CN113462805B - 一种与大麦耐盐性相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与大麦耐盐性相关的SNP分子标记及其应用，该SNP分子标记的位点位于大麦二号染色体第63352292个碱基处；SNP碱基差异为G或T。本发明通过对大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量全基因组关联分析鉴定对耐盐性有提高作用的SNP位点，首次公开了一个与大麦盐胁迫下根部相对干物重及钠离子含量显著相关联的SNP分子标记，该分子标记检测准确高效、扩增方便稳定，可用于分子标记辅助选择，提高不同耐盐性大麦品种的鉴定效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，尤其涉及一种与大麦耐盐性相关的SNP分子标记及其应用。
背景技术
盐胁迫是制约作物生产和食品安全的主要环境因素之一。盐土中含有大量盐碱成分，具有不良理化性质，会抑制甚至伤害植物生长。据联合国粮农组织统计，全球盐碱地面积超过9亿公顷，约占土地总面积的7％，我国盐碱土总面积约3467×104hm2，高居世界第三，而目前已开垦种植的盐碱土面积仅为577×104hm2，不足1/5。此外，我国耕地中盐碱化面积达到920.9×104hm2，约占耕地总面积的6.62％。盐碱地作为我国重要的后备耕地资源，改善和利用盐碱地已成为弥补耕地面积减少，保障国家粮食安全的重要途径。大麦(Hordeum vulgare L.)是最耐盐的谷类作物，也是全球种植面积仅次于玉米、小麦和水稻的第四大谷类作物，可作为将作物生产转移到边缘盐碱地的重要原始材料。
盐碱土改良利用具有复杂性和多样性，目前盐碱地改良措施包括农业技术、农田水利、化学改良措施和生物改良措施等，而培育耐盐作物无疑是提高盐碱地利用率最有效的方法。植物的耐盐性是一种数量遗传性状，涉及复杂的信号转导与分子调控过程。全基因组关联分析(Genome wide association study,GWAS)是研究复杂数量性状与生理表型之间关系的有效工具，尤其在非生物胁迫方面。在过去的数十年中，GWAS在植物耐盐基因鉴定方面取得了颇具前景的进展。
因此，有必要开发可以快速、准确检测大麦耐盐性的分子标记，可用于指导标记辅助育种和作物基因改造。
发明内容
本发明的目的是提供了一种与大麦耐盐性相关的SNP分子标记，同时提供了该SNP分子标记在筛选大麦耐盐性方面的应用，该分子标记S2H_63352292，应用于筛选不同耐盐性的大麦种质材料，同时在大麦遗传育种领域可用于培育具有较强耐盐性的大麦新品种。
具体技术方案如下：
本发明提供了一种与大麦耐盐性相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点位于大麦二号染色体第63352292个碱基处；SNP碱基差异为G或T。
进一步地，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.3所示；即：TCTTGAGGGAAGTTGGAAAGGGTGACCCCAGCGGCGACAACCTCGGCAAAG(/T)TGAAAGAGATGACAATGGTCCTCCATGAAACCCTGAGGCTCTA。
进一步地，所述耐盐性的表征为大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量。
进一步地，本发明根据上述SNP位点设计了扩增引物，用于扩增所述SNP分子标记的引物对序列，如下所示：
上游引物F为：5’-TCTTGAGGGAAGTTGGAAAGGG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物R为：5’-TAGAGCCTCAGGGTTTCATGG-3’(SEQ ID NO.2)。
扩增产物为94bp，序列如SEQ ID NO.3所示，SNP位点位于所述扩增片段的第51bp处。
进一步地，本发明还提供了一种用于扩增所述SNP分子标记的引物对，序列如下所示：
上游引物F为：5’-TCTTGAGGGAAGTTGGAAAGGG-3’；
下游引物R为：5’-TAGAGCCTCAGGGTTTCATGG-3’。
利用上述引物对对不用大麦基因型进行PCR扩增并测序分析，可有效筛选不同耐盐性的大麦种质资源，具体为根部高相对干物重，高钠离子含量的大麦材料在该SNP位点上为G类型，而低相对干物重及钠离子含量的大麦材料为T类型。
本发明还提供了所述SNP分子标记以及所述引物对在大麦分子标记辅助育种中的应用。
本发明还提供了所述SNP分子标记以及所述引物对在筛选不同耐盐性的大麦种质资源中的应用。
具体的，所述应用包括以下步骤：
(1)提取大麦植株的基因组DNA；
(2)以步骤(1)所述基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增反应(使用Vazyme Rapid Taq Master Mix)；
(3)对扩增产物进行测序，从而进行基因分型和单倍型分析；
若SNP位点上的碱基为G类型，则该待测大麦植株为高耐盐性材料；若SNP位点上的碱基为T类型，则该待测大麦植株为低耐盐性材料。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过对大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量全基因组关联分析鉴定对耐盐性有提高作用的SNP位点，首次公开了一个与大麦盐胁迫下根部相对干物重及钠离子含量显著相关联的SNP分子标记，该分子标记检测准确高效、扩增方便稳定，可用于分子标记辅助选择，提高不同耐盐性大麦品种的鉴定效率。
附图说明
图1为实施例1中100份大麦材料根部相对干物重(a)及钠离子含量(b)GWAS单倍型分析的箱型图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的分子标记和应用进行详细说明，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明所使用的大麦材料可从浙江大学作物科学研究所得到。本发明所使用生化试剂均为市售。
实施例1
(1)供试材料
利用100份全球大麦微核心种质资源为材料，其中包含34份二棱大麦和66份六棱大麦。
(2)性状测定
用2％H2O2溶液对大麦种子进行消毒，并置于生长室的湿滤纸上发芽。种子发芽7天后，将幼苗移植到含有五分之一的Hoagland溶液(pH 6.0)的15L黑色塑料容器中，水培营养液每3天更换一次。于2019年秋季在浙江大学紫金港校区网室和温室(250μmol·m-2s-1日光灯，23℃14h/18℃10h)进行水培育苗及盐处理试验。
在幼苗成长14天时向水培溶液中加入100mM氯化钠，第二天再添加氯化钠至200mM并持续处理两周。用去离子水冲洗植株后取根部，用吸水纸轻轻晾干，在80℃烘箱中干燥3天后测定根部样品干重。在2ml 69％HNO3中消化干燥的根样品后采用ICP-OES/MS法测定消解液中Na+含量。相对干重＝处理干重/对照干重×100％。
(3)GWAS分析及SNP分子标记确定
结合上述测定的大麦根部相对干物质重、Na+含量和该群体的279515个SNP标记，采用TASSEL软件进行GWAS分析，结果显示位于二号染色体上的一个SNP标记与大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量显著关联，该SNP位于二号染色体的第63352292个碱基处，可在两个环境中重复检测，-LOG10(P)值均大于4(-LOG10(P)＝4.7)，所述SNP位点为碱基G/T的差异。
(4)单倍型分析
结合SNP标记与100份供试材料的根部相对干物质重、Na+含量表型数据进行单倍型分析，结果如图1所示。其中，SNP分型共分为两个组，深色为G型，浅色为T型，G型基因型大麦根部相对干物质重、Na+含量显著高于T型大麦基因型。
实施例2
(1)供试材料
利用12份全球大麦微核心种质资源为材料，分别进行盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量的测定及S2H_63352292-SNP目标区域的分析。具体如表1所示，包括6份高相对干物质重和钠含量材料及6份低相对干物质重和钠含量材料。
表1 12份不同耐盐性的大麦种质材料
| 大麦种质 | SNP检测结果 | Na+含量 | 相对干重 | 指标类型 |
| W37 | G | 59.70 | 0.71 | 高 |
| W91 | G | 59.29 | 0.75 | 高 |
| W86 | G | 55.46 | 0.50 | 高 |
| W54 | G | 55.42 | 0.50 | 高 |
| W80 | G | 54.57 | 0.76 | 高 |
| W70 | G | 50.40 | 0.85 | 高 |
| W81 | T | 27.13 | 0.18 | 低 |
| W69 | T | 22.68 | 0.44 | 低 |
| W36 | T | 13.79 | 0.30 | 低 |
| W39 | T | 28.32 | 0.47 | 低 |
| W63 | T | 32.14 | 0.40 | 低 |
| W44 | T | 35.89 | 0.33 | 低 |
(2)SNP标记的获得
根据上述SNP位点信息，结合大麦全基因组序列信息，开发SNP标记引物，上游引物F为：5’-TCTTGAGGGAAGTTGGAAAGGG-3’；下游引物R为：5’-TAGAGCCTCAGGGTTTCATGG-3’，扩增大小为94bp，所述SNP位于扩增片段的第51bp处，利用上述引物，对大麦二号染色体63352292处碱基的变异进行检测。
(3)DNA提取
以苗期新鲜叶片为材料，采用CTAB法提取DNA，详细步骤如下：
a)在2ml可立管内放入一大两小用75％乙醇清洗的钢珠并加入400μl CTAB提取缓冲液；
b)取大麦嫩叶5g左右放入可立管中，放入全自动磨样机中55HZ磨样1min后置于65℃水浴1h，每隔15min摇匀，水浴后置于室温冷却；
c)加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，并充分摇匀；经10000rpm离心10min，将上清液转入一个新的1.5ml离心管中；
d)加入上清液体积2/3预冷的异丙醇，缓慢上下摇匀30s使异丙醇与水层充分混合，在-20℃下静置20min以沉淀DNA；
e)12000rpm离心4min，弃去上清夜；加入400μl无水乙醇静置20min洗涤DNA；
f)10000rpm离心ddH2O溶解DNA，保存于-20℃待用。
(4)PCR
PCR扩增反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)25μl,10μmol/L PrimerF 1μl,10μmol/L Primer R 1μl,100ng/μl模板DNA 1μl,无菌水22μl,反应总量50μl。
在PCR仪上进行PCR反应,程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3s，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存。
(5)反应结束后将反应产物测序进行基因分型鉴定，结果显示SNP位点变异如表1所示。
以上结果说明我们制备的分子标记可以应用于大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量的分子标记辅助选择，以提高选择的准确度。
序列表
<110> 浙江大学中原研究院
<120> 一种与大麦耐盐性相关的SNP分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcttgaggga agttggaaag gg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagagcctca gggtttcatg g 21
<210> 3
<211> 94
<212> DNA
<213> 大麦(Hordeum vulgare L.)
<400> 3
tcttgaggga agttggaaag ggtgacccca gcggcgacaa cctcggcaaa ktgaaagaga 60
tgacaatggt cctccatgaa accctgaggc tcta 94
Claims (4)
1.一种与大麦耐盐性相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的序列如SEQID NO.3所示；SNP碱基差异为G或T；SNP位点位于序列SEQ ID NO.3的第51bp处。
2.如权利要求1所述的SNP分子标记在大麦分子标记辅助育种中的应用。
3.如权利要求1所述的SNP分子标记在筛选不同耐盐性的大麦种质资源中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取大麦植株的基因组DNA；
（2）以步骤（1）所述基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增反应；
所述引物对的序列，如下所示：
上游引物F为：5’- TCTTGAGGGAAGTTGGAAAGGG -3’；
下游引物R为：5’- TAGAGCCTCAGGGTTTCATGG -3’；
（3）对扩增产物进行测序，从而进行基因分型和单倍型分析；
若SNP位点上的碱基为G类型，则该待测大麦植株为高耐盐性材料；若SNP位点上的碱基为T类型，则该待测大麦植株为低耐盐性材料。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| CN106498058A (zh) * | 2016-10-27 | 2017-03-15 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 水稻耐盐基因及其紧密连锁分子标记的育种应用 |
| CN108411028A (zh) * | 2018-05-24 | 2018-08-17 | 湖北省农业科学院粮食作物研究所 | 水稻耐盐基因skc1基因内特异snp共显性分子标记引物及应用 |
| CN109371162A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-02-22 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 与水稻耐盐性相关的snp分子标记及其应用 |
-
2021
- 2021-08-05 CN CN202110895570.1A patent/CN113462805B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Association of SNP Haplotypes of HKT Family Genes with Salt Tolerance in Indian Wild Rice Germplasm;Shefali等;《RICE(N Y)》;第9卷(第1期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113462805A (zh) | 2021-10-01 |
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