CN113462806B - 与大麦耐盐能力相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与大麦耐盐能力相关的SNP分子标记及其应用，该SNP分子标记的位点位于大麦五号染色体第492426681个碱基处；SNP碱基差异为G或T。本发明通过对大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量全基因组关联分析鉴定对耐盐能力有提高作用的SNP位点，公开了一个与大麦盐胁迫下根部相对干物重及钠离子含量显著相关联的SNP分子标记，该分子标记检测准确高效、扩增方便稳定，可用于分子标记辅助选择，提高不同耐盐性大麦品种的鉴定效率。

Description

与大麦耐盐能力相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，尤其涉及一种与大麦耐盐能力相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

土壤盐渍化是限制全球作物生产的最主要非生物逆境之一。据估计，到2050年，由于全球气候变暖和不合理的耕作因素，将会有超过50％的耕地受到盐胁迫的影响，特别是在干旱和半干旱地区。中国盐碱地分布广泛，无法耕作或难以耕种的盐碱地总面积约5.5亿亩，其中具有农业利用前景的盐碱地总面积1.85亿亩，占我国耕地总面积10％以上，其中包括未治理改造的盐碱障碍耕地0.32亿亩，以及尚未利用和新形成的盐碱荒地1.53亿亩。对这些盐碱地合理改造利用可大幅提升农业生产能力，估计每年能够增加200亿斤以上的粮棉油产量，具有巨大的开发和治理利用潜力。

我国目前已形成诸多水利工程、生物、农艺、化学等盐碱地治理利用综合技术。事实上，通过生物技术改良培育耐盐作物是最为高效和环境友好的措施。但是，不同植物种间及种内不同基因型之间也存在显著的耐盐性差异，这是由于植物的耐盐性是一种数量遗传性状，涉及复杂的信号转导与分子调控通路。大麦(Hordeum vulgare L.)作为全球第四大禾谷类作物，其耐盐性显著强于水稻和普通小麦，具有广泛的适应性和丰富的抗逆资源，并且目前己完成全基因组测序精细图谱，已经作为研究作物耐盐机理及遗传改良的理想模式作物。

大量研究已经证实通过全基因组关联分析(Genome wide association study,GWAS)发掘与植物非生物胁迫相关的分子标记及候选基因是有效可靠的，并且这种技术手段已经成为研究复杂数量性状与生理表型之间关系的有力工具，可以为探究作物非生物胁迫分子调控机制提供有效参考。因此，通过GWAS等技术方法开发可靠的分子标记用于鉴定大麦种质耐盐性、分子标记辅助育种、耐盐作物精准育种是具有重要的意义和实践价值的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种与大麦耐盐能力相关的SNP分子标记，同时提供了该SNP分子标记在筛选大麦耐盐能力方面的应用，该分子标记S5H_492426681，应用于筛选耐盐性强的大麦种质材料，同时在大麦遗传育种领域可用于培育具有较强耐盐性的大麦新品种。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种与大麦耐盐能力相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记的位点位于大麦五号染色体第492426681个碱基处；SNP碱基差异为G或T。

进一步地，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO.3所示；

即:CGTGCTCGTCTGTCCCTTGTAGTAAACGACAAATGACAACAATTATTTGAT(/G)GCTATGTAAAGTCTTTGTACGATTTTTTTGTTGCTAACTTGTAAGAAGAAGGAATTAGTAGTGGGGAGTTTTCGTTTAGGT。

进一步地，所述耐盐能力的表征指标为大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量。

进一步地，本发明根据上述SNP位点设计了扩增引物，用于扩增所述SNP分子标记的引物对序列，如下所示：

上游引物F为：5’-CGTGCTCGTCTGTCCCTTG-3’(SEQ ID NO.1)；

下游引物R为：5’-TAGTGGGGAGTTTTCGTTTAGGT-3’(SEQ ID NO.2)。

扩增产物为132bp，序列如SEQ ID NO.3所示，SNP位点位于所述扩增片段的第52bp处。

进一步地，本发明还提供了一种用于扩增所述SNP分子标记的引物对，序列如下所示：

上游引物F为：5’-CGTGCTCGTCTGTCCCTTG-3’；

下游引物R为：5’-TAGTGGGGAGTTTTCGTTTAGGT-3’。

利用上述引物对对不用大麦基因型进行PCR扩增并测序分析，可有效筛选不同耐盐能力的大麦种质资源，具体为根部高相对干物重，高钠离子含量的大麦材料在该SNP位点上为T类型，而低相对干物重及钠离子含量的大麦材料为G类型。

本发明还提供了所述SNP分子标记以及所述引物对在大麦分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了所述SNP分子标记以及所述引物对在筛选耐盐能力强的大麦种质资源中的应用。

具体的，所述应用包括以下步骤：

(1)提取大麦植株的基因组DNA；

(2)以步骤(1)所述基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增反应(使用Vazyme Rapid Taq Master Mix)；

(3)对扩增产物进行测序，从而进行基因分型和单倍型分析；

若SNP位点上的碱基为T类型，则该待测大麦植株为耐盐能力强的材料；若SNP位点上的碱基为G类型，则该待测大麦植株为耐盐能力弱的材料。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过对大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量全基因组关联分析鉴定对耐盐性有提高作用的SNP位点，首次公开了一个与大麦盐胁迫下根部相对干物重及钠离子含量显著相关联的SNP分子标记S5H_492426681，该分子标记检测准确高效、扩增方便稳定，可用于分子标记辅助选择，提高不同耐盐性大麦品种的鉴定效率。

附图说明

图1为实施例1中100份大麦材料根部相对干物重(a)及钠离子含量(b)GWAS单倍型分析的箱型图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的分子标记和应用进行详细说明，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所使用的大麦材料可从浙江大学作物科学研究所得到。本发明所使用生化试剂均为市售。

实施例1

(1)供试材料

利用100份全球大麦微核心种质资源为材料，其中包含34份二棱大麦和66份六棱大麦。

(2)性状测定

用2％H₂O₂溶液对大麦种子进行消毒，并置于生长室的湿滤纸上发芽。种子发芽7天后，将幼苗移植到含有五分之一的Hoagland溶液(pH 6.0)的15L黑色塑料容器中，水培营养液每3天更换一次。于2019年秋季在浙江大学紫金港校区网室和温室(250μmol·m^-2s^-1日光灯，23℃14h/18℃10h)进行水培育苗及盐处理试验。

在幼苗成长14天时向水培溶液中加入100mM氯化钠，第二天再添加氯化钠至200mM并持续处理两周。用去离子水冲洗植株后取根部，用吸水纸轻轻晾干，在80℃烘箱中干燥3天后测定根部样品干重。在2ml 69％HNO₃中消化干燥的根样品后采用ICP-OES/MS法测定消解液中Na⁺含量。相对干重＝处理干重/对照干重×100％。

(3)GWAS分析及SNP分子标记确定

结合上述测定的大麦根部相对干物质重、Na⁺含量和该群体的12564个SNP标记，采用TASSEL软件进行GWAS分析，结果显示位于五号染色体上的一个SNP标记与大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量显著关联，该SNP位于五号染色体的第492426681个碱基处，可在两个环境中重复检测，-LOG10(P)值均大于4，所述SNP位点为碱基G/T的差异。

(4)单倍型分析

结合SNP标记与100份供试材料的根部相对干物质重、Na⁺含量表型数据进行单倍型分析，结果如图1所示。其中，SNP分型共分为两个组，深色为G型，浅色为T型，T型基因型大麦根部相对干物质重、Na⁺含量显著高于G型大麦基因型。

实施例2

(1)供试材料

利用14份全球大麦微核心种质资源为材料，分别进行盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量的测定及S5H_492426681目标区域的分析。具体如表1所示，包括7份高相对干物质重和钠含量材料及7份低相对干物质重和钠含量材料。

表1 14份不同耐盐性的大麦种质材料

大麦种质	SNP检测结果	Na+含量	相对干重	指标类型
					W37	T	59.71	0.71	高
W91	T	59.29	0.76	高
					W61	T	55.10	0.98	高
W53	T	54.03	0.72	高
					W70	T	50.41	0.85	高
W67	T	46.82	0.46	高
					W33	T	39.92	0.47	高
W44	G	35.89	0.34	低
					W81	G	27.14	0.18	低
W27	G	28.23	0.27	低
					W35	G	30.34	0.27	低
W97	G	34.21	0.22	低
					W16	G	36.84	0.15	低
W22	G	36.08	0.20	低

(2)SNP标记的获得

根据上述SNP位点信息，结合大麦全基因组序列信息，开发SNP标记引物，上游引物F为：5’-CGTGCTCGTCTGTCCCTTG-3’；下游引物R为：5’-TAGTGGGGAGTTTTCGTTTAGGT-3’，扩增大小为132bp，所述SNP位于扩增片段的第52bp处，利用上述引物，对大麦五号染色体492426681处碱基的变异进行检测。

(3)DNA提取

以苗期新鲜叶片为材料，采用CTAB法提取DNA，详细步骤如下：

a)在2ml可立管内放入一大两小用75％乙醇清洗的钢珠并加入400μl CTAB提取缓冲液；

b)取大麦嫩叶5g左右放入可立管中，放入全自动磨样机中55HZ磨样1min后置于65℃水浴1h，每隔15min摇匀，水浴后置于室温冷却；

c)加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，并充分摇匀；经10000rpm离心10min，将上清液转入一个新的1.5ml离心管中；

d)加入上清液体积2/3预冷的异丙醇，缓慢上下摇匀30s使异丙醇与水层充分混合，在-20℃下静置20min以沉淀DNA；

e)12000rpm离心4min，弃去上清夜；加入400μl无水乙醇静置20min洗涤DNA；

f)10000rpm离心ddH₂O溶解DNA，保存于-20℃待用。

(4)PCR

PCR扩增反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)25μl,10μmol/LPrimerF 1μl,10μmol/L Primer R 1μl,100ng/μl模板DNA 1μl,无菌水22μl,反应总量50μl。

在PCR仪上进行PCR反应,程序如下：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸3s，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存。

(5)反应结束后将反应产物测序进行基因分型鉴定，结果显示SNP位点变异如表1所示。

以上结果说明我们制备的分子标记可以应用于大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量的分子标记辅助选择，以提高选择的准确度。

序列表

<110> 浙江大学中原研究院

<120> 与大麦耐盐能力相关的SNP分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgctcgtc tgtcccttg 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagtggggag ttttcgttta ggt 23

<210> 3

<211> 132

<212> DNA

<213> 大麦(Hordeum vulgare L.)

<400> 3

cgtgctcgtc tgtcccttgt agtaaacgac aaatgacaac aattatttga kgctatgtaa 60

agtctttgta cgattttttt gttgctaact tgtaagaaga aggaattagt agtggggagt 120

tttcgtttag gt 132

Claims (7)

1.与大麦耐盐能力相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的位点位于大麦五号染色体第492426681个碱基处；SNP碱基差异为G或T；所述SNP分子标记的序列如SEQID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的与大麦耐盐能力相关的SNP分子标记，其特征在于，所述耐盐能力的表征为大麦盐胁迫下根部相对干物质重和钠含量。

3.如权利要求1所述的与大麦耐盐能力相关的SNP分子标记，其特征在于，用于扩增所述SNP分子标记的引物对序列，如下所示：

上游引物F为：5’- CGTGCTCGTCTGTCCCTTG -3’；

下游引物R为：5’- TAGTGGGGAGTTTTCGTTTAGGT -3’;

扩增产物为132bp，序列如SEQ ID NO.3所示，SNP位点位于所述扩增片段的第52bp处。

4.一种用于扩增权利要求1所述SNP分子标记的引物对，其特征在于，序列如下所示：

上游引物F为：5’- CGTGCTCGTCTGTCCCTTG -3’；

下游引物R为：5’- TAGTGGGGAGTTTTCGTTTAGGT -3’。

5.如权利要求4所述的引物对在大麦分子标记辅助育种中的应用，其特征在于，所述应用为大麦品种耐盐性鉴定。

6.如权利要求4所述的引物对在筛选耐盐能力强的大麦种质资源中的应用。

7.如权利要求6所述的权利要求4所述引物对在筛选耐盐能力强的大麦种质资源中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取大麦植株的基因组DNA；

（2）以步骤（1）所述基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增反应；

（3）对扩增产物进行测序，从而进行基因分型和单倍型分析；

若SNP位点上的碱基为T类型，则该待测大麦植株为耐盐能力强的材料；若SNP位点上的碱基为G类型，则该待测大麦植株为耐盐能力弱的材料。

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