KR940005657B1

KR940005657B1 - 트립토판 동족체 공급에 의한 레베카마이신 동족체

Info

Publication number: KR940005657B1
Application number: KR1019910003548A
Authority: KR
Inventors: 싱 램 킨; 알. 쉬뢰더 다니엘; 마테이 재클린; 포렌자 살바토레; 에이. 맷슨 제임스
Original assignee: 브리스톨-마이어즈 스퀴브 컴페니; 도미닉 엠. 메자펠
Priority date: 1990-03-06
Filing date: 1991-03-05
Publication date: 1994-06-22
Also published as: KR910016934A; DK0450327T3; NO179555C; AU623050B2; NO910855D0; CY1941A; DE69119964T2; IL97233A0; HUT61601A; EP0450327B1; US5468849A; HK181496A; CS9100586A2; NO179555B; HU910716D0; HU211055B; EP0450327A1; DE69119964D1; AU7261691A; ES2088439T3

Abstract

내용 없음.

Description

트립토판 동족체 공급에 의한 레베카마이신 동족체

제 1 도는 구조식 (IV)의 화합물에 대한 IR 스펙트럼.

제 2 도는 구조식(IV)의 화합물에 대한¹H-NMR.

제 3 도는 구조식(IV)의 화합물에 대한¹³C-NMR.

제 4 도는 구조식(V)의 화합물에 대한 IR 스펙트럼.

제 5 도는 구조식(V)의 화합물에 대한¹H-NMR.

제 6 도는 구조식(V)의 화합물에 대한¹³C-NMR.

제 7 도는 구조식(VIII)의 화합물에 대한 IR 스펙트럼.

제 8 도는 구조식(VIII)의 화합물에 대한¹H-NMR.

제 9 도는 구조식(VIII)의 화합물에 대한¹³C-NMR.

제10도는 구조식(IV) 화합물의 질량 스펙트럼.

제11도는 구조식(IV) 화합물의 UV 스펙트럼.

제12도는 구조식(V) 화합물의 질량 스펙트럼.

제13도는 구조식(V) 화합물의 UV 스펙트럼.

제14도는 구조식(VIII) 화합물의 질량 스펙트럼.

제15도는 구조식(VIII) 화합물의 UV 스펙트럼.

본 발명은 항신생물 특성을 가진 신규의 레베카마이신(rebeccarmycin) 동족체에 관한 것이다.

미국특허 제4,487,925호 및 4,552,842호에서는 레베카마이신으로 지칭된 항종양제, 및 그의 5'-메틸과 5', 2', 3" ,6" -테트라아세테이트 유도체, 그리고 실제량의 레베카마이신이 생성될 때까지 침지 초기 조건하에 탄소 및 질소 동화원을 함유한 수성영양배지에서 노카르디아 아에로콜로니게네스(Nocardia aerocolonigenes), 바람직하게는 노카르디아 아에로콜로니게네스 ATCC 39243의 레베카마이신 생성균주, 또는 그의 레베카마이신 생성 돌연변이체를 배양시켜 동일시약을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 최근에, 노카르디아 아에로콜로니게네스, ATCC 39243은 사카로트릭스 아에로콜로니게너스(Saccharothrix aerocolonigenes), ATCC 39243으로 재분류되었다(Bush외 그의 공동저자, J.Antibiotics, 40 : 668-678, 1987).

본 발명은 레베카마이신(구조식 I )으로 지칭된 신규의 항종양제 동족체를 제공한다.

[구조식 Ⅰ]

보다 구체적으로는, 다음의 일반식 (II 및 III)의 레베카마이신 동족체, 그위에 이와 같은 동족체의 약리적으로 허용되는 산부가염을 제공한다.

[일반식Ⅱ]

[일반식Ⅲ]

상기식에서 X₁및 X₂는 X₁및 X₂가 동시에 수소가 아니라는 조건하에 각각 불소 또는 수소이다.

일반식 (II 및 III)의 화합물은 사카로트릭스 아에로폴로니게네스인 레베카마이신 생성균주 배양체를 적합한 트립토판 동족체로 보충함으로서 생성된다.

미국특허 제4,487,925호 및 4,552,842호에서는 레베카마이신(구조식 I )으로 지칭된 항종양제의 생성 및 분리를 개시한다.

[구조식 Ⅰ]

상기 언급된 레베카마이신 화합물은 사카로트릭스 아에로콜로니게네스인 레베카마이신 생성균주의 발효 주요성분이다.

본 발명에 따라 유용한 항종양 특성을 가진 신규의 레베카마이신 동족체를 생성하는 어떠한 트립토판 동족체의 존재하에 미국특허 제4,487,925호 및 4,552,842호에 기재된 발효법이 수행될 수 있다는 것이 발견된 바 있다. 본 발명의 레베카마이신 동족체, 그외에 약리적으로 허용되는 산부가염이 다음의 일반식(II 및 III)을 가진다.

[일반식 Ⅱ]

[일반식 Ⅲ]

상기식에서 X₁및 X₂는 X₁및 X₂가 동시에 수소가 아닌 조건하에 불소 또는 수소이다.

본 발명의 화합물의 보다 바람직한 일예는 다음 구조식(VI)을 가진 화합물이다.

[구조식 Ⅳ]

본 발명의 화합물의 다른 바람직한 일예는 다음 구조식(V)을 가진 화합물이다.

[구조식 Ⅴ]

본 발명의 화합물의 다른 바람직한 일예는 다음 구조식(VI)을 가진 화합물이다.

[구조식 Ⅵ]

본 발명의 화합물의 또다른 바람직한 일예는 다음 구조식(VII)을 가진 화합물이다.

[구조식 Ⅶ]

본 발명의 화합물의 또다른 바람직한 일예는 다음 구조식(VIII)을 가진 화합물이다.

[구조식 Ⅷ]

본 발명의 화합물의 다른 바람직한 일예는 다음 구조식(IX)을 가진 화합물이다.

[구조식 Ⅸ]

본 발명의 화합물의 다른 바람직한 일예는 다음 구조식(X)을 가진 화합물이다.

[구조식 Ⅹ]

또한 본 발명의 화합물의 다른 바람직한 일예는 다음 구조식(XI)을 가진 화합물이다.

[구조식 XI]

본 발명에 있어서 트립토판 동족체를 레베카마이신 발효배지에 첨가하고 발효중 상응하는 레베카마이신 동족체 생성 레베카마이신 구조로 혼입시킨다. 본 방법에 대한 보다 면밀한 기술이 다음에 제공되며 예시 실시예로 이어진다.

항생제의 제조

구조식(IV-XI)의 화합물은 DL-4-플루오로트립토판, DL-5-플루오로트립토판, DL-6-플루오로트립토판, 또는 DL-7-플루오로트립토판과 함께 사카로트릭스 아에로콜로니게네스의 레베카마이신 생성 균주를 배양시켜 제조된다. 보다 바람직한 생성 유기체는 미국특허 제4,487,925호에서 노카르디아 아에로콜로니게네스 균주 C38, 383-RK2(ATCC 39243)로서 이전에 지칭된 사카로트릭스 아에로콜리니게네스의 신규 균주이다. 최근에, 이와 같은 균주는 사카로트릭스 아에로콜로니게네스로서 재분류되었으며(Bush외, J. Antibiotics 40 : 668-678, 1987), 본 발명에서 사카로트릭스 아에로콜로니게네스 균주 C38, 383-RK2(ATCC 39243)로서 지칭된다. 이와 같은 균주를 파나마에서 수집된 토양시료로부터 분리하였다. 균주 C38, 383-RK2의 생물적 순수 배양체가 매릴랜드주 록빌시 소재 American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁된 바 있으며 ATCC 39243으로서 미생물 영구 수탁번호를 부여받았다. C38, 383-RK2로서 지칭된 이와 같은 배양체는 코네티컷주 06492 윌링포드 리서치 파코웨이 5소재 브리스톨-마이어즈 스퀴브 컴페니 약제연구 및 개발부(배양수탁)에서 친액성 튜브 및 냉동약병으로 휴면배양체로서 유지된다.

균주 C38, 383-RK2(ATCC 39243)에 대한 분류연구가 미국특허 제4,487,925호 및 J. Antibiotics 40 : 668-678, 1987에 상세히 기재된 바 있다. 균주는 사카로트릭스 아에로콜로니게네스의 신규 균주로 분류된 바 있다.

본 발명은 특히 바람직한 균주 ATCC 39243의 용도 또는 그 기술과 완전히 상응하는 유기체에 국한하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 특히 X선 방사, 자외선 방사, 나이트로겐 머스타드처리, 페이지 노출등과 같은 종래수단에 의하여 생성될 수 있는 다른 레베카마이신 생성 균주 또는 기재된 유기체의 돌연변이체를 포함하는 것으로 의도된다.

본 방법을 실시하는데 있어서, 균주 C38, 383-RK2(ATCC 39243)의 확인 특성이 있는 사카로트릭스 아에로콜로니게네스의 레베카마이신 생성 균주, 또는 그의 돌연변이체 또는 변이체를 적합한 트립토판 동족체로 보충된 종래의 수성 영영배지에서 배양시킨다. 구조식(VI 및 X) 화합물의 최적생성을 위하여, 배지는 DL-4-플루오로트립토판으로 보충된다. 구조식(IV 및 IX) 화합물의 최적생성을 위하여, 배지는 DL-5-플루오로트립토판으로 보충된다. 구조식(V 및 VIII) 화합물의 최적생성을 위하여, 배지는 DL-6-플루오로트립토판으로 보충된다. 구조식(VII 및 XI) 화합물의 생성을 위하여, 배지는 DL-7-플루오로트립토판으로 보충된다. 방사선 균류용 공지의 영양원 함유 영양배지에서 유기체를 성장시킨다. 따라서, 유기체는 수크로서, 락토스, 글루코스, 람노스, 프룩토스, 글리세롤 또는 가용성 전분과 같은 탄소 동화원을 함유한 영양배지에서 성장된다. 배지는 또한 어분, 팹톤, 땅콩깻묵, 면실박, 옥수수, 침지액, 아미노산 또는 암모늄염과 같은 질소 동화원을 함유한다. 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 인산염, 황산염, 질산염, 탄산염 및 유사이온을 제공하도록 배지내에 영양무기염이 또한 혼입될 수 있다. 구리, 망간, 철, 아연등과 같은 미량원소가 필요하다면 배지에 첨가되거나, 또는 그들이 배지의 다른 구성물의 불순물로서 존재할 수 있다. 한정된 양의 제조를 위하여, 표면배양 및 병이 또한 사용될 수 있지만 대량의 항생제 제조를 위하여 침지 호기조건이 사용되는 것이 바람직하다. 다른 방사선 균류의 배양에 사용된 일반적 방법이 본 발명에 적용될 수 있다.

본 발명의 항생제 제조는 생성 유기체의 만족할만한 성장에 도움이 되는 어떠한 온도에서 효과적일 수 있으며 편리하게도 약 28℃의 온도에서 수행된다. 발효는 플라스크 또는 다양한 용량의 실험실 또는 산업용 발효기에서 수행될 수 있다.

탱크 발효가 사용될때 소량의 배양배지를 생성 유기체의 사면, 저온 방부제배양 또는 친액배양과 함께 접종시킴으로서 영양즙에서 식물성 접종물을 생성시키는 것이 바람직하다. 이와 같은 방식으로 생육가능하고 활성인 접종물을 얻은후, 그것을 본 발명의 항생제에 대한 대규모 제조용 생성배지로 충전된 발효 탱크로 무균 전이시킨다. 식물성 접종물이 성장된 배지는 생성 유기체의 양호한 성장이 얻어지는한 탱크에 사용되고 적합한 플루오로트립토판으로 보충된 것과 동일하거나, 서로 다를수 있다. 추가의 교반은 임펠러장치에 의하여 제공될 수 있다. 돼지기름 또는 실리콘오일과 같은 소포제가 또한 필요에 따라 첨가될 수 있다. 항생제 제조는 고성능 액체 크로마토그래피 시험 또는 종래의 생물학적 시험에 의하여 검측된다. 일반적으로, 본 발명의 항생제 최적제조는 약 6일의 배양후 성취된다.

소위 얻어진 유도체의 분리 및 정제는 종래의 크로마토그래피 방법에 의하여 수행될 수 있다.

물리화학적 특성 :

구조식 (IV, V 및 VIII)의 화합물은 다음의 물리화학적 특성을 갖는다 :

구조식 (IV) 화합물

성상 : 밝은황색 비정질 고체

분자식 : C₂₆H₁₉F₂N₃O₇

분자량 : 523.454

질량 스펙트럼 : 크라토스(Kratos) MS25 질량 분광계. FABMS 524(M+H)⁺, 361(M-162, 클루코스상실).

자외선 스펙트럼 : 휴렛 팩커드(Hewlett Packard) 845A 다이오드 배열 분광광도계. 농도 1.0mg/100ml MeOH. 중성 λmax nm(E 1%/1cm) : 405.322(457), 288, 277, 259, 230(348).

적외선 스펙트럼 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 1800 FTIR 분광계. KBr 펠릿(cm^-1) : 3340, 2915, 1752, 1708, 1628, 1591, 1484, 1462, 1392, 1331, 1292, 1247, 1191, 1112, 1081, 1052, 947, 904, 795, 762, 752, 752, 511.

360MHz¹H-NMR : 브루커 모델(Bruker Model) AM-3000 분광계. 이중 탄소-양자 프로브, 5mm.용매 d₆-DMSO. 관찰된 화학전이(ppm) : 11.76(s, 1H), 11.23(s,1H), 8.85(dd,1H), 8.77(dd,1H), 8.01(dd, 1H), 7.68(dd, 1H), 7.46(m, 2H), 6.29(d, 1H), 6.12(t, 1H), 5.45(d, 1H), 5.17(d, 1H), 4.95(d, 1H), 4.07(d, 1H), 3.95(m,2H), 3.81(d, 1H), 3.59(m, 2H).

90MHz¹³C-NMR : 브루커 모델 AM-3000 분광계. 양자 짝풀림 스펙트럼. 이중 탄소-양자 프로브, 5mm. 용매 d₆-DMSO. 관찰된 화학전이(ppm) : 170.9, 170.8, 157.0(d), 157.0(d), 138.6, 137.2, 130.7, 129.2, 121, 7(d), 121.4(d), 121.3, 119.6, 116.6, 115.1, 115.0(d), 114.6(d), 113.3(d), 113.2(d), 109,1(d), .109.1(d), 84.8, 78.7, 76.5, 73.2, 67.6, 58.3.

용해도 : DMSO, DMF, THF, 아세톤, EtOAc, MeOH에서 가용성.

박층 크로마토그래피(R_f값) : 정상 상(실리카겔 60) ; EtOAc : 0.10. EtOAc-MeOH(9 : 1 v/v) : 0.41. 역상(C₁₈) ; 0.1M NH₄OAc-MeOH-CH₃CN(2 : 4 : 4 : v/v) : 0.67

구조식(V) 화합물

성상 : 밝은황색 비정질 고체

분자식 : C₂₆H₁₉F₂N₃O₇

분자량 : 523.454

질량 스펙트럼 : 크라토스 MS25 질량 분광계. FABMS 524(M+H)⁺, 361(M-162, 글루코스상실).

자외선 스펙트럼 : 휴렛 팩커드 8452A 다이오드 배열 분광 광도계. 농도 1.0mg/100ml MeOH. 중성 λmax nm(E 1%/1cm) 398(60), 316(640), 280(259), 256(313), 226(526), 204(497).

적외선 스펙트럼 : 퍼킨-엘머 1800 FTIR 분광계. KBr 펠릿(cm-1) : 3324, 2927, 1745, 1701, 1623, 1580, 1491, 1471, 1452, 1412, 1384, 1330, 1233, 1172, 1116, 1075, 1048, 1016, 963, 916, 829, 764, 745, 646, 635, 617, 498, 490.

360MHz¹H-NMR 브루커 모델 AM-3000 분광계. 이중 탄소-양자 프로브, 5mm. 용매 d₆-DMSO. 관찰된 화학전이(ppm) 11.77(s,1H), 11.18(s, 1H), 9.12(dd, 1H), 9.05(dd, 1H), 7.85(dd, 1H), 7.43(dd, 1H), 7.23(t, 2H), 6.26(d, 1H), 6.24(s, 1H), 5.31(d, 1H), 5.04(d, 1H), 3.98(m,2H), 3.87(m, 1H), 3.66(S,2H).

90MHz¹³C-NMR : 브루커 모델 AM-3000 스펙트럼. 양자 짝풀림 스펙트럼. 이중 탄소-양자 프로브, 5mm. 용매 d₆-DMSO. 관찰된 화학전이(ppm) : 170.8, 170.7, 161.8(d), 161.8(d), 143.2(d), 141.5(d), 130.1, 128.7, 126.0(d), 125.9(d), 120.9, 119.3, 118.2, 118.1, 117.7, 116.5, 108.8(d), 108.6(d), 98.9(d), 98.3(d), 84.7, 78.6, 76.5, 73.1, 67.5, 58.3.

용해도 : DMSO, DMF, THF, MeOH, 아세톤, EtOAc에서 가용성.

박층 크로마토그래피(R_f값) : 정상 상(실리카겔 60) ; EtOAc 0.40. EtOAc-MeOH(9 : 1 v/v) : 0.63. 역상(C₁₈) : 0.1M, NH₄OAc-MeOH-CH₃CN(2 : 4 : 4 : v/v) : 0.60.

구조식(VIII) 화합물

성상 : 밝은황색 비정질 고체

분자식 : C₂₇H₂₁F₂N₃O₇

분자량 : 537.481

질량 스펙트럼 : 크라토스 MS25 질량 분광계. FABMS 538(M+H)⁺, 361(M-176, 4-O-메틸글루코스 상실).

자외선 스펙트럼 : 휴렛 팩커드 8452A 다이오드 배열 분광 광도계. 농도 1.2mg/100ml MeOH. 중성 λmax nm(E 1%/1cm) : 398(103), 316(1050), 280(387), 256(454), 228(780).

적외선 스펙트럼 : 퍼킨-엘머 1800 FTIR 분광계. KBr 펠릿(cm^-1) : 3324, 2938, 1747, 1703, 1623, 1580, 1491, 1471, 1452, 1412, 1384, 1330, 1233, 1172, 1140, 1116, 1087, 1054, 963, 918, 828, 764, 649, 635, 618, 498.

360MHz¹H-NMR : 브루커 모델 AM-3000 분광계. 이중 탄소-양자 프로브, 5mm. 용매 d₆-DMSO. 관찰된 화학전이(ppm) : 11.77(s, 1H), 11.18(a, 1H), 9.12(dd, 1H), 9.05(dd, 1H), 7.88(dd, 1H), 7.41(dd, 1H), 7.23(m,2H), 6.25(d, 1H), 6.24(s, 1H), 5.36(dd, 1H), 5.31(d, 1H), 5.04(d, 1H), 3.97(m, 2H), 3.60-3.95(m,4H)

90MHz¹³C-NMR : 브루커 모델 AM-3000 분광계. 양자 짝풀림 스펙트럼. 이중 탄소-양자 프로브, 5mm. 용매 d₆-DMSO. 관찰된 화학전이(ppm) : 170.8, 170. 7, 161.8(d), 161.7(d), 143.1(d), 141.5(d), 130.1, 128.7, 126.0(d), 125.9(d), 120.9, 119.4, 118.2, 118.1, 117.7, 116.5, 108.8(d), 108.6(d), 98.7(d), 98.3(d), 84.4, 77.2, 77.2, 76.2, 73.2, 59.9, 58.5ppm.

용해도 : DMSO, DMF, THF, 아세톤, EtOAc, MeOH에서 가용성.

박충 크로마토그래피(R_f값) : 정상 상(실리카겔 60) ; EtOAc : 0.72, EtOAc-MeOH(9 : 1 v/v) ; 0.89. 역상(C₁₈) : 0.1M NH₄OAc-MeOH-CH₃CN(2 : 4 : 4 v/v) : 0.59.

생물학적 특성 :

본 발명의 대표적 화합물을 이식된 쥐 백혈병 P388에 대하여 시험하여 생체내 항종양 활성을 측정하였다(표1-3). 쥐의 이식성 백혈병을 생성시키는 DBA/2 도너쥐로부터 얻어진 10⁶의 P388 백혈병 세포로 CDF₁쥐를 보강내 ("ip") 이식하였다. CDF₁백혈병 쥐를 후기 종양 접종 1일에 한번 식염(억제 쥐) 또는 구조식(IV, V 및 VIII) 화합물의 투여량으로 ip 처리하였다. 이들 동물을 매일 관찰하였고 그들의 치사수를 기록하였다. 약물 독성을 반영하는 수단으로서 모든 군에 대하여 평균 제중변화(백혈병 이식일로부터 최종 처리일까지)를 측정하였다. 약물독성을 평가하는 추가의 수단으로서 후기 종양이식 5일에 각군에서 쥐의 생존율을 기록하였다. 5일까지 처리군당 1마리 이상의 쥐가 치사된다면 치료 경과가 의미없는 것으로 간주되었다. 각 처리군은 4-6마리의 쥐로 구성되었으며 ; 억제군은 10마리 쥐가 포함되었다. 어쨌든 30일(실험 첫날)까지 생존하는 쥐의 수를 또한 기록하였다.

구조식(IV, V 및 VIII)의 화합물로서 처리된 쥐의 중간 생존시간("MST")을 측정하고 그것을 대응하는 억제쥐의 MST와 비교함으로써 치료효과를 측정하였다. 이와 같은 비교는 전자의 MST를 후자로 나누고 100배함으로서 퍼센트 T/C 수치라 불리는 변수를 유도하여 이루어졌다. ≥125%의 퍼센트 T/C는 수명에서 의미있는 증가 및 따라서, 활성결과를 나타낸다고 생각되어왔다.

표 1에 제시된 바와 같이, 구조식(IV)의 화합물은 10-90mg/kg의 투여수준에서 P388 백혈병에 대하여 활성이다. 가장 양호한 효과는 30mg/kg의 투여량에서 성취되었고 175%의 퍼센트 T/C로 구성되었다. 독성은 시험된 가장 높은 투여량(90mg/kg)에서 조차 관찰되지 않았다.

표 2에 제시된 바와 같이, 구조식(V)의 화합물은 0.8-102.4mg/kg의 투여수준에서 P388 백혈병에 대하여 활성이다. 가장 양호한 효과는 102.4mg/kg의 투여량에서 성취되었고 178%의 퍼센트 T/C로 구성되었다. 독성은 시험된 가장 높은 투여량(102.4mg/kg)에서 조차 관찰되지 않았다.

표 3에 제시된 바와 같이, 구조식(VIII)의 화합물은 0.8-102.4mg/kg의 투여수준에서 P388 백혈병에 대하여 활성이다. 가장 앙호한 효과는 51.2mg/kg의 투여량에서 성취되었고 206%의 퍼센트 T/C로 구성되었다. 독성은 시험된 가장 높은 투여량(102.4mg/kg)에서 관찰되지 않았다.

[표 1]

P388 백혈병^a에 대한 구조식(IV) 화합물의 효과(처리 1일)

^a쥐를 10⁶의 P388 백혈병 세포로 이식하였고, 구조식(IV) 화합물로서 처리를 1일후에 시작하였다. 억제쥐에 식염수 주사하였다.

[표 2]

P388 백혈병^a에 대한 구조식(V) 화합물의 효과(처리 1일)

^a쥐를 10⁶의 P388 백혈병 세포로 이식하였고, 구조식(V) 화합물로서 처리를 1일후에 시작하였다. 억제쥐에 식염수 주사하였다.

[표 3]

P388 백혈병^a에 대한 구조식(VIII) 화합물의 효과(처리 1일)

^a쥐를 10⁶의 P388 백혈병 세포로 이식하였고, 구조식(VIII) 화합물로서 처리를 1일후에 시작하였다. 억제쥐에 식염수 주사하였다.

본 발명은 그외 범위내에 약리적으로 허용되는 불활성 담체 또는 희석제와 조합하여 본 발명의 레베카마이신 동족체, 또는 그의 약리적으로 허용되는 산부가염의 유효 또는 종양억제량으로 이루어진 약제조성물을 포함한다.

본 발명의 다른 일예에 따라, 악성종양에 의하여 감영된 동물(바람직하게는 포유류) 숙주에 본 발명의 항생제 또는 약리적으로 허용되는 산부가염의 유효종양 억제투여량을 투여하는 것으로 이루어진 이러한 숙주를 치료처리하는 방법이 제공된다.

적합한 조성물의 실예는 정제, 캡슐, 알약, 분제 및 입제와 같은 경구투여용 고체조성물, 액제, 현탁액 또는 에멀젼과 같은 경구투여용 액체조성물 및 무균용액, 현탁액 또는 에멀젼과 같은 비경구투여용 제제를 포함한다. 그들은 또한 무균수, 생리적 식염수 또는 사용전 즉시 주사가능한 다른 무균배지에 용해될 수 있는 무균 고체조성물의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 레베카마이신 동족체의 실제 바람직한 투여량은 사용되는 특정화합물, 특정배합조성물, 사용형태 및 처리될 특정부위, 숙주 및 질병에 따라 다를것이라는 것이 확인될 것이다. 약물작용을 변형시키는 많은 인자는 본 기술에 숙련된 자에 의하여, 예를 들어 연령, 체중, 성별, 식이요법, 투여시간, 배설율, 숙주상태, 약물조합, 반응과민성 및 질병의 심각도로 설명될 것이다. 투여는 최대 지속투여량내에서 연속 또는 주기적으로 수행될 수 있다. 제공된 일련의 조건에 대한 최적 적용율은 종래의 투여량 측정 시험을 이용하여 본 기숱에 숙련된 자에 의하여 쉽게 확인될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 범위를 한정시키는 것으로 추정되지 않는 다음 실시예로서 예시된다.

[실시예 1]

사카로트릭스 아에로콜로니게네스 균주 C38, 383-RK2(ATCC 39243)의 저온방부 배양체의 제조

사카로트릭스 아에로콜로니게네스 균주 C38, 383-RK2를 레브코(Revco) 초저온 냉동기내 -80℃에 저장된 저온방부 배양체로서 유지하였다. 저온방부 배양체를 제조하기 위하여, 균주 C38, 383-RK2를 다음과 같이 구성되고 CaCO₃로 보충된 효모-맥아 추출 한천의 사면배양기 위 시험튜브에 전이시켰다.

덱스트로스 4.0g

효모 추출물 4.0g

맥아 추출물 10g

CaCO₃1.5g

한천 15g

탈이온수 1L까지 충분한 양

한천 사면배양기를 28℃에서 7-10일간 배양하였다. 사면배양기 배양체로부터 표면성장체를 다음과 같이 이루어진 무균 식물성배지 100ml를 함유한 500ml Erlenmeyer 플라스크에 전이시킴으로서 식물성 배양체를 제조하였다.

세렐로스(Cerelose, 옥수수 생성물) 30g

파르마메디아(Pharmamedia, Traders Oil Mill Co.) 10g

누트리소이(Nutrisoy, Archer Daniels Midland Co.) 10g

CaCO₃3g

탈이온수 1L까지 충분한 양

이와 같은 식물성 배양체를 250rev/min에 고정된 회전식 교반기 위에서 28℃에 48시간 배양하였다. 식물성 배양체를 다음과 같이 이루어진 저온방부액 동부피와 혼합하였다.

수크로스 100g

글리세롤 200g

탈이온수 1L까지 충분한 양

이와 같은 혼합물 4ml를 무균 저온 튜브(5ml 용량, Corning)에 전달한다음 건조얼음-아세톤 중량에서 동결시켰다. 그후 동결된 식물성 배양체를 레브코 초저온 냉동기내 -80℃에 저장하였다.

[실시예 2]

사카로트릭스 아에로콜로니게네스 균주 C38, 383-RK2(ATCC 39242)의 식물성 배양체 제조

저온 방부 배양체 4ml를 실시예 1에 기재된 식물성배지와 동일한 조성의 무균 식물성대지 100ml가 함유된 500ml Erlenmeyer 플라스크에 전이시켜 식물성 배양체를 제조하였다. 식물성 배양체를 250rev/min에 고정한 후전식 교반기위 28℃에서 48시간 배양하였다.

[실시예 3]

구조식(IV) 화합물의 제조

각각 다음과 같이 이루어진 생성배지 100ml 함유 500ml Erlenmeyer 플라스크에 실시예 2의 식물성 배양체 3ml를 접종하였다.

스트클립스(Staclipse) J-UB 전분(A.E. Staley) 10g

KH₂PO₄2g

MgSO₄2.5g

L-트레오닌 2.5g

CaCO₃2g

탈이온수 1L까지 충분한 양

생성 배양체를 250rev/min에 고정된 회전식 교반기 위에서 28℃에 배양하였다. 48시간 발효후, 최종농도 1mg/ml에서 DL-5-플루오로트립토판들 배양체에 첨가하였다. 배양체를 28℃에 배양한 다음 추가의 4일간 250rev/min에서 교반하였다. 구조식(IV) 화합물의 생성을 HPLC에 의하여 검측하였다. 농도 23-32mg/ml의 농도에서 구조식(IV) 화합물의 최적생성은 발효 6일(즉 DL-5-플루오로트립토판 첨가후 4일)에 얻어졌다.

[실시예 4]

구조식 (V 및 VIII) 화합물의 제조

실시예 2의 식물성 배양체 3ml를 각각 실시예 3에 기재된 것과 동일한 조성을 가진 생성배지 100ml 함유 500ml Erlenmeyer 플라스크에 접종하였다. 생성 배양체를 250rev/min에 고정된 회전식 교반기위 28℃에 배양하였다. 48시간 발효후, 최종농도 1mg/ml에서 DL-6-플루오로트립토판을 배양체에 첨가하였다. 배양체를 28℃에서 배양시킨 다음 추가의 4일간 250rev/min에서 교반하였다. 구조식(V 및 VIII) 화합물의 생성물 HPLC에 의하여 검측하였다. 구조식(V 및 VIII) 화합물의 최적생성은 일반적으로 농도 36-58μg/ml 및 31-42μg/ml에서 발효 6일(즉 DL-6-플루오로트립토판 첨가후 4일)에 얻어졌다.

[실시예 5]

구조식 (IV, V 및 VIII) 화합물의 분리 및 정제

a) 일반적 방법

사용전에 용매를 재증류하지 않았다. 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 이소프로필아테르, 클로로포름, 테트라히드로퓨란, 에틸에테르 및 헥산은 ACS 시약 급수이었다. HPLC 용수는 Barnstead Nanopure II 시스템으로부터 자가 탈이온수를 뜻한다. HPLC 사용을 위한 테트라히드로퓨란, 메탄올 및 아세토니트릴은 B & J Brand HPLC 금수용매이었다. 암모늄 아세테이트는 피션(Fisher) HPLC 급수이었다.

정상의 상 박층 크로마토그래피(tlc)를 실리카겔 60, F-254 플레이트(EM Reagents, Cat. #5765, 5×10cm, 두께 0.25mm) 위에서 수행하였다. 역상 tlc를 화트만(Whatman) MKC₁₈플레이트(Cat. #4803-110, 0.2mm 두께)로서 성취하였다. 플레이트를 화트만 실린더 병에서 용출액 10ml로 전개시켰다. 레베카마이신 동족체는 정상의 빛에서 황색 부위로서 또는 254nm 또는 366nm 자외선으로서 황색 형광부위로서 가시화될 수 있었다.

전체즙에 디칼라이트(Dicalite, 스피드 플러스) 여과기 조제를 첨가하였다. 간단한 교반후 그 즙을 큰 뷰흐너 깔데기 또는 톨허스트 센터슬렁(Tolhurst Centerslung) 원심분리 여과장치(Model lB15, Ametec, Inc.)로 여과시켰다. 여과액을 버렸다. 균사체 매트를 THF 또는 THF-아세톤 혼합물에서 1시간 교반하고, 여과한 다음 UV 광선하에 더이상 황색 형과되지 않을때까지 아세톤으로 디칼라이트를 추가로 린스하였다. 결합된 여과액을 감압하에 농축시켜 원추출물을 얻었다.

진공액체 크로마토그래피(VLC) 장치는 밀봉된 소결유리 디스크(M 다공도)를 포함한 뷰흐너 깔데기(Kontes, Art. #K-954100), 진공용 측면 호스연결부 및 수납플라스크의 부착을 위한 하부 24/40 조인트로 구성되어 있다 초기에, 최소 극성 용출용매를 진공하여 뽑아내서 아주 조밀한 5cm의 흡착제 층 높이를 형성하였다. 시료를 흡착제로 예비흡착시킨 다음 슬러리로서 깔데기에 접촉시키거나 또는 최소 극성 용출용매의 용액에 접촉시켰다. 스텝 기울기를 일정부피의 극성증가 용출제가 분율을 구성한 경우에 수행하였다. 각 부피의 용출후 깔데기를 건조상태로 흡수시켰다. 분율을 봉축시킨 다음 tlc 분석을 기초로 결합하였다.

크기 배제 크로마토그래피를 위한 장치는 다음과 같이 구성되어 있다. 내용매성 테플론과 플레이트를 갖춘 글렌코(Glenco) 컬럼(2.5I.D×100cm) ; Fluid Metering, Inc. 사제 FMI 랩 펌프(모델 RP-G150) ; 글렌코 유리 저장기(500ml) ; 328 분율수집기. 컬럼을 용출용매에서 미리 부풀린 세파덱스(Sephadex) LH-20(Pharmacia)로 슬러리 충전하였다. 용매를 랩펌프에 의하여 조절된 속도에서 컬럼 하방으로 전달하였다.

반예비 HPLC 시스템을 조립하는데 다음의 요소를 사용하였다 : Waters Associates 모델 590 용매 전달 시스템 펌프 , Knauer 모델 87 가변성 파장 검출기 ; Waters Associates 모델 SR-204 스트립 차트 기록계 ; 화트만 파르트실 10 ODS-3 컬럼(10mm×50cm ; 316 스테인레스강 튜빙(0.23mm i.d.).

b) 구조식(IV) 화합물의 분리 및 정제

전체 즙(5L)을 디칼라이트로서 여과시킨 다음 THF(2L)에서 1시간 교반함으로서 균사체 매트를 추출하였다. 추가의 여과, 및 추가의 THF 린스(1L) 후, 결합된 여과액을 감압하에 농축시켜 4.5g의 원추출물을 얻었다. 추출물을 6.5g의 Lichroprep Si 60 실리카겔(EM Science, Art. 9336, 15-25 마이크론) 위에 흡착시키고 추가의 실리카겔 24.5g을 함유한 60ml VLC 깔데기에 사용하였다. 헥산-에틸아세테이트 스텝 기울기를 수행하였고(200ml 부피), 이어서 200ml 부피의 THF 세척액으로 하였다. THF 세척액(156mg)을 4ml의 THF에 용해시킨 다음 THF와 평행된 세파덱스 LH-20 160g을 함유한 컬럼에 사용하였다(층높이 90cm, 충부피 430ml). 유속 3.75ml/min. 외관적으로 측정될 수 있는 바와 같이, 주요 황색 밴드(62mg)의 제 2 의 층부피의 처음 4분의 1에서 용출하였다. 유속 4ml/min로서 역상(C₁₈) HPLC 크로마토그래피(0.1M NH₄OAc-THF(60-40))에 의하여 최종정제를 성취하였다. 320nm에서 검출되었다. 39분에 용출은 구조식(IV) 화합물로 지칭된 주요 동족체(23mg)이었다.

c) 구조식(V 및 VIII) 화합물의 분리 및 정제

디칼라이트 여과조제를 사용하여 전체즙(2L)을 여과시켰다. 45분간 THF(2L)에서 교반후 균사체 매트를 여과시킨 다음, 추가 부피의 THF(1.5L)로 린스하였다. 여과액을 감압하 농축시켜 3.39g의 원추출물을 얻었다. 원추출물을 부피 50ml씩 5회의 THF로 분쇄하였고, 결합한 다음 농축시켜 THF 가용성 잔사 0.74g을 얻었다. 이와 같은 물질은 벌크의 황색 형광물질을 함유하였다. THF 가용성 물질을 2g의 실리카겔 H(Merck, 10-40 마이크론)에 흡착시킨 다음 추가 11g의 실리카겔 H을 함유한 30ml VLC 깔데기에 사용하였다. 부피 100ml의 용출액을 사용하여 헥산-에틸아세테이트 스텝기울기를 수행하였다. 이와 같은 방식으로 두개의 주요 레베카마이신 동족체를 깨끗하게 분리하였다. 극성이 적은 황색부위(141mg)는 헥산-에틸아세테이트(1 : 1)로서 그리고 더 극성인 동족체(105mg)는 헥산-에틸아세테이트(1 : 3)로서 용출하였다.

보다 극성인 동족체(105mg)를 2ml의 THF에 용해시킨 다음 THF에서 미리 부풀린 세파덱스 LH-20 160g을 함유한 컬럼에 사용하였다(층높이 90cm, 층부피 430ml). 유속은 4ml/min 이었다. 외관적으로 측정될 수 있는 바와 같이 주요 황색 밴드는 1.25층 부피에서 용출하며 구조식(V) 화합물(77mg)을 얻었다.

VLC로부터 극성이 적은 동족체(141mg)를 2ml의 MeOH에 용해시킨 다음 MeOH에서 미리 부풀린 세파덱스 LH-20 110g을 함유한 컬럼에 사용하였다(층높이 80cm, 층부피 400ml) 유속은 3.5ml/min 이었다. 주요 황색부위는 제 4 의 층부피의 말단에서 용출하여 구조식(VIII) 화합물(70mg)을 얻었다.

Claims

다음 일반식을 가진 레베카마이신 동족체, 및 약리적으로 허용되는 그의 산부가염 :

상기식에서 X₁및 X₂는 X₁및 X₂가 동시에 수소가 아니라는 조건하에 각각 불소 또는 수소이다.
다음 일반식을 가진 레베카마이신 동족체, 및 약리적으로 허용되는 그의 산부가염 :

상기식에서 X₁및 X₂는 X₁및 X₂가 동시에 수소가 아니라는 조건하에 각각 불소 또는 수소이다.
제 1 항에 있어서, 동족체가 다음 구조식인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항에 있어서, 동족체가 다음 구조식인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항에 있어서, 동족체가 다음 구조식인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 1 항에 있어서, 동족체가 다음 구조식인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 2 항에 있어서, 동족체가 다음 구조식인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 2 항에 있어서, 동족체가 다음 구조식인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 2 항에 있어서, 동족체가 다음 구조식인 것을 특징으로 하는 화합물.
제 2 항에 있어서, 동족체가 다음 구조식인 것을 특징으로 하는 화합물.
트립토판 동족체 존재하에 수성 영양배지에서 레베카마이신 생성균주인 사카로트릭스 아에로콜리니게네스를 필요로한 레베카마이신 동족체의 실제량이 그 유기체에 의하여 그 배양배지에서 생성될때까지 배양시키며 배양배지로부터 실제 순수한 형태로 필요로한 레베카마이신 유도체를 회수하는 것으로 이루어진 제1 또는 2항의 레베카마이신 동족체, 또는 약리적으로 허용되는 그의 산부가염의 제조방법.
제11항에 있어서, 레베카마이신 생성균주가 사카로트릭스 아에로콜로니게네스 ATCC 39242인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제11항에 있어서, 트립토판 동족체가 DL-4-플루오로트립토판인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제11항에 있어서, 트립토판 동족체가 DL-5-플루오로트립토판인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제11항에 있어서, 트립토판 동족체가 DL-6-플루오로트립토판인 것을 특징으로 하는 제조방법 .
제11항에 있어서, 트립토판 동족체가 DL-7-플루오로트립포판인 것을 특징으로 하는 제조방법.
약리적으로 허용되는 실제 비독성인 담체 또는 부형제와 결합하여 제1 또는 2항의 적어도 한가지 화합물의 유효 종양 억제량으로 이루어진 제1 또는 2항에 정의된 레베카마이신 동족체에 과민한 종양에 의하여 감염된 포유류 숙주의 치료 처리용 약제 조성물.
제1 또는 2항의 적어도 한가지 화합물의 유효 종양 억제량을 약리적으로 허용되는 실제 비독성인 담체 또는 부형제와 결합하여 제1 또는 2항에 정의된 레베카마이신 동족체에 과민한 종양에 의하여 감염된 포유류 숙주에 투여하는 것으로 이루어진 상기 종양에 대하여 감영된 포유류 숙주의 치료처리방법.