CN114214454A - 水稻低温萌发基因ctg6的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了水稻低温萌发基因CTG6的分子标记及其应用，该分子标记的正向引物序列为：TTGAAATTTGAGATGAAAAGTTGA(SEQ ID No.1所示)，反向引物序列为：CATTGGATGGCTAGCTCCTT(SEQ ID No.2所示)。利用本发明的分子标记在水稻生长早期或在苗床上对低温萌发的基因CTG6进行选择，选择效率大大提高，同时能够缩短选择周期。

Description

水稻低温萌发基因CTG6的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种水稻低温萌发基因CTG6的分子标记及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是喜温作物，起源于热带、亚热带，相较小麦、大麦等其他谷类作物，水稻对低温更加敏感。华南双季稻区早稻直播和东北高寒稻区的单季稻直播往往会遇到春季低温天气，造成种子萌发不齐，缺苗断垄，导致严重减产。这就要求用于直播的水稻种子有较强的低温萌发力。而上述稻作区一直以育秧移栽为主，导致品种的低温萌发能力长期不作为育种目标，造成品种低温萌发基因大量丢失。致使许多高产、优质的水稻品种由于低温发芽力弱而不能用作直播稻，限制了直播稻的生产。解决水稻萌发期低温冷害的根本方法就是培育耐低温的水稻品种。
在水稻生长发育过程中开展耐低温基因的挖掘及其机制研究，为确保水稻正常生长发育提供了理论基础。QTL分析已经明确多个在营养生长和生殖生长过程中耐低温的QTLs，它们分布在12条染色体上(http://qtaro.abr.affrc.go.jp)。但是目前只有少数基因被克隆。目前，精细定位的水稻低温萌发QTL非常少，主要是qLTG3-1和OsSAP16，精细定位的区间分别为4.8kb和72.3kb。
现有的改良水稻萌发期耐低温能力的基因很少，已有的改良水稻萌发期耐低温性状专利CN111304216A水稻低温萌发相关基因OsDJC58及其应用，利用热激蛋白基因OsDJC58在多个逆境中能发挥作用，在萌发期低温处理时，该基因参与了种子低温萌发过程的启动，可以提高水稻萌发期的耐冷性。然而热激蛋白对植物逆境的调控不单单是正调控，可能同时存在负调控或者是其他复杂的调控关系。存在一定的不确定性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：一方面，提供一个新的水稻低温萌发基因及其分子标记，另一方面，提供了该分子标记在该基因的辅助育种中的应用。
本发明的技术方案为：水稻低温萌发基因CTG6的分子标记，该分子标记的正向引物序列为：TTGAAATTTGAGATGAAAAGTTGA(SEQ ID No.1所示)，反向引物序列为：CATTGGATGGCTAGCTCCTT(SEQ ID No.2所示)。
本发明的分子标记在水稻低温萌发基因CTG6的辅助育种中的应用。
具体地，以带有低温萌发基因CTG6的丽江新团黑谷或其衍生后代为亲本与待改良材料进行杂交，采用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的分子标记对杂交后代进行PCR扩增，扩增出241bp核苷酸片段的单株就是成功导入CTG6基因的材料，扩增出209bp核苷酸片段的单株为不带有CTG6基因的材料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
利用本发明的分子标记在水稻生长早期或在苗床上对低温萌发的基因CTG6进行选择，选择效率大大提高，同时能够缩短选择周期。
附图说明
图1是本发明实施例中CTG6分子标记的检测结果示意图；图中标记说明：M：分子标记标准；1：丽江新团黑谷；2：沈农265；3-10：萌发期耐冷F6代株系；11-17：萌发期不耐冷F6代株系。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
本发明中使用到的生物材料丽江新团黑谷和沈农265均为商品化种。
实施例1水稻萌发期耐冷基因CTG6的发现与分子标记定位
丽江新团黑谷是低温萌发能力极强的水稻品种，2004年7月在沈阳以丽江新团黑谷父本，以超级稻品种“沈农265”为母本进行杂交，2005—2013年分别在辽宁沈阳(2005—2006,2008—2009)、海南三亚(2010)和黑龙江哈尔滨(2011—2015)三地,利用单粒传法套袋自交11代获得包含144个株系的稳定遗传重组自交系群体，采用“滑动窗口”法构建了丽江新团黑谷和沈农265的重组自交系群体bin遗传图谱。对应的包含2828个bin标记的遗传连锁图谱，2018年，重组自交系在黑龙江省农业科学院民主水田种植，插秧规格13.3cm×30cm，水稻第6号染色体上鉴定到到一个稳定遗传的主效QTL，其增效等位基因来自于耐冷品种“丽江新团黑谷”，将其命名为CTG6(cold tolerance at germination)。
实施例2水稻CTG6基因型鉴别的共显性分子标记开发与验证
根据前期的定位结果，分别对丽江新团黑谷和沈农265的目标区域进行重测序比对分析，仅仅在LOC_Os06g01320基因发现了不同，我们将其命名为CTG6。利用PCR测序分析基因及其3kb的启动子区域，在启动子区域发现一个32kb的缺失和一个T-C的突变。在基因体中的第18个外显子上存在一个C-A的突变引起在LTH中苏氨酸代替天冬酰胺。利用primer3设计出1个与CTG6基因紧密连锁的共显性分子标记,该分子标记CTG6的正向引物序列为：TTGAAATTTGAGATGAAAAGTTGA(SEQ ID No.1所示)，反向引物序列为：CATTGGATGGCTAGCTCCTT(SEQ ID No.2所示)。将这个分子标记应用于丽江新团黑谷和沈农265的育种后代群体中进行PCR验证，利用CTAB的方法提取水稻基因组DNA，PCR扩增总体积15μL，包括DNA模板2.0μL、引物(10umol/L)各2.0μL，7.5μL的2×Mix混合体系，1.5μL ddH2O。扩增程序为：94℃4min,，55℃40s，72℃40s，35个循环，72℃10min，12℃保存。PCR扩増产物用3％的琼脂糖凝胶电泳检测。使用CTG6分子标记时，携带CTG6的后代材料能够扩增出241bp的条带，而不具有CTG6的后代能够扩增出209bp的条带。这些材料在15℃条件下处理6天，萌发率大于80％材料携带CTG6基因，而萌发率小于20％的材料不携带CTG6基因。进一步对重组自交系进行验证，发现这个分子标记与CTG6共分离。综上，这个分子标记可以用于鉴定待测材料是否在CTG6座位上含有丽江新团黑谷的萌发期耐冷等位基因。
实施例3水稻萌发期耐冷基因CTG6的分子育种应用
以含有CTG6基因的“丽江新团黑谷”或具有“丽江新团黑谷”萌发期耐冷血缘的育种材料为父本，需改良的品种做母本，对杂交后代或以需改良品种为轮回亲本的回交后代进行分子标记选择，实现水稻CTG6基因的辅助改良。其中，辅助选择的方法是：采用引物对CTG6以待测育种材料的基因组为DNA模版，能扩增出241bp核苷酸序列的单株就是成功导入CTG6基因的材料，不带有CTG6基因的材料扩增出209bp核苷酸序列。
具体步骤：根据丽江新团黑谷或其衍生后代的生育期，分批种植待改良品种。在抽穗开花期，以含有CTG6基因的品种为父本，需改良品种为母本进行杂交。所获杂交种再自交或回交，利用本发明的分子标记进行跟踪选择，直至育种材料稳定。
下面结合实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
以丽江新团黑谷为父本，沈农265为母本进行杂交，利用本发明的分子标记对高产、抗病的F2-F6代材料进行辅助选择，在F6代选择到10份材料含有CTG6基因的稳定品系，这些品系在使用标记CTG6时，能够扩增出241bp的条带，而不是209bp的条带，经测定这10份材料在15℃条件下处理6天后萌发率的均大于80％。
序列表
<110> 黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所
<120> 水稻低温萌发基因CTG6的分子标记及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgaaatttg agatgaaaag ttga 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cattggatgg ctagctcctt 20

Claims (3)

1.水稻低温萌发基因CTG6的分子标记，该分子标记的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述的分子标记在水稻低温萌发基因CTG6的辅助育种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以带有低温萌发基因CTG6的丽江新团黑谷或其衍生后代为亲本与待改良材料进行杂交，采用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的分子标记对杂交后代进行PCR扩增，扩增出241bp核苷酸片段的单株就是成功导入CTG6基因的材料，扩增出209bp核苷酸片段的单株为不带有CTG6基因的材料。
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