JPH0789981A

JPH0789981A - トリプトファンアナローグフィーディングによるレベッカマイシンアナローグ

Info

Publication number: JPH0789981A
Application number: JP3038752A
Authority: JP
Inventors: Kin Sing Lam; シンラムキン; Daniel R Schroeder; アールシュローダーダニエル; Jacqueline Marie Mattei; マリーマッティージャックリーン; Salvatore Forenza; フォレンザサルヴァトア; James A Matson; アンドリューマトソンジェイムズ
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1990-03-06
Filing date: 1991-03-05
Publication date: 1995-04-04
Anticipated expiration: 2010-08-30
Also published as: AU623050B2; FI911047A0; NO179555C; IE910737A1; EP0450327A1; FI102376B; EP0450327B1; KR940005657B1; DK0450327T3; FI102376B1; YU39391A; TW232698B; KR910016934A; PT96943B; NO179555B; CY1941A; SG63555A1; NO910855L; FI911047A; HUT61601A

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】Saccharothrix erocolonigenes のレベッカ
マイシン生産性菌株の醗酵中に培地ヘリプトファンアナ
ローグを添加することによる有効な抗腫瘍特性を有する
新規レベッカマイシンアナローグの製造、当該製造方法
によって製造される【化１】もしくは【化２】の式であ
らわされるレベッカマイシンアナローグ並びにその製剤
上受容できる酸付加体及び少くとも１種の上記レベッカ
マイシンアナローグを含む抗腫瘍性の製剤組成物。〔式中、Ｘ^１及びＸ^２は独立にＦまたはＨであるが、両
者が同時にＨになることはない〕【効果】Ｐ３８８白血病マウスにたいして0.8 〜１０2.
４mg/kgの投与量で有効でありかつ最高投与量でも毒性
は見られなかった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗新生物特性を有するレ
ベッカマイシンの新規アナローグに関する。

【０００２】

【技術的背景】米国特許第 4,487,925号及び第 4,552,8
42号はレベッカマイシンと称する抗腫瘍剤、及びその
５′−メチル及び５′，２′，３″，６″−テトラアセ
テート誘導体、並びにこれら薬剤を、Nocardia aeroco
lonigenes のレベッカマイシン生産性菌株、好ましくは
Nocardia aerocolonigenes ATCC 39243、又はそのレ
ベッカマイシン生産性突然変異株を資化性炭素及び窒素
源を含む水性栄養培地中、液内好気条件下で実質的な量
のレベッカマイシンが生産されるまで培養することによ
って製造する方法を記載している。最近、Nocardia ae
rocolonigenes, ATCC 39243 はSaccharothrix aeroco
lonigenes ATCC 39243 として分類し直された（Bush
ら、J. Antibiotics, ４０：６６８−６７８、１９８
７）。

【０００３】

【発明の要約】本発明はレベッカマイシン（式Ｉ）と称
する抗腫瘍剤の新アナローグを提供する。

【０００４】

【化１１】

【０００５】特に本発明は下記式II及びIII

【０００６】

【化１２】

【０００７】

【化１３】

【０００８】（上記式II及びIII 中、X₁及びX₂は独立に
弗素又は水素であり、但しX₁とX₂とが同時に水素である
ことはないことを条件とする）を有するレベッカマイシ
ンアナローグ、並びにかかるアナローグの製剤上受容で
きる酸付加塩を提供する。式II及びIII の化合物はSacc
harothrix aerocolonigenes のレベッカマイシン生産
性菌株の培養を適当なトリプトファンアナローグで補足
することによって製造される。

【０００９】米国特許第 4,487,925号及び第 4,552,842
号はレベッカマイシン（式Ｉ）

【００１０】

【化１４】

【００１１】と称する抗腫瘍剤の製造及び単離を記載し
ている。上記レベッカマイシン化合物はSaccharothrix
aerocolonigenes のレベッカマイシン生産性菌株の発
酵の主成分である。今回、本発明によれば、ある種のト
リプトファンアナローグの存在下で米国特許第 4,487,9
25号及び第 4,552,842号中に記載されている発酵操作を
実施することによって有効な抗腫瘍特性を有するレベッ
カマイシンの新規アナローグを製造することができるこ
とが発見された。本発明のレベッカマイシンアナローグ
は下記式II及びIII

【００１２】

【化１５】

【００１３】

【化１６】

【００１４】（上記式II及びIII 中、X₁及びX₂は弗素又
は水素であり、但しX₁とX₂とが同時に水素であることは
ないことを条件とする）を有しかつその製剤上受容でき
る酸付加塩を含む。本発明の化合物の１つの好ましい例
は下記構造式IV

【００１５】

【化１７】

【００１６】を有する化合物である。本発明の化合物の
もう１つの好ましい例は下記構造式Ｖ

【００１７】

【化１８】

【００１８】を有する化合物である。本発明の化合物の
もう１つの好ましい例は下記構造式VI

【００１９】

【化１９】

【００２０】を有する化合物である。本発明の化合物の
さらにもう１つの好ましい例は下記構造式VII

【００２１】

【化２０】

【００２２】を有する化合物である。本発明の化合物の
さらにもう１つの好ましい例は下記構造式VIII

【００２３】

【化２１】

【００２４】を有する化合物である。本発明の化合物の
もう１つの好ましい例は下記構造式IX

【００２５】

【化２２】

【００２６】を有する化合物である。本発明の化合物の
もう１つの好ましい例は下記構造式Ｘ

【００２７】

【化２３】

【００２８】を有する化合物である。本発明の化合物の
さらにもう１つの好ましい例は下記構造式XI

【００２９】

【化２４】

【００３０】を有する化合物である。本発明の方法に於
て、トリプトファンアナローグがレベッカマイシン発酵
培地へ添加されかつ発酵中にレベッカマイシン構造中に
組み込まれて対応するレベッカマイシンアナローグを生
成する。本発明の方法のより詳細な説明は以下にかつそ
れに続く説明のための実施例中に示される。〔抗生物質の製造〕式IV〜XIの化合物はSaccharothrix
aerocolonigenes のレベッカマイシン生産性菌株をＤ
Ｌ−４−フルオロトリプトファン、ＤＬ−５−フルオロ
トリプトファン、ＤＬ−６−フルオロトリプトファン又
はＤＬ−７−フルオロトリプトファンと共に培養するこ
とによって製造される。好ましいレベッカマイシン生産
性菌株は、以前に米国特許第 4,487,925号中でNocardia
aerocolonigenes 株C38,383-RK2 （ATCC 39243）と呼
ばれていたSaccharothrix aerocolonigenes の新規菌
株である。最近、この菌株はSaccharothrix aerocolo
nigenes として分類し直され（Bush et al.,J. Antibio
tics ４０：６６８−６７８、１９８７）、本明細書中
ではSaccharothrix aerocolonigenes 株C38,383-RK2
（ATCC 39243）と称す。この菌株はパナマで採集された
土壌試料から単離された。菌株 C38,383-RK2の生物学的
純粋培養菌はメリーランド州ロックビルの American Ty
pe Culture Collection に寄託され、ATCC 39243として
その微生物パーマネントコレクションに加えられた。
このC38,383-RK2 と称する培養菌は米国コネクチカット
州、ウォーリングフォード（５ Research Parkway, Wal
lingford, Connecticut 06492)の Bristol-Myers Squib
b Co. の Pharmaceuticol Research and Development D
ivision Culture Collection中の凍結乾燥管（lyophile
tubes) 及び極低温バイアル（cryogenic vials)中に休
眠培養菌（dormant culture)としても保存されている。

【００３１】菌株C38,383-RK2 （ATCC 39243）について
の分類学的研究は米国特許第 4,487,925号中及び J. A
ntibiotics, ４０：６６８−６７８、１９８７中に詳細
に記載されている。この菌株はSaccharothrix aeroco
lonigenes の新規菌株として分類された。本発明が特別
な好ましい菌株ATCC 39243の使用又はその記載に充分に
合致する菌に限定されないことは言うまでもない。特
に、他のレベッカマイシン生産性菌株あるいはＸ線、紫
外線、ナイトロジェンマスタードによる処理、ファージ
暴露（phage exposure) のような通常の手段によって生
産され得る記載菌の突然変異株を含むことを意図してい
る。

【００３２】本発明の実施に於ては、菌株C38,383-RK2
（ATCC 39243）の確認特性を有するSaccharothrix ae
rocolonigenes のレベッカマイシン生産性菌株、あるい
はその突然変異株又は変異株を適当なトリプトファンア
ナローグで補足された通常の水性栄養培地中で培養す
る。式VI及びＸの化合物の最適生産のためには、培地を
ＤＬ−４−フルオロトリプトファンで補足しなければな
らない。式IV及びIXの化合物の最適生産のためには、培
地をＤＬ−５−フルオロトリプトファンで補足しなけれ
ばならない。式Ｖ及びVIIIの化合物の最適生産のために
は、培地をＤＬ−６−フルオロトリプトファンで補足し
なければならない。式VII 及びXIの化合物の最適生産の
ためには、培地をＤＬ−７−フルオロトリプトファンで
補足しなければならない。菌は、放線菌用の既知の栄養
源を含む栄養培地中で増殖される。かくして菌は蔗糖、
乳糖、ブドウ糖、ラムノース、果糖、グリセリン又は可
溶性殿粉のような資化性炭素源を含む栄養培地中で増殖
される。培地は魚粉、ペプトン、落花生粉、綿実粉、と
うもろこし浸漬液（corn steep liquor)、アミノ酸又は
アンモニウム塩のような資化性窒素源をも含まねばなら
ない。培地中には、ナトリウム、カリウム、アンモニウ
ム、カルシウム、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、炭酸塩及
び同様なイオンのような養分無機塩をも含むことができ
る。銅、マンガン、鉄、亜鉛などのような微量元素が所
望ならば培地へ添加され、あるいは培地の他の成分の不
純物として存在する可能性がある。抗生物質の大量生産
には浸漬好気条件を用いることが好ましいが、限定量の
生産には、表面培養及び瓶を用いることもできる。他の
放線菌の培養のために用いられる一般的方法は本発明に
適用可能である。

【００３３】本発明の抗生物質の製造はレベッカマイシ
ン生産性菌の満足な増殖に資する温度、例えば１８〜３
９℃で行うことができ、約２８℃の温度で都合よく行わ
れる。発酵は、フラスコ中で、あるいは種々の容量の実
験室又は工業用発酵槽中で行われる。タンク発酵を用い
る場合、レベッカマイシン生産性菌の斜面、低温保存培
養菌又は凍結乾燥培養菌で少量の培地を接種することに
よって栄養ブロス中に増殖形接種物を与えることが望ま
しい。この方法で生育可能な活性接種物を得た後、本発
明の抗生物質の大規模製造のための生産培地が入ってい
る発酵タンクへ無菌的に移す。増殖形接種物がその中で
増殖する培地は、レベッカマイシン生産性菌の良好な増
殖が得られかつ適当なフルオロトリプトファンで補足さ
れているようなものである限り、タンク中に用いられる
培地と同じであっても、あるいは異なっていてもよい。
機械的インペラーによってさらに撹拌を与えることがで
きる。所望ならばラード油又はシリコーン油のような消
泡剤を加えることができる。高速液体クロマトグラフィ
ー分析又は通常の生物学的分析によって抗生物質生産を
監視する。一般に、本発明の抗生物質の最適生産は約６
日のインキュベーション後に達成される。

【００３４】かくして得られた誘導体の単離及び精製は
通常のクロマトグラフィー操作によって行われる。物理的及び化学的性質：式IV、Ｖ及びVIIIの化合物は下
記の物理的及び化学的性質を有する。式IVの化合物性状：光輝ある黄色無定形固体分子式：Ｃ₂₆Ｈ₁₉Ｆ₂Ｎ₃Ｏ₇ 分子量： 523.454質量スペクトル： Kratos MS25 Mass Spectrometer. FA
BMS 524(M+H)⁺、361（Ｍ−１６２、グルコースの喪
失）。

【００３５】紫外スペクトル： Hewlett Packard 845A
Diode Array Spectrophotometer.濃度1.０mg／１００ml
MeOH 。中性λ_maxnm（Ｅ１％／１cm）： 405, 322(45
7),288, 277, 252, 230(348) 。赤外スペクトル： Perkin-Elmer 1800 FTIR Spectromet
er. KBr 錠剤 (cm^-1）： 3340, 2915, 1752, 1708, 162
8, 1591, 1484, 1462, 1392, 1331, 1292, 1247, 1191,
1112, 1081, 1052, 947, 904, 795, 762, 752, 511 。

【００３６】360MHz¹H-NMR ： Bruker Model AM-3000
Spectrometer. Duel炭素−プロトンプローブ、５mm。溶
媒 d₆-DMSO、観察された化学シフト（ppm)： 11.76(s,
1H),11.23(s, 1H), 8.85(dd, 1H), 8.77(dd, 1H), 8.01
(dd, 1H), 7.68(dd, 1H), 7.46(m, 2H), 6.29(d, 1H),
6.12(t, 1H), 5.45(d, 1H), 5.17(d, 1H), 4.95(d,1H),
4.07(d, 1H), 3.95(m, 2H), 3.81(d, 1H), 3.59(m, 2
H) 。

【００３７】90MHz ¹³C-NMR ： Bruker Model AM-3000
Spectrometer. プロトンデカップルドスペクトル、Duel
炭素−プロトンプローブ、５mm。溶媒 d₆-DMSO、観察さ
れた化学シフト（ppm)： 170.9, 170.8, 157.0(d), 15
7.0(d), 138.6, 137.2, 130.7, 129.2, 121.7(d), 121.
4(d), 121.3, 119.6, 116.6, 115.1, 115.0(d), 114.6
(d), 113.3(d), 113.2(d), 109.1(d), 109.1(d), 84.8,
78.7, 76.5, 73.2,67.6, 58.3。

【００３８】溶解度： DMSO, DMF, THF,アセトン，EtOA
c, MeOH に可溶。薄層クロマトグラフィー(R_f値 ) ：正常相（シリカゲル
６０）； EtOAc：0.１０． EtOAc−MeOH（９：１ v/v) ：0.４
１。逆相（C₁₈)；0.1M NH₄ OAc-MeOH-CH₃CN（２：４：４ v/v）：0.６７式Ｖの化合物性状：光輝ある黄色無定形固体分子式：Ｃ₂₆Ｈ₁₉Ｆ₂Ｎ₃Ｏ₇ 分子量： 523.454質量スペクトル： Kratos MS25 Mass Spectrometer. FA
BMS 524(M+H)⁺、361（Ｍ−１６２、グルコースの喪
失）。

【００３９】紫外スペクトル： Hewlett Packard 8452A
Diode Array Spectrophotometer.濃度1.０mg／１００m
l MeOH 。中性λ_maxnm（Ｅ１％／１cm）： 398(60), 3
16(640), 280(259), 256(313), 226(526), 204(497)。赤外スペクトル： Perkin-Elmer 1800 FTIR Spectromet
er. KBr 錠剤 (cm^-1）： 3324, 2927, 1745, 1701, 162
3, 1580, 1491, 1471, 1452, 1412, 1384, 1330, 1233,
1172, 1116, 1075, 1048, 1016, 963, 916, 829, 764,
745, 646, 635, 617, 498, 490 。

【００４０】360MHz¹H-NMR ： Bruker Model AM-3000
Spectrometer. Duel炭素−プロトンプローブ、５mm。溶
媒 d₆-DMSO、観察された化学シフト（ppm)： 11.77(s,
1H),11.18(s, 1H), 9.12(dd, 1H), 9.05(dd, 1H), 7.85
(dd, 1H), 7.43(dd, 1H), 7.23(t, 2H), 6.26(d, 1H),
6.24(s, 1H), 5.31(d, 1H), 5.04(d, 1H), 3.98(m,2H),
3.87(m, 1H), 3.66(s, 2H) 。

【００４１】90MHz ¹³C-NMR ： Bruker Model AM-3000
Spectrometer. プロトンデカップルドスペクトル。Duel
炭素−プロトンプローブ、５mm。溶媒 d₆-DMSO、観察さ
れた化学シフト（ppm)： 170.8, 170.7, 161.8(d), 16
1.8(d), 143.2(d), 141.5(d),130.1, 128.7, 126.0(d),
125.9(d), 120.9, 119.3, 118.2, 118.1, 117.7, 116.
5, 108.8(d), 108.6(d), 98.9(d), 98.3(d), 84.7, 78.
6, 76.5, 73.1, 67.5,58.3 。

【００４２】溶解度： DMSO, DMF, THF, MeOH,アセト
ン, EtOAc に可溶。薄層クロマトグラフィー(R_f値) ：正常相（シリカゲル
６０）； EtOAc：0.40． EtOAc−MeOH（９：１ v/v) ：0.63。逆
相（C₁₈)；0.1M NH₄ OAc-MeOH-CH₃CN（２：４：４ v/
v）：0.60 式VIIIの化合物性状：光輝ある黄色無定形固体分子式：Ｃ₂₇Ｈ₂₁Ｆ₂Ｎ₃Ｏ₇ 分子量： 537.481質量スペクトル： Kratos MS25 Mass Spectrometer. FA
BMS 538(M+H)⁺、361（Ｍ−１７６, ４−Ｏ−メチルグ
ルコース）。

【００４３】紫外スペクトル： Hewlett Packard 8452A
Diode Array Spectrophotometer.濃度1.２mg／１００m
l MeOH 。中性λ_maxnm（Ｅ１％／１cm）： 398(103),
316(1050), 280(387), 256(454), 228(780)。赤外スペクトル： Perkin-Elmer 1800 FTIR Spectromet
er. KBr 錠剤 (cm^-1）： 3324, 2938, 1747, 1703, 162
3, 1580, 1491, 1471, 1452, 1412, 1384, 1330, 1233,
1172, 1140, 1116, 1087, 1054, 963, 918, 828, 764,
649, 635, 618, 498 。

【００４４】360MHz¹H-NMR ： Bruker Model AM-3000
Spectrometer. Duel炭素−プロトンプローブ、５mm。溶
媒 d₆-DMSO、観察された化学シフト（ppm)： 11.77(s,
1H),11.18(s, 1H), 9.12(dd, 1H), 9.05(dd, 1H), 7.88
(dd, 1H), 7.41(dd, 1H), 7.23(m, 2H), 6.25(d, 1H),
6.24(s, 1H), 5.36(dd, 1H), 5.31(d, 1H), 5.04(d,1
H), 3.97(m, 2H), 3.60-3.95(m, 4H) 。

【００４５】90MHz ¹³C-NMR ： Bruker Model AM-3000
Spectrometer. プロトンデカップルドスペクトル。Duel
炭素−プロトンプローブ、５mm。溶媒 d₆-DMSO。観察
された化学シフト（ppm)： 170.8, 170.7, 161.8(d), 1
61.7(d), 143.1(d), 141.5(d), 130.1, 128.7, 126.0
(d), 125.9(d), 120.9, 119.4, 118.2, 118.1, 117.7,1
16.5, 108.8(d), 108.6(d), 98.7(d), 98.3(d), 84.4,
77.2, 77.2, 76.2, 73.2, 59.9, 58.5 。

【００４６】溶解度： DMSO, DMF, THF, アセトン、 E
tOAc、MeOHに可溶。薄層クロマトグラフィー(R_f値) ：正常相（シリカゲル
６０）； EtOAc：0.72. EtOAc−MeOH（９：１ v/v) ：0.89。逆
相（C₁₈)；0.1M NH₄OAc-MeOH-CH₃CN（２：４：４ v/
v）：0.59。生物学的性質：本発明の代表的な化合物を移植されたマ
ウス白血病Ｐ３８８に対して試験して生体内抗腫瘍活性
を求めた（表１〜３）。移植可能なネズミＰ３８８白血
病を有するＤＢＡ／２供与マウスから得た１０⁶個のＰ
３８８白血病細胞で CDF₁マウスを腹腔内 ("ip") 移植
した。この CDF₁白血病マウスを食塩水（対照マウス）
又は式IV、Ｖ及びVIIIの化合物の種々の量で、腫瘍接種
後第１日に１回 ip 処理した。これらのマウスを毎日観
察し、その死亡を記録した。薬物毒性を反映する手段と
してすべての群について平均体重変化（白血病移植の日
から最終処理の日まで）を測定した。薬物毒性の付加的
検定手段として腫瘍移植後第５日に於ける各群のマウス
の生存率を記録した。第５日までに１処理群あたり１匹
より多くのマウスが死亡した場合には、治療効果が有意
ではないと考えた。各処理群は４〜６匹のマウスからな
り、対照群は１０匹であった。第３０日（実験の第１日
から）まで生存しているマウスがあれば、その匹数も記
録した。

【００４７】式IV、Ｖ及びVIIIの化合物で処理されたマ
ウスの中間生存時間（“ＭＳＴ”）を測定し、同時に測
定した対照マウスのＭＳＴと比較することによって治療
効率を評価した。この比較は、前者のＭＳＴを後者のＭ
ＳＴで割って１００を掛けて％Ｔ／Ｃ値と呼ばれるパラ
メーターを誘導することによって行われた。％Ｔ／Ｃ＞
１２５％は寿命の有意な延長、従って有効な結果を示す
と考えた。

【００４８】表１に示すように、式IVの化合物は１０〜
９０mg／kgの範囲の投与量レベルでＰ３８８白血病に対
して有効である。最良効果は３０mg／kgの投与量で得ら
れ、％Ｔ／Ｃは１７５％であった。試験した最高投与量
（９０mg／kg）でも毒性は見られなかった。表２に示す
ように、式Ｖの化合物は0.８〜１０2.４mg／kgの範囲の
投与量レベルでＰ３８８白血病に対して有効である。最
良の結果は１０2.４mg／kgの投与量で得られ、％Ｔ／Ｃ
は１７８％であった。試験した最高量（１０2.４mg／k
g）でも毒性は見られなかった。

【００４９】表３に示すように、式VIIIの化合物は0.８
〜１０2.４mg／kgの範囲の投与量レベルでＰ３８８白血
病に対して有効である。最良の効果は５1.２mg／kgの投
与量で得られ、％Ｔ／Ｃは２０６％であった。試験した
最高投与量（１０2.４mg／kg）でも毒性は見られなかっ
た。表 1. 式IVの化合物のP388白血病に対する効果^a （第１日処理） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 投与量,ip. 中間生存 % 平均体重生存マウス匹数時間 T/C 変化 ━━━━━━━━━ (mg/kg/inj) （日） (g) 第５日第30日 ━━━━━━━ ━━━━━ ━━━ ━━━━━━ ━━━━━━━━━ 90 16.5 165 -0.9 4/4 0/4 30 17.5 175 0.6 4/4 0/4 10 14.5 145 0.7 4/4 0/4 対象 10.0 100 10/10 0/10 ^a マウスを１０⁶個のＰ３８８白血病細胞で移植し、式
IVの化合物による処理を１日後に開始した。対照マウス
には食塩水を注射した。

【００５０】表 2. 式Ｖの化合物のP388白血病に対する効果^a （第１日処理） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 投与量,ip. 中間生存 % 平均体重生存マウス匹数時間 T/C 変化 ━━━━━━━━━ (mg/kg/inj) （日） (g) 第５日第30日 ━━━━━━━ ━━━━━ ━━━ ━━━━━━ ━━━━━━━━━ 102.4 16.0 178 -0.1 6/6 0/6 51.2 15.0 167 -0.2 6/6 0/6 25.6 14.5 161 -0.2 6/6 0/6 12.8 15.0 167 0.8 6/6 0/6 6.4 15.0 167 -1.1 6/6 0/6 3.2 14.0 156 0.0 6/6 0/6 1.6 14.0 156 -0.7 6/6 0/6 0.8 13.0 144 0.1 6/6 0/6 対照 9.0 100 1.3 10/10 0/10 ^a マウスを１０⁶個の白血病細胞で移植し、式Ｖの化合
物による処理を１日後に開始した。対照マウスには食塩
水を注射した。

【００５１】表 3. 式VIIIの化合物のP388白血病に対する効果^a （第１日処理） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 投与量,ip. 中間生存 % 平均体重生存マウス匹数時間 T/C 変化 ━━━━━━━━━ (mg/kg/inj) （日） (g) 第５日第30日 ━━━━━━━ ━━━━━ ━━━ ━━━━━━ ━━━━━━━━━ 102.4 14.5 161 0.2 6/6 0/6 51.2 18.5 206 0.3 6/6 0/6 25.6 14.0 156 0.1 6/6 0/6 12.8 14.5 161 -0.1 6/6 0/6 6.4 16.0 178 0.1 6/6 0/6 3.2 16.5 183 -0.3 6/6 0/6 1.6 14.0 156 -0.1 6/6 0/6 0.8 14.0 156 -0.4 6/6 0/6 対照 9.0 100 1.3 10/10 0/10 ^a マウスを１０⁶個のP388細胞で移植し、式VIIIの化合
物による処理を１日後に開始した。対照マウスには食塩
水を注射した。

【００５２】本発明はその範囲内に、本発明のレベッカ
マイシンアナローグ又はその製剤上受容できる酸付加塩
の有効量すなわち腫瘍抑制量を不活性な製剤上受容でき
る担体又は希釈剤と組み合わせて含む製剤組成物を含
む。本発明のもう１つの観点によれば、本発明の抗生物
質又はその製剤上受容できる酸付加塩の有効腫瘍抑制量
を悪性腫瘍に冒された動物（好ましくは哺乳動物）ホス
トへ投与することを含むかかるホストの治療方法が提供
される。

【００５３】適当な組成物の例には、錠剤、カプセル、
丸剤、散在及び顆粒のような経口投与用固体組成物、液
剤、懸濁剤、シロップ及びエリキシルのような経口投与
用液体組成物並びに滅菌液剤、懸濁剤又は乳剤のような
非経口投与用製剤が含まれる。組成物は、使用直前に滅
菌水、生理食塩水又は何か他の注射用媒質に溶解するこ
とができる滅菌固体組成物の形で製造することもでき
る。

【００５４】使用する特別な化合物、調製される特別な
組成物、適用方式並びに治療される特別な場所、ホスト
及び病気によって本発明のレベッカマイシンアナローグ
の実際の好ましい投与量が異なることは当然理解される
ことである。当業者には、例えば年令、体重、性別、食
餌、投与時間、排出速度、ホストの状態、併用薬物、反
応感受性及び疾病の重度のような薬物の作用を変化させ
る多くの因子が考えられるであろう。当業者は通常の投
与量決定試験を用いて、与えられた１組の条件に対する
最適な適用率を容易に確かめることができる。

【００５５】以下、本発明の範囲を限定すると考えられ
るべきではない実施例によって本発明を説明する。〔実施例１〕 Saccharothrix aerocolonigenes C3
8,383-RK2株 (ATCC 39243) の低温保存培養菌の調製Saccharothrix aerocolonigenes C38,383-RK2株を R
evco超低温冷凍機中に−８０℃で貯蔵された低温保存培
養菌として保持した。低温保存培養菌を調製するため、
C38,383-RK2 株を試験管内のブドウ糖 4.０ｇ酵母エキス 4.０ｇ麦芽エキス１０ｇ CaCO₃ 1.５ｇ寒天１５ｇ脱イオン水１リットルにするための
適量からなる、CaCO₃で補足された酵母−麦芽エキス寒天の
斜面上に移した。

【００５６】この寒天斜面を２８℃で７〜１０日間イン
キュベートした。この斜面培養からの表面増殖面を Cerelose(Corn Products) ３０ｇ Pharmamedia(Traders Oil Mill Co.) １０ｇ Nutrisoy(Archer Daniels Midland Co.) １０ｇ CaCO₃ ３ｇ脱イオン水１リットルにするための適量からなる滅菌増殖培地の１００mlが入っている５００ml
エルレンマイヤーフラスコへ移すことによって増殖培養
菌を調製した。

【００５７】この増殖培養菌を２５０rpm にセットされ
た回転振盪機上で２８℃に於て４８時間インキュベート
した。この増殖培養菌を蔗糖１００ｇグリセリン２００ｇ脱イオン水１リットルにするための適量からなる低温保護溶液の等容量と混合した。

【００５８】この混合物４ml部を滅菌低温管（５ml容、
Conining) へ移し、ドライアイス−アセトン浴中で冷凍
した。次に、この冷凍増殖培養菌を Revo 超低温冷凍機
中で−８０℃に於て貯蔵した。〔実施例２〕 Saccharothrix aerocolonigenes C3
8,383-RK2 (ATCC 39243)株の増殖培養菌の調製低温保存培養菌４mlを実施例１記載の増殖培地と同じ組
成を有する滅菌増殖培地１００mlが入っている５００ml
エルレンマイヤーフラスコへ移すことによって増殖培養
菌を調製した。この増殖培養菌を２５０rev/min にセッ
トされた回転振盪機上で２８℃に於て４８時間インキュ
ベートした。〔実施例３〕式IVの化合物の製造実施例２の増殖培養菌３mlを Staclipse J-UB殿粉（A.E.Staley) １０ｇ KH₂PO₄ ２ｇ MgSO₄ １ｇＬ−トレオニン 2.５ｇ CaCO₃ ２ｇ脱イオン水１リットルにするため
の適量からなる生産培地各１００mlが入っている５００mlエル
レンマイヤーフラスコ中へ接種した。

【００５９】この生産培養菌を２５０rev/min にセット
した回転振盪機上で２８℃に於てインキュベートした。
４８時間の発酵後、培養菌へＤＬ−５−フルオロトリプ
トファンを最終濃度１mg／mlで添加した。この培養菌を
２８℃に於てインキュベートし、２５０rev/min でさら
に４日間振盪した。式IVの化合物の生成をＨＰＬＣで監
視した。２３〜３２mg／mlの濃度の式IVの化合物の最適
生産が一般に６日の発酵後に（すなわちＤＬ−５−フル
オロトリプトファンの添加から４日後に）得られた。〔実施例４〕式Ｖ及びVIIIの化合物の製造実施例２の増殖培養菌３mlを実施例３記載と同じ組成を
有する生産培地各１００mlが入っている５００mlエルレ
ンマイヤーフラスコ中へ接種した。この生産培養菌を２
５０rev/min にセットされた回転振盪機上で２８℃に於
てインキュベートした。４８時間の発酵後、この培養菌
へＤＬ−６−フルオロトリプトファンを１mg／mlの最終
濃度で添加した。この培養菌を２８℃に於てインキュベ
ートし、２５０rev/min でさらに４日間振盪した。式Ｖ
及びVIIIの化合物の生産をＨＰＬＣで監視した。式Ｖ及
びVIIIの化合物の最適生産は一般に６日間の発酵で（す
なわちＤＬ−６−フルオロトリプトファンの添加から４
日後に）それぞれ３６〜５８μg ／ml及び３１〜４２μ
g ／mlの濃度で得られた。〔実施例５〕式IV，Ｖ及びVIIIの化合物の単離及び精
製ａ）一般的方法溶媒は使用前に再蒸留しなかった。メタノール、アセト
ン、酢酸エチル、イソプロピルエーテル、クロロホル
ム、テトラヒドロフラン、エチルエーテル及びヘキサン
はＡＣＳ試薬級であった。ＨＰＬＣ用の水は Barnstead
Nanopure IIシステムにより製造した自家製脱イオン水
を用いた。ＨＰＬＣ用のテトラヒドロフラン、メタノー
ル及びアセトニトリルはＢ＆ＪブランドのＨＰＬＣ級溶
媒であった。酢酸アンモニウムはFischer ＨＰＬＣ用で
あった。

【００６０】順相薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は
シリカゲル６０、Ｆ−２５４プレート（ＥＭ Reagent
s, Cat. ＃５７６５、５×１０cm、厚さ0.２５mm）上
で行った。逆相ＴＬＣは Whatman MKC₁₈プレート（Cat.
＃４８０３−１１０、厚さ0.２mm）で行った。プレー
トの展開は、栓付き Whatman円筒形ジャー中で、１０ml
の溶離液で行った。レベッカマイシンアナローグは自然
光下で黄色ゾーンとして、あるいは２５４nm又は３６６
nmの紫外線による黄色蛍光ゾーンとして見ることができ
た。

【００６１】全ブロスに Dicalite(スピードプラス）濾
過助剤を添加した。簡単な撹拌機、大型 Buchner漏斗又
は Tolhurst Centerslung Centrifugal Filter Unit(Mo
del(1B15, Ametek, Inc.)で濾過した。濾液は廃棄し
た。菌糸マットをＴＨＦはＴＨＦ−アセトン混合物中で
１時間撹拌し、濾過し、かつ Dicalite をアセトンでも
はや紫外線下で黄色蛍光がなくなるまで洗浄した。濾液
を合わせ、減圧下に濃縮して粗製抽出物を得た。

【００６２】真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ）装
置は封入焼結ガラスディスク（Ｍ多孔度）を含む Buchn
er漏斗（Knotes, Art. # K-954100)、真空用側方ホース
連結及び受取り用フラスコ取付け用の下部２４／４０接
合部からなる。初めに、真空下に最小極性溶離用溶媒を
吸引して密に充填した５cmの吸着床高さを形成した。吸
着剤上に試料を予め吸着させ、スラリーとして漏斗へ適
用するか、あるいは最小極性溶離用溶媒を用いて溶液と
した。段階勾配を行い、次第に増加する極性溶媒により
溶出を行い所定の量で分画した。各容量の溶離液後、漏
斗を吸引乾燥した。各分画を濃縮し、ＴＬＣ分析に基づ
いて合わせた。

【００６３】サイズエクスクルージョン（size exclusi
on) クロマトグラフィー用装置は耐溶剤性テフロン及び
プレートを備えた Glenco カラム（内径2.５×１００c
m）、Fluid Metering, Inc. FMI実験室用ポンプ（Model
RP-G150)、Glencoガラスリザーバ（５００ml）、 Isco
Model ３２８分画捕集器からなっていた。カラムを溶
離用溶媒で予め膨潤させた Sephadex ＬＨ−２０（Phay
macia)でスラリー充填した。実験室用ポンプで調節され
た速度で溶媒をカラムに通して流下方式で流した。

【００６４】半・分取ＨＰＬＣシステムを組み立てるた
めに下記の成分を用いた。 WatersAssociates Model 59
0 Solvent Delivery System ポンプ, Knauer Model 8
7 Variable Wavelength検出器， Waters Associates Mo
del SR-204 Strip Chart 記録計, Whatman Partisil１
０ＯＤＳ−３カラム（１０mm×５０cm）、３１６ステン
レス銅等（内径0.２３mm）。ｂ）式Ｖの化合物の単離及び精製全ブロス（５リットル）を Dicalite で濾過し、菌糸マ
ットをＴＨＦ（２リットル）中で１時間撹拌することに
よって抽出した。さらに濾過し、かつさらにＴＨＦ洗浄
（１リットル）を行った後、濾液を合わせ、減圧下に濃
縮して4.５ｇの粗製抽出物を得た。この抽出物を6.５ｇ
の Lichroprep Si６０シリカゲル（EM Science, Art.９
３３６，１５〜２５μm ）上に吸着させ、追加の２4.５
ｇのシリカゲルが入っている６０mlＶＬＣ漏斗へ適用し
た。ヘキサン−酢酸エチルを用いて段階勾配溶出を行っ
た（２００ml容）後、２００ml容ＴＨＦ洗浄を行った。
ＴＨＦ洗浄物（１５６mg）を４mlのＴＨＦに溶解し、Ｔ
ＨＦで平衡にされた１６０ｇのSephadexＬＨ−２０が入
っているカラム（床高９０cm、床容積４３０ml）へ適用
した。流速3.７５ml／分。目で見てわかるように、主黄
色帯（６２mg）が第２床容積の最初の 1／4 中に溶出し
た。最終的精製は、逆相（C₁₈)ＨＰＬＣクロマトグラフ
ィーにより、４ml／分の流速（0.１M NH₄OAc−ＴＨＦ
（６０−４０））で行った。検出は３２０nmに於てなさ
れた。３９分に於ける溶出物が式IVで示される化合物、
主生成物（２３mg）であった。ｃ）式Ｖ及びVIIIの化合物の単離及び精製全ブロス（２リットル）を Dicalite 濾過助剤を用いて
濾過した。菌糸マットをＴＨＦ（２リットル）中で４５
分間撹拌後、濾過し、さらにＴＨＦ（1.５リットル）で
洗浄した。濾液を減圧下に濃縮して3.３９ｇの粗製抽出
物を得た。この粗製抽出物を５０mlずつのＴＨＦで５回
すりつぶし抽出を行い、抽出液を合わせ、濃縮して0.７
４ｇのＴＨＦ可溶性残留物を得た。この塊には黄色蛍光
物質の大部分が含まれていた。このＴＨＦ可溶性物質を
２ｇの Silica Gel H (Merck, １０〜４０μm ）上に吸
着させ、追加の１１ｇの Silica Gel H が入っている３
０mlＶＬＣ漏斗に装填した。１００ml容の溶離液を用い
てヘキサン−酢酸エチルを用いて段階勾配溶離を行っ
た。この方法で２つの主レベッカマイシンアナローグは
きれいに分離された。低極性黄色ゾーン（１４１mg）は
ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で溶出し、高極性アナ
ローグ（１０５mg）はヘキサン−酢酸エチル（１：３）
で溶出した。

【００６５】高極性アナローグ（１０５mg）を２mlのＴ
ＨＦに溶解し、ＴＨＦで予め膨潤させた１６０ｇの Sep
hadex ＬＨ−２０が入っているカラム（床高９０cm、床
容積４３０ml）に装填した。流速は４ml／分であった。
主黄色帯は目で見てわかるように1.２５床容積で流出し
て式Ｖの化合物（７７mg）を得た。ＶＬＣからの高極性
アナローグ（１４１mg）を２mlのMeOHに溶解し、MeOHで
予め膨潤させた１１０ｇの Sephadex ＬＨ−２０が入っ
ているカラム（床高８０cm、床容積４００ml）に装填し
た。流速は3.５ml／分であった。主黄色ゾーンは第４床
容積の終りに溶出し、式VIIIの化合物（７０mg）を得
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】式IVの化合物のＩＲスペクトルを示す。

【図２】式IVの化合物の¹H-NMR を示す。

【図３】式IVの化合物の¹³C-NMRを示す。

【図４】式Ｖの化合物のＩＲスペクトルを示す。

【図５】式Ｖの化合物の¹H-NMR を示す。

【図６】式Ｖの化合物の¹³C-NMRを示す。

【図７】式VIIIの化合物のＩＲスペクトルを示す。

【図８】式VIIIの化合物の¹H-NMR を示す。

【図９】式VIIIの化合物の¹³C-NMRを示す。

【図１０】式IVの化合物の質量スペクトルを示す。

【図１１】式IVの化合物のＵＶスペクトルを示す。

【図１２】式Ｖの化合物の質量スペクトルを示す。

【図１３】式Ｖの化合物のＵＶスペクトルを示す。

【図１４】式VIIIの化合物の質量スペクトルを示す。

【図１５】式VIIIの化合物のＵＶスペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダニエルアールシュローダーアメリカ合衆国コネチカット州 06441 ヒッガナムダブリンヒルロード 150 (72)発明者ジャックリーンマリーマッティーアメリカ合衆国コネチカット州 06405 ブランフォードクラークアベニュー 164 (72)発明者サルヴァトアフォレンザアメリカ合衆国コネチカット州 06410 チェシャーウッドヒルロード 481 (72)発明者ジェイムズアンドリューマトソンアメリカ合衆国コネチカット州 06410 チェシャーワーリングフォードロード 475

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式【化１】（上記式中、X₁及びX₂は独立に弗素又は水素であり、但
しX₁とX₂とが同時に水素であることはないことを条件と
する）を有するレベッカマイシンアナローグ並びにその
製剤上受容できる酸付加塩。
【請求項２】式【化２】（上記式中、X₁及びX₂は独立に弗素又は水素であり、但
しX₁とX₂とが同時に水素であることはないことを条件と
する）を有するレベッカマイシンアナローグ並びにその
製剤上受容できる酸付加塩。
【請求項３】該アナローグが【化３】である請求項１記載の化合物。
【請求項４】該アナローグが【化４】である請求項１記載の化合物。
【請求項５】該アナローグが【化５】である請求項１記載の化合物。
【請求項６】該アナローグが【化６】である請求項１記載の化合物。
【請求項７】該アナローグが【化７】である請求項２記載の化合物。
【請求項８】該アナローグが【化８】である請求項２記載の化合物。
【請求項９】該アナローグが【化９】である請求項２記載の化合物。
【請求項１０】該アナローグが【化１０】である請求項２記載の化合物。
【請求項１１】 Saccharothrix aerocolonigenes
のレベッカマイシン生産性菌株を、水性栄養培地中、ト
リプトファンアナローグの存在下に於て、該培地中で該
菌が実質的な量の所望なレベッカマイシンアナローグを
生産するまで培養する工程及び該培地から所望のレベッ
カマイシン誘導体を実質的に純粋な形で回収する工程を
含む、請求項１又は２記載のレベッカマイシンアナロー
グあるいはその製剤上受容できる酸付加塩の製造法。
【請求項１２】レベッカマイシン生産性菌株がSaccha
rothrix aerocolonigenes ATCC 39243 である請求項
１１記載の製造法。
【請求項１３】トリプトファンアナローグがＤＬ−４
−フルオロトリプトファンである請求項１１記載の製造
法。
【請求項１４】トリプトファンアナローグがＤＬ−５
−フルオロトリプトファンである請求項１１記載の製造
法。
【請求項１５】トリプトファンアナローグがＤＬ−６
−フルオロトリプトファンである請求項１１記載の製造
法。
【請求項１６】トリプトファンアナローグがＤＬ−７
−フルオロトリプトファンである請求項１１記載の製造
法。
【請求項１７】製剤上受容できる実質的に無毒な担体
又は賦形済と共に請求項１又は２記載の少なくとも１種
の化合物の有効腫瘍抑制量を含む、請求項１又は２中で
定義されたレベッカマイシンアナローグに感受性の腫瘍
に冒された哺乳動物ホストの治療に用いるための製剤組
成物。
【請求項１８】請求項１又は２中で定義されたレベッ
カマイシンアナローグに感受性の腫瘍に冒された哺乳動
物ホストに製剤上受容できる実質的に無毒な担体又は賦
形済と共に請求項１又は２記載の少なくとも１種の化合
物の有効腫瘍抑制量を投与することを含む該ホストの治
療方法。