ES2214307T3 - Metodo para separar compuestos de alto peso molecular que contienen lactona. - Google Patents
Metodo para separar compuestos de alto peso molecular que contienen lactona.Info
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Abstract
Un método para separar un compuesto que contiene lactona, que comprende someter una mezcla de un compuesto que contiene lactona que tiene una estructura química básica de 1, 14-dihidroxi-12-[2-(4-hidroxi-ciclohexil)-1- metilvinil]-23, 25-dimetoxi-13, 19, 21, 27-tetrametil-11, 28-
Description
Método para separar compuestos de alto peso
molecular que contienen lactona.
La presente invención se refiere a un método para
separar compuestos análogos de peso molecular elevado que contienen
lactona, más particularmente un método para separar compuestos de
peso molecular elevado que contienen lactona que tienen diferentes
cadenas laterales utilizando una resina de adsorción no iónica y/o
una alúmina activa básica.
Se ha sabido utilizar iones plata para separar
los isómeros cis-trans de un ácido alifático
insaturado que tenía el mismo número de átomos de carbono (J.
Chromatography, 149 (1978) 417 -). Sin embargo, ha sido difícil
separar compuestos análogos que son ligera y parcialmente
diferentes en su estructura molecular mediante procedimientos
habituales, porque tienen el mismo o casi el mismo número de átomos
de carbono y por consiguiente son similares unos a otros en
propiedades físicas tales como solubilidad en y afinidad a
disolventes.
Los inventores de la presente invención han hecho
extensos estudios para encontrar un método para separar eficazmente
compuestos análogos que se asemejaban unos a otros en propiedades
físicas sin cambiar su estructura química. Inesperadamente, han
encontrado un método para separar compuestos de peso molecular
elevado que contienen lactona que tienen diferentes cadenas
laterales utilizando una resina de adsorción no iónica y un eluyente
apropiado y/o una alúmina activa básica y un eluyente
apropiado.
La presente invención proporciona un método para
separar un compuesto que contiene lactona que comprende someter una
mezcla de un compuesto que contiene lactona que tiene una estructura
química básica de
1,14-dihidroxi-12-[2-(4-hidroxi-ciclohexil)-1-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo-[22.3.1.0^{4.9}]
octacos-18-en-2,3,10,16-tetraona y, por lo menos uno de un grupo alquenilo (C_{2}-C_{6}) y un grupo alcoxi (C_{1}-C_{6}) como su cadena lateral y su compuesto(s) análogo a o una o ambas etapas, en cualquier, orden de
octacos-18-en-2,3,10,16-tetraona y, por lo menos uno de un grupo alquenilo (C_{2}-C_{6}) y un grupo alcoxi (C_{1}-C_{6}) como su cadena lateral y su compuesto(s) análogo a o una o ambas etapas, en cualquier, orden de
una etapa (A) para adsorber la mezcla en una
resina de adsorción no iónica y eluir con un disolvente acuoso que
contiene iones plata, y
una etapa (B) para adsorber la mezcla en una
alúmina activa básica y eluir con un disolvente orgánico,
para separar cada uno de los compuestos.
Preferentemente, según la presente invención, se
llevan a cabo ambas etapas (A) y (B) para separar un compuesto de
peso molecular elevado que contiene lactona que tiene, como su
cadena lateral, un grupo alquenilo inferior y un grupo alcoxi
inferior de su compuesto(s) análogo. Cualquiera de las etapas
(A) y (B) se puede realizar en primer lugar, pero por lo general
preferentemente se puede llevar a cabo la etapa (A) en primer
lugar.
La etapa (A) se lleva a cabo preferentemente para
separar un compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona
que tiene, como su cadena lateral, un grupo alquenilo inferior de
su compuesto(s) análogo.
La etapa (B) se lleva a cabo preferentemente para
separar un compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona
que tiene, como su cadena lateral, un grupo alcoxi inferior de su
compuesto(s) análogo.
Los compuestos de peso molecular elevado que
contienen lactona a los que se aplica el método de separación de la
presente invención son compuestos con la estructura básica de
1,14-dihidroxi-12-[2-(4-hidroxi-ciclohexil)-1-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo-[22.3.1.0^{4.9}]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraona
(designado como "Compuesto Z" en adelante en la presente
memoria) (que es tacrolimus cuando la posición 17 está sustituida
con grupo alilo y la posición 3 del ciclohexilo en el resto
4-hidroxi-ciclohexilo está
sustituida con grupo metoxi, y ascomicina cuando la posición 17
está sustituida con grupo etilo y la posición 3 del ciclohexilo en
el resto 4-hidroxi-ciclohexilo está
sustituida con grupo metoxi).
El grupo alquenilo como la cadena lateral en los
compuestos de peso molecular elevado que contienen lactona pueden
ser grupos alquenilo de cadena lineal o de cadena ramificada que
tienen 2 - 6 átomos de carbono tales como vinilo, propenilo (alilo
o 1-propenilo), butenilo, isobutenilo, pentenilo, y
hexenilo, entre los que se prefieren el vinilo y el propenilo.
Los grupos alcoxi como la cadena lateral en los
compuestos de peso molecular elevado que contienen lactona pueden
ser grupos alcoxi de cadena lineal o de cadena ramificada que
tienen 1 - 6 átomos de carbono tales como, metoxi, etoxi, propoxi,
isopropoxi, butoxi, isobutoxi, sec-butoxi,
terc-butoxi, pentiloxi, isopentiloxi, y hexiloxi,
entre los que los preferidos son los que tienen 1 - 4 átomos de
carbono tales como metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi,
isobutoxi y similares.
Especialmente, el compuesto de peso molecular
elevado que contiene lactona a ser separado según la presente
invención que tiene al menos uno del grupo alquenilo inferior y el
grupo alcoxi inferior como cadena lateral es preferentemente uno
que contienen el Compuesto Z como su estructura química básica en el
cual el grupo alquenilo inferior es el grupo propenilo y el grupo
alcoxi inferior es el grupo metoxi, uno que contiene el Compuesto Z
como su estructura química básica en el cual el grupo alquenilo
inferior es el grupo propenilo, o uno que contienen el Compuesto Z
como su estructura química básica en el cual el grupo alcoxi
inferior es el grupo metoxi.
Compuestos análogos al compuesto de peso
molecular elevado que contiene lactona a los cuales se aplica el
método de separación de la presente invención significa compuestos
que tienen la misma o sustancialmente la misma estructura química
básica que el compuesto de peso molecular elevado que contiene
lactona anteriormente descrito pero que tienen
sustituyente(s) diferentes como sus cadena(s)
lateral(es). Por ejemplo, compuestos análogos a uno que tiene
los grupos alquenilo inferior como su cadena lateral pueden ser los
que tienen la misma estructura química básica pero que tienen un
grupo alquilo inferior, un grupo alcoxi inferior, un grupo hidroxi
o similares en lugar del grupo alquenilo inferior en la misma
posición. Tales compuestos análogos incluyen los que tienen una
estructura química básica algo diferente en otras partes que la
posición de sustitución anteriormente mencionada pero que en
conjunto exhiben propiedades similares.
Compuestos particularmente preferidos análogos al
compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona que tiene
un grupo alquenilo inferior como su cadena lateral pueden ser los
que tienen un grupo alquilo inferior en lugar del grupo alquenilo
inferior, compuestos análogos a uno que tiene un grupo alcoxi
inferior como su cadena lateral pueden ser los que tienen un grupo
hidroxi en lugar del grupo alcoxi inferior, y compuestos análogos
al compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona que
tiene un grupo alquenilo inferior y un grupo alcoxi inferior como
sus distintas cadenas laterales pueden ser los que tienen un grupo
alquilo inferior en lugar del grupo alquenilo inferior y/o un grupo
hidroxi en lugar del grupo alcoxi inferior.
El grupo alquilo inferior como cadena lateral en
los compuestos de peso molecular elevado que contienen lactona
puede ser grupos alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada
que tienen 1 - 6 átomos de carbono tales como metilo, etilo,
propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo,
terc-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, entre los
que los preferidos son los que tienen 1 - 4 átomos de carbono tales
como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo.
La adsorción de la mezcla que contiene el
compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona que tiene
por lo menos uno de un grupo alquenilo inferior y de un grupo
alcoxi inferior como su(s) cadena(s)
lateral(es) y de su(s) compuesto(s)
análogo(s) sobre la resina de adsorción no iónica o la
alúmina activa básica, y la elución del compuesto objetivo del
absorbente según la presente invención se pueden llevar a cabo de
la siguiente manera.
Por ejemplo, en el caso que una mezcla de un
compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona que tiene
por lo menos uno de un grupo alquenilo inferior y de un grupo
alcoxi inferior como su cadena lateral y de
\hbox{su(s)} compuesto(s)
análogo(s) se obtenga por fermentación, la manera de someter
la mezcla al método de separación depende de si los compuestos se
producen fuera de la bacteria, es decir, extracelularmente, o si se
producen dentro de la bacteria, es decir, intracelularmente. Si se
producen extracelularmente, la mezcla de fermentación líquida se
somete al método de separación de la presente invención. Si los
compuestos se producen intracelularmente, la bacteria se trata con
un disolvente apropiado y después la mezcla extraída líquida
resultante se somete al método de separación de la presente
invención. La mezcla de fermentación líquida o la mezcla extraída
líquida, tal como es o después de concentración, se puede verter en
una columna o similar rellenada con un absorbente. Alternativamente,
el líquido de fermentación o el líquido extraído se pueden
concentrar a sequedad para dar un residuo y después el residuo se
puede disolver en un disolvente apropiado para dar una disolución,
que se vierte en la columna o similar.
Si una mezcla de un compuesto de peso molecular
elevado que contiene lactona que tiene por lo menos uno de un grupo
alquenilo inferior y de un grupo alcoxi inferior como su cadena
lateral y de su(s) compuesto(s) análogo(s) se
obtenga por síntesis, el líquido de reacción o el líquido extraído,
tal como es o después de concentración, se puede verter en una
columna o similar rellenada con un absorbente. Alternativamente, el
líquido de reacción o el líquido extraído se pueden concentrar a
sequedad para dar un residuo y después el residuo se puede disolver
en un disolvente apropiado para dar una disolución, que se vierte en
la columna o similar.
El compuesto de peso molecular elevado que
contiene lactona que tiene por lo menos uno de un grupo alquenilo
inferior y de un grupo alcoxi inferior como su cadena lateral y
su(s) compuesto(s) análogo(s) contenidos en la
mezcla se eluyen selectivamente según su afinidad por el adsorbente
y el eluyente, y un eluato combinado que contiene un compuesto
deseado se concentra a sequedad. Así se separa el compuesto deseado
de peso molecular elevado que contiene lactona.
La resina de adsorción no iónica utilizada como
el adsorbente puede ser una resina de polietileno que tiene una
estructura parcial representada por la fórmula:
en la que R es un átomo de hidrógeno o de
halógeno. Específicamente, preferentemente utilizadas son Diaion® HP
20, Diaion® HP20SS, Sepabeads® SP207 (fabricadas por Mitsubishi
Chemical Corporation, Japón) o similares. Por ejemplo, en el caso
presente en el que la estructura química básica del compuesto de
peso molecular elevado que contiene lactona es el Compuesto Z,
generalmente es preferible utilizar Diaion®
HP20SS.
Para eluir el compuesto de peso molecular elevado
que contiene lactona adsorbido por la resina de adsorción no iónica,
se utiliza un disolvente acuoso que contiene ion plata. Como sal de
plata contenida en el disolvente acuoso que contiene el ion plata,
las preferidas son nitrato de plata, perclorato de plata o
similares que existen como iones plata en agua, entre las cuales se
prefiere el nitrato de plata en el presente caso en el que la
estructura química básica del compuesto de peso molecular elevado
que contiene lactona es el Compuesto Z. La concentración de los
iones plata varía dependiendo de la naturaleza del compuesto de
peso molecular elevado que contiene lactona a ser separado, pero
puede ser generalmente 0,059 a 1,18 mol/L, preferentemente 0,12 a
0,59 mol/L, más preferentemente 0,18 a
0,47 mol/L, lo más preferentemente 0,24 a 0,35 mol/L, en términos de Ag^{+}.
0,47 mol/L, lo más preferentemente 0,24 a 0,35 mol/L, en términos de Ag^{+}.
Como medio acuoso para el disolvente acuoso que
contiene ion plata, pueden servir de ejemplo una acetona acuosa,
un alcohol acuoso (por ejemplo, metanol y etanol), un acetonitrilo
acuoso o similares. Por ejemplo, una acetona acuosa se puede
utilizar preferentemente en el presente caso en el que la estructura
química básica del compuesto de peso molecular elevado que contiene
lactona es el Compuesto Z.
La alúmina activa básica utilizada como
adsorbente puede ser preferentemente AC12 (marca registrada,
fabricada por Sumitomo Chemical Company, Limited, Japón) en el
presente caso en el que la estructura química básica del compuesto
de peso molecular elevado que contiene lactona es el Compuesto Z,
por ejemplo.
Se utiliza un disolvente orgánico para eluir el
compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona adsorbido
por la alúmina activa básica. El disolvente orgánico utilizado como
eluyente puede ser uno convencional tal como acetato de etilo,
acetona, diclorometano, una mezcla de cloroformo y metanol, una
mezcla de acetato de etilo y n-hexano. Por ejemplo,
el acetato de etilo se puede utilizar preferentemente en el caso en
el que la estructura química básica del compuesto de peso molecular
elevado que contiene lactona es el Compuesto Z.
El tipo de eluyente y, si el eluyente es un
disolvente mezclado, la proporción de mezcla de los mismos se
seleccionan preferentemente según la naturaleza del compuesto de
peso molecular elevado que contiene lactona a ser separado, a
través de análisis preliminares tales como la cromatografía en capa
fina (TLC) o similares.
La cantidad del adsorbente es preferentemente 50
veces más grande que el peso de los compuestos de peso molecular
elevado que contienen lactona en el caso en el que el adsorbente es
una resina de adsorción no iónica, y preferentemente 70 veces más
grande que el peso de los compuestos de peso molecular elevado que
contienen lactona en el caso en el que el adsorbente es una alúmina
activa básica.
El caudal SV del disolvente de elución varía
dependiendo del tamaño de partícula del adsorbente, y generalmente
puede ser aproximadamente 3 a 5 mL/min. en el caso de la resina de
adsorción no iónica y generalmente aproximadamente 3 a 5 mL/min. en
el caso de la alúmina activa básica.
La(s) fracción(es) que contienen el
compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona que tiene
por lo menos uno de un grupo alquenilo inferior y de un grupo
alcoxi inferior como su cadena(s) lateral(es) se
puede(n) detectar mediante un detector de
ultravioleta-visible o un detector diferencial de
índice de refracción, o mediante TLC después de obtener varias
fracciones. Las fracciones que contienen una sustancia deseada se
combinan y se evaporan a sequedad bajo presión reducida, por lo
cual se purifica la sustancia deseada.
Aunque la presente invención es el método de
separación para un compuesto de peso molecular elevado que contiene
lactona que tiene por lo menos uno de un grupo alquenilo inferior y
de un grupo alcoxi inferior como su cadena(s)
lateral(es), es posible separar además un compuesto análogo
restante de los otros compuestos análogos después de la separación
del compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona. Por
ejemplo, un compuesto de peso molecular elevado que contiene
lactona que tiene un grupo alcoxi inferior como su cadena lateral
se separa de una mezcla que contiene el compuesto de peso molecular
elevado que contiene lactona y un compuesto análogo que tiene
sustancialmente la misma estructura química básica y que tiene un
grupo hidroxi como su cadena lateral, y después, el método se puede
aplicar otra vez para separar el compuesto análogo por elución
utilizando un disolvente que tenga una polaridad diferente.
La Fig. 1 es un gráfico que muestra la separación
por cromatografía en columna utilizando Diaion® HP20SS y una acetona
acuosa como eluyente.
La Fig. 2 es un gráfico que muestra la separación
por cromatografía en columna utilizando Diaion® HP20SS y acetona
acuosa que contiene nitrato de plata (0,294 mol/L) como
eluyente.
La presente invención se explica ahora en detalle
por medio de ejemplos, que están para ilustrar la invención
solamente.
Ejemplo de Preparación
1
Preparación de una mezcla que contiene un
compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona que tiene
por lo menos uno de un grupo alquenilo inferior y de un grupo
alcoxi inferior como sus cadenas laterales y su compuesto análogo
por fermentación.
Un medio de cultivo (100 mL) que contiene 1% de
almidón de maíz, 1% de glicerina, 0,5% de glucosa, 1% de harina de
semilla de algodón, 0,5% de levadura desecada, 0,5% de agua
empleada para remojar el maíz y 0,2% de carbonato de calcio se
ajustó a pH 6,5, se vertió en 8 matraces Erlenmeyer de 500 mL y se
esterilizó a 120ºC durante 30 minutos. Un asa de cultivo inclinado
de Streptomyces tsukubaensis Nº 9993 (Depósito Nº FERM
BP-927 en el National Institute of Bioscience and
Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology,
Japón, bajo el Tratado de Budapest) se inoculó al medio en cada uno
de los matraces y se cultivó a 30ºC durante 72 horas en un agitador
rotatorio. Este caldo cultivado se transfirió como un cultivo de
siembra a 160 L del mismo medio que estaba contenido en un
fermentador tipo tanque de 200 L pre-esterilizado a
120ºC durante 30 minutos y al cual se han añadido 0,05% de
Adekanol® (agente antiespumante, marca registrada, fabricado por
Asahi Denka Co., Japón) y 0,05% de silicona (fabricada por Shinetsu
Chemical Co., Japón). Esto se cultivó a 30ºC durante 48 horas con
agitación a 200 rpm bajo aireación de 160 L/min. Este caldo
cultivado (30 L) se inoculó a 3.000 L de un medio de producción de
pH 6,8 pre-esterilizado a 120ºC durante 30 minutos
que contenía 3% de almidón soluble, 0,8% de germen de trigo, 0,4%
de levadura desecada, 0,6% de agua empleada para remojar el maíz,
0,1% de carbonato de calcio, 0,05% de Adekanol® y 0,05% de silicona
en un tanque de 4.000 L, y se fermentó a 25ºC durante 168 horas con
agitación a
140 rpm bajo aireación de 1.500 L/min.
140 rpm bajo aireación de 1.500 L/min.
El caldo cultivado así obtenido se filtró
utilizando 50 kg de tierra de diatomeas. Las torras miceliales se
extrajeron con 1.000 L de acetona para dar 1.000 L de extracto. El
extracto de acetona de las tortas miceliales y el filtrado
(2.700 L) se combinaron para dar una muestra cruda.
(2.700 L) se combinaron para dar una muestra cruda.
Se sometió una mezcla (200 mg) de tacrolimus (200
mg), ascomicina y 17-propil
-1,14-dihidroxi-12-[2-(4-hidroxi-3-metoxiciclohexil)-1-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4
-azatriciclo[22.3.1.0^{4.9}]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraona
(designado como "Compuesto A" en adelante en la presente
memoria) en acetona acuosa del 50% a cromatografía en columna
utilizando Diaion® HP20SS (20 mL) de modo que se adsorbieron las
sustancias contenidas en la mezcla. Después, se eluyeron el
tacrolimus, la ascomicina y el Compuesto A a temperatura ambiente
utilizando una acetona acuosa del 50% (v/v) que contenía nitrato de
plata (0,294 mol/L) y una acetona acuosa del 60%(v/v) como
eluyentes en una carga de 9,5 g/L - R en términos de tacrolimus.
También se llevo a cabo de manera semejante una prueba de control
utilizando una acetona acuosa como eluyente que no contenía nitrato
de plata. Los resultados se muestran en la Fig. 1 y en la Fig.
2.
La muestra cruda (300 mL) obtenida en el Ejemplo
de Preparación 1 se sometió a cromatografía en columna utilizando
Diaion® HP20SS (20 mL) de modo que se adsorbieron las sustancias
contenidas. La columna se lavó con acetona acuosa del 40% (100 mL).
Después de eso, se eluyó una mezcla de tacrolimus y
17-alil-1,14-dihidroxi-12-[2-(3,4-dihidroxiciclohexil)-1-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo[22.3.1.0^{4.9}]oc-
tacos-18-en-2,3,10,16-tetraona (designado como "Compuesto B" en adelante en la presente memoria) a temperatura ambiente utilizando como eluyente una acetona acuosa del 50% que contenía nitrato de plata (0,294 mol/L). Posteriormente, bajo las mismas condiciones, se eluyó por separado una mezcla de ascomicina y el Compuesto A utilizando acetona acuosa del 60% (v/v).
tacos-18-en-2,3,10,16-tetraona (designado como "Compuesto B" en adelante en la presente memoria) a temperatura ambiente utilizando como eluyente una acetona acuosa del 50% que contenía nitrato de plata (0,294 mol/L). Posteriormente, bajo las mismas condiciones, se eluyó por separado una mezcla de ascomicina y el Compuesto A utilizando acetona acuosa del 60% (v/v).
La cantidad de cada uno de los compuestos
contenidos en las fracciones separadas así obtenidas se midió por
análisis de HPLC (fase móvil: acetonitrilo/solución acuosa del 10%
de éter de polioxietileno y alcohol laurílico (Nakalai Tesque,
Inc., Kyoto, Japón)/ agua = 40/10/50; columna: TOSOH
TSK-gel ODS-80Tm (5 \mum, 4,6
\phi x 150 mm); temperatura: 75ºC; longitud de onda para la
detección: 210 nm; caudal: 1,0 mL/min.; cantidad de inyección: 20
\muL). Los resultados de la separación de una mezcla de
tacrolimus y Compuesto B, ascomicina y Compuesto A se muestran en
la Tabla 1.
Como se ve claramente en la Tabla 1, el
tacrolimus, el Compuesto B, la ascomicina y el Compuesto A no se
eluyeron en el líquido de paso (fracción 1) ni en el líquido de
lavado (fracción 2). Fueron adsorbidos completamente por la resina.
Por elución con la disolución de nitrato de plata (fracción 3), se
recogieron aproximadamente el 100% del tacrolimus y el Compuesto B,
y la elución de Compuesto A estuvo por debajo de un nivel
detectable. En la fracción extruida por acetona acosa del 60%
(fracción 4), se recogieron selectivamente aproximadamente el 100%
de la ascomicina y el Compuesto A.
Para resumir, adsorbiendo al mezcla de compuestos
de peso molecular elevado que contienen lactona que tienen un grupo
alquenilo inferior como su cadena lateral (tacrolimus y Compuesto B)
y sus compuestos análogos (ascomicina y Compuesto A) a la resina de
adsorción no iónica y eluyendo con el disolvente acuoso que
contiene iones plata, se pudieron separar los compuestos de peso
molecular elevado que contienen lactona que tienen un grupo
alquenilo inferior como su cadena lateral.
Además, los resultados anteriormente mencionados
muestran que también se separaron los compuestos de peso molecular
elevado que contienen lactona que tienen un grupo alquilo inferior
como su cadena lateral (ascomicina y Compuesto A).
Se concentraron y extrajeron con acetato de etilo
las fracciones obtenidas en el Ejemplo 2 que contenían la mezcla de
tacrolimus y Compuesto B. Una capa orgánica se secó con sulfato
magnésico y después se evaporó a sequedad. El residuo obtenido se
sometió a cromatografía en columna utilizando una alúmina activa
básica, AC 12 (20 mL) empaquetada con acetato de etilo. La elución
se llevo a cabo, a temperatura ambiente, utilizando acetato de
etilo
(400 mL) como eluyente y se obtuvieron fracciones separadas (20 mL x 1 y 200 mL x 2).
(400 mL) como eluyente y se obtuvieron fracciones separadas (20 mL x 1 y 200 mL x 2).
Se midió la cantidad de cada uno de los
compuestos contenidos en las fracciones separadas así obtenidas
mediante análisis de HPLC de la misma manera que en el Ejemplo 2.
Los resultados de la separación del tacrolimus y el Compuesto B se
muestran en la Tabla 2.
| Fracción Nº | Cantidad de líquido | Tacrolimus | Compuesto B |
| 1 | 20 mL | 0% | 0% |
| 2 | 100 mL | 59,7% | 0% |
| 3 | 100 mL | 10,4% | 0% |
| Total | 220 mL | 70,1% | 0% |
Como se ve claramente en la Tabla 2, adsorbiendo
la mezcla de un compuesto de peso molecular elevado que contiene
lactona que tiene un grupo alcoxi inferior como su cadena lateral
(tacrolimus) y su compuesto análogo (Compuesto B) a la alúmina
activa básica y eluyendo con el disolvente orgánico, se pudo separar
el compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona que
tiene un grupo alcoxi inferior como su cadena lateral.
Además, los resultados anteriormente mencionados
muestran que también se separó el compuesto de peso molecular
elevado que contiene lactona que tiene un grupo hidroxi como su
cadena lateral (Compuesto B).
El tacrolimus, que es un compuesto de peso
molecular elevado que contiene lactona que tiene un grupo alquenilo
inferior y un grupo alcoxi inferior como sus cadenas laterales, se
separó llevando a cabo los Ejemplos 2 y 3, es decir, llevando a
cabo la etapa de adsorción por la resina de adsorción no iónica y
elución con el disolvente acuoso que contiene iones plata y la etapa
de adsorción por la alúmina activa básica y elución con el
disolvente orgánico en este orden o en orden inverso sobre la
solución que contiene una mezcla de tacrolimus y su compuesto
análogo.
Según la presente invención, se puede separar un
compuesto de peso molecular elevado que contiene lactona que tiene
por lo menos uno de un grupo alquenilo inferior y de un grupo alcoxi
inferior como su(s) cadena(s) lateral(es) de
compuesto(s) análogo(s) con inesperada alta eficacia
realizando o una o ambas etapas de una etapa para adsorber en una
resina de adsorción no iónica y eluir con disolvente acuoso que
contiene iones plata y una etapa para adsorber en una alúmina
activa básica y eluir con un disolvente orgánico.
Claims (14)
1. Un método para separar un compuesto que
contiene lactona, que comprende someter una mezcla de un compuesto
que contiene lactona que tiene una estructura química básica de
1,14-dihidroxi-12-[2-(4-hidroxi-ciclohexil)-1-metilvinil]-23,25-dimetoxi-13,19,21,27-tetrametil-11,28-dioxa-4-azatriciclo-
[22.3.1.0^{4.9}]octacos-18-en-2,3,10,16-tetraona
y, por lo menos uno de un grupo alquenilo
(C_{2}-C_{6}) y un grupo alcoxi
(C_{1}-C_{6}) como su cadena lateral y
su(s) compuesto(s) análogo(s) a o una o ambas
etapas, en cualquier orden, de
una etapa (A) para adsorber la mezcla en una
resina de adsorción no iónica y eluir con un disolvente acuoso que
contiene iones plata, y
una etapa (B) para adsorber la mezcla en una
alúmina activa básica y eluir con un disolvente orgánico,
para separar cada uno de los compuestos.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que
el compuesto que contiene lactona tiene tanto un grupo alquenilo
(C_{2}-C_{6}) como un grupo alcoxi
(C_{1}-C_{6}) como sus cadenas laterales y se
separa realizando las etapas (A) y (B) en este orden o en orden
inverso.
3. Un método según la reivindicación 1, en el que
el compuesto que contiene lactona tiene un grupo alquenilo
(C_{2}-C_{6}) como su cadena lateral y se separa realizando la etapa (A).
(C_{2}-C_{6}) como su cadena lateral y se separa realizando la etapa (A).
4. Un método según la reivindicación 1, en el que
el compuesto que contiene lactona tiene un grupo alcoxi
(C_{1}-C_{6}) como su cadena lateral y se
separa realizando la etapa (B).
5. Un método según la reivindicación 2, en el que
el grupo alquenilo (C_{2} -C_{6}) como la cadena lateral es un
grupo propenilo y el grupo alcoxi (C_{1}-C_{6})
como la cadena lateral es un grupo metoxi.
6. Un método según la reivindicación 3, en el que
el grupo alquenilo (C_{2} -C_{6}) como la cadena lateral es un
grupo propenilo.
7. Un método según la reivindicación 4, en el que
el grupo alcoxi (C_{1} -C_{6}) como la cadena lateral es un
grupo metoxi.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la resina de adsorción no iónica
tiene una estructura parcial representada por la fórmula:
en la que R es un átomo de hidrógeno o un átomo
de
halógeno.
9. Un método según la reivindicación 8, en el que
la resina de adsorción no iónica es Diaion® HP20, Diaion® HP20SS o
Sepabeads® SP207.
10. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1, 2, 4, 5, 6, 7 y 9, en el que la alúmina activa
básica es AC 12.
11. Un método según la reivindicación 2, en el
que el compuesto análogo es un compuesto que contiene lactona que
tiene, como su(s) cadena(s) lateral(es), un
grupo alquilo (C_{1}-C_{6}) y un grupo hidroxi
en lugar del grupo alquenilo (C_{2}-C_{6}) y
del grupo alcoxi (C_{1}-C_{6}),
respectivamente.
12. Un método según la reivindicación 3, en el
que el compuesto análogo es un compuesto que contiene lactona que
tiene, como su cadena lateral, un grupo alquilo
(C_{1}-C_{6}) en lugar del grupo alquenilo
(C_{2}-C_{6}).
\newpage
13. Un método según la reivindicación 4, en el
que el compuesto análogo es un compuesto que contiene lactona que
tiene, como su cadena lateral, un grupo hidroxi en lugar del grupo
alcoxi (C_{1}-C_{6}).
14. Un método según la reivindicación 5 ó 6, en
el que el grupo propenilo es alilo.
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