CN111304216A

CN111304216A - 水稻低温萌发相关基因OsDJC58及其应用

Info

Publication number: CN111304216A
Application number: CN202010174103.5A
Authority: CN
Inventors: 肖武名; 王长龙; 罗立新; 郭涛; 王慧; 陈志强
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2040-03-13
Also published as: CN111304216B

Abstract

本发明公开了一种水稻低温萌发相关基因OsDJC58及其应用。本发明的OsDJC58基因受低温萌发诱导后表达量增加，敲除之后显著降低水稻低温萌发的萌发率和萌发指数。利用OsDJC58基因构建表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌，可有助于了解OsDJC58的作用机制，OsDJC58的克隆为进一步了解水稻低温萌发的遗传调控，抗逆信号传导通路奠定了基础，可用于培育低温萌发转基因水稻品种。本发明还提供了基因OsDJC58的分子标记检测引物和包含该引物的检测试剂盒，可通过检测基因表达量的变化，快速判定目标品种低温防御水平，选育低温萌发新品种。

Description

水稻低温萌发相关基因OsDJC58及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种水稻低温萌发相关基因OsDJC58及其应用。

背景技术

水稻(Oryza Sativa)是世界上重要的粮食作物之一，养活着全球半数以上的人口(Khush，2005)，也是我国近一半人口的主要食物来源(刘国权等，2004)。水稻直播栽培因具有省时省工、成本低、操作简便等特点，已成为一个重要的生产方式(赵丽萍等，2013)。欧洲、澳大利亚和美国等一些工业化国家由于劳动力缺乏和工资成本较高，主要是采用直播方法种植水稻。水稻主产区的东南亚地区，直播稻的种植面积近年来呈现不断增长的趋势。在我国，近年来随着人力成本的逐渐增加，直播稻因省工省力倍受广大农民朋友的青睐，在不少地区已成为水稻种植的优先选择(吴文革等，2006；齐国峰，2017)。

出苗率问题一直是直播稻产量不高不稳的首要问题，它直接影响群体的起点苗数，进而影响群体质量及调控技术(陈健，2003)。目前用于直播栽培的水稻品种往往不耐低温，特别是15℃以下的低温，会使水稻发芽率低、出苗不整齐，影响直播稻的产量。此外，在直播稻推广的亚热带及温带地区，由于播种季节(尤其是早季)常遇到低温、冷水灌溉等影响，容易导致直播稻出苗不齐、缺苗、烂苗等问题，给直播稻的高产稳产带来巨大障碍(李林芳，2012)。

已有研究表明，水稻种子低温萌发特性是由遗传因素控制的复杂性状。目前，已经有2个控制低温萌发的基因(qLTG3-1、OsSAP16)被报道。qLTG3-1位于3号染色体，包含一个外显子，编码一个由184个氨基酸组成的蛋白产物，包含GRP结构域和LTP结构域。前人研究发现qLTG3-1是通过调节种皮的糊粉层和覆盖胚芽鞘的上胚层的细胞液泡化，从而引起这些组织的松弛而提高种子在低温下的发芽势(Fujino,K.,et al，2008)，从而确定qLTG3-1控制水稻发芽期的低温耐受性。而OsSAP16则是首次通过GWAS(全基因组关联分析)分析鉴定出来的一个LTG基因，研究者对187个水稻自然种质的LTG进行了表型分析及GWAS，共发现53个数量性状位点(QTLs)与LTG相关，其中20个位于先前报道的QTLs上。进一步研究发现，编码锌指蛋白的Stress-Associated Protein16(OsSAP16)是主要LTG QTL之一的因果基因。OsSAP16的功能缺失降低了水稻种子的萌发率，而高表达OsSAP16则增强了低温条件下的萌发率。此外，具有极高和极低LTG值的水稻种质，低温条件下的OsSAP16表达水平对应为高和低，表明OsSAP16基因表达的变化有助于LTG变异。目前，对水稻低温萌发遗传调控机制的了解仍十分有限，热激蛋白参与调控水稻低温萌发的有关研究未见报道。

因此，开展水稻种子低温萌发的相关研究，克隆一些重要的低温萌发相关基因，在理论上有助于我们加深对水稻低温萌发机制的科学认识，在实践层面上有助于指导水稻育种，对解决直播稻低温出苗问题具有较大的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种水稻低温萌发相关基因OsDJC58。该基因编码的蛋白属于热激蛋白，受低温萌发诱导后表达量增加。该基因敲除之后显著降低了水稻低温萌发率和萌发指数。

本发明的另一目的在于提供上述基因的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种水稻低温萌发相关基因OsDJC58，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述的水稻低温萌发相关基因OsDJC58，其核苷酸序列为A和B中的一种：

A.如SEQ ID NO：2所示的cDNA序列；

B.如SEQ ID NO：3所示的基因组序列。

上述水稻低温萌发相关基因OsDJC58在提高水稻低温萌发率或低温萌发水稻育种中的应用。

本发明发明人在水稻种子低温萌发过程的差异转录组学分析发现了一个可被低温明显诱导的基因OsDJC58，该基因编码蛋白含有保守的DnaJ结构域，属于热激蛋白HSP(Heat Shocked Protein)家族的成员。

本发明涉及植物基因克隆以及功能分析，提供了一个提高水稻抗低温萌发率的新基因OsDJC58，该基因位于7号染色体上，基因座位号为LOC_Os07g09450(MSU登录号)，其全长基因组序列为3690bp，包括5′非翻译区(5′UTR)、3个外显子、2个内含子和3′非翻译区(3′UTR)(图1)；其cDNA全长339bp，编码112个氨基酸；OsDJC58编码的蛋白质序列存在DnaJ结构域。

一种针对上述水稻低温萌发相关基因OsDJC58的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。

上述针对水稻低温萌发相关基因OsDJC58的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在提高水稻低温萌发率或低温萌发水稻育种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明水稻低温萌发相关基因OsDJC58的应用是基于该基因受低温萌发诱导后表达量增加，敲除之后显著降低水稻低温萌发的萌发率和萌发指数。

将构建的OsDJC58基因敲除载体转化水稻，可以显著降低水稻萌发率和萌发指数。因此，利用OsDJC58基因构建表达载体、表达盒、转基因细胞系、宿主菌，可以为水稻低温萌发提供理论依据，可用于培育低温萌发转基因水稻品种。

一种水稻低温萌发相关基因OsDJC58的分子标记检测引物，包括SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的上游引物和下游引物。

上述分子标记检测引物在鉴别低温萌发的水稻品种中的应用，包括如下步骤：利用所述的分子标记检测引物对待检测的水稻品种的种质基因组DNA或者RNA进行扩增，通过基因表达量的变化判断目标品种。

一种水稻低温萌发相关基因OsDJC58的分子标记检测试剂盒，包括上述分子标记检测引物。

所述的水稻低温萌发相关基因OsDJC58的分子标记检测试剂盒，还包括PCR用酶、PCR用水和PCR用缓冲液中的至少一种。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明利用反转录PCR技术从水稻中克隆到了一个含DnaJ结构域蛋白的基因OsDJC58，证实了其在水稻低温防御中的作用，是一种重要的参与水稻抗逆性的基因。本发明有助于了解OsDJC58的作用机制，OsDJC58的克隆为进一步了解水稻低温萌发的遗传调控，抗逆信号传导通路奠定了基础。

2.本发明提供的OsDJC58基因在低温萌发转基因水稻品种培育中具有较大的应用价值。

3.本发明提供的基因OsDJC58的分子标记检测引物和包含该引物的检测试剂盒通过基因表达量的变化，快速判定目标品种低温防御水平，选育低温萌发新品种。

附图说明

图1为OsDJC58的基因组结构图。

图2为编码OsDJC58的氨基酸保守结构预测结果图。

图3为OsDJC58的系统进化分析图。

图4为OsDJC58基因在野生稻中对应编码序列比对图。

图5是与敲除载体PRGEB32相连接的序列结构图。

图6为OsDJC58敲除纯合突变体测序结果图。

图7为野生型与OsDJC58敲除纯合突变体ZH11-KO的低温萌发表型照片图。

图8为水稻品种ZH11及其OsDJC58基因敲除纯合突变体ZH11-KO的种子在15℃低温萌中不同时间段基因OsDJC58的表达量统计图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例中所使用的引物序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。中花11(ZH11)在文献“水稻花培新品种-中花11[J].作物品种资源,1989.”中公开。敲除载体pRGEB32在文献“Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with theendogenous tRNA-processing system.Proceedings of the National Academy ofSciences,2015.112(11):p.3570-3575.”中公开。

实施例1水稻OsDJC58基因的克隆以及序列分析

1)水稻总RNA的提取

取中花11(Zhonghua11，文献“水稻花培新品种-中花11[J].作物品种资源,1989.”中公开)四叶期水稻幼苗50mg，在陶瓷研钵中用液氮冷冻并研磨成粉状，转入1.5mL离心管，并按照每100mg材料加入1mL提取试剂的比例加入Trizol试剂(Invitrogen公司)，混合均匀；按照每100mg材料加入200μL氯仿的比例加入氯仿，混合均匀10000g，4℃离心15min，弃去中间层及下层有机相，收集上层水相转到新的离心管内；加入600μL异丙醇，混合均匀，室温静置20min，10000g，4℃离心15min，收集沉淀，待异丙醇挥发后溶于无RNA酶的超纯水中，-80℃冻存备用。

2)OsDJC58基因的克隆

A.第一链cDNA的合成

取出-80℃保存的水稻叶片总RNA，加入2μL的Oligo(dT)₁₆(10mM)，混匀后置于70℃中水浴5min；在冰上向EP管中先后加入dNTP Mixture(10mM)2μL、5×RT Buffer 4μL、RNase抑制剂1μL(10U/μL)、RNase-free ddH₂O 8μL、ReverTraAce 1μL；将EP管置于PCR仪中，按30℃、10min，42℃、60min，99℃、5min，40℃、5min反应后，得到第一链的单链cDNA，于-20℃冰箱保存。

B.cDNA的PCR

设计两条引物OsDJC58-F：5'-ATGGCTACACCACTCATAGCAGG-3'(SEQID NO:6)和OsDJC58-R：5'-TCAAAAGGCTGACCCCCC-3'(SEQ ID NO:7)。PCR反应体系为：cDNA模板1μL、上下游引物(10μM)各2μL、dNTP Mix(10mM each)1μL、2×phanta Max buffer 25μL(含有Mg² ⁺)、phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 1μL，补ddH₂O至50μL。扩增条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃、15s，72℃、50s、32个循环，72℃彻底延伸5min，得到OsDJC58的CDS(Coding sequence)序列，图1展示了该基因的结构。然后将其送往苏州金唯智公司进行测序分析。利用NCBI Blast Protein功能检测出OsDJC58氨基酸序列中含有一个保守的蛋白结构域，位于C端的DnaJ结构域(57～101aa)(图2)。利用WoLF PSORT对OsDJC58蛋白的定位区间进行预测，结果显示该蛋白主要定位在叶绿体和内质网中，这表明该蛋白极有可能参与光合作用和蛋白质的修饰与加工。而热激蛋白除了能够在逆境条件下抵御不良环境外，还通过作为分子伴侣参与细胞内蛋白的折叠、组装和转运功能。这正好与定位预测结果相一致。另外通过plantCARE对该基因的启动子区进行分析，发现在启动子区恰巧含有多个逆境响应元件，推测该基因很可能参与了逆境响应。通过对OsDJC58进行进化树及同源性分析，结果显示OsDJC58是进化保守的热激蛋白，仅仅在一些野生稻品种中有着相对高度的同源性，在其他物种中包括拟南芥、烟草、玉米等物种中同源性很低(图3)，对OsDJC58在一些野生稻品种中进行氨基酸保守结构域的序列分析，可以发现仅仅刚开始的几个氨基酸不同，其他所有序列基本都保持一致(图4)，进一步说明了OsDJC58是进化保守的热激蛋白。

实施例2水稻OsDJC58敲除载体的构建及转基因植株的获得

根据靶点设计原则，在CRISPR-GE网站设计靶点，得到最终的靶点序列(划横线部分为靶点)为F:5'-AGCAGGACTCACGGTTGCAG-3'(SEQ ID NO:8)和R:5'-TCGTCCTGAGTGCCAACGTC-3'(SEQ ID NO:9)。然后由公司直接合成与PRGEB32相连接的序列(SEQ ID NO:10)，其结构见图5。经FokI酶切之后，用同源重组片段扩增，所用引物为：

Cas9-TF-F:5'-TGTGCAGATGATCCGTGGCAACAAAGCACCAGTGGTCTA-3'

(SEQ ID NO:11)；

Cas9-TF-R:5'-GCTATTTCTAGCTCTAAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC-3'(SEQ IDNO:12)。

将扩增得到的片段连接到经BsaI酶切后的敲除载体PRGEB32(在文献“BoostingCRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processingsystem.Proceedings of the National Academy of Sciences,2015.112(11):p.3570-3575.”中公开)上相应位点中，连接方法按照诺唯赞同源重组试剂盒说明开展。连接产物进行PCR验证，所用引物为：

p32-F:5'-CATTACGCAATTGGACGAC-3'(SEQ ID NO:13)；

p32-R:5'-CAAGTTGATAACGGACTAGCC-3'(SEQ ID NO:14)。

连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。用引物SP1/SP2检测生长出的克隆中是否含有sgRNA表达盒连接片段，挑选含有目的条带的克隆进行测序分析。

SP1:5'-CCCGACATAGATGCAATAACTTC-3'(SEQ ID NO:15)；

SP2:5'-GCGCGGTGTCATCTATGTTA-3'(SEQ ID NO:16)。

以上所有引物序列均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。测序正确的通过热激法转化农杆菌EHA105(A.tumefaciens)，具体步骤参考Hiei等(1994)的方法利用农杆菌介导侵染水稻中花11的愈伤组织，经共抗性愈伤的预分化、分化及幼苗的生根壮苗后得到转基因植株。

实施例3敲除OsDJC58的低温萌发鉴定

将实施例2得到的转基因植株T₀代进行繁种，采用CTAB法提取T1代转基因植株的叶片基因组DNA(在文献“Murrray MG,Thompson WK.Rapid isolation of highmolecular-weight plant DNA.Nucleic Acids Research,1980,8:p.4321-4325.”中公开)，送去公司测序，测序引物为：

cas9-OsDJC58-F:5'-CTGAGTATTGCCCCATTTGAATCC-3'(SEQ ID NO:17)；

cas9-OsDJC58-R:5'-GTGGACAGACCTGCTAACATTTTC-3'(SEQ ID NO:18)。

得到纯合突变体，将纯合突变体ZH11-KO-1、ZH11-KO-2和野生型测序，纯合突变体和野生型的测序结果及峰图见图6。相比野生型，纯合突变体插入了一个碱基A。

挑取纯合突变体ZH11-KO-1、ZH11-KO-2、ZH11-KO-3和野生型进行水稻低温萌发(低温萌发实验过程为：经消毒的种子在适温(25℃)下浸种24h，然后放入垫有两层湿润滤纸的直径为9cm培养皿中，置于15℃的生长箱中进行低温处理。每份材料50粒种子，3次重复。以芽长≥1mm作为低温萌发标准，处理后每2d调查种子低温发芽率，直至第10d)，并统计结果。结果表明，中花11野生型低温萌发率较好，而纯合突变体ZH11-KO-1、ZH11-KO-2和ZH11-KO-3的种子低温萌发比较差，表现出较低的低温萌发率(图7)。

实施例4水稻种子低温萌发后OsDJC58表达趋势分析

利用定量RT-PCR技术对OsDJC58基因低温萌发后的表达模式进行了分析。在水稻品种ZH11(耐低温)及实施例3的纯合突变体ZH11-KO(为ZH11-KO-1和ZH11-KO-2和等量混合样品，不耐低温)的种子低温萌发(实验过程为：经消毒的种子在适温(25℃)下浸种24h，然后放入垫有两层湿润滤纸的直径为9cm培养皿中，置于15℃的生长箱中进行低温处理。每份材料50粒种子，3次重复。以芽长≥1mm作为低温萌发标准，处理后每2d调查种子低温发芽率。)后不同的时间点(0h、24h、48h、72h、96h、120h)采集叶片并提取其总RNA，利用反转录试剂盒ReverTraAce反转录合成cDNA第一条链。然后采用SYBR Premix ExTaq试剂盒结合ABStepOne Plus荧光定量PCR检测仪分析OsDJC58的表达量，Actin作为内参基因，所用引物为：

OsDJC58-RT-F：5'-CTACACCACTCATAGCAGGACTCAC-3'(SEQ ID NO:4)；

OsDJC58-RT-R：5'-GAAAGCCACCTTCATAGAATTTGCG-3'(SEQ ID NO:5)；

Actin-RT-F：5'-GAATGCTAAGCCAAGAGGAG-3'(SEQ ID NO:19)；

Actin-RT-R：5'-AATCACAAGTGAGAACCACAG-3'(SEQ ID NO:20)。

结果如图8所示，ZH11中OsDJC58的表达量在低温萌发后有所增加，24h达到峰值，随后表达量呈现缓慢降低的趋势；在ZH11-KO中，OsDJC58的表达量在低温萌发后明显降低，并没有呈现出明显的变化趋势。与ZH11-KO相比，ZH11中OsDJC58的表达量除了在96h时表达量没有显著差异外，在其他几个时间点都呈现出极显著差异。结果表明，低温萌发的过程中OsDJC58的表达很可能受到了低温调控。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 水稻低温萌发相关基因OsDJC58及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsDJC58的氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Thr Pro Leu Ile Ala Gly Leu Thr Val Ala Ala Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ala Gly Arg Tyr Ser Ile Gln Ala Trp Asn Ala Tyr Lys Ala Arg Pro

20 25 30

Val Val Pro Arg Met Arg Lys Phe Tyr Glu Gly Gly Phe Gln Pro Thr

35 40 45

Met Thr Arg Arg Glu Ala Gly Leu Ile Leu Gly Val Arg Glu Asn Ala

50 55 60

His Pro Glu Lys Val Lys Glu Ala His Lys Lys Val Met Val Ala Asn

65 70 75 80

His Pro Asp Ala Gly Gly Ser His Tyr Leu Ala Ser Lys Ile Asn Glu

85 90 95

Ala Lys Asp Ile Leu Leu Gly Lys Thr Lys Gly Gly Gly Ser Ala Phe

100 105 110

<210> 2

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsDJC58的cDNA序列

<400> 2

atggctacac cactcatagc aggactcacg gttgcagcgg cggcccttgc tggtagatat 60

agtatccaag cttggaatgc ttataaggca aggcctgtag ttcctaggat gcgcaaattc 120

tatgaaggtg gctttcaacc tacaatgact cgaagagaag ctggtttaat cctaggtgtc 180

agggaaaacg cccatcctga gaaggtaaaa gaggcgcata agaaggtcat ggttgctaac 240

catccagatg caggcggtag ccattacctt gcttcaaaga tcaatgaggc caaagatatt 300

ttgttaggga agacaaaagg aggggggtca gccttttga 339

<210> 3

<211> 3690

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsDJC58的基因组序列

<400> 3

actccgaagc agcacaagcc caagtagggt ttcctcgctc ccaccttcac ccacgaggtc 60

tccgacgccg ccgcggccgc cgacgacgac gactacctcc ggcgaccgcc ggggcggcct 120

tagcgccggg taccctgccg cctccgcgta gccgagccct atcgcgtacc cgtccctctc 180

gcgcctagtg cgccgggctg gccggtggcg gagtaccgga aatggtgatc tcttctccct 240

ctcagagatt ccagctttgg ttagtggctc gtgtgtcgtt tgcatgtgct aagattggat 300

tgagtttttg tttgagcaat cccatccgta gggtaaggga accaggtgca gctatagagg 360

gaattttcca ggtgttgcac tgattgctaa tgtgaaatgt tgagcaattt tggagtcagg 420

ggtgtgtgtg gtagatgtaa gattgggaac tttgttggta aatctgttat tattccgatt 480

gaaagttaaa gctcagatta ctctgctctg tggatttgtt gagccagttg cttatctggg 540

acttcggtaa tccaattaga gtagaacttg gtgggcatag tcaatctgca cgaattgtta 600

ctaatgatca tggaaacatc ttagtataac ttacatcatt tctcatcctc ctattactat 660

tggtatgaaa ttacattttg ggtgcattca ctgcatggtt ttaagtatta atcagcgggt 720

tgtccgaaac taagaatgag tgtaaattgg cattggtttg atttatgttt gcaatgcagc 780

ggcagttttc taatgaccgt gttgttttcg gttatttttg tagttcgcaa aacaatttcc 840

tattgtcttc tccatgcatc ctaccagttt gtgcttattt actttctagc ttctggataa 900

ttttatgatc tctaaatgtt tgatttcagt ttaatgcatg aatacagagt gccaataaca 960

aagtagaggc caaaaatgga tgcgcaacac gacaaagtta gttataaagt tatagcgatt 1020

taatacttcc atatttaatt tctgcaggct acaccactca tagcaggact cacggttgca 1080

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gtagttccta ggatgcgcaa attctatgaa ggtggctttc aacctacaat gactcgaaga 1200

gaagctggtt taatcctagg tgtcaggtaa atatcatata gaagcatagt agtatctgta 1260

gtacagtcaa tgaatcttta atgtttatat ttgtattagc acaaatctac tcatatatct 1320

agcttcaccc catccccatg tcattgatat tttgttgaac tgatgcactc atactcatga 1380

acttttcctg atccctgccc ccctcttaac tcatagtaag attccaccca tcccaagcct 1440

ccaatttgtt ggccagatcc tcataaacaa tggaagtaca catttcacag aaatgtaggg 1500

agttaaggac tgtaaggccg atgcagtaaa atctgtgaga tgcttgtttt ctgtatgggg 1560

agatattgtt gaacatcatt gaggggtact cattaaactt ctaaaataga cacaggattc 1620

atagctgtaa ttttactgta atgaacacat catagaacac agctagttgc aaagaaaaca 1680

actcttccct tcccaaatac aaatagttct gtagctctcg atgtttatgt attagacatg 1740

tcataaaagt atagttttag aagctgaaca tgatcattct atcattttag atgtaagcct 1800

gccaatgggt ctaaatccaa tccaaaacca atccaaccca acacctgccg aggcagccca 1860

ccaaaccaat ccacaccatt ttcccattta taagatccaa cccaaaccaa cccacaagca 1920

cttccaggcc aaactaaccc aaaccattcc agcctagtgg gttcaaccca ttttatatcc 1980

atgggttcag tccacgtaca gtccaatctt catcaattgt caccactcgc catcgggagg 2040

aaaggtccag gacgccgccg cgttcgcaaa gatcgagcag ctcgttcccc tttccctccc 2100

tctcccttcg ctttctctct tccttcctag ggcttcccct cctcggcggc gcttcacatc 2160

agcggcgggg gcaagttcgg ggacatgctg atcgaggagg agttggtcgt ccacgacgtg 2220

gtggtcggtg tcgggctgag cggcgaccgc ggcggcggtg gcgggacggc ggcggaggcg 2280

gaggcggagg cgcggcttgg ccttgtcgtc gtcgtcaaca acggcgacgg cggcgtggtg 2340

gtggagcggc attgggcggt tctagaaggt tctagaaggg ggagggcgct gctacgacta 2400

cgagctctga tatgaatctg cgtcttaagt gtgctttcta gcttgtgtgt gtgtgtgtct 2460

aagcttgctt tgggcttaag ctttggttaa gcttcacaca cacttcgctg gctgctgctg 2520

ctgggtttgg ctttgtactg atcactgtat tcagaggcca ttagtgcaat ccactcgtat 2580

ccatgggttg aatccatggt tacaatccat tttggaccat aaagaattgt aaccacatcc 2640

aaaccaaccc acaccgtttt tcaatgaatc caaaccgctc cagtccattc tgagtattgc 2700

cccatttgaa tccaaccaaa gccagtccat ttagaaatcc aacccattcc acccatttac 2760

atccagtcca ttagcaggct tatttagatg gattagtgga atagatggat cagtcttgca 2820

tttcacccat actatgtggg gcaaaaagta ctgagctact ggtaacagtg cacctaactc 2880

ccattaacta acctatctac caagagtcaa ttgaaatttc cctggtaaat tagctccttt 2940

gcaatgatat gctttctttt tagtatgctt tctccattga tacagaaagg aattgttatc 3000

agaggcgtag ttttctattc ttgagagaga caaatatgtg ttctgtcaaa tgtactcttt 3060

tagcacctat agtttgaatt aagtcctgtg tttgtccctc caaagttgaa cacttcagat 3120

cagtcattcc tgcatttgtg aagtcccttt ttttaattca acagttttta tttggtaact 3180

tgcaatttga gatttattta cgtttctttc tttcattaag ttgttgttcc tttcctcctt 3240

tgatccctgc agggaaaacg cccatcctga gaaggtaaaa gaggcgcata agaaggtcat 3300

ggttgctaac catccagatg caggcggtag ccattacctt gcttcaaaga tcaatgaggc 3360

caaagatatt ttgttaggga agacaaaagg aggggggtca gccttttgat tattacaata 3420

ataatgcacc atatgttctt tcaatgaaat ggtgaatttt ggtatctgta gtctgaggac 3480

ttgaaaggta ggcttaaatc ttgatgcgtg actagaaatt tatggacaga aaatgttagc 3540

aggtctgtcc actgtttgac atttcagtgc ccggtcgtgt tcgctcaact ggttatcgaa 3600

taactgatat acatggaaat ggtaatacct gtacgatgta tcatatctct attagacctg 3660

ttgcattttg gtagctcttc ggtggacttg 3690

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsDJC58-RT-F

<400> 4

ctacaccact catagcagga ctcac 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsDJC58-RT-R

<400> 5

gaaagccacc ttcatagaat ttgcg 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsDJC58-F

<400> 6

atggctacac cactcatagc agg 23

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OsDJC58-R

<400> 7

tcaaaaggct gacccccc 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶点序列F

<400> 8

agcaggactc acggttgcag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶点序列R

<400> 9

tcgtcctgag tgccaacgtc 20

<210> 10

<211> 226

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 与PRGEB32相连接的序列

<400> 10

caaaggatgg gcagtctggg caacaaagca ccagtggtct agtggtagaa tagtaccctg 60

ccacggtaca gacccgggtt cgattcccgg ctggtgcagt tgcagcggcg gcccttgcgt 120

tttagagcta gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg 180

caccgagtcg gtgctttttt ttttgtttgc tgtcgctcat ccgttt 226

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cas9-TF-F

<400> 11

tgtgcagatg atccgtggca acaaagcacc agtggtcta 39

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Cas9-TF-R

<400> 12

gctatttcta gctctaaaac aaaaaaaaaa gcaccgactc ggtgcc 46

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> p32-F

<400> 13

cattacgcaa ttggacgac 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> p32-R

<400> 14

caagttgata acggactagc c 21

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SP1

<400> 15

cccgacatag atgcaataac ttc 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SP2

<400> 16

gcgcggtgtc atctatgtta 20

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cas9- OsDJC58-F

<400> 17

ctgagtattg ccccatttga atcc 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> cas9- OsDJC58-R

<400> 18

gtggacagac ctgctaacat tttc 24

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Actin-RT-F

<400> 19

gaatgctaag ccaagaggag 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Actin-RT-R

<400> 20

aatcacaagt gagaaccaca g 21

Claims

1.一种水稻低温萌发相关基因OsDJC58，其特征在于，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的水稻低温萌发相关基因OsDJC58，其特征在于，其核苷酸序列为A和B中的一种：

A.如SEQ ID NO：2所示的cDNA序列；

B.如SEQ ID NO：3所示的基因组序列。

3.权利要求1或2所述的水稻低温萌发相关基因OsDJC58在提高水稻低温萌发率或低温萌发水稻育种中的应用。

4.一种针对权利要求1或2所述的水稻低温萌发相关基因OsDJC58的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。

5.权利要求4所述的针对水稻低温萌发相关基因OsDJC58的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在提高水稻低温萌发率或低温萌发水稻育种中的应用。

6.一种水稻低温萌发相关基因OsDJC58的分子标记检测引物，其特征在于包括SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示的上游引物和下游引物。

7.权利要求6所述的分子标记检测引物在鉴别低温萌发的水稻品种中的应用，其特征在于包括如下步骤：利用所述的分子标记检测引物对待检测的水稻品种的种质基因组DNA或者RNA进行扩增，通过基因表达量的变化判断目标品种。

8.一种水稻低温萌发相关基因OsDJC58的分子标记检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求6所述的分子标记检测引物。

9.根据权利要求8所述的水稻低温萌发相关基因OsDJC58的分子标记检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR用酶、PCR用水和PCR用缓冲液中的至少一种。