ES2321248T3

ES2321248T3 - Regulacion de la expresion genica en plantas.

Info

Publication number: ES2321248T3
Application number: ES98941169T
Authority: ES
Inventors: Zhongyi Li; Matthew Morell; Sadequr Rahman
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Biogemma SAS
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Biogemma SAS
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2018-09-11
Also published as: US20060010517A1; JP2001516575A; US7750206B2; WO1999014314A1; NZ503137A; US6916976B1; EP1012250A1; CA2303407A1; DE69840362D1; CA2303407C; EP1012250B1; ATE417924T1; EP1012250A4

Abstract

Una secuencia de ácido nucleico aislada, que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta de cereales, en donde la enzima es una enzima II de ramificación del almidón del trigo, que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO:

Description

Regulación de la expresión génica en plantas.

Esta invención se relaciona con una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica una enzima II de ramificación del almidón del trigo que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO:2. La invención además se relaciona con los métodos para modificar las características del almidón producido por una planta, mediante la introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima II de ramificación del almidón de trigo que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2, o mediante la introducción de una secuencia anti-sentido de ácido nucleico dirigida a un gen que codifica una enzima II de ramificación del almidón de trigo que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2. La invención además se relaciona con plantas transformadas con una construcción que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica, o que es antisentido a, la enzima II de ramificación del almidón del trigo que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2, y con los productos de plantas que comprenden tales construcciones. La invención aún mas se relaciona con los métodos para identificar variaciones en las características de síntesis del almidón de una planta de trigo por la identificación de mutaciones, variación de secuencia intrónica, o la ausencia de un gen que codifica una enzima II de ramificación del almidón de trigo que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2.

El almidón es un importante constituyente de granos y de harinas de cereales, representando alrededor del 65-67% del peso del grano en la madurez. Se produce en el amiloplasto del endosperma del grano por la acción concertada de un número de enzimas, incluyendo ADP-Glucosa pirofosforilasa (EC 2.7.7.27), almidón sintasas (EC 2.4.1.21), enzimas de ramificación (EC 2.4.1.18) y enzimas de desramificación (EC 3.2.1.41 y EC 3.2.1.68) (Ball et al, 1996; Martin and Smith, 1995; Morell et al, 1995) Algunas de las proteínas involucradas en la síntesis del almidón se pueden recuperar a partir del gránulo del almidón (Denyer et al, 1995; Rahman et al, 1995).

La mayoría de los cultivadores de trigo normalmente producen el almidón que contiene 25% de amilosa y 75% de amilopectina. La amilosa se compone de grandes cadenas lineales de residuos\alpha-D-glucopiranosil (1-4) ligados, mientras que la amilopectina es una forma de ramificación de \alpha-glican ligada por unos enlaces (1-6). La relación de amilosa y amilopectina, la longitud de la cadena ramificada y el número de cadenas ramificadas de la amilopectina son los principales factores que determinan las propiedades del almidón de trigo.

El almidón con diversas propiedades, ha sido ampliamente utilizado en la industria, la ciencia de los alimentos y la ciencia médica. El trigo con alta amilosa se puede utilizar como sustitutos de plásticos y en la fabricación del papel, para proteger el ambiente; en alimentos naturales para reducir cáncer de intestino y enfermedad del corazón; y en los alimentos para deportes para mejorar el rendimiento de los atletas. El trigo con alta amilopectina puede ser apropiado para los fideos Japoneses, y se utiliza como un espesante en la industria alimentaria.

El trigo contiene tres grupos de cromosomas (A, B y D) en su muy grande genoma de unos 1010 pares de base (bp). El donante del genoma D al trigo es el Triticum tauschii, y empleando un acceso apropiado de esta especie, los genes a partir del genoma D se pueden estudiar por separado (Lagudah et al, 1991).

Existe una pequeña variación comparativamente en la estructura del almidón encontrada en las variedades del trigo, debido a que la naturaleza hexaploide del trigo previene que, las mutaciones sean fácilmente identificadas. Las alteraciones dramáticas en la estructura del almidón se espera que requieran la combinación de alelos recesivos homocigóticos a partir de cada uno de los 3 genomas del trigo, A, B y D. Este requisito da la probabilidad muy baja, de encontrar tales mutantes en poblaciones naturales o mutagenizadas del trigo. La variación en almidón de trigo es deseable con el fin de permitir una mejor adaptación de los almidones del trigo para su procesamiento y las necesidades del usuario final.

Los objetivos comerciales claves para la manipulación de la biosíntesis del almidón son:

1. Trigos "Cerosos" en los cuales el contenido de amilosa se reduce a niveles insignificantes. Este resultado se espera que se obtenga, mediante la eliminación de la actividad de la sintasa del almidón unido al gránulo.

2. Trigos con alta amilosa, que se esperan obtener, mediante la eliminación de la actividad de la enzima-II de ramificación del almidón.

3. trigos que siguen a la síntesis del almidón a temperaturas elevadas, que se esperan obtener mediante la identificación o la introducción de un gen que codifica una sintasa del almidón soluble estable al calor.

4. "Tipos azucarados" de trigo que contienen un contenido de amilosa incrementado y azúcares libres, que se esperan obtener, manipulando una enzima de desramificación del tipo isoamilasa.

Existen dos estrategias generales que se pueden utilizar para obtener trigos con la estructura del almidón alterada:

(a) utilizando estrategias de ingeniería genética para suprimir la actividad de un gen específico, o para introducir un gen novedoso en una línea de trigo; y

(b) seleccionando entre la variación existente en trigo por alelos ausentes ("nulos") o alterados de un gen en cada uno de los genomas del trigo, y combinando estos por reproducción de la planta.

Sin embargo, en vista de la complejidad de las familias de genes, particularmente la enzima I de ramificación del almidón (SBE I), sin la capacidad de dirigir las regiones que son únicas para genes expresados en el endosperma, modificación del trigo por combinación de alelos nulos de varias enzimas en general representa una labor casi imposible.

Las enzimas de ramificación se involucran en la producción de glucosa \alpha-1,6 ramas. De los dos principales constituyentes del almidón, la amilosa es esencialmente lineal, pero la amilopectina es altamente ramificada; de esta manera las enzimas de ramificación se consideran directamente implicadas en la síntesis de la amilopectina pero no de la amilosa. Existen dos tipos de enzimas de ramificación en plantas, la enzima I de ramificación del almidón (SBE I) y la enzima II de ramificación del almidón (SBE II), y ambas tienen unos 85 kDa en tamaño. En el nivel de ácido nucleico hay cerca de 65% de identidad de la secuencia entre los tipos I y II en la porción central de las moléculas; la identidad de la secuencia entre SBE I a partir de diferentes cereales es cerca del 85% en general (Burton et al, 1995; Morell et al, 1995).

En los cereales, los genes SBE I han sido reportados hasta el momento solamente para el arroz (Kawasaki et al, 1991; Rahman et al, 1997). Una secuencia de cADN para el SBE I del trigo se encuentra disponible en la base de datos GenBank (No. de acceso Y12320; Repellin A., Nair R.B., Baga M., and Chibbar R.N.: Plant Gene Register PGR97-094, 1997). En la medida en que somos conscientes, ninguna secuencia promotor para el SBE I del trigo ha sido reportada.

Hemos caracterizado un gen SBE I, designado wSBE I-D2, a partir del Triticum tauschii, el donante del genoma D para el trigo (Rahman et al, 1997). Este gen codifica una secuencia de proteína, la cual tiene una deleción de aproximadamente 65 aminoácidos en el final del C-terminal, y no parece contener ninguna de la características del motivo de aminoácido conservada de esta clase de enzima (Svensson, 1994). Aunque wSBE I-D 2 se expresó como mARN, ninguna proteína correspondiente se ha encontrado aún en nuestro análisis de las isoformas SBE I a partir del endosperma, y de esta manera es posible que este gen sea un pseudogen transcrito.

Los genes para SBE II son menos bien caracterizados; ninguna secuencia genómica está disponible, aunque los cADNs del SBE II a partir del arroz (Mizuno et al, 1993; No. de acceso D16201) y del maíz (Fisher et al, 1993; No. de acceso L08065) han sido reportados. Además, una secuencia de cADN para SBE II a partir del trigo se encuentra disponible en la base de datos GenBank (Nair et al, 1997; No. de acceso Y11282); aunque las secuencias son muy similares a aquellas reportadas allí, Existen diferencias cerca al N-terminal de la proteína, que especifica su localización intracelular. Ninguna secuencia promotor ha sido reportada, en la medida que somos conscientes.

La sintasa del almidón unida al gránulo del trigo (GBSS) es responsable para la síntesis de la amilosa, mientras que las enzimas de ramificación del trigo junto con las sintasas del almidón solubles se consideran que se involucran directamente en la biosíntesis de la amilopectina. Un número de isoformas de sintasas del almidón solubles y unidas al gránulo han sido identificadas en el endosperma del trigo desarrollado (Denyer et al, 1995). Existen tres distintas isoformas de sintasas del almidón, 60 kDa, 75-77 kDa y 100-105 kDa, que existen en los gránulos del almidón (Denyer et al, 1995; Rahman et al, 1995). La GBSS de 60 kDa es el producto del gen wx. La proteína de 75-77 kDa es una sintasa I del almidón soluble en trigo (SSSI) que esta presente en ambas, la fracción soluble y la fracción unida al gránulo del almidón del endosperma. Sin embargo, las proteínas de 100-105 kDa, que son otro tipo de la sintasa de almidón soluble, se localizan solamente en gránulos del almidón (Denyer et al, 1995; Rahman et al, 1995). Hasta donde sabemos no ha habido ningún informe de ninguna secuencia de SSS I del trigo completa, ya sea en el nivel de la proteína o del nucleótido.

Ambos cADN y ADN genómico que codifican una sintasa de almidón soluble I de arroz han sido clonados y analizados (Baba et al, 1993; Tanaka et al, 1995). Los cADNs que codifican la sintasa de almidón soluble de la patata SSSII y SSSIII y sintasa de almidón soluble del guisante SSSII, también han sido reportadas (Edwards et al, 1995; Marshall et al, 1996; Dry et al, 1992). Sin embargo, las secuencias de cADN de longitud completa correspondiente para el trigo hasta ahora no han sido disponibles, aunque una secuencia de cADN parcial (No. de acceso U48227) ha sido liberada en la base de datos GenBank.

La metodología (b) mencionada anteriormente ha sido demostrada para el gen por la sintasa unida al gránulo del almidón. Los alelos nulos en los cromosomas 7A, 7D y 4A se identificaron por el análisis de las bandas de la proteína de GBSS por electroforesis, y se combinan por cultivo de las plantas para producir una línea de trigo que no contiene ni GBSS, y ni amilosa (Nakamura et al, 1995). Posteriormente, marcadores de ADN basados en PCR han sido identificados, los cuales también identifican alelos nulos para el emplazamiento de GBSS en cada uno de los tres genomas del trigo. A pesar de la disponibilidad de una cantidad considerable de información en el oficio anterior, los principales problemas permanecen. En primer lugar, la presencia de tres grupos separados de cromosomas en el trigo hace el análisis genético en esta especie, extraordinariamente complejo. Esto se complica aún más por el hecho que un número de enzimas se involucran en la síntesis del almidón, y cada una de estas enzimas está presente por si misma en un número de formas, y en un número de localizaciones dentro de la célula vegetal. Poca, casi ninguna, información ha estado disponible en cuanto a que forma específica de cada enzima se expresa en el endosperma. Para el trigo, una cantidad limitada de información de la secuencia de ácido nucleico se encuentra disponible, pero esta es solamente la secuencia de cADN; sin la secuencia genómica, y por consiguiente ninguna información con respecto a los promotores y otras secuencias control, se encuentra disponible. Sin ser capaz de demostrar que el gen específico del endosperma dentro de una familia ha sido aislado, tal información de la secuencia es de limitada utilidad práctica.

Chibbar et al (1996) Cereal Foods World 41(7):587 (D3) describe la clonación molecular y la caracterización de los genes de la enzima de ramificación del almidón a partir del trigo.

WO 97/22703 (D4) describe almidones novedosos vía modificación de la expresión de genes de enzima biosintética del almidón.

Nair et al (1997) Plant Science 122:153-163 (D6) revela el aislamiento, caracterización y análisis de expresión de un cADN de la enzima II de ramificación del almidón a partir del trigo.

En esta aplicación se presenta el aislamiento y la identificación de genes novedosos a partir de T. tauschii, el donante del trigo del genoma-D, que codifican SBE I, SBE II, una SSS I de 75 kDa, y una enzima de desramificación del tipo isoamilasa (DBE). Debido a la relación muy cercana entre T. tauschii y el trigo, como se discute anteriormente, los resultados obtenidos con T. tauschii se pueden aplicar directamente con el trigo con poca, casi ninguna, modificación. Tal modificación que pueda ser necesaria representa una experimentación de ensayo y error rutinario. Las secuencias a partir de estos genes se pueden utilizar como sondas para identificar alelos nulos o alterados en trigo, que luego se pueden utilizar en programas de cultivos de plantas para proporcionar modificaciones de las características del almidón. Las secuencias novedosas de la invención se pueden utilizar en estrategias de ingeniería genética o para introducir un gen deseado en una planta huésped, para proporcionar las secuencias antisentido para la supresión de uno o más genes específicos en una planta huésped, con el fin de modificar las características del almidón producido por la planta.

Mediante el uso de T. tauschii, hemos sido capaces de examinar un genoma solo, en lugar de tres como en el trigo, y para identificar y aislar las formas de la síntesis de los genes del almidón que se expresan en el endosperma. Mediante el direccionamiento de la secuencia genómica, hemos sido capaces de aislar promotores de tejido específico para los genes relevantes, lo que proporciona un mecanismo para la manipulación simultánea de un número de genes en el endosperma. Puesto que T. tauschii es tan estrechamente relacionado con el trigo, los resultados obtenidos con este sistema modelo se aplican directamente al trigo, y hemos confirmado esto experimentalmente. La secuencia genómica que hemos determinado también se puede utilizar como sondas para la identificación y aislamiento de las secuencias correspondientes, incluyendo secuencias promotor, a partir de otra especie de planta de cereales.

En su aspecto más general, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta de cereales, siendo dicha enzima, la enzima II de ramificación del almidón de trigo (SBEII) que tiene una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

Preferiblemente la secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ADN, y puede ser ADN genómico o cADN. Preferiblemente la secuencia es aquella que es funcional en el trigo. La secuencia se deriva a partir de una especie Triticum, más preferiblemente el Triticum tauschii.

En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica, la enzima II de ramificación del almidón del trigo, que tiene SEQ ID NO: 2 ligada operablemente a una o más secuencias de ácido nucleico que facilitan la expresión de dicha enzima en una planta, preferiblemente una planta de cereales: La construcción puede ser un plásmido o un vector, preferiblemente uno apropiado para utilizar en la transformación de una planta. Un vector particularmente apropiado es una bacteria del género Agrobacterium, preferiblemente el Agrobacterium tumefaciens. Los métodos de transformación de plantas de cereales, que utilizan el Agrobacterium tumefaciens son conocidos; ver por ejemplo Australian Patent No. 667939 por Japan Tobacco Inc., International Patent Application WO 97/48814 por Monsanto Company and Tingay et al (1997).

En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para modificar las características del almidón producido por una planta, que comprende la etapa de:

(a) la introducción de un gen que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta huésped, o

(b) la introducción de una secuencia anti-sentido de ácido nucleico dirigida a un gen que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta huésped, en donde dicha enzima es la enzima II de ramificación del almidón de trigo que tiene una secuencia de aminoácido de SEQ IN NO:2.

Preferiblemente la planta es una planta de cereales, más preferiblemente el trigo o la cebada.

Como es bien conocido en el oficio, la secuencias anti-sentido se pueden utilizar para suprimir la expresión de la proteína para la cual la secuencia anti-sentido es complementaria. Será evidente para alguien de habilidad en el oficio, que diferentes combinaciones de secuencias sentido y anti-sentido, se pueden elegir, de manera que causen una variedad de diferentes modificaciones de las características del almidón producido por la planta.

Este aspecto de la invención proporciona un método de expresión dirigida del gen SBE II del trigo al endosperma de una planta de cereales.

Este aspecto de la invención proporciona un método de modulación del tiempo de expresión del gen SBE II del trigo en el endosperma de una planta de cereales.

A pesar de que la invención se describe con detalle en relación con el trigo, se debe entender claramente que también es aplicable a otras plantas de cereales de la familia Gramineae, tales como maíz, cebada y arroz.

Los métodos para la transformación de plantas monocotiledóneas tales como el trigo, maíz, cebada y arroz y para la regeneración de plantas a partir de protoplastos o embriones de plantas inmaduras son bien conocidos en el oficio. Ver por ejemplo Lazzeri et al, 1991; Jahne et al, 1991 y Wan and Lemaux, 1994 para la cebada; Wirtzens et al, 1997; Tingay et al, 1997; Canadian Patent Application No. 2092588 por Nehra; Australian Patent Application No. 61781/94 por National Research Council of Canada, Australian Patent No. 667939 por Japan Tobacco Co, y International Patent Application WO97/48814 por Monsanto Company.

Se conocen las secuencias de glucosa pirofosforilasa ADP a partir de la cebada (Australian Patent Application No. 65392/94), enzima de desramificación del almidón y su promotor a partir del arroz (Japanese Patent Publication No. Kokai 6261787 y Japanese Patent Publication No. Kokai 5317057), y enzima de desramificación del almidón a partir de la espinaca y patata (Australian Patent Application No. 44333/96).

Descripción detallada de los dibujos

La invención será descrita con detalle en función solamente a los siguientes ejemplos no-limitantes y a las figuras.

Figura 1a muestra la expresión de Sintasa I del Almidón Soluble (SSS), Enzima I de Ramificación del Almidón (BE I) y Enzima II de Ramificación del Almidón (BE II) mARNs durante el desarrollo del endosperma.

El ARN se purificó a partir de hojas, flores antes de la antesis, y endosperma del trigo cultivo Rosella cultivado en un invernadero, recolectado 5 a 8 días después de la antesis, 10 a 15 días después de la antesis y 18 a 22 días después de la antesis, y a partir del endosperma del trigo cultivo Rosella, cultivado en el campo y recolectado 12, 15 y 18 días después de la antesis respectivamente. Cantidades equivalentes de ARN se sometieron a electroforesis en cada senda. Las sondas fueron de la región codificante del cADN de SSS I SM2 (a partir del nucleótido 1615 a 1919 de la secuencia de cADN de SM2); wSBE I-D43C (ver Tabla I), que corresponda al terminal 3' no traducido de cADN de wSBE I-D4 (E1 (3'; y la región 5' de SBE9 (SBE9 (5'), correspondiente a la región entre los nucleótidos 743 a 1004 de la secuencia Y11282 de Genbank. No se detecto ninguna hibridación para el ARN extraído a partir de hojas o flores de la preantesis.

Figura 1b muestra la hibridación del ARN a partir del endosperma del cultivo T. aestivum hexaploide "Wyuna" con el gen de la enzima II de ramificación del almidón. La sonda, wSBE II-D13, se define en la Tabla 1.

Figura 2 muestra la hibridación de los clones genómicos F1, F2, F3 y F4 con la secuencia SBE-9 completa. El ADN a partir de los clones se purificó y se metabolizó con BamHI o EcoRI, se separó sobre agarosa, se transfirió sobre nitrocelulosa y se hibridizó con SBE-9 marcado (un cADN de tipo SBE II). El patrón de las bandas de hibridación es diferente en los cuatro aislados.

Figura 3a muestra la secuencia N-terminal de SBE II purificada a partir del endosperma del trigo como en Morell et al, (1997).

Figura 3b muestra la secuencia de aminoácido deducida a partir de la parte de wSBE II-D1 que codifica la secuencia N-terminal como se describe en Morell et al, (1997).

Figura 4 muestra la deducida estructura exón-intrón para una parte de wSBE II-D1. La escala se marca en las bases. Los rectángulos negros son exones.

Figura 5 muestra la hibridación del ADN a partir de líneas de ingeniería del cromosoma del trigo (cultivo Chinese Spring) con una sonda de los nucleótidos 550-850 a partir de SBE-9. La banda de aproximadamente 2.2 kb se pierde en la línea en la cual el cromosoma 2D está ausente.

T2BN2A: cuatro copias del cromosoma 2B, ninguna copia del cromosoma 2A;

T2AN2B: cuatro copias del cromosoma 2A, ninguna copia del cromosoma 2B;

T2AN2D: cuatro copias del cromosoma 2A, ninguna copia del cromosoma 2D.

Figura 6 ilustra el diseño de los grupos del cebador BE II que abarcan el intrón 15. Los cebadores se basaron en la secuencia wSBE II-D1 (SEQ ID No: 1), y se diseñaron de tal manera que las secuencias del intrón en la secuencia wSBE II-D1 (deducida a partir de la Figura 13b y Nair et al, 1997; No. de acceso Y11282) se amplificaron por PCR.

Figura 7 muestra los resultados de la amplificación utilizando el grupo cebador 5 del Intrón de SBE II (grupo cebador 6: sr913F y WBE2E6 R) en diversos trigos diploide, tetraploide y hexaploide.

i) T.boeodicum (diploide del genoma A)

ii) T.tauschii (diploide del genoma D)

iii) T.aestivum cv. Chinese Spring línea ditelosómica 2AS (carente del cromosoma arm 2AL)

iv) Crete 10 (tetraploide AABB)

v) T. aestivum cv Rosella (hexaploide)

El eje horizontal indica el tamaño del producto en pares de base, el eje vertical muestra las unidades de fluorescencia arbitrarias. Las diversas flechas indican los productos de diferentes genomas: A, genoma A, B, genoma B, D, genoma D, U, producto adicional en disponibilidad.

Figura 8 muestra los resultados obtenidos por amplificación utilizando el grupo cebador 10 del Intrón de SBE II (grupo cebador 11: da5.seq y WBE2E11R en las líneas de trigo:

(i) T. aestivum cv. Chinese Spring línea ditelosómica 2AS.

(ii) T. aestivum Chinese Spring línea nulisómica/tetrasómica N2BT2A.

(iii) T. aestivum Chinese Spring línea nulisómica/tetrasómica N2DT2B.

El eje horizontal indica el tamaño del producto en pares de base, el eje vertical muestra unidades de fluorescencia arbitrarias. Las diversas flechas indican los productos de diferentes genomas: A, genoma A, B, genoma B, D,
genoma D.

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Ejemplo 1 Construcción de Genoteca y Aislamiento de Clones

La genoteca utilizada en este estudio se construyó a partir del Triticum tauschii, var. strangulata, número de acceso CPI 100799. De todos los accesos de T. tauschii examinados, el genoma de CPI 100799 es el más estrechamente relacionado con el genoma D del trigo hexaploide.

Tricicum tauschii, var strangulata (número de acceso CPI 110799) fue proporcionado amablemente por el Dr E Lagudah. Las hojas se aislaron a partir de plantas cultivadas en el invernadero.

El ADN se extrajo a partir de las hojas de Triticum tauschii utilizando los métodos publicados (Lagudah et al, 1991), se metabolizó parcialmente con Sau3A, tamaño fraccionado y ligado con los brazos de lambda GEM 12 (Promega). Los Productos ligados se utilizaron para transferir la cepa tolerante a la metilación PMC 103 (Doherty et al. 1992). Un total de 2 x 10^{6} placas primarias se obtuvieron con un tamaño de inserto medio de unos 15 kb. De esta manera la biblioteca contiene aproximadamente 6 genomas activos de ADN de T. tauschii. La biblioteca se amplificó y almacenó a 4ºC hasta que se necesite.

Las placas positivas en la genoteca se seleccionaron como aquellas que hibridizan con el terminal 5' de un cADN de la enzima I de ramificación del almidón de maíz (Baba et al, 1991) utilizando condiciones rigurosas moderadamente como se describe en Rahman et al, (1997).

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Preparación del ARN Total a partir del trigo

El ARN total se aisló a partir de hojas, pericarpio pre-antesis y diferentes etapas del desarrollo del endosperma del trigo del cultivo, Hartog y Rosella. Este, material se recolectó de tanto el invernadero como del campo. El método utilizado para el aislamiento del ARN fue esencialmente el mismo como aquel descrito por Higgins et al (1976). El ARN luego se cuantificó por absorción UV y por separación en geles 1.4% agarosa-formaldehido que luego se visualizaron bajo luz UV después de la tinción con bromuro de etidio (Sambrook et al, 1989).

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Análisis de ADN y ARN

El ADN se aisló y analizó utilizando protocolos establecidos (Sambrook et al, 1989). Se extrajo ADN a partir del trigo (cv. Chinese Spring) utilizando métodos publicados (Lagudah et al, 1991). Un análisis Southern se realizó esencialmente como se describe por Jolly et al (1996). En resumen, 20 \mug de ADN del trigo se metabolizaron, se sometieron a electroforesis y se transfirieron a una membrana de nylon. La hibridación se condujo a 42ºC en 25% o 50% de formamida, 2 x SSC, 6% de Dextran Sulfato por 16h y la membrana se lavó a 60ºC en 2 x SSC por 3 x 1h a menos que se indique de otra manera. La hibridación se detectó por autoradiografía utilizando una película Fuji
X-Omat.

El análisis de ARN se realizó como sigue. 10 \mug de ARN total se separaron en un gel de agarosa-formaldehido al 1.4% y se transfirieron a una membrana de nylon Hybond N+ (Sambrook et al, 1989 ), y se hibridizaron con una sonda de cADN a 42ºC en solución reguladora de hibridización Khandjian (Khandjian, 1989). La parte 3' del cADN SBE I del trigo se marcó con el Rapid Multiprime ADN Probe Labelling Kit (Amersham) y se empleó como sonda. Después del lavado a 60ºC con 2 x SSC, 0.1% de SDS tres veces, cada vez por cerca de 1 a 2 horas, la membrana se visualizó por exposición durante la noche a -80ºC con una película de rayos-X, Kodak MR.

Ejemplo 2 Construcción y Selección de la Biblioteca de cADN

Una biblioteca de cADN del trigo se construyó a partir del cultivo Rosella utilizando ARN mezclado a partir del endosperma a 8, 12, 18 y 20 días después de la antesis.

La biblioteca de cADN se preparó a partir del poli A+ ARN que se extrajo a partir de granos de trigo en desarrollo (cv. Rosella, un cultivo de trigo flexible hexaploide) a 8, 12, 15, 18, 21 y 30 días después de la antesis. El ARN se mezcló y se empleo para la síntesis de cADN que se propagó en lambda ZapII (Stratagene).

Las enzimas de ramificación del almidón son miembros de la familia de la proteína\alpha-amilasa, y en un sondeo reciente Svensson (1994) identificó ocho residuos en esta familia que son invariantes, siete en el sitio catalítico y una glicina en una vuelta corta. De los siete residuos catalíticos, cuatro se modifican en el tipo SBE I-D2. Sin embargo, una variación adicional en los residuos "conservados" puede salir a la luz cuando más cADNs de la planta para la enzima I de ramificación están disponibles para el análisis. Además, la comparación de las secuencias SBE I del maíz y del arroz indican que la región 3' (a partir del residuo del aminoácido 730 del maíz) es mucho más variable que las regiones 5' y central. Los sitios activos de las secuencias SBE I arroz y maíz, como se indica por Svensson (1994), se codifican por secuencias que están en la porción central del gen. Cuando las secuencias SBE II de la Arabidopsis se compararon por Fisher et al (1996) también encontraron variación en los terminales 3' y 5'.

Ejemplo 3 Aislamiento de SBE II Codificante de Clones Genómicos

Selección de una biblioteca de cADN, preparada a partir del endosperma del trigo como se describe en el Ejemplo 2, con el clon BE I del maíz (Baba et al, 1991) a baja severidad conduce al aislamiento de dos clases de placas positivas. Una clase fue hibridizado fuertemente, y causa el aislamiento de los clones del cADN del trigo tipo SBE I-D2 y tipo SBE I-D4, como se describe en Rahman et al (1997). La segunda clase fue débilmente hibridizada, y un miembro de esta clase se purificó. Este clon débilmente hibridizado fue denominado SBE-9, y en la secuenciación se encontró que contenía una secuencia que era diferente de aquella para SBE I. Esta secuencia mostró mayor homología con las secuencias BE II del maíz, y se consideró que codifica parte de la secuencia SBE II del trigo.

La selección de aproximadamente 5 x 10^{5} placas a partir de una genoteca construida a partir de T. tauschii (ver Ejemplo 1) con la secuencia SBE-9 conduce al aislamiento de cuatro placas que fueron positivas. Estas se designaron wSBE II-D1 a wSBE II-D4 respectivamente, y se purificaron y analizaron mediante un mapa de restricción. Aunque todas tenían diferentes patrones de hibridación con SBE-9, como se muestra en la Figura 2, los resultados fueron consistentes con el aislamiento del mismo gen en fragmentos de tamaño diferente.

Ejemplo 4 Identificación de la secuencia N-terminal de SBE II

La secuenciación del gen SBE II contenido en el clon 2, denominado EBB II-D 1 (ver SEQ ID No: 1), demostró que, codifica para la secuencia N-terminal de la principal isoforma de SBE II expresada en el endosperma del trigo, como se identifica por Morell et al (1997). Esto se muestra en la Figura 3.

Ejemplo 5 Estructura Intrón-Exón del Gen SBE II

Además de codificar la secuencia N-terminal de sBE II, la secuencia de cADN reportada por Nair et al (1997) también se encontró que tenía 100% de identidad de la secuencia con parte de la secuencia de wSBE II-D1. De esta manera, la estructura intrón-exón se puede deducir, y esto se muestra en la Figura 4. Las Posiciones de exones y otras características estructurales principales del gen SBE II se resumen en la Tabla 1.

Ejemplo 6 Número de Genes SBE II en T. tauschii y Trigo

La hibridación de la región conservada SBE II con el ADN de T. tauschii reveló la presencia de las tres clases de genes. Sin embargo, en nuestra selección solamente se recuperó una clase. La hibridación con el ADN del trigo indicó que el locus para SBE II fue en el cromosoma 2, con aproximadamente 5 locus en el trigo; la mayoría de estos parecen estar en el cromosoma 2D, como se muestra en la Figura 5.

TABLA 1 Posiciones de características estructurales en wSBE II-D1

1

2

Ejemplo 7 Expresión de SBE II

La hibridación de ARN a partir del endosperma de cultivos T. tauschii hexaploide con SBE II se examinó. El ARN se purificó en diversos números de días después de la antesis a partir de plantas cultivadas con un foto periodo de 16 h a 13ºC (noche) y 18ºC (día). La edad de los endospermas a partir de los cuales el ARN se extrajo en días después de la antesis se da en la parte superior de las sendas en la mancha. Cantidades equivalentes de ARN se sometieron a electroforesis en cada senda. La sonda utilizada se identifica en la Tabla 1.

Los resultados se muestran en la Figuras 1a y 1b.

La investigación del patrón de expresión de SBE II reveló que el gen solamente se expresó en el endosperma. Sin embargo el tiempo de expresión fue considerablemente distinto de aquel de SBE I, como se ilustra en las Figuras 1a y 1b.

La expresión del gen SBE I es detectable solo claramente a partir de la etapa media de desarrollo del endosperma (10 días después de la antesis), mientras que la expresión del gen SBE II se ve claramente mucho más temprano, en el tejido de endosperma a los 5-8 días después del desarrollo (Figuras 1a y 1b), correspondiente a una etapa inmadura del desarrollo del endosperma.

Ejemplo 8 Uso de sondas a partir de las secuencias SBE II para identificar los alelos nulos o alterados para utilizar en programas de reproducción

Los grupos del cebador de ADN se diseñaron para permitir la amplificación de los primeros 9 intrones del gen SBE II utilizando PCR. El diseño de los grupos del cebador se ilustra en la Figura 6. Los cebadores se basaron en la secuencia wSBE II-D1 (deducida a partir de la Figura 3b y Nair et al, 1997; No. de acceso Y11282) y se diseñaron de tal manera que las secuencias del intrón en la secuencia wSBE II se amplificaron por PCR. Estos grupos del cebador individualmente amplificaron los primeros 9 intrones de SBE II. Un cebador (sr913F) contuvo un marcador fluorescente en el terminal 5'. Continuando con la amplificación, los productos se metabolizaron con la enzima de restricción Ddel y se analizaron utilizando un Secuenciador de ADN ABI 377 con software de análisis de fragmentos Genescan^{TM}. Un grupo cebador, para el intrón 5, se encontró que amplifica los productos a partir de cada uno de los cromosomas 2A, 2B y 2D del trigo Esto se muestra en la Figura 7, que ilustra los resultados obtenidos con diversas líneas de trigo, y demuestra que los productos a partir de cada uno de los genomas del trigo de diversos trigos se amplificaron, y que por consiguiente, las líneas carentes del gen wSBEII sobre un cromosoma específico podrían ser fácilmente identificadas. La senda (iii) ilustra la identificación de la ausencia del gen wSBEII del genoma A, a partir de la línea ditelosómica 2AS del trigo hexaploide del cultivo Chinese Spring.

La Figura 8 compara los resultados de amplificación con un grupo cebador 10 del Intrón para diversas líneas nulisómica/tetrasómica del trigo hexaploide Chinese Spring. Los deoxinucleótidos dUTP fluorescentes se incluyeron en la reacción de amplificación. Después de la amplificación, los productos se metabolizaron con la enzima de restricción DdeI y se analizaron utilizando un Secuenciador de ADN ABI 377 con software de análisis de fragmentos Genescan^{TM}. En la senda (i) Chinese Spring línea ditelosómica 2AS, un producto base 300 está ausente; en la senda (ii) N2BT2A, un producto base 204 está ausente, y en la senda (iii) N2DT2B un producto base 191 está ausente. Estos resultados demostraron que la ausencia de genes específicos wSBEII en cada uno de los cromosomas del trigo se puede detectar por este ensayo. Las líneas carentes de las formas wSBEII se pueden utilizar como una línea parental para los programas de reproducción para la generación de nuevas líneas en las cuales la expresión de SBE II se disminuye o suprime, con el consiguiente incremento en el contenido de amilasa del grano de trigo. De esta manera, se puede producir un trigo con alta amilosa.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citadas en la descripción

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): APLICANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: COMMON WEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Limestone Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Campbell

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: ACT

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: AUSTRALIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2612

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: THE AUSTRALIAN NATIONAL UNIVERSITY

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: BRIAN LEWIS CRESCENT

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: ACTON

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: ACT

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: AUSTRALIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2601

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: GOODMAN FIELDER LIMITED

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: LEVEL 42, GROSVENOR PLACE

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: SYDNEY

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: NSW

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: AUSTRALIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: GROUPE LIMAGRAIN PACIFIC PTY LIMITED

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: LEVEL 31, 1 O'CONNELL CALLE

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: SYDNEY

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: NSW

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: AUSTRALIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2000

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TITLE OF INVENTION: REGULACIÓN DE EXPRESIÓN GÉNICA EN PLANTAS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA DE LECTURA DEL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0. Version #1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11463 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: triticum tauschii

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO DE TEJIDO: Endosperma

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: miscfeature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..11463

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN:/producto= "secuencia completa del gen de la enzima II de ramificación del almidón"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

6

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 768 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: triticum tauschii

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..768

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: Proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..768

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN:/producto= "secuencia de aminoácio deducida SBE II"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

10

11

12

Claims

1. Una secuencia de ácido nucleico aislada, que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta de cereales, en donde la enzima es una enzima II de ramificación del almidón del trigo, que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2.

2. Una secuencia de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia es una secuencia de ADN genómico o de cADN.

3. Una secuencia de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la secuencia es funcional en trigo.

4. Una secuencia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia se deriva de una especie Triticum.

5. Una secuencia de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la especie Triticum es Triticum tauschii.

6. Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, ligada operablemente a una o más secuencias de ácido nucleico que facilitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico en una planta.

7. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la secuencia de ácido nucleico también se liga operablemente a una o más secuencias dirigidas adicionales y/o una o más secuencias no-traducidas 3'.

8. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la secuencia de ácido nucleico está en la orientación sentido.

9. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la secuencia de ácido nucleico está en la orientación anti-sentido.

10. Una construcción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde la construcción es tanto un plásmido o un vector.

11. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el plásmido o el vector es apropiado para utilizar en la transformación de una planta.

12. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el vector es una bacteria del género Agrobacterium.

13. Una construcción de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el vector es el Agrobacterium tumefaciens.

14. Un método para modificar las características del almidón producido por una planta, que comprende la etapa de introducción de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta de cereales en una planta huésped, en donde la enzima es una enzima II de ramificación del almidón del trigo que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2.

15. Un método para modificar las características del almidón producido por una planta, que comprende la etapa de introducción de una secuencia de ácido nucleico antisentido dirigida a un gen que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta de cereales dentro de una planta huésped, en donde la enzima es una enzima II de ramificación del almidón del trigo que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde la planta es una planta de cereales.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la planta de cereales es el trigo o la cebada.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde una construcción de ácido nucleico que comprende dicha secuencia de ácido nucleico ligada operablemente a una secuencia promotor, se introduce en dicha planta huésped, en donde dicha secuencia promotor dirige la expresión de un gen al endosperma de una planta de cereales.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde una construcción de ácido nucleico que comprende dicha secuencia de ácido nucleico ligada operablemente a una secuencia promotor se introduce en dicha planta huésped, en donde dicha secuencia promotor modula el tiempo de expresión de un gen en el endosperma de una planta de cereales.

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20. Una planta transformada con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta de cereales, ligada operablemente a una o más secuencias de ácido nucleico que facilitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico en una planta, en donde la enzima es una enzima II de ramificación del almidón del trigo, que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2.

21. Una planta de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la secuencia de ácido nucleico en la citada construcción, está en la orientación sentido.

22. Una planta de acuerdo con la reivindicación 20, en donde la secuencia de ácido nucleico en la citada construcción, está en la orientación anti-sentido.

23. Una planta de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en donde la planta es una planta de cereales.

24. Una planta de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la planta de cereales es el trigo o la cebada.

25. Una planta de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la planta de cereales es el trigo.

26. Un método para identificar las variaciones en las características de síntesis del almidón de una planta de trigo, que comprende la etapa de identificación de una variación en la secuencia de ácido nucleico en las regiones intrón de un gen de la enzima II de ramificación del almidón del trigo, que codifica una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2.

27. Un método para identificar las variaciones en las características de síntesis del almidón de una planta de trigo, que comprende la etapa de detección de una mutación o ausencia de un gen de la enzima II de ramificación del almidón del trigo, que codifica una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2.

28. Un producto que comprende material vegetal que comprende una construcción de ácido nucleico, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta de cereales, ligada operablemente a una o más secuencias de ácido nucleico que facilitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico en una planta, en donde la enzima es una enzima II de ramificación del almidón del trigo que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ ID NO: 2.

29. Un producto de acuerdo con la reivindicación 28, en donde la secuencia de ácido nucleico en la citada construcción, está en la orientación sentido.

30. Un producto que comprende material vegetal que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico antisentido dirigida a un gen que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta de cereales, ligada operablemente a una o más secuencias de ácido nucleico que facilitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico antisentido en una planta, en donde la enzima es una enzima II de ramificación del almidón del trigo, que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en SEQID NO: 2.

31. Un producto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 en donde el producto es un producto alimenticio.

32. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, que además comprende la etapa de introducción de una secuencia anti-sentido de ácido nucleico dirigida a un gen que codifica una enzima de la ruta biosintética del almidón en una planta de cereales en dicha planta huésped.

33. Un método de acuerdo con la reivindicación 32, en donde la planta es una planta de cereales.

34. Un método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la planta de cereales es el trigo.

35. Un método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde la planta es el maíz, la cebada o el arroz.

36. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en donde la citada etapa de introducción de una secuencia de ácido nucleico en una planta huésped comprende la introducción de dicha secuencia de ácido nucleico en un protoplasto o embrión de planta inmadura de la planta y la regeneración de una planta a partir de dicho protoplasto o embrión de la planta inmadura.