JP2989674B2 - 制癌性物質サイトブラスチンおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な制癌性物質サイト
ブラスチンおよびその塩に関し、またサイトブラスチン
の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】インドラクタム骨格を有する抗生物質と
してテレオシジンＢ（Ｔｅｌｅｏｃｉｄｉｎ Ｂ）が
「Ｂｕｌｌ． Ａｇｒ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐ
ａｎ」２４，６４７頁及び同誌２４，６５２頁（１９６
２）に開示されている。

【０００３】本発明によるサイトブラスチンは、これら
テレオシジン群の抗生物質とは、インドラクタム骨格の
７位に対してインドール環と１，２−プロパンジオール
基とを含む置換基が結合する点で化学構造上で異なり、
また生物活性も異なる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来既知の制癌性又は
抗腫瘍性物質は一般に毒性が強く、臨床での使用に大き
な制約となっている。そこで、毒性の弱い新しい制癌性
化合物が求められている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは新し
く、毒性の低い制癌剤化合物を見いだすべく、鋭意研究
を行なっている。そして、本発明者らは、ストレプトバ
ーチシリウム属に属する一菌株の培養液中に抗腫瘍活性
をもつ物質が産生され蓄積されていることを認め、その
物質を単離してそれの化学構造が後記の式（Ｉ）で表わ
し得ること、この物質が抗腫瘍活性を有すること及び新
規な化合物であることを知見した。これらの研究の結果
に基づいて、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、第１の本発明は式（Ｉ）： で表わされる制癌性物質サイトブラスチンもしくはその
塩に関する。また、第２の本発明はストレプトバーチシ
リウム属に属するサイトブラスチン生産菌を培養し、そ
の培養物から上記の式（Ｉ）のサイトブラスチンもしく
はその塩を採取することを特徴とする、サイトブラスチ
ンもしくはその塩の製造法に関するものである。

【０００７】本発明によるサイトブラスチンは塩基性の
物質であってその塩には、酸付加塩がある。サイトブラ
スチンの酸付加塩の例には、製薬学的に許容できる無機
酸、例えば塩酸、硫酸、硝酸、燐酸など、あるいは製薬
学的に許容できる有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、
マレイン酸、メタンスルホン酸などとの付加塩がある。

【０００８】本発明によるサイトブラスチンは下記の理
化学的性状を有するものである。

【０００９】サイトブラスチンの化学構造は次のとおり
解析された。すなわち、サイトブラスチンの紫外部吸収
スぺクトルに２２５と３００ｎｍの吸収があり、これは
テレオシジン群化合物のそれに類似している。また、こ
の吸収以外に２８３と２９０ｎｍに吸収が認められるこ
とから、サイトブラスチンの分子内には、更にインドー
ル環の存在が示唆された。サイトブラスチンの分子式と
その核磁気共鳴スペクトルの解析は、インドラクタムＶ
〔Ｉｎｄｏｌａｃｔａｍ Ｖ， 「Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｏｒｏｎ 」４２，５９０５−５９４２頁，（１９８
６）参照〕の骨格に、もう一つのインドール環とプロパ
ンジオール部分が結合していることを示した。特に^１Ｈ
核と^１３Ｃ核間の遠隔スピン結合を測定する異種核相関
（ＨＭＢＣ）スペクトルをサイトブラスチンのトリアセ
チル化物について測定して、そのスペクトルの詳細な解
析をした。その結果、前記（Ｉ）式に表わされるよう
に、サイトブラスチンはインドラクタムＶ骨格の７位に
２，３−ジヒドロキシ−１−（３−インドリル）プロピ
ル基［２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１−（３−ｉｎｄ
ｏｌｙｌ）ｐｒｏｐｙｌ基］が結合している構造をもつ
ことを明らかにした。

【００１０】サイトブラスチンは後記の生物学的性質を
有する。サイトブラスチンはグラム陽性および陰性細
菌、並びにかびに対して１００μｇ／ｍｌの濃度で抗菌
活性を示さなかった。

【００１１】各種の動物癌細胞及び人癌細胞に対するサ
イトブラスチン増殖阻害活性（ＩＣ₅₀値）は、表１に示
すように、ヒト肺癌細胞ＬＸ−１を除いてサイトブラス
チンのＩＣ₅₀値で＞１００μｇ／ｍｌであり、このよう
にサイトブラスチンの細胞毒性は非常に低い。

【００１２】

【００１３】サイトブラスチンのリンパ球の増殖に対す
る影響は以下の方法によって調べた。すなわち、ナイロ
ンウール通過Ｆｉｓｃｈｅｒラット脾臓細胞にコンカナ
バリンＡを５μｇ／ｍｌの量で加え、３７℃、４時間培
養する。２０ｍｇ／ｍｌのメチルマンノシドを加え２回
培地で洗浄する。この細胞を２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗ
ｅｌｌとなるようにマイクロプレートに加え、更に試料
としてサイトブラスチンを１０μｌの量で加え３７℃、
７２時間培養した。^３Ｈ−チミジンを加え１８時間培養
した後、培養細胞中への^３Ｈ−チミジンの取り込みをシ
ンチレーションカウンターで測定した。対照群のリンパ
球に取り込まれた^３Ｈ−チミジンのカウントを１００と
したときのサイトブラスチン添加群に取り込まれた３Ｈ
−チミジンのカウントの割合（Ｔ／Ｃ，％）を表２に示
した。

【００１４】

【００１５】サイトブラスチンのエールリッヒ固形癌担
癌マウスに対する治療実験は以下の方法によって行っ
た。すなわち、ＩＣＲマウス（雌性、６週令）にエール
リッヒ腹水癌細胞を２×１０⁶ 個／マウスとなるように
鼠蹊部皮下に移植し、移植後７日目から１４日目までサ
イトブラスチンを７．８，３１．２５，１２５または５
００μｇ／マウスの各投与量で連日腹腔内に投与した。
癌細胞移植後１５日目に固形癌を取り出し、生理食塩水
を投与した対照群のマウスの固形癌の重量を１００とし
たときのサイトブラスチン投与群の固形癌の重量の減少
の割合を阻害率として表３に示した。

【００１６】

【００１７】本発明によるサイトブラスチンは、ストレ
プトバーチシリウム属に属するサイトブラスチン生産菌
を培養してその培養物中にサイトブラスチン及び（又
は）その塩を蓄積させ、その後にそれを採取することに
よって製造できる。本発明の方法で使用できるストレプ
トバーチシリウム属に属するサイトブラスチン（もしく
はその塩）の生産菌の一例には、神奈川県横浜市で採取
された放線菌の菌株であってＭＩ４３−３７Ｆ１１株の
菌株番号を付された菌株がある。本菌株の菌学的特徴は
次に記載されるとおりである。 ＭＩ４３−３７Ｆ１１株の菌学的性状

【００１８】１．形態 ＭＩ４３−３７Ｆ１１株は、顕微鏡下で分枝した気中菌
糸より輪生枝を有する気菌糸を伸長する。気菌糸の先端
には１０個以上の胞子の連鎖をみとめ、らせん形成はみ
とめられない。胞子の大きさは、０．７〜０．８×１．
１〜１．２ミクロン位を示し、胞子の表面は平滑であ
る。

【００１９】２．各種培地における生育状態 （１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 発育は無色であり、気菌糸は白でうっすらと着生し、溶
解性色素は認められない。 （２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培
養） 無色〜うす黄〜うす黄茶の発育上に、黄味白の気菌糸を
うっすらと着生する。また、部分的に白の綿状の着生も
みられ、溶解性色素は認められない。 （３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５、２７℃培養） 発育は無色〜うす黄茶、気菌糸は白である。溶解性色素
はわずかに茶色味を呈する。 （４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、２
７℃培養） 無色〜うす黄茶の発育上に黄味白〜明るいオリーブ灰の
気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。 （５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７、２７℃培
養） 発育はうす黄茶〜明るい灰茶、気菌糸は白〜茶白、溶解
性色素は認められない。 （６）栄養寒天培地（２７℃培養） 無色〜うす黄の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生
し、黒っぽい溶解性色素をわずかに認める。 （７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２、２７
℃培養） 無色〜うす黄茶のしわのある発育上に、白〜茶白の気菌
糸を着生し溶解性色素は認められない。 （８）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−培地３、２７℃
培養） 無色〜うす黄の発育上に、白〜黄味白の気菌糸をうっす
らと着生し、溶解性色素は認められない。 （９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７℃培養） 発育は無色〜うす黄、気菌糸は白〜黄味白でうっすらと
着生し、溶解性色素は認められない。 （１０）スターチ寒天培地（２７℃培養） 無色〜うす黄〜うす黄茶の発育上に、白〜黄味白の気菌
糸を着生し、溶解性色素は認められない。 （１１）リンゴ酸石灰寒天培地（２７℃培養） 発育は無色で生育はきわめて悪く、白の気菌糸をわずか
に着生し、溶解性色素も認められない。 （１２）セルロース・濾紙片添加合成液（２７℃培養） 無色の発育上に気菌糸を着生せず、溶解性色素も認めら
れない。 （１３）ゼラチン穿刺培養 １５％単純ゼラチン培地（２０℃培養）では、発育は無
色、気菌糸は着生せず、うす黄茶の溶解性色素が認めら
れる。又、グルコース・ペプトン・ゼラチン培地（２７
℃培養）では、発育は無色、気菌糸は着生せず溶解性色
素はわずかに茶色味を呈する。 （１４）脱脂牛乳（３７℃培養） 無色〜うす茶の発育上に、気菌糸は着生せず溶解性色素
はわずかにうす黄〜茶色味をおびる。

【００２０】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４、ＢＡＫＵ
ＴＯ−ＩＮＯＲＧＡＮＩＣ−ＳＡＬＴＳ ＳＴＡＲＣＨ
−ＡＧＡＲ）を用い２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、
３７℃、５０℃の各温度で試験の結果、５０℃を除いて
そのいずれの温度でも発育したが最適生育温度は２７℃
付近と思われる。 （２）ゼラチンの液化（１５％単純ゼラチン培地、２０
℃培養；グルコース・ペプトン・ゼラチン培地、２７℃
培養） 単純ゼラチン培地、グルコース・ペプトン・ゼラチン培
地のいずれでも３日目頃より液化が始まりその作用は中
程度〜強い方である。 （３）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地
及びスターチ・寒天培地、いずれも２７℃培養） スターチ・無機塩寒天培地、スターチ寒天培地ともに培
養後３日目頃より水解性が認められ、その作用は強い方
である。 （４）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養） 培養後２日目には凝固が始まり、３日目には完了し直ち
にペプトン化が始まる。ペプトン化の進行はきわめて遅
く、培養後３週間を経ても完了しない。 （５）メラミン用色素の生成（トリプトン・イースト・
ブロス，ＩＳＰ−培地７、いずれも２７℃培養） ペプトン・イースト・鉄寒天培地では陽性、チロシン寒
天培地では陰性、トリプトン・イースト・ブロスでは陽
性であると思われる。 （６）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培
地，ＩＳＰ−培地９、２７℃培養） グルコース、フラクトース、イノシトールを利用して発
育し、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、シュクロー
ス、ラムノース、ラフィノース、Ｄ−マンニトール、ラ
クトースは利用しない。 （７）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天培地、２
７℃培養） 陰性である。 （８）硝酸塩の還元反応（０．１％硝酸カリウム含有ペ
プトン水，ＩＳＰ−培地８、２７℃培養） やや弱いが陽性である。 （９）セルロースの分解（濾紙片添加合成培地、２７℃
培養） 陰性である。

【００２１】以上の性状を要約すると、ＭＩ４３−３７
Ｆ１１株の気菌糸は輪生枝を有し、らせん形成は認めら
れず、胞子の表面は平滑である。種々の培地で無色〜う
す黄茶の発育上に白〜茶白、あるいは黄味白、時に明る
いオリーブ灰の気菌糸を着生する。溶解性色素は認めら
れないか茶色味を帯びる程度である。メラミン様色素の
生成はチロシン寒天培地では陰性、トリプトン・イース
ト・ブロス及びペプトン・イースト鉄寒天培地で、陽性
である。蛋白分解力は中程度〜強い方であり、スターチ
の水解性も強い方である。なお、細胞壁に含まれる２，
６−ジアミノピメリン酸はＬＬ−型であった。

【００２２】これらの性状より、ＭＩ４３−３７Ｆ１１
株はストレプトバーチシリウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒ
ｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属に属するものと考えられた。更
に近縁の既知菌種を検索すると、ストレプトバーチシリ
ウム・ユーロシディクム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕｍ）及びストレプ
トバーチシリウム・アルビレティキュリ（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｉｒｅｔｉｃｕｌ
ｉ）が挙げられた。そこで、ＭＩ４３−３７Ｆ１１株と
これら菌種について実地に比較検討し結果をまとめると
表４に示したようになる。

【００２３】

【００２５】表４から明らかなように、ＭＩ４３−３７
Ｆ１１株とストレプトバーチシリウム・ユーロシディク
ム及びストレプトバーチシリウム・アルビレティキュリ
とは３者ともが極めて類似した性質を有する。

【００２６】ＭＩ４３−３７Ｆ１１株により近縁の種を
選ぶとすると、気菌糸が明るいオリーブ灰を呈するこ
と、ＩＳＰ−培地７におけるメラミン様色素の生成がお
そらく陰性である点、フラクトースをおそらく利用する
こと等からストレプトバーチシリウム・ユーロシディク
ムが挙げられる。

【００２７】従ってＭＩ４３−３７Ｆ１１株をストレプ
トバーチシリウム・ユーロシディクム（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｕｒｏｃｉｄｉｃｕ
ｍ）ＭＩ４３−３７Ｆ１１株と同定した。なお、ＭＩ４
３−３７Ｆ１１株を工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託申請し、平成元年１月２７日、微工研菌寄第１０５
１３号として受託され、さらにブダペスト条約の規約の
下に平成２年２月２８日に移管されて微工研条寄第２７
８３号として寄託してある。

【００２８】次に、サイトブラスチンおよびその塩の製
造について説明する。ストレプトバーチシリウム属に属
するサイトブラスチン（およびその塩）生産菌株を栄養
源含有培地に接種して好気的に発育させることによって
サイトブラスチン（およびその塩）を含む培養物が得ら
れる。栄養源としては放線菌の栄養源として使用しうる
ものが使用される。栄養源として、例えば市販されてい
るペプトン、肉エキス、コーン・ステイープ・リカー、
綿実粉、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、ＮＺ−アミ
ン、カゼインの水解物、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウムなどの窒素源、及び市販されてい
るグリセリン、しょ糖、でん粉、グルコース、ガラクト
ース、マンノース、糖蜜などの炭水化物あるいは脂肪な
どの炭素源が使用できる。更に、食塩、リン酸塩、炭酸
カルシウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩を添加して
使用できる。その他必要に応じて微量の金属塩を添加す
ることができる。これらのものはサイトブラスチン生産
菌が利用し、サイトブラスチン（およびその塩）の生産
に役立つ物であればよく、公知の放線菌の培養材料はす
べて用いることができる。

【００２９】サイトブラスチン（およびその塩）の大量
生産には液体培養が好ましく、培養温度は生産菌が発育
しサイトブラスチン（およびその塩）を生産する範囲で
使用でき、通常２７〜３２℃である。培養は以上に述べ
た条件を使用するサイトブラスチン（およびその塩）生
産菌の性質に応じて適宜選択して行う事ができる。サイ
トブラスチン（およびその塩）は培養液に存在する。培
養物を濾過し、得られた培養濾液より酢酸エチル等の水
不混和性有機溶剤で抽出することができる。上述の抽出
法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、
例えば吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラ
フィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わ
せる事により純粋に採取することができる。

【００３０】

【実施例】次に本発明を実施例により説明するが、本発
明はこれに限定されものではない。

【００３１】実施例１ 寒天斜面培地で培養したストレプトバーチシリウム・ユ
ーロシディクムＭＩ４３−３７Ｆ１１株（微工研菌寄第
１０５１３号）よりガラクトース２．０％、デキストリ
ン２．０％、ソイペプトン（ディフコ社製バクトソイト
ン）１．０％、コーンスティープ・リカー（日本食品化
工（株）製）０．５％、硫酸アンモニウム０．２％、炭
酸カルシウム０．２％、消泡用シリコンオイル（信越化
学工業（株）製シリコンオイルＫＭ７０）０．００３
％、からなる液体培地（ｐＨ７．４）を１１０ｍｌずつ
分注したワッフル付き三角フラスコ２本に一白金耳ずつ
接種し、３０℃で２日間振とう培養した。それを種培養
液として、グリセリン２．０％、エスサンミート（味の
素（株）製）１．５％、リン酸１カリ０．１％、塩化コ
バルト６水和物０．０００５％、消泡用シリコン０．０
０３％、を含み、リン酸２カリでｐＨ６．２に調整した
液体培地を１２５ｍｌずつ分注した坂口フラスコ８０本
に２．５ｍｌずつ接種し、２８℃で４日間振とう培養し
た。

【００３２】培養液をろ過により濾液を菌体から分離
し、得られた培養濾液を等量の酢酸エチルで抽出した。
それを減圧濃縮し、２．０ｇの褐色油状物質を得た。こ
れを１０ｇのシリカゲルにまぶしクロロホルムで充填し
た６０ｍｌのシリカゲルカラムに重層し、クロマトグラ
フィーを行った。まずカラムをクロロホルム−メタノー
ル（１０：１）３００ｍｌで洗浄し次いでクロロホルム
−メタノール（８：２）３００ｍｌで溶出した。活性画
分を集め減圧濃縮し、０．５ｇの褐色油状物質を得た。
これを１０ｍｌのメタノールに溶かし、メタノールで充
填した１０ｍｌのカーボンカラムに流し、メタノールで
洗浄した。通過液を集め、減圧濃縮し、０．３ｇの褐色
油状物質を得た。

【００３３】これを少量のメタノールに溶かし高速液体
クロマトグラフィーを行った。カラムはセンシュー科学
（株）製センシューパックＯＤＳ３３０ＩＮ、２０φ×
３００ｍｍを用い、５０％から１００％メタノールの直
線濃度勾配で、５ｍｌ／分の流速で溶出し、５ｍｌずつ
分画した。活性画分を集め減圧濃縮し、１０ｍｇの黄色
飴状物質を得た。これを小量のメタノールに溶かし、２
×７０ｃｍのメタノールで充填したＬＨ−２０のカラム
クロマトグラフィーを行った。メタノールで溶出し３ｇ
ずつ分画した。活性画分を集め減圧濃縮して乾固し、３
ｍｇの白色粉状物質としてサイトブラスチンを得た。

【００３４】この白色物質はシリカゲル薄層クロマトグ
ラフィー（メルク社製Ａｒｔ．５７１５、展開溶媒：ク
ロロホルム−メタノール８：２）を行うと、単一のＵＶ
吸収スポットを与え、またＦｅＣｌ_３−ＨＣｌＯ_４で発
色させると赤色の単一スポットを与えたので、純粋なサ
イトブラスチンであると認められた。

【００３５】実施例２ 単一に精製されたサイトブラスチンは以下の方法によっ
て塩酸塩（または硫酸塩）とした。すなわち、実施例１
で得たサイトブラスチン２０ｍｇを２０ｍｌの酢酸エチ
ルに溶かし、そこに０．１Ｎ塩酸（または硫酸）２０ｍ
ｌを加え、よく振とうした後、水層を凍結乾燥すること
によりサイトブラスチンの塩酸塩（または硫酸塩）を得
た。

【００３６】

【発明の効果】以上詳細に説明したとうり、本発明によ
り新規な制癌性抗生物質サイトブラスチンと、その塩が
提供され、またサイトブラスチンの製造法が提供され
た。本発明による制癌性抗生物質サイトブラスチンは毒
性が極めて弱く、固形癌に有効な点で顕著な特徴を有す
る抗腫瘍活性を示す。

【００３７】

【図面の簡単な説明】

【図１】 はサイトブラスチン（メタノール中）の紫
外部吸収スペクトルを示す。

【図２】 はサイトブラスチン（ＫＢｒ錠中）の赤外
部吸収スペクトルを示す。

【図３】 はサイトブラスチンの^１Ｈ−ＮＭＲスペク
トル（重メタノール中、４００ＭＨｚ）を示す。

【図４】 はサイトブラスチンの^１３Ｃ−ＮＭＲスペ
クトル（重メタノール中、１００ＭＨｚ）を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 濱田 雅 東京都新宿区内藤町１番地26 秀和レジ デンス405号 (72)発明者 前田 謙二 東京都目黒区五本木２丁目46番11号 (72)発明者 竹内 富雄 東京都品川区東五反田５丁目１番11号 ニューフジマンション701 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07D 487/06 C12P 17/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の式（Ｉ）： で表わされる化合物である制癌性物質サイトブラスチ
   ン、およびその塩。
2. 【請求項２】 ストレプトバーチシリウム属に属するサ
   イトブラスチン生産菌を培養し、その培養物から請求項
   １のサイトブラスチンもしくはその塩を採取することを
   特徴とする、サイトブラスチンもしくはその塩の製造
   法。