CN103289903B - 一种有抑菌功能的黑曲霉h菌、活性腐解剂及其制备方法 - Google Patents

一种有抑菌功能的黑曲霉h菌、活性腐解剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种有抑菌功能的黑曲霉H菌、活性腐解剂及其制备方法，该腐解剂由自主分离、诱变的多酶谱、高酶活黑曲霉H菌株（Asperillus niger.H）制备而成。该黑曲霉H菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:中国,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码:100101，保藏编号为CGMCC N0.7465，保藏日期为2013年4月12日。该腐解剂既能快速腐解秸秆和畜禽粪便等有机物料，还有抑制土传病原菌的功效。制备方法：利用各种廉价的农副产品为原料，成本低，适宜推广。本发明适宜中小企业和农民就地将废弃物资源化，安全无毒，符合生态农业和可持续农业发展的需求。

Description

一种有抑菌功能的黑曲霉H菌、活性腐解剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物在农业方面应用技术，主要涉及一种有抑菌功能的活性腐解剂及其制备方法。
背景技术
我国每年可产农作物秸秆5亿吨以上，而畜禽粪便的产生量高达30-40亿吨，用秸秆和畜禽粪便制作肥料，不仅可以减少污染，还可变废为宝。传统堆肥方法处理畜禽粪便和秸秆，周期长、需要较大的堆沤空间，所挥发的的甲烷、氨气等导致环境二次污染；近年来，国家大力推广秸秆腐熟剂促进秸秆直接还田。为此，各地研发出多种秸秆腐熟剂。如山东的金葵子秸秆腐熟剂、山东金利丰生物的腐熟宝微生物菌剂等，此外，还有一些国外进口产品。无论用几种微生物菌种组成，其功能主要是作为腐熟剂。
随着设施农业的快速发展，连作和大量使用化肥农药，使设施土壤养分失衡，土壤酸化、板结，土传病害频繁发生，严重制约了设施生产的可持续发展。为此，利用微生物的广泛适应性和多功能性来转化秸秆和畜禽粪便，同时，抑制土传病害的发生已引起人们的重视，将成为国内外研究的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种有抑菌功能的活性腐解剂及其制备方法。该腐解剂由黑曲霉H菌发酵而成；发酵用农副产品及其下脚料，原料易得，成本低廉；曲盘生产，配方优化，发酵产物效价高；不仅快速腐解秸秆和畜禽粪便等有机物料，还有抑制土传病原菌、抑制番茄枯萎病等功效。
为实现上述本发明的目的，本发明的技术方案是：
1.本发明提供一株有益真菌：
一株黑曲霉H菌(Asperillus niger.H.Sp)，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:中国,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码:100101，保藏编号为CGMCC NO.7465，保藏日期为2013年4月12日。
黑曲霉H菌株的获得过程
分离和筛选过程：本发明中的黑曲霉H菌株是本发明人从山西省农科院秸秆反应堆中分离，并经紫外线诱变获得。其分离过程：采集已腐熟的秸秆，称取10g，放置在装有玻璃珠的90ml无菌水中，剧烈振荡30分钟，静置5分钟。吸取稀释液1ml,加入放置滤纸条(5cm×1cm)的纤维素分解菌液体培养基中，置28℃恒温培养5～10d，逐日观察记载菌液对滤纸条的分解效果。选滤纸条分解快的菌液，采用梯度稀释分离单菌落若干。按上述步骤，逐个验证其对滤纸条的分解效果。选分解效果最佳的菌株，反复纯化后，除在平板上观察菌落形态，还用凹玻片半固体悬滴法，定时观察菌丝、孢子囊、孢子梗、孢子等形态，确定其为黑曲霉，保存于液体石蜡斜面试管和麸皮试管中。
紫外线(UV)诱变过程：将筛选的黑曲霉出发菌株的菌悬液稀释至5×107cfu/mL，在距离紫外灯30-40cm处，辐照3-5min，将菌悬液梯度稀释涂平板，挑取存活菌落至自制的半纤维素培养基上，观察水解透明圈(D)与菌落(d)的大小，选取D/d值大于出发菌株的菌落进行纯化，通过测定纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、β-葡聚糖酶，最终筛选出诱变菌株(经中国科学院微生物所鉴定为黑曲霉)，定名黑曲霉H菌株。该菌液体发酵产物总酶活性比出发菌株高14.9％，其固体曲盘发酵产物的木聚糖酶和β-葡聚糖酶分别高于文献中同类菌株发酵产物1.86倍和6倍之多【赵林果等饲料研究2011.1】。
所述的黑曲霉H菌用于有机物料的腐解，也可用于抑制土传病害。又可用于抑制番茄枯萎病。
2.本发明提供黑曲霉H活性腐解剂及其制备方法
一种黑曲霉H菌活性腐解剂，其特征在于：该活性腐解剂是由黑曲霉H菌固体发酵而成。
所述的黑曲霉H菌活性腐解剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)菌种活化：取液体石蜡中冷藏保存的黑曲霉H，划线接种于PDA斜面培养基上，在温度为26～33℃条件下，培养60～72h，连续转管2次使菌种得到活化，备用；
(2)种子液培养：将活化菌种接种于装有100mL马铃薯葡萄糖培养液的250mL三角瓶中，在温度为26～33℃条件下，以150～200r/min转动三角瓶，摇匀种子液培养，恒温培养48～60h作为种子液，备用；
(3)菌剂制备：用各种廉价易得的农副产品做发酵料，将黑曲霉H菌种子液按3～10％的比例接入经高压灭菌1h的发酵料中；
(4)在温度为26～33℃条件下，静止培养50～72h，经风干后获得活菌数≥2×109cfu/g的干基培养物，即为含黑曲霉H菌的活性腐解剂。
其中：所述的发酵料按重量各组分组成为：麸皮30～40％、玉米粉20～30％、谷糠5～10％、玉米芯粉3～5％、玉米毛粉3～5％、谷粉2～5％，玉米秸粉1～3％，糖0.5～1.5％，盐0.1％～0.5％，营养液1～5％，含水量20～40％。
本发明的突出实质性特点与显著有益效果和功能：
黑曲霉H活性腐解剂可产生抑制植物病原菌繁殖、防治土传病害，促进植物生长的物质；能有效分解作物秸秆、糟渣中的木质素，纤维素和半纤维素等多种酶，腐熟效果稳定；对畜禽粪便有腐解、除菌、脱臭功能。发酵原料廉价易得，发酵过程无“三废”排出；增加土壤养分、改良土壤结构、提高肥料利用率；可直接使用，也可制成生物有机肥、生物有机无机复混肥等。
本发明黑曲霉H菌活性腐解剂可作为有机物料腐解剂使用，并对引起土传病害的病原真菌具有一定的抑制作用。
具体实施方式
一、本发明涉及一种有益真菌
一株黑曲霉H菌(Asperillus niger)，菌株为本发明人分离、诱变获得；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:中国,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码:100101，保藏编号为CGMCC NO.7465，保藏日期为2013年4月12日。
所述的黑曲霉H菌用于有机物料的腐解，也可用于抑制土传病害。又可用于抑制番茄枯萎病。
二、黑曲霉H的菌株特征
黑曲霉H菌株是本发明人从山西省农科院秸秆反应堆中分离，并经紫外线诱变获得。其分离过程：采集已腐熟的秸秆，称取10g，放置在装有玻璃珠的90ml无菌水中，剧烈振荡30分钟，静置5分钟。吸取稀释液1ml,加入放置滤纸条(5cm×1cm)的纤维素分解菌液体培养基中,(纤维素分解菌液体培养基配方见具体实施方式五)，置28℃恒温培养5～10d，逐日观察记载菌液对滤纸条的分解效果。选取滤纸条分解快的菌液，采用梯度稀释分离单菌落若干。按上述步骤，逐个验证其对滤纸条的分解效果。选分解效果最佳的菌株，反复纯化后，除在平板上观察菌落形态，还用凹玻片半固体悬滴法，定时观察菌丝、孢子囊、孢子梗、孢子等形态，确定其为黑曲霉，保存于液体石蜡斜面试管和麸皮试管中。
紫外线(UV)诱变过程：将筛选的黑曲霉出发菌株的菌悬液稀释至5×107cfu/mL，在距离紫外灯30-40cm处，辐照3-5min，将菌悬液梯度稀释涂平板，挑取存活菌落至自制的半纤维素培养基上，(半纤维素培养基配方见具体实施方式五)，观察水解透明圈(D)与菌落(d)的大小，选取D/d值大于出发菌株的菌落进行纯化，通过测定纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、β-葡聚糖酶，最终筛选出诱变菌株(经中国科学院微生物所鉴定为黑曲霉)，定名黑曲霉H菌株。该菌液体发酵产物总酶活性(10819.36U/g)比出发菌株CK总酶活性(9055.29U/g)高19.48％，其固体曲盘发酵产物的木聚糖酶和β-葡聚糖酶分别高于文献中同类菌株发酵产物1.86倍和6倍之多，具体数据见表1。
表1紫外线诱变菌株H与文献菌株酶活力的比较(U/g)
菌株 木聚糖酶 β-葡聚糖酶 总酶
黑曲霉H 55815.64 33287.69 100696.51
文献菌株* 30000.00 5000.00 50200.00
*赵林果等，饲料研究，2011.1。
三、黑曲霉H菌活性腐解剂的制备方法
黑曲霉H菌活性腐解剂的制备方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：取液体石蜡中冷藏保存的黑曲霉H划线接种于PDA斜面培养基上，在温度为26～33℃条件下，培养60～72h，连续转管2次使菌种得到活化，备用。
(2)种子液培养：将活化菌种接种于装有100mLPDA培养液的250mL三角瓶中，在温度为26～33℃条件下，以150～200r/min转动三角瓶，摇匀种子液培养，恒温培养48～60h作为种子液，备用。
(3)菌剂制备：用各种廉价易得的农副产品做发酵料，将黑曲霉H菌种子液按3～10％的比例接入经高压灭菌1h的发酵料中；
(4)在温度为26～33℃条件下，静止培养50～72h，经风干或烘干，及粉碎后，可获得活菌数≥2×109cfu/g的干基培养物，即为含黑曲霉H菌的活性腐解剂。
其中：发酵料按重量各组分组成为：麸皮30～40％、玉米粉20～30％、谷糠5～10％、玉米芯粉3～5％、玉米毛粉3～5％、谷粉2～5％，玉米秸粉1～3％，糖0.5～1.5％，盐0.1％～0.5％，营养液1～5％(营养液配方见具体实施方式五)，含水量20～40％；
该黑曲霉H菌活性腐解剂生产的特点是，利用农作物收获期间废弃的玉米芯、玉米毛、玉米秸、谷壳以及菌渣、糠醛渣、酒糟、醋糟等农副产品下脚料，廉价、环保，发酵产物效价高，无“三废”排出。
四、本发明所涉及的半纤维素培养基和营养液配方
Hutchison(赫氏)纤维素分解菌基础培养基(王家玲.环境微生物学实验[M].北京:高等教育出版社.1991:65-67.)，营养液配方的各组分按重量为：KH2PO41.0g，CaCl2 0.1g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.1g，FeCl3 0.01g，NaNO32.5g，蒸馏水1 000mL，pH 7.0—7.2。
将液体培养基分装于试管内，每管10mL，将自行处理的无淀粉滤纸剪成(5cm×1cm)小条放入试管中；121℃高压灭菌30min后备用。
半纤维素培养基的各组分按重量为：KH2PO4 2.0g，NH4NO3 2.0g，MgSO4·7H2O0.2g，酵母膏5g，半纤维素20g，蒸馏水1 000mL，pH7.2。
半纤维素的制备：90℃恒温水浴中，用4％NaOH浸泡玉米秸粉2h，过滤得滤液。将滤液用浓HCl调pH至4.5后，加入与滤液等体积的无水乙醇以沉淀半纤维素，将溶液离心得沉淀。用无水乙醇洗涤沉淀2-3次，再将沉淀置于恒温干燥箱中45℃烘干，即得浅黄色粉末状半纤维素，干燥保存备用。
发酵真菌菌剂用营养液的各组分按重量为：KH2PO4 2.0g，(NH4)2SO4 1.4g，尿素0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.3g，FeSO4·7H2O 5.0mg，MnSO4·H2O1.56mg，ZnSO4·7H2O 1.4mg，CoCl2 2.0mg，蒸馏水1 000mL，pH 5.0。
五、本发明涉及的黑曲霉H菌活性腐解剂对病原菌的抑制效果
将预先培养好的直径为6mm的病原菌fq菌块接种于PDA平板中央，再将腐解菌H菌的菌块等距接种于病原菌fq的两侧，以只接种病原菌的平板做对照，28℃温箱中倒置培养，培养3d后观察并记录病原菌fq菌落大小(以mm计)，重复三次,将三次重复取平均值采用生长速率法计算腐解菌对病原菌的抑制生长率R，结果见表2。
计算公式如下:
抑制生长率(R)％＝[(对照CK菌落直径-6)-(处理H菌落直径-6)]×100/(对照CK菌落直径-6)
表2黑曲霉H菌对病原菌的抑制生长率
注：D为菌落直径；R为抑制生长率(％)。
表中看出，黑曲霉H菌对病原菌有很强的抑制作用，其对病原菌的平均抑制生长率为85.5～89.5％。
六、本发明黑曲霉H菌活性腐解剂对有机物料的腐解效果
称取1cm长度的玉米秸秆10g，放入玻璃瓶中，加入20mL营养液，分别添加自制的活性腐解剂或市售秸秆腐熟剂各0.5g，CK不加腐熟剂。22℃恒温培养。从第5d开始，每隔5d采样测定失重率、C/N，评价腐解效果，结果见表3。
表3黑曲霉H菌腐解剂对秸秆的腐解效果
结果显示，在腐解过程中秸秆中各组分不断被微生物分解利用，因此秸秆的重量会有明显的降低。20d各处理的失重率均高于CK，腐熟菌加速了秸秆的分解；其中自制活性腐解剂最好，失重率达到25％以上，较对照提高了近70％；C/N也分别比CK降低3.3和6.9,对玉米秸秆均有促腐效果，其中自制活性腐解剂效果较好。

Claims (4)

1.一株黑曲霉H菌(Asperillus niger),菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:中国,北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码:100101，保藏编号为CGMCC N0.7465，保藏日期为2013年4月12日。
2.一种黑曲霉H菌活性腐解剂，其特征在于：该活性腐解剂是由如权利要求1所述的黑曲霉H菌固体发酵而成。
3.如权利要求2所述的黑曲霉H菌活性腐解剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)菌种活化：取液体石蜡中冷藏保存的黑曲霉H划线接种于PDA斜面培养基上，在温度为26～33℃条件下，培养60～72h，连续转管2次使菌种得到活化，备用；
(2)种子液培养：将活化菌种接种于装有100mL马铃薯葡萄糖培养液的250mL三角瓶中，在温度为26～33℃条件下，以150～200r/min转动三角瓶，摇匀种子液培养，恒温培养48～60h作为种子液，备用；
(3)菌剂制备：用各种廉价易得的农副产品做发酵料，将黑曲霉H菌种子液按3～10％的比例接入经高压灭菌1h的发酵料中；
(4)在温度为26～33℃条件下，静止培养50～72h，经风干后获得活菌数≥2×109cfu/g的干基培养物。
4.如权利要求3所述的黑曲霉H菌活性腐解剂的制备方法，其特征在于：所述的发酵料按重量各组分组成为：麸皮30～40％、玉米粉20～30％、谷糠5～10％、玉米芯粉3～5％、玉米毛粉3～5％、谷粉2～5％，玉米秸粉1～3％，糖0.5～1.5％，盐0.1％～0.5％，营养液1～5％，含水量20～40％；所述的营养液各组分按重量为：KH2PO4 1.0～3.0g，(NH4)2S04 1.0～2.0g，尿素0.1～0.5g，MgS04·7H20 0.1～0.5g，CaCl2 0.1～0.5g，FeS04·7H20 1.0～10mg，MnS04·H20 1.0～3.0mg，ZnS04·7H20 1.0～3.0mg，CoCl2 1.0～3.0mg，蒸馏水1000mL，pH 4.5～5.5。
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