 60.09 8.24

60.26 8.32

[ag -70,7° (c = 1.0. CHCl₃)

6) α. ß-Diacetat von B-5050-A Veresterungsmittel: Essigsäureanhydrid Elementaranalyse: C H Berechnet für Cj.H-.NO,,: 59,92 8,02 Gefunden: 59,49 8,21

[ag-77,4° (c = 1. EtOH)

7) a, ß-Dipropionat von B-5050-A Veresterungsmittel: Propionsäureanhydrid Elementaranalyse: C H Berechnet für C,₉H-₉NO,₈: 60.66 8.21 Gefunden: 60,48 834

[ag -83,2° (c = 1.02. EtOH)

8) σ, ß-Diacetat von B-5050-B Veresterungsmittel: Essigsäureanhydrid Eiemenaranaiyse: C H Berechnet für C₄₆H₇₃NO₁₈: 59,53 7,93 Gefunden: 59,47 8,10

/V

1.45

9) (u (i-Diiicetat von B-5O5O-C

Veresterungsmittel: Essigsiiureanhydrid

In der vorstehend beschriebenen Weise, jedoch unter Verwendung anderer Veresterungsmittel, werden die folgenden Verbindungen erhalten:

I,' α, ß-Dipropionat von B-5O5O Veresterungsmittel: Propionsnureanhydrid Schmelzpunkt: l32°C(Zers.) Elementaranalyse: C H

Berechnet für C₄-H-^NO₁,: 59.92 8.02 Gefunden: 60.01 8.31

riementaninalyse:
Berechnet flir C_4;H-,N(),»

Gefunden:
(«j;,' -H 1.5° ic = I. CHCI₁)

59.13

58.89 59,02

7.48

8.10 8,07

1.45

10) <(, ß-Dipropionat von B-5O5O-C

Veresterungsmittel: Propionsäureanhydrid lüementaranalyse: C H /Y

Berechnet für C₄-I Ι-,ΝΟ,.,: 59.92 8,02 1.4' (icfunden: 59,54 8.20 1.5(

In];,' -86.9° (c = 1.01.CHCI₁)

Beispiel 4

Herstellung von «-Acetyl-^monopropionat von B-505Ö

In 12 kaumteilen Pyridin werden 6,0 Gew-Teili ,i-Propionat von B-5050 bei Raumtemperatur gelösl Zur Lösung werden 1,5 Raumteile Essigsäureanhydric gegeben, während gekühlt wird. Das Gemisch wird 1' Stunden stehengelassen und dann in 500 Raumteili Eiswasser gegossen. Die gebildete Fällung wire abfiltriert end mit Wasser gewaschen. Die Mutterlaugi wird mit '!er Waschflüssigkeit vereinigt und da: Gemisch 2mal mit je 200 Raumteilen Äthylaceta extrahiert. Die Fällung wird mit dem hierbei erhaltener Extrakt vereinigt. Das Gemisch wird unter verminder tem Druck eingeengt, worauf 300 Raumteile n-Hexat zugesetzt werden. Hierbei werden 5,45 Gew.-TeiU kristallines Pulver erhalten.

	Elementaranalyse:	C	H	.V
,V	Berechnet für C₄₆H₇,NO\|_S:	59,53	7,93	1,51
1.58 1.68	Gefunden:	58,84	7,85	1,5/

60

65

[a]² _p ^} -82,3° (c = 1,CHCl₁)

Beispiel 5 Herstellung von a-PropionyI-/?-acetat von B-5050

In IO Raumteilen Pyridin werden 2,0 Gew.-Teile a-Propionat von B-5050 gelöst Zur Lösung werden bei Raumtemperatur 5 Raumteile Essigsäureanhydrid gegeben, während gerührt wird. Das Gemisch wird 15 Stunden stehengelassen und dann in 300 Raumteile Eiswasser gegossen. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen und in IC Raumteilen Äthylacetat gelöst Die Lösung wird dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Petroläther zugesetzt wird. Hierbei werden 1,8 Gew.-Teile eines kristallinen Pulvers erhalten.

Elementaranalyse: C

Berechnet für C₄₆H₇₃NO_]8: 59.53 Gefunden: 59,58

[ag-82.8° (C= LCHCI₃)

Beispiel 6

Herstellung von j?-Acetat von Tetrahydro-B-5050 als Zwischenprodukt

In 1,2 Raumteilen Aceton werden 0,2 Gew.-Teile Tetrahydro-B-5050 gelöst Zur Lösung wird 0,1 Raum-

H	N
7,93	1,51
7.92	Ul

teil Essigsäureanhydrid gegeben, während bei O⁰C gerührt wird. Das Gemisch wird 18 Stunden bei 0°C gehalten und dann in 50 Raumteile Eiswasser gegossen. Das Gemisch wird mit 5%igem Natriumhydrogencarbonat auf pH 8,0 eingestellt und dann 2mal mit je 20 Raumteilen Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand wird η-Hexan gegeben, wobei 0,161 Gew.-Teile ^-Acetyltetrahydro-B-5050 in Form eines Pulvers erhalten werden.

Elementaranalyse:	C	H	/V
Berechnet für C₄,H„NO\|₇:	58,97	8.34	1.60
Gefunden:	58.62	8.34	1.59
	58.57	8.46	1.53

[ci$ -68,2° (c = I in EtOH)

In der vorstehend beschriebenen Weise, jedoch unter Verwendung von Propionsäureanhydrid als Veresterungsmittel, wird das ß-Propionat von Tetrahydro-B-5050 hergestellt.

Elementaranalyse: C H

Berechnet fur C₄₄H₇₅NO₁₇: 59.37 8,49

Gefunden: 59.48 8,59

[α]»-76,2° (c = 1 in EtOH)

/V

1,57

1,39 Raumteile Essigsäureanhydrid gegeben, während bei Raumtemperatur gerührt wird. Das Gemisch wird 15 Stunden stehengelassen. Das Reaktionsgemisch wird in 800 Raumteile Eiswasser gegossen und 2mal mit je 270 Raumteilen Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatschichten werden vereinigt, mit Wasser, einer 5%igen wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck auf etwa 200 Raumteile eingeengt. Nach Zusatz von 8,0 Gew.-Teilen chromatographischer Aktivkohle wird das Gemisch auf eine mäßige Temperatur erwärmt und filtriert. Das Filtrat wird eingeengt.

Zum Konzentrat wird ein Gemisch von Methylenchlorid und η-Hexan gegeben, wobei 4,2 Gew.-Teile a^.y-Triacetat von Tetrahydro-B-5050 in Form von farblosen Prismen erhalten werden. Nach Zusatz von Petroläther zur Mutterlauge werden weitere 23 Gew.-Teile Pulver erhalten. Schmelzpunkt 110 bis i13"C(Zers.).

Beispiel 7

Herstellung von «,y-Dipropionat von Tetrahydro-B-5050

In 20 Raumteilen Pyridin werden 5,0 Gew.-Teile Tetrahydro-B-5050 gelöst. Zur Lösung werden bei 0⁰C v-, unter Rühren 2,0 Raumteile Propionylchlorid gegeben. Das Gemisch wird 2 Stunden stehengelassen und dann in 500 Raumteile Eiswasser gegossen. Das Gemisch wird 2mal mit je 250 Raumteilen Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und mit Wasser, einer -in 5%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen und dann dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Zum Rückstand wird n-Hexan-Petroläther gegeben, wobei 3,0 Gew.-Teile a,y-Dipropionat von Tetrahydro-B-5050 als Pulver erhalten werden.

Elementaranalyse: C HN

Berechnet für C₄₇H₇₉NOi₈: 59,66 8,42 1,45 Gefunden: 58,96 8,40 1,82

[ag -53,5° (c = 1,0 in CHCl₃)

Auf die vorstehend beschriebene Weise, jedoch unter Verwendung von n-ButyTylchJorid als Veresterungsmittel, wird α, γ-Di-n-butyrat von Tetrahydro-B-5050 hergestellt.

Elementaranalyse: C HN

Berechnet für C₄₉H₈₃NO₁₈: 60,41 8,59 1,44 Gerunden: 60,62 8,49 1,50

[ag -52,9° (c = 1,0 in CHCl₃)

Beispiel 8

Herstellung von a^.y-Triacetat von Tetrahydro-B-5050

In 30 Raumteilen Pyridin werden 8,0 Gew.-Teile Tetrahydro-B-5050 gelöst Zur Lösung werden 15

Elementaranalyse:	C	H	N
Berechnet für C₄₇H₇₇NO₁₉:	58,80	8,08	1,46
Gefunden:	58,33	8,08	1,49

[ag -76,3° (c = 1,0 in CHCI₃)

Auf die vorstehend beschriebene Weise, jedoch unter Verwendung von Propionsäureanhydrid als Veresterungsmittel, wird das α, β, γ-Tripropionat von Tetrahydro-B-5050 jo vom Schmelzpunkt 118 bis 122⁰C (Zers.) hergestellt.

Elementaranalyse: C HN

Berechnet fur C₀H₈₃NO₁₉: 59,92 8,35 1.40 Gefunden: 60,24 8,54 1,35

[α]»-70.1° (C= 1,OmCHCl₃)

Beispiel 9

Herstellung von «jS.y-Tripropionat von Tetrahydro-B-5050

In 4 Raumteilen Pyridin wird 1 Gew.-Teil 0-Propkmat von Tetrahydro-B-5050 gelöst Der Lösung wird 1 Raumteil Propionsäureanhydrid zugetropft, während mit Eiswasser gekühlt wird. Das Gemisch wird 20 St«L bei Raumtemperatur stehengelassen und dann in 15« Raumteile Eiswasser gegossen. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet Ausbeute 1,04 Gew.-Teile.

50

60

Elementaranalyse: C H

Berechnet für C₅₀H₈₃NO₁₉: 59,92 8,35 Gefunden: 59,66 8,42

{ag-73,1° (c =1,0, CHCl₃)

Beispiel 10

Herstellung von «^,y-Triacetat von Tetrahydro-B-5050

In 3 Raumteilen Pyridin werden 03 Gew.-Teile «JJ-Diacetat von Tetrahydro-B-5050 gelöst Der Lösung werden 0,3 Raumteile Essigsäureanhydrid zugetropft, während mit Eiswasser gekühlt wird. Das Gemisch wird 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und dann in 80 Raumteile Eiswasser gegossen. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet Ausbeute 0,25 Gew.-%.

Elementaranalyse: C //

Berechnet fur C₄₇H₇₇NO,,: 58,80 8.08
Gefunden: 58.45 8,26

[α# -74,9° (c = 1 in CHCI₃)

/V

1,46

1,43

In der gleichen V.'eise wird das <x^,y-Triacetat von Tetrahydro-B-5050 durch Veresterung von «,y-Diacetat von Tetrahydro-B-3050 hergestellt.

in Beispiel 11

Herstellung von «,jS.y-Tripropionat
von Tetrahydro-B-5050

In 2 Raumteilen Pyridin werden 0,3 Gew.-Teile r> «-Propionat von Tetrahydro-B-5050 gelöst. Der Lösung werden 03 Raumteile Propionsäureanhydrid zugetropft, während mit Eis gekühlt und gerührt wird. Das Gemisch wird 20 Stunden bei Raumtemperatur

Raumteile Eiswasser gegossen und die gebildete Fällung abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei werden 0,25 Gew.-Teile «^,y-Tripropionat von Tetrahydro-B-5050 in Form eines Pulvers erhalten. Der Rf-Wert (Dünnschichtchromatographie an Kieselgel) und die anderen Kennzeichen dieses Produkts stimmen mit denen des gemäß Beispiel 11 hergestellten «^,y-Tripropionats von Tetrahydro-B-5050 überein.

Beispiel 12

Herstellung von a^-Dipropionat
von Tetrahydro-B-5050

In 30 Raumteilen Aceton werden 5 Gew.-Teile «-Propionat von Tetrahydro-B-5050 gelöst. Der Lösung werden 2 Raumteile Propionsäureanhydrid zugetropft, während mit Eiswasser gekühlt wird. Das Gemisch wird

18 Stunden im Kühlschrank gehalten und dann in 100 Raumteile einer 2°/oigen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung gegossen. Die gebildete Fällung wird 2mal mit Äthylacetat extrahiert, gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltenen sirupartigen Substanz werden 200 Raumteile n-Hexan zugesetzt, wobei 4,6 Gew.-Teile eines weißen Pulvers gebildet werden.

Elementaranalyse: C H

Berechnet für C₄₇H₇₉NO₁₈: 59,66 8,42
Gefunden: 59,38 8,29

[α]»-78.5° (c = 1.CHCl₁)

Beispiel 13

Herstellung von «,y-Dipropionat
von Tetrahydro-B-5050

(X-Propionat von Tetrahydro-B-5050 gelöst Die Lösung wird unter K'ihlung mit Eiswasser mit 1,0 Raumteil Propionylchlorid versetzt und 2 Stunden gerührt Das Reaktionsgemisch wird in 300 Raumteile Eiswasser gegossen. Das Gemisch wird 2mal mit je 300 Raumteilen Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden 2mal mit einer 5%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlör.ung gewaschen, dehydratisiert und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf η-Hexan zugesetzt wird. Hierbei wird «,y-Dipropionat von Tetrahydro-B-5050 als Pulver erhalten. Ausbeute 2,4 Gew.-Teile.

Elementaranalyse:	C	H	N
Berechnet für C₄₇H₇₉NO₁₈:	59,66	8,42	1,45
Gefunden:	59,41	8,53	1.47

[α]» -54,7° (c = 1,0, CHCl₃)

Claims

Patentansprüche:

1. Ester der Antibiotika B 5050 und Tetrahydro-B-5050,dadurch gekennzeichnet, daß sich die 5 b) Acylgruppen von gesättigten Monocarbonsäuren mit 2 bis 7 C-Atomen oder von Crotonsäure ableiten und folgende Verbindungen umfaßt werden: