CN112626080A

CN112626080A - 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的r基因及其蛋白质和应用

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Publication number: CN112626080A
Application number: CN202011537197.4A
Authority: CN
Inventors: 王学路; 张豹; 李友国
Original assignee: Huazhong Agricultural University; Henan University
Current assignee: Huazhong Agricultural University; Henan University
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2040-12-23
Also published as: WO2022135246A1; CN112626080B; US20240182918A1

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及新基因的应用，特别是指一种控制大豆‑根瘤菌匹配性的R基因及其蛋白质和应用。本发明公开的基因GmNNL1在大豆品系横峰乌豆中的GmNNL1基因组序列为SEQ ID NO.2所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。大豆的R基因GmNNL1是一个可以调控特定根瘤菌在大豆上结瘤数量的有效基因，它可以通过直接识别慢生型根瘤菌特定效应蛋白NopP的单倍型来调控结瘤数量，限制土著根瘤菌的共生结瘤，使得大豆优先与人为施加的高效根瘤菌剂结瘤，并且能够提高共生固氮能力。

Description

一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因及其蛋白质和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及新基因的应用，特别是指一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因及其蛋白质和应用。

背景技术

栽培大豆[Glycine max(L.)Merr]起源于我国，是世界上重要的粮食、饲料、油料和能源作物，传统“五谷”之一，是人们日常饮食中重要的组成部分(Palander et al.,2005)。同时，随着我国经济的发展和人口激增对粮食需求的压力，我国在粮食生产中大量施用化肥，其中以氮肥最甚。根据世界粮农组织FAO的统计，我国2002年到2014年间每年的氮肥使用量不断上升；我国耕地面积虽仅占全世界的8％，但氮肥使用量却达到了全世界使用总量的35％(http://faostat.fao.org/)。氮肥的过度施用和养分流失，导致了严重的水体富营养化污染；同时也影响了土壤有机质组成，降低了生物活性，导致土壤板结。固氮微生物能够利用其自身合成的固氮酶将大气中的氮气还原成可被植物直接利用的氨，即生物固氮。大豆和根瘤菌共生固氮既减少能源消耗(工业氮肥生产耗能多)，又能很好地在改良土壤，是提高豆科作物氮效率的重要途径。在全球生态系统中，豆科植物通过共生固氮方式的固氮量占生物固氮量的60％-70％。在农业系统中，大豆占据豆类共生固氮86％的绝对性优势，每年产氮量达1644万吨(Herridge 2008)；所以利用大豆和根瘤菌建立的共生固氮体系，对农业生产及绿色可持续农业的发展具有重要意义。

大豆与根瘤菌之间存在匹配性。同一株根瘤菌在不同的大豆品系上，或不同的根瘤菌在同一个大豆品系上的结瘤和固氮特性存在较大差别。选择匹配性好，共生固氮能力强的豆科植物-根瘤菌组合，才能更好发挥共生固氮的优良效应。能筛选到具有广谱匹配性能的根瘤菌，则更易于推广使用。例如慢生型大豆根瘤菌USDA110虽是国际公认的高效广谱的根瘤菌，能够在一些大豆品系上较好地结瘤固氮，但在一些大豆品系上仍然只具有较低的共生固氮能力。我国根瘤菌分布具有明显的地理分布特征。在我国的不同地区分布着不同种类的根瘤菌。田长富等发现在我国东北地区和华南地区，慢生型根瘤菌占比到达100％和 99.6％；而在碱性土壤的黄淮海地区，慢生型根瘤菌占比30％，快生型根瘤菌70％；而在新疆半干旱的碱性土壤地区，慢生型根瘤菌和快生型根瘤菌各占约50％(Tian et al.,2012)。已有研究表明，人为接种根瘤菌可显著提高豆科作物的共生固氮能力，促进根系的生长并提高作物产量(Ferreira et al.,2009)。在美国和巴西等大豆主产国，接种大豆匹配性根瘤菌做为大豆“减肥”增产的重要措施之一，被大面积推广和应用 (Mendes et al.,2003；Sogut 2006；de Freitas et al.,2012)。我国接种根瘤菌的面积相对较小，但是也取得了良好的效益(汤复跃等2011)。黑龙江海龙市率先在大豆种植区接种根瘤菌达80％，亩增产10％以上。但近十几年来，我国大豆接种根瘤菌接种总面积没有提高，反而减少，根瘤菌接种面积不到大豆种植面积的3％，与国际上相差甚远。这其中一个重要原因在于根瘤菌菌剂在田间的竞争结瘤能力弱于土著根瘤菌。大豆起源于我国，大豆主产区的土壤中一般都存在着大量的适应性和结瘤能力强，但固氮能力低下的土著性根瘤菌(伍恵，2004；孙传瑞，2004)，影响了人工根瘤菌菌剂的结瘤和效力发挥。因此，限制土壤中土著根瘤菌与大豆的结瘤，对于接种的高效根瘤菌的效力发挥具有重要意义。然而，关于如何让大豆限制土著根瘤菌，而优先与人为施加的高效根瘤菌菌剂结瘤的研究和技术发明尚未见报道。

发明内容

本发明提出一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因及其蛋白质和应用，解决了大豆与根瘤菌匹配性的调控、以及如何利用大豆与根瘤菌的匹配性来提高大豆固氮能力，进而提高大豆对氮元素的利用率的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因，所述基因序列如SEQ ID NO.2或如SEQ ID NO.2经过修饰后的核苷酸序列所示。进一步，所述修饰包括转座子的插入、碱基的缺失或增加或CRISPR-Cas9修饰。所述R基因的序列还可以如SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。

用于鉴定上述R基因的功能标记引物对GmSINE1-F/R，所述GmSINE1-F序列如SEQID NO.9所示， GmSINE1-R序列如SEQ ID NO.10所示。所述功能标记引物对GmSINE1-F/R在用于扩增序列如SEQ ID NO.2的R基因时扩增的条带为443bp，在用于扩增序列如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的R基因时扩增条带为622bp。

上述的R基因编码的蛋白质。进一步，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。该基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述的R基因或其编码的蛋白质在改良大豆及大豆-根瘤菌组合，减弱和限制土著根瘤菌在大豆上的结瘤，增强大豆与根瘤菌菌剂匹配性、增强共生固氮能力中的应用。

上述的R基因和其启动子在改良豆科作物共生固氮中的应用。进一步，其步骤为：构建包含有序列如 SEQ ID NO.2所示的R基因和序列如SEQ ID NO.1所示的启动子的过表达载体或R基因的RNAi载体，通过农杆菌介导转化，然后筛选转基因阳性植株进行培养，接种根瘤菌菌剂，继续培养，完成增强大豆共生固氮能力的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本申请的大豆R基因GmNNL1通过栽培大豆共生固氮表型的全基因组关联分析方法获得，利用遗传群体验证、大豆毛根瞬时转化体系、稳定转基因植株以及HR反应鉴定实验等成功地进行了分离、克隆和验证。大豆的R基因GmNNL1是一个可以调控特定根瘤菌在大豆上结瘤数量的有效基因，它可以通过直接识别慢生型根瘤菌特定效应蛋白NopP的单倍型来调控结瘤数量，可限制土著根瘤菌的共生结瘤，使得大豆优先与人为施加的高效根瘤菌剂结瘤，并且能够提高共生固氮能力。对R基因精细调控大豆-根瘤菌匹配性进而提高作物地上部分生物量的分子机制并不清楚，该基因揭示了其参与抑制根毛侵染调控结瘤进而影响地上部分生物量的分子机制。

2、本申请的具有功能型R基因的GmNNL1^HT1单倍型的大豆能够限制了土壤中分布广泛的带有 NopP^{USDA110/USDA6}单倍型的慢生型根瘤菌在其上的结瘤，但是不能限制其他根瘤菌在其上的结瘤；具有非功能型R基因的GmNNL1^HT2-HT6单倍型(编码的TIR-NBS-LRR蛋白结构不完整)不能够限制根瘤菌在其上的结瘤。通过GmNNL1基因启动子(SEQ ID.NO：1所示序列)驱动GmNNL1基因在大豆植株中超量表达可达减少特定根瘤菌的结瘤数量，从而使其与接种的高效大豆根瘤菌菌剂更好地结瘤，提高大豆的共生固氮能力；另外也可将有功能的GmNNL1基因进行RNAi或者敲除，使转基因大豆能与土著根瘤菌结瘤，提高共生固氮能力(尽管效率低)。

3、GmNNL1-NopP识别关系的打破可增加单株的瘤数，提高作物根瘤数量、重量和植株地上部分生物量；发明人的研究将为包括大豆在内的豆科植物的氮高效和分子育种提供基因资源，为大豆-根瘤菌的组合利用及应用提供分子改造技术，从而服务于环境友好型的绿色可持续农业的发展。

附图说明

图1为各个大豆GmNNL1单倍型的蛋白结构示意图。

图2为各个大豆GmNNL1单倍型的单株根瘤数量比较分析。

图3为GmNNL1^HT1单倍型大豆品系的单株固氮酶活(a)和地上部分生物量(b)与GmNNL1^HT2-HT6单倍型大豆品系的比较分析。

图4为不同GmNNL1单倍型的大豆品系接种USDA110及其效应蛋白基因nopP基因突变菌株 USDA110ΔnopP后根瘤数量表现。

图5为GmNNL1^HT1能够识别NopP^USDA110从而在烟草叶片中引起HR反应，而GmNNL1^HT2不能。

图6为大豆pGmNNL1::GmNNL1稳定转基因株系的根瘤数量(a)表达量分析和表达量(b)分析。

图7为RNAi-GmNNL1转基因大豆与转空载体转基因大豆的毛根根瘤数量比较分析。

图8为RNAi-GmNNL1转基因大豆毛根根瘤中GmNNL1基因表达水平。

图9为不同NopP单倍型根瘤菌在我国的分布。

图10为不同GmNNL1单倍型的大豆接种不同NopP单倍型根瘤菌的根瘤数量的表现。

图11为GmNNL1^HT1能够识别NopP^{USDA110/USDA6}(而不能识别NopP^USDA122),从而在烟草叶片中引起HR 反应。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本申请构建栽培大豆核心种质，是通过全基因组关联分析的方法，鉴定到大豆中一个能够同时影响大豆根瘤数量、单株固氮酶活和地上部分生物量的R基因，GmNNL1。通过单倍型分析，发现GmNNL1的6 种主要的单倍型中，只有GmNNL1^HT1(序列如SEQ ID No.1所示)可以正常的编码成一个完整的 TIR-NBS-LRR的典型R蛋白，其他的5种单倍型(序列如SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示)均因一个转座子GmSINE1的插入或单个碱基的缺失导致了非完整的蛋白形式(图1)。通过单倍型分析发现，具有GmNNL1^HT1单倍型大豆的根瘤数量显著低于其他单倍型(图 2)，通过比较R蛋白结构完整形式的GmNNL1^HT1和非完整形式的GmNNL1^HT2-HT6，发现具有GmNNL1^HT1单倍型大豆的单株固氮酶活和地上部分鲜重均显著低于具有GmNNL1^HT2-HT6单倍型的大豆(图3)。

在研究中我们发现，GmNNL1^HT1是识别了根瘤菌中的效应蛋白NopP。利用USDA110及其nopP基因突变菌株USDA110ΔnopP,分别接种带有GmNNL1^HT1的大豆品系和带有GmNNL1(具有GmSINE1转座子插入)单倍型的大豆品系，结果发现，相较于接种野生型菌株USDA110,USDA110ΔnopP能够在带有 GmNNL1^HT1的大豆品系上结更多的根瘤，而在具有GmNNL1^HT2-HT6的品系上结瘤数量减少或无显著变化 (图4)。

在N.benthamiana瞬时注射单独转入NopP^USDA110、NopT1(作为正对照，已报道能在烟草中引起HR 类的细胞死亡)、GmNNL1^HT1、GmNNL1^HT2，共转NopP^USDA110和GmNNL1^HT1，以及共转NopP^USDA110和 GmNNL1^HT2。7天后发现NopP^USDA110与GmNNL1^HT1共转在烟草叶片中引起强烈的HR类的细胞死亡，而 NopP^USDA110、GmNNL1^HT1、GmNNL1^HT2单独转化以及NopP^USDA110与GmNNL1^HT2共转并没有引起强烈的细胞死亡(图5)，说明GmNNL1^HT1能够识别NopP^USDA110并引起HR反应。

我们得到具体的大豆-根瘤菌匹配性关系为：具有功能型R基因的GmNNL1^HT1单倍型的大豆能够限制带有NopP^USDA110单倍型的慢生型根瘤菌在其上的结瘤，但是不能限制根瘤菌在其上的结瘤；具有非功能型R基因的GmNNL1^HT2-HT6单倍型(编码的TIR-NBS-LRR蛋白结构不完整)不能够限制根瘤菌在其上的结瘤。序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的5种单倍型，由于不能编码成一个完整的TIR-NBS-LRR的典型R蛋白，因此并不能或不完全能发挥R蛋白的功能。

实施例2

GmNNL1的基因序列利用下述方法得到：

反应体系的总体积为50μl，模板为大豆品系横峰乌豆基因组DNA 1μL(约50ng)、10×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL₂ 2μl、5mM dNTP 5μl、5uM引物5μl(引物NNL1-F和NNL1-R，每条引物均为2.5μl)、 1μl KOD酶，加ddH₂O(无菌去离子水)至50μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃1min、68℃ 3.5min 35cycles，68℃延伸10min。引物为：NNL1-F:ATGGCACACAGAACAGCACCATCT；NNL1-R: TCATTTAACAACATAGTACAAAC；最终获得包含有SEQ IDNO.2所述核苷酸的基因序列，该基因编码的蛋白质为SEQ ID NO.3所示。

本发明的保护内容还包括SEQ ID NO.3所示氨基酸序列对应的核苷酸序列，还包括SEQ ID NO.3所示序列经过改造修饰的具有相同功能的蛋白。

实施例3

GmNNL1基因在调控大豆-根瘤菌匹配性进而影响大豆共生固氮效率方面的应用，应用过程如下：

将从HFWD中克隆的GmNNL1的启动子和全长CDS克隆到pUB-GFP上，转入Williams82(WS82， GmNNL1^HT2)中，所获得的转基因系中接种USDA110后，GmNNL1^HT1的表达量越高，根瘤数量越少(图 6)。因此可通过该方法减少特定种类根瘤菌的结瘤。具体过程为：

(1)所述的GmNNL1启动子区通过以下方式获得：

反应体系的总体积为50μl，模板为横峰乌豆基因组DNA 1μl(约50ng)、1×KOD酶反应缓冲液5μl、25mM MgCL₂ 2μl、5mM dNTP 5μl、5uM引物5μl(引物pNNL1-F和pNNL1-R分别2.5μl)、1μl KOD酶，加 ddH₂O(无菌去离子水)至50μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃1min、68℃2min 35cycles， 68℃延伸10min。所用引物如下：pNNL1-F:TCGTTCCCTCTCATGTGTTCGA；pNNL1-R： GATTTAGGAACTTCAGAAAT。最终获得含有SEQ.ID.No.1所示的GmNNL1基因启动子区域。

(2)植物表达载体pGmNNL1::GmNNL1的构建

首先从横峰乌豆基因组中将GmNNL1的启动子区和基因区一起扩增出来，并将片段连接到pUB-GFP 载体上，获得植物表达载体pUB-pGmNNL1::GmNNL1，转入Williams82(WS82)中。

所用引物如下：NNL1-aF:CAGTGCCAAGCTGGGCTGCAGTCGTTCCCTCTCATGTGTTCGA；

NNL1-aR:GTCCTTATAGTCCATGGTACCTTTAACAACATAGTACAAACAACT；

(3)大豆遗传转化

本研究中大豆转化均采用农杆菌EHA105介导的大豆子叶节转化法，主要参考前人报道的转化方法 (Luth et al 2015)，并在此基础上作了改进。

1)大豆种子灭菌及萌发

①种子灭菌：挑取无破损、无病斑的大豆用氯气灭菌(量取100ml次氯酸钠置入250ml烧杯中，沿杯壁缓缓加入5ml浓盐酸，密封灭菌16小时)。

②种子萌发：将灭过菌的大豆种放置于萌发培养基中，置于22℃培养箱中暗培养16-24小时使其萌发。

2)农杆菌的活化和侵染液的制备

取250μl冻存的菌液涂布于相应抗生素的LB平板上，28℃培养过夜。用一次性接种环刮取菌膜，垂悬于液体共培养基里，用分光光度计测定菌液浓度，使终浓度OD₆₀₀＝0.5～0.6。

3)外植体准备和侵染

保留3～5mm长的下胚轴，分离两片子叶，去除种皮，切除初生芽后，用刀片在子叶节部位划几刀，得到用于转化的子叶节外植体。将其置于侵染液中，于水平旋转仪上振荡(转速50～80r/min)侵染30min。

4)共培养

倒掉菌液，将外植体转移至铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，每皿15～20个，22℃培养箱中暗培养3～5天。

5)筛选培养和植株再生

①芽诱导培养：共培养3～5天之后，将外植体转移至芽诱导培养基中，每皿放5个外植体，光周期16/8 小时(光照/黑暗)、25℃条件下培养，每2周继代一次，继代2次。

②芽伸长培养：除去死芽，切掉子叶部分，将外植体转移至芽伸长培养基中，每皿放5个外植体，光周期16/8小时(光照/黑暗)、25℃条件下培养，每3周继代一次，继代2～4次。

③生根诱导：当伸长苗长至3cm长之后，切下转移至根诱导培养基中，光周期16/8小时(光照/黑暗)、 25℃条件下培养。

6)炼苗及移栽培养

①当再生植株生根并长出两片以上复叶后，取出植株，洗净根部的培养基，栽入盛有灭菌蛭石的小花盆中，在人工智能培养箱(温度25℃，光周期16/8小时，相对湿度85％RH，光照强度90μM/m²/s)炼苗 5～7天。

②待壮苗之后将其移栽到大花盆(营养土：蛭石＝1:1)中，移至培养室(温度28±2℃，光周期13.5/10.5h，相对湿度40％～60％RH，光照强度90μM/m²/s)中生长至成熟。

7)在T1代对植株进行鉴定

取T1代转基因大豆植株的叶片提取DNA，利用GmNNL1^HT1基因的功能型标记GmSINE1-F/R对T1 代的全部植株进行PCR扩增并电泳。能扩增出GmNNL1^HT1特异的443bp条带的单株即为转基因成功植株。

所用引物如下：GmSINE1-F:GAAAGTCGTTGGTTTGGCAA；

GmSINE1-R:CCATGAGCACGTAGCACTGA。

注：本发明的保护内容还包括GmNNL1^HT1的功能标记GmSINE1-F/R。GmSINE1-F/R作为GmNNL1^HT1的功能标记，在具有GmNNL1^HT1的品系基因组DNA中可以扩增出443bp的片段；在具有GmNNL1^HT2-HT6的大豆品系基因组中可以扩增出622bp的片段；可用于GmNNL1单倍型的鉴定和分子标记辅助选择。

(4)转基因植株GmNNL1^HT1表达量鉴定和表型分析

接种根瘤菌USDA110后25天后，对转基因植株的根瘤数量进行考察，同时利用RealTime qRT-PCR 的方法对根瘤中的GmNNL1^HT1的基因表达量进行分析。所用引物如下：GmNNL1^HT1_qF1:GAATGTAATTCTGCATTGGA；GmNNL1^HT1_qR1:CACCACAAGTATTGAAGAAACA 实施例4

GmNNL1基因干扰载体的构建及应用：将大豆品系横峰乌豆(HFWD,GmNNL1^HT1)、小青豆 (XQD,GmNNL1^HT1)、Williams82(WS82,GmNNL1^HT2)和天隆一号(TL1，GmNNL1^HT2)，中的GmNNL1 基因在毛根转化系统中进行RNAi，所获得的转基因毛根接种USDA110后，在HFWD和XQD的毛根中， GmNNL1^HT1的表达量降低后，根瘤数量变多；而在WS82和TL1的毛根中，GmNNL1^HT2的表达量降低后，根瘤数量无显著变化(图7和图8)。

(1)植物表达载体RNAi-GmNNL1的构建：从横峰乌豆中扩增出GmNNL1基因的296bp(+2804～ +3099bp)的片段，利用AscI/SwaI和AvrII/BamHI酶切位点进行酶切，并将其连接到RNAi载体pG2RNAi2 上，构建pG2RNAi2-GmNNL1(GmNNL1-RNAi)重组载体。

所用引物如下：2R-RNAi-F:CGCCTAGGGGCGCGCCAGGAAATGCGGAAGGCTTCA

2R-RNAi-R:CGGGATCCATTTAAATCTCTGCTCCCATCCTTGCTT

(2)发根农杆菌K599介导的大豆毛根转化

1)大豆种子灭菌及萌发

①种子灭菌。挑取无破损、无病斑的大豆用氯气灭菌(量取100ml次氯酸钠置入250ml烧杯中，沿杯壁缓缓加入5ml浓盐酸，密封灭菌16小时)。

②种子萌发。将灭过菌的大豆种播种于灭过菌的石英砂中，放置于在大豆人工气候室中培养4～5天，生长至子叶竖起，与下胚轴约成直角状态。

2)带有目标重组载体的发根农杆菌的准备

将重组质粒导入到发根农杆菌K599，得到工程菌；将工程菌在液体培养基中活化，取500μl工程菌菌液涂板，28℃培养约2～3天，生成“菌膜”。

3)侵染

①萌发第5天(即暗培养3天，光培养2天后)，取出大豆，在下胚轴“绿白交界处”沿45°斜切。

②用大豆下胚轴切口在工程菌菌板上蘸取工程菌；将侵染后的大豆放入无氮固体培养基中暗处共培养 2天培养。

③将植株转入有氮培养基的方皿，下胚轴遮光培养6天。

4)毛根培养

将植株取出，去除切面愈伤组织处长出的根后，将植株放入到有氮液体培养基中培养9～10天。

5)转基因阳性根鉴定和筛选

①取出植株，吸水纸吸干其根上的水，在体式荧光显微镜下检测阳性根，具有GFP绿色荧光的为阳性根；仅留下最粗壮的单一阳性根，其余剪除；将具有单一阳性根的植株继续放入有氮FM培养基中培养4～5 天，然后移至土壤中进行培养接菌。

(3)转基因植株毛根GmNNL1表达量鉴定和表型分析。

接种根瘤菌USDA110后25天后，对转基因植株毛根的根瘤数量进行考察，同时利用Real Time qRT-PCR 的方法对根瘤中的GmNNL1的基因表达量进行分析。

所用引物如下：GmNNL1^HT1_qF1/qR1用于对HFWD和XQD，GmNNL1^HT2_qF1/qR1用于对WS82和 TL1转基因毛根中的GmNNL1基因表达量检测。

GmNNL1^HT1_qF1:GAATGTAATTCTGCATTGGA；

GmNNL1^HT1_qR1:CACCACAAGTATTGAAGAAACA；

GmNNL1^HT2_qF1:GAGCCCTGGTGCAGCGGTAAAGTTGT；

GmNNL1^HT2_qR1:GGCTCTTCGCTATGCGAAGGTATGAGGGA。

实施例5

(1)通过对我国不同区域的154株土著根瘤菌NopP单倍型进行检测，在我国主要鉴定到3种NopP 单倍型，其中144株(占总检测根瘤菌的93.50％)具有NopP^USDA110；5株(占总检测根瘤菌的3.25％) 具有NopP^USDA6以及5株(占总检测根瘤菌的3.25％)具有NopP^USDA122；并且发现NopP^USDA110是分布最广的根瘤菌类型(图9)。

(2)通过不同GmNNL1单倍型的大豆接种不同NopP单倍型的根瘤菌的结瘤表现如图10所示，结果发现：具有功能型R基因的GmNNL1^HT1单倍型的大豆能够限制带有NopP^USDA110 ^/USDA6单倍型的土著慢生型根瘤菌在其上的结瘤，但是不能限制其他根瘤菌在其上的结瘤；具有非功能型R基因的GmNNL1^HT2-HT6单倍型(TIR-NBS-LRR的结构不完整)不能够限制根瘤菌在其上的结瘤。

具体为：大豆材料的选择。本研究中选取了10个大豆材料。其中5个大豆材料带有功能型的 GmNNL1^HT1，分别为L279、L283、L887、L909和L935；另外5个大豆材料的GmNNL1中是具有GmSINE1 转座子的非功能形式，L851、L115、L613、L545和L203。

根瘤菌材料的选择。本研究中选取了5株大豆根瘤菌，分别为USDA110(NopP^USDA110)、 GXD3(NopP^USDA122)、SN2-5(NopP^USDA122)、NW5-3(NopP^USDA6)和USDA38(NopP^USDA6)。

(3)在N.benthamiana瞬时注射单独转入NopP^USDA110、NopP^USDA6、NopP^USDA122、GmNNL1^HT1、共转 GmNNL1^HT1和NopP^USDA110、共转GmNNL1^HT1和NopP^USDA6、以及共转GmNNL1^HT1和NopP^USDA122。7 天后发现共转GmNNL1^HT1和NopP^USDA110以及共转GmNNL1^HT1和NopP^USDA6能在在烟草叶片中引起强烈的HR类的细胞死亡，而其他转染并没有引起强烈的细胞死亡(图11)，说明GmNNL1^HT1能够识别NopP ^{USDA110/USDA6}并引起HR反应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 河南大学，华中农业大学

<120> 一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因及其蛋白质和应用

<160> 10

<210> 1

<211> 2017

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 1

tcgttccctc tcatgtgttc gacgatttga aaaaaagaat aagaaggagc atgctaaagg 60

aaaggaaata tgatcctaaa atgtattcat gaaattgata caaaatcaaa ttgcaacaac 120

attaatttat tggaaggaaa tgaaatttgt gaaattgaaa aaaaaaaaat caagtcacat 180

gtgctgaagg aaggagcaac gagatactag taggatagtg gttactagga aattatatat 240

gaaattttac acctaaggac taaatattaa tagaatatga gattatattt ttattggaaa 300

taaaatatat ctagaattaa tttttttatc ttgtattctc aaaaataatt aaatattccg 360

tgaaataaat actcctatct caatttcttt gcctccccat ttttttatta taaagtttga 420

gacaaataaa tgaaattgac ataatacact taaatgaaga ctatcattta tttttccaaa 480

accatagaaa ttgaaggaat ggagaggatt tttttccatg aaccgtatgt aaagtttttg 540

cataacgaat gggcgaaaat gagttacgta tatgtttgta tttaatttga gttgagtggt 600

gatgtatcga taacataaaa taattttata tattcattta attataaatt attatttata 660

taacttttaa ataattatca cacatgatac attaatatta tgattggaaa cgatataaat 720

tattttacac tggcagtctg ttttttattt ttttattata aataataaga ctccaaaaaa 780

tagtaataat taagctttat attttccaaa ttaagttata gttaaataca aaagaaatca 840

ttaataatta ggctttatat gctccatctt aaaatacaca ataataataa aaaattgcac 900

aaagtaaact aatacagttt tgaaatttaa atgtatgact aattaggttg cgtatgctcg 960

ataacttaaa gctttgattg agttccaaaa aagattatga tttatcttaa agagatcaca 1020

gttgcagcag tacaatttca tacctgaaaa ttcagaggaa tatttgctat tctgattgga 1080

gtaacattct aaaaattact aacaacattg gagaagaaaa cataaaaaaa ttactaacaa 1140

catataaaga aattactagc aacatataaa aatattagat atattagata gggtacaagg 1200

gatactcaac ctttctacag aaaacaaaaa aacctgttct gcaccattcc actgaccaat 1260

taaatctgat aaaccttttc ctataaataa taaacacacc ttagtactcc tacataattc 1320

cttcaaacac tccatgggat acattgacca ttcataaaaa gaaaaggaaa aagacttcat 1380

tctcctatta gaccatcata tccacgatct atacttgatc aaatcagaaa cacattcaaa 1440

gttaggactg tcattattga aaacaatttt atttctatgt aaccatagag tgaccattcg 1500

catatggtct ctttgttttt gctagggagc aaaattattt tctgtaacgt ttccttttgg 1560

cttaagcttt attttttttg gattttatca aggtcgactc ttgatctttg attccaagct 1620

tagttagata taacctcttt gtccgttttg gattgctatt ttatgtcttg tatcttcatg 1680

gattcctctt aaatttctga tgtttcttat atatatacaa gggttagagt attcctttta 1740

cttctgattt gaatcccatg ttaataaatt ttttttgcct gcaaaaaaag tcaacaaaga 1800

aagtaggaca cttctcacat ttaccccttc tttcgaacca aaagcaatga taagtaaatc 1860

acaaaacaaa taaacaacta acacaaacaa caaccttgca acttcttggt atataaatac 1920

ttgctaattc ctccttactg atcacaaact tgttttactg caaacataag ttgtcttcca 1980

agtttctttg tgtttatatt tctgaagttc ctaaatc 2017

<210> 2

<211> 3578

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 2

atggcacaca gaacagcacc atcttggtct accttcacac ttaaatggat ttatgatgtc 60

ttcctcagtt ttagaggtga agacactcgt caaaaattca ctggcaatct ctacaattct 120

ctgtgtgaaa agggagttca tactttcatt gatgatgaag ggcttagaag aggggaagaa 180

attacaccag ctcttctcaa tgccattcaa aattcaagga ttgccattgt tgttttctct 240

aagaactatg catcctcaac tttttgtttg gatgaacttg tcaagatcct tgagtgcttg 300

aaggaagaaa aaggtcgatc agtttttcca atattttatg atgtggatcc atcacatgtt 360

cggcatcaga aagggactta ttcagaagca ttggcaaaac atgaagaaag gttcccagat 420

gacagtgaca aagtgcaaaa atggaggaag gctttatatg aagcagccaa tctatcaggc 480

tggcatttcc aacatgggta ttctatactt cctttttatt gtatgtgtta taaactgatc 540

tctttttaca tttgcctaat aattttcata ttaattactc acaaagaaag aaagcatagt 600

aaatcacatt gatctatctt gaacggtgaa atttaagaaa tggagacaat aaatttatga 660

gattaattct gattgaaatg agtaaactaa acacaaattt gaagctttag tttcaattca 720

catgttttat acaatgggca gggagctaga atataagtcc atccgaaaaa ttgttaaaga 780

ggtctataaa aggattagtt gcattccttt acacattgct gataatccaa ttgggctaga 840

gcatgcagtg ctagaagtga aatctctcct tggacatggt tctgatgtca acattatagg 900

aatttatggt attggtggta tcggtaaaac cacaatttct cgtgccgtgt ataacttgat 960

ttgtagtcaa tttgaaggca catgttttct ccctgacatt agagaaaagg caatcaataa 1020

gcaaggtctt gtccaactcc aagaaatgtt actttctgaa gtactcaaga agaaacatat 1080

caaagtgggt gatgttaaca gaggaattcc aataataaaa aggaggcttg aaaaaaagaa 1140

ggttcttctg gttttagatg atgttgacaa attagagcag ttaaaggttc ttgcaggaga 1200

aagtcgttgg tttggcaatg gaagtataat cattatcacc acaagagaca aacacttgct 1260

agcgactcat ggggtggtaa aaatatatga tgttaaacca ttaaatgttg caaaggctct 1320

tgaattgttt aactggtgtg cctttaaaaa tcataaagct gatccacttt atgtgaatat 1380

tgctaaccgt gcagtttctt atgcgtgtgg cattccattg gctctggaag tgataggttc 1440

tcatttattt ggaaaaagtt tgaatgaatg taattctgca ttggataaat atgaaagaat 1500

tcctcatgaa aagatccatg aaatacttaa agtaagctat gatggtttgg aagaaaatga 1560

gaagcaaatt ttccttgaca ttgcttgttt cttcaatact tgtggtgtgg gctacgtcac 1620

atcagtgcta cgtgctcatg gttttcatgt aaaagatggt ttgagagtgt tggttgacag 1680

atctctctta aagattgatg cttctggttg tgtgagaatg catgatctaa ttcgagacac 1740

aggcagagaa attgtaaggc aagaatcaac agttgagcct ggcagacgta gtaggttatg 1800

gtttgaagag gacattgttc atgttttgga agaaaatacg gtatgttaga aattacgaac 1860

atctctatgc tatttctttg cttttcattc ctttattaaa ataacaattt tactgaatac 1920

atgataaatt ttgggattct ttcccctgtt atctatttaa tttttatatg atgatgagat 1980

tgctaatgtg cacatttttg tggctaaatt gtgctttggg catggaaggg aactgataaa 2040

atagaattca taaagcttga agggtacaac aacatacaag tgcaatggaa tggaaaagcc 2100

ttgaaggaga tgaagaacct gaggattttg attattgaaa atacaacctt ttctacaggc 2160

cccgagcatc tgccaaatag tttgagagtg ctagattgga gttgctaccc ttcaccatct 2220

ttgcctgctg atttcaatcc taaacgagtt gagctactcc ttatgcctga aagttgcctt 2280

caaatcttcc aaccatacaa tgtatgtatc agtttcgaag ttattatttt taacatgaat 2340

ttctacttta aaaaaaaaaa aaaaaacacg cacctcacac acaacttgag tcattgtctt 2400

ttaatttgca gatgtttgaa tcattgtctg tgttaagcat tgaagattgc cagttcttaa 2460

cagatctacc aagcctaaga gaagtaccac ttttagcata tttgtgtatt gataattgca 2520

ccaatttggt taaaattgat ggttcaattg gctttcttga taagctccaa ctcttgagtg 2580

ctaaacggtg tagcaagcta aaaattctag caccctgcgt catgttgcca tctcttgaaa 2640

ttttggacct tcgggggtgc acatgtcttg atagcttccc ggaagtattg ggaaagatgg 2700

agaacataaa agaaatatat ttagacgaga cagccataga gacactgcca tgttcaattg 2760

gaaattttgt tgggcttcaa cttttgtccc tgaggaaatg cggaaggctt catcagctac 2820

caggtagtat atgtatattg ccgaaagtta aagtgatttt cggttttggg catgtggtat 2880

atcgattttg ggaagagaac caatatgaac aagagttgag cttagaagtg tctccaaggt 2940

ccatggttgt tgttgatggt gacctggatt ttacatatat tgacatgtat tatccacaca 3000

taagtccaaa taatgtcatc caagtatgca gtcctaatct gctcttgcat catgatttca 3060

ttttgttgtt caaaaagctt gcaagcaagg atgggagcag aggcaggaaa tcgtcaatgc 3120

atttctcgtt tcgaaacaaa ttccccaaga ttgcggtatg ttgttctgta ttgcctagtt 3180

tgaaaattac catgatattg attttgaagt tgggcgtact catcaacggc actaagatat 3240

ttagttcatc atgtaactac ttatttacac aaacatggaa cccaaaactt tggtgtgatc 3300

tagaaagcaa agcagagggg atgttttcag agcaagaatg gaatgaagct gagattttgt 3360

ttgagttggg ataccccaca ccatgtgctg gattaacaat gtcgctccac aactttgctg 3420

agggacgtct aaattggacc ctatttggtg tctacgagaa gggaaataat aaggaggata 3480

ttaaatttaa agatcccatg tcaacctttt cattctgtaa catgctcatg gaacctccct 3540

cttcattacc tagttgtttg tactatgttg ttaaatga 3578

<210> 3

<211> 1011

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 3

Met Ala His Arg Thr Ala Pro Ser Trp Ser Thr Phe Thr Leu Lys Trp

1 5 10 15

Ile Tyr Asp Val Phe Leu Ser Phe Arg Gly Glu Asp Thr Arg Gln Lys

20 25 30

Phe Thr Gly Asn Leu Tyr Asn Ser Leu Cys Glu Lys Gly Val His Thr

35 40 45

Phe Ile Asp Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Glu Glu Ile Thr Pro Ala

50 55 60

Leu Leu Asn Ala Ile Gln Asn Ser Arg Ile Ala Ile Val Val Phe Ser

65 70 75 80

Lys Asn Tyr Ala Ser Ser Thr Phe Cys Leu Asp Glu Leu Val Lys Ile

85 90 95

Leu Glu Cys Leu Lys Glu Glu Lys Gly Arg Ser Val Phe Pro Ile Phe

100 105 110

Tyr Asp Val Asp Pro Ser His Val Arg His Gln Lys Gly Thr Tyr Ser

115 120 125

Glu Ala Leu Ala Lys His Glu Glu Arg Phe Pro Asp Asp Ser Asp Lys

130 135 140

Val Gln Lys Trp Arg Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Ala Asn Leu Ser Gly

145 150 155 160

Trp His Phe Gln His Gly Glu Leu Glu Tyr Lys Ser Ile Arg Lys Ile

165 170 175

Val Lys Glu Val Tyr Lys Arg Ile Ser Cys Ile Pro Leu His Ile Ala

180 185 190

Asp Asn Pro Ile Gly Leu Glu His Ala Val Leu Glu Val Lys Ser Leu

195 200 205

Leu Gly His Gly Ser Asp Val Asn Ile Ile Gly Ile Tyr Gly Ile Gly

210 215 220

Gly Ile Gly Lys Thr Thr Ile Ser Arg Ala Val Tyr Asn Leu Ile Cys

225 230 235 240

Ser Gln Phe Glu Gly Thr Cys Phe Leu Pro Asp Ile Arg Glu Lys Ala

245 250 255

Ile Asn Lys Gln Gly Leu Val Gln Leu Gln Glu Met Leu Leu Ser Glu

260 265 270

Val Leu Lys Lys Lys His Ile Lys Val Gly Asp Val Asn Arg Gly Ile

275 280 285

Pro Ile Ile Lys Arg Arg Leu Glu Lys Lys Lys Val Leu Leu Val Leu

290 295 300

Asp Asp Val Asp Lys Leu Glu Gln Leu Lys Val Leu Ala Gly Glu Ser

305 310 315 320

Arg Trp Phe Gly Asn Gly Ser Ile Ile Ile Ile Thr Thr Arg Asp Lys

325 330 335

His Leu Leu Ala Thr His Gly Val Val Lys Ile Tyr Asp Val Lys Pro

340 345 350

Leu Asn Val Ala Lys Ala Leu Glu Leu Phe Asn Trp Cys Ala Phe Lys

355 360 365

Asn His Lys Ala Asp Pro Leu Tyr Val Asn Ile Ala Asn Arg Ala Val

370 375 380

Ser Tyr Ala Cys Gly Ile Pro Leu Ala Leu Glu Val Ile Gly Ser His

385 390 395 400

Leu Phe Gly Lys Ser Leu Asn Glu Cys Asn Ser Ala Leu Asp Lys Tyr

405 410 415

Glu Arg Ile Pro His Glu Lys Ile His Glu Ile Leu Lys Val Ser Tyr

420 425 430

Asp Gly Leu Glu Glu Asn Glu Lys Gln Ile Phe Leu Asp Ile Ala Cys

435 440 445

Phe Phe Asn Thr Cys Gly Val Gly Tyr Val Thr Ser Val Leu Arg Ala

450 455 460

His Gly Phe His Val Lys Asp Gly Leu Arg Val Leu Val Asp Arg Ser

465 470 475 480

Leu Leu Lys Ile Asp Ala Ser Gly Cys Val Arg Met His Asp Leu Ile

485 490 495

Arg Asp Thr Gly Arg Glu Ile Val Arg Gln Glu Ser Thr Val Glu Pro

500 505 510

Gly Arg Arg Ser Arg Leu Trp Phe Glu Glu Asp Ile Val His Val Leu

515 520 525

Glu Glu Asn Thr Gly Thr Asp Lys Ile Glu Phe Ile Lys Leu Glu Gly

530 535 540

Tyr Asn Asn Ile Gln Val Gln Trp Asn Gly Lys Ala Leu Lys Glu Met

545 550 555 560

Lys Asn Leu Arg Ile Leu Ile Ile Glu Asn Thr Thr Phe Ser Thr Gly

565 570 575

Pro Glu His Leu Pro Asn Ser Leu Arg Val Leu Asp Trp Ser Cys Tyr

580 585 590

Pro Ser Pro Ser Leu Pro Ala Asp Phe Asn Pro Lys Arg Val Glu Leu

595 600 605

Leu Leu Met Pro Glu Ser Cys Leu Gln Ile Phe Gln Pro Tyr Asn Met

610 615 620

Phe Glu Ser Leu Ser Val Leu Ser Ile Glu Asp Cys Gln Phe Leu Thr

625 630 635 640

Asp Leu Pro Ser Leu Arg Glu Val Pro Leu Leu Ala Tyr Leu Cys Ile

645 650 655

Asp Asn Cys Thr Asn Leu Val Lys Ile Asp Gly Ser Ile Gly Phe Leu

660 665 670

Asp Lys Leu Gln Leu Leu Ser Ala Lys Arg Cys Ser Lys Leu Lys Ile

675 680 685

Leu Ala Pro Cys Val Met Leu Pro Ser Leu Glu Ile Leu Asp Leu Arg

690 695 700

Gly Cys Thr Cys Leu Asp Ser Phe Pro Glu Val Leu Gly Lys Met Glu

705 710 715 720

Asn Ile Lys Glu Ile Tyr Leu Asp Glu Thr Ala Ile Glu Thr Leu Pro

725 730 735

Cys Ser Ile Gly Asn Phe Val Gly Leu Gln Leu Leu Ser Leu Arg Lys

740 745 750

Cys Gly Arg Leu His Gln Leu Pro Gly Ser Ile Cys Ile Leu Pro Lys

755 760 765

Val Lys Val Ile Phe Gly Phe Gly His Val Val Tyr Arg Phe Trp Glu

770 775 780

Glu Asn Gln Tyr Glu Gln Glu Leu Ser Leu Glu Val Ser Pro Arg Ser

785 790 795 800

Met Val Val Val Asp Gly Asp Leu Asp Phe Thr Tyr Ile Asp Met Tyr

805 810 815

Tyr Pro His Ile Ser Pro Asn Asn Val Ile Gln Val Cys Ser Pro Asn

820 825 830

Leu Leu Leu His His Asp Phe Ile Leu Leu Phe Lys Lys Leu Ala Ser

835 840 845

Lys Asp Gly Ser Arg Gly Arg Lys Ser Ser Met His Phe Ser Phe Arg

850 855 860

Asn Lys Phe Pro Lys Ile Ala Val Cys Cys Ser Val Leu Pro Ser Leu

865 870 875 880

Lys Ile Thr Met Ile Leu Ile Leu Lys Leu Gly Val Leu Ile Asn Gly

885 890 895

Thr Lys Ile Phe Ser Ser Ser Cys Asn Tyr Leu Phe Thr Gln Thr Trp

900 905 910

Asn Pro Lys Leu Trp Cys Asp Leu Glu Ser Lys Ala Glu Gly Met Phe

915 920 925

Ser Glu Gln Glu Trp Asn Glu Ala Glu Ile Leu Phe Glu Leu Gly Tyr

930 935 940

Pro Thr Pro Cys Ala Gly Leu Thr Met Ser Leu His Asn Phe Ala Glu

945 950 955 960

Gly Arg Leu Asn Trp Thr Leu Phe Gly Val Tyr Glu Lys Gly Asn Asn

965 970 975

Lys Glu Asp Ile Lys Phe Lys Asp Pro Met Ser Thr Phe Ser Phe Cys

980 985 990

Asn Met Leu Met Glu Pro Pro Ser Ser Leu Pro Ser Cys Leu Tyr Tyr

995 1000 1005

Val Val Lys

1010

<210> 4

<211> 3755

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 4

atggcacaca gaacagcacc atcttggtct accttcacac ttaaatggat ttatgatgtc 60

ttcctcagtt ttagaggtga agacactcgt caaaaattca ctggcaatct ctacaattct 120

ctgtgtgaaa agggagttca tactttcatt gatgatgaag ggcttagaag aggggaagaa 180

attacaccag ctcttctcaa tgccattcaa aattcaagga ttgccattgt tgttttctct 240

aagaactatg catcctcaac tttttgtttg gataaacttg tcaagatcct tgagtgcttg 300

aaggaagaaa aaggtcgatc agtttttcca atattttatg atgtggatcc atcacatgtt 360

cggcatcaga aagggactta ttcagaagca ttggcaaaac atgaagaaag gttcccagat 420

gacagtgaca aagtgcaaaa atggaggaag gctttatatg aagcagccaa tctatcaggc 480

tggcatttcc aacatgggta ttctatactt cctttttatt gtatgtgtta taaactgatc 540

tctttttaca tttgcctaat aattttcata ttaattactc acaaagaaag aaagcatagt 600

aaatcacatt gatctatctt gaacggtgaa atttaagaaa tggagacaat aaatttatga 660

gattaattct gattgaaatg agtaaactaa acacaaattt gaagctttag tttcaattca 720

catgttttat acaatgggca gggagctaga atataagtcc atccgaaaaa ttgttaaaga 780

ggtctataaa aggattagtt gcattccttt acacattgct gataatccaa ttgggctaga 840

gcatgcagtg ctagaagtga aatctctcct tggacatggt tctgatgtca acattatagg 900

aatttatggt attggtggta tcggtaaaac cacaatttct cgtgccgtgt ataacttgat 960

ttgtagtcaa tttgaaggca catgttttct ccttgacatt agagaaaagg caatcaataa 1020

gcaaggtctt gtccaactcc aagaaatgtt actttctgaa gtactcaaga agaaacatat 1080

caaagtgggt gatgttaaca gaggaattcc aataataaaa aggaggcttg aaaaaaagaa 1140

ggttcttctg gttttagatg atgttgacaa attagagcag ttaaaggttc ttgcaggaga 1200

aagtcgttgg tttggcaatg gaagtataat cattatcacc acaagagaca aacacttgct 1260

agcgactcat ggggtggtaa aaatatatga tgttaaacca ttaaatgttg caaaggctct 1320

tgaattgttt aactggtgtg cctttaaaaa tcataaagct gatccacttt atgtgaatat 1380

tgctaaccgt gcagtttctt atgcgtgtgg cattccattg gctctggaag tgataggttc 1440

tcatttattt ggaaaaagtt tgaatgaatg taattctgca ttggagggcg agccctggtg 1500

cagcggtaaa gttgtgcctt ggtgacttgt tggtcatggg ttcgaatccg gaaacagcct 1560

ctttgcatat gcaagggtaa gactgcgtac aatatccctc cctcatacct tcgcatagcg 1620

aagagcctct gggcaatggg gtacgaatgt aattctgcat tggataaata tgaaagaatt 1680

cctcatgaaa agatccatga aatacttaaa gtaagctatg atggtttgga agaaaatgag 1740

aagcaaattt tccttgacat tgcttgtttc ttcaatactt gtggtgtggg ctacgtcaca 1800

tcagtgctac gtgctcatgg ttttcatgta aaagatggtt tgagagtgtt ggttgacaga 1860

tctctcttaa agattgatgc ttctggttgt gtgagaatgc atgatctaat tcgagacaca 1920

ggcagagaaa ttgtaaggca agaatcaaca gttgagcctg gcagacgtag taggttatgg 1980

tttgaagagg acattgttca tgttttggaa gaaaatacgg tatgttagaa attacgaaca 2040

tctctatgct atttctttgc ttttcattcc tttattaaaa taacaatttt actgaataca 2100

tgataatttt tgggattctt tcccctgtta tctatttaat ttttatatga tgatgagatt 2160

gctaatgtgc acatttttgt ggctaaattg tgctttgggc atggaaggga actgataaaa 2220

tagaattcat aaagcttgaa gggtacaaca acatacaagt gcaatggaat ggaaaagcct 2280

tgaaggagat gaagaacctg aggattttga ttattgaaaa tacaaccttt tctacaggcc 2340

ccgagcatct gccaaatagt ttgagagtgc tagattggag ttgctaccct tcaccatctt 2400

tgcctgctga tttcaatcct aaacgagttg agctactcct tatgcctgaa agttgccttc 2460

aaatcttcca accatacaat gtatgtatca gtttcgaagt tattattttt aacatgaatt 2520

tctactttaa aaaaaaaaaa aaacacgcac ctcacacaca acttgagtca ttgtctttta 2580

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atctaccaag cctacgagaa gtaccacttt tagcatattt gtgtattgat aattgcacca 2700

atttggttaa aattgatggt tcaattggct ttcttgataa gctccaactc ttgagtgcta 2760

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acataaaaga aatatattta gacgagacag ccatagagac actgccatgt tcaattggaa 2940

attttgttgg gcttcaactt ttgtccctga ggaaatgcgg aaggcttcat cagctaccag 3000

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gattttggga agagaaccaa tatgaacaag agttgagctt agaagtgtct ccaaggtcca 3120

tggttgttgt tgatggtgac ctggatttta catatattga catgtattat ccacacataa 3180

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tctcgtttcg aaacaaattc cccaagattg cggtatgttg ttctgtattg cctagtttga 3360

aaattaccat gatattgatt ttgaagttgg gcgtactcat caacggcact aagatattta 3420

gttcatcatg taactactta tttacacaaa catggaaccc aaaactttgg tgtgatctag 3480

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agttgggata ccccacacca tgtgctggat taacaatgtc gctccacaac tttgctgagg 3600

gacgtctaaa ttggacccta tttggtgtct acgaggaggg aaataataag gaggatatta 3660

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<210> 5

<211> 3755

<212> DNA

<213> Glycine max

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ttcctcagtt ttagaggtga agacactcgt caaaaattca ctggcaatct ctacaattct 120

ctgtgtgaaa agggagttca tactttcatt gatgatgaag ggcttagaag aggggaagaa 180

attacaccag ctcttctcaa tgccattcaa aattcaagga ttgccattgt tgttttctct 240

aagaactatg catcctcaac tttttgtttg gatgaacttg tcaagatcct tgagtgcttg 300

aaggaagaaa aaggtcgatc agtttttcca atattttatg atgtggatcc atcacatgtt 360

cggcatcaga aagggactta ttcagaagca ttggcaaaac atgaagaaag gttcccagat 420

gacagtgaca aagtgcaaaa atggaggaag gctttatatg aagcagccaa tctatcaggc 480

tggcatttcc aacatgggta ttctatactt cctttttatt gtatgtgtta taaactgatc 540

tctttttaca tttgcctaat aattttcata ttaattactc acaaagaaag aaagcatagt 600

aaatcacatt gatctatctt gaacggtgaa atttaagaaa tggagacaat aaatttatga 660

gattaattct gattgaaatg agtaaactaa acacaaattt gaagctttag tttcaattca 720

catgttttat acaatgggca gggagctaga atataagtcc atccgaaaaa ttgttaaaga 780

ggtctataaa aggattagtt gcattccttt acacattgct gataatccaa ttgggctaga 840

gcatgcagtg ctagaagtga aatctctcct tggacatggt tctgatgtca acattatagg 900

aatttatggt attggtggta tcggtaaaac cacaatttct cgtgccgtgt ataacttgat 960

ttgtagtcaa tttgaaggca catgttttct ccctgacatt agagaaaagg caatcaataa 1020

gcaaggtctt gtccaactcc aagaaatgtt actttctgaa gtactcaaga agaaacatat 1080

caaagtgggt gatgttaaca gaggaattcc aataataaaa aggaggcttg aaaaaaagaa 1140

ggttcttctg gttttagatg atgttgacaa attagagcag ttaaaggttc ttgcaggaga 1200

aagtcgttgg tttggcaatg gaagtataat cattatcacc acaagagaca aacacttgct 1260

agcgactcat ggggtggtaa aaatatatga tgttaaacca ttaaatgttg caaaggctct 1320

tgaattgttt aactggtgtg cctttaaaaa tcataaagct gatccacttt atgtgaatat 1380

tgctaaccgt gcagtttctt atgcgtgtgg cattccattg gctctggaag tgataggttc 1440

tcatttattt ggaaaaagtt tgaatgaatg taattctgca ttggagggcg agccctggtg 1500

cagcggtaaa gttgtgtctt ggtgacttgt tggtcatggg ttcgaatccg gaaacagcct 1560

ctttgcatat gcaagggtaa ggctgcgtac aatatccctc ccccatacct tcgcatagcg 1620

aagagcctct gggcaatggg gtacgaatgt aattctgcat tggataaata tgaaagaatt 1680

cctcatgaaa agatccatga aatacttaaa gtaagctatg atggtttgga agaaaatgag 1740

aagcaaattt tccttgacat tgcttgtttc ttcaatactt gtggtgtggg ctacgtcaca 1800

tcagtgctac gtgctcatgg ttttcatgta aaagatggtt tgagagtgtt ggttgacaga 1860

tctctcttaa agattgatgc ttctggttgt gtgagaatgc atgatctaat tcgagacaca 1920

ggcagagaaa ttgtaaggca agaatcaaca gttgagcctg gcagacgtag taggttatgg 1980

tttgaagagg acattgttca tgttttggaa gaaaatacgg tatgttagaa attacgaaca 2040

tctctatgct atttctttgc ttttcattcc tttattaaaa taacaatttt actgaataca 2100

tgataaattt tgggattctt tcccctgtta tctatttaat ttttatatga tgatgagatt 2160

gctaatgtgc acatttttgt ggctaaattg tgctttgggc atggaaggga actgataaaa 2220

tagaattcat aaagcttgaa gggtacaaca acatacaagt gcaatggaat ggaaaagcct 2280

tgaaggagat gaagaacctg aggattttga ttattgaaaa tacaaccttt tctacaggcc 2340

ccgagcatct gccaaatagt ttgagagtgc tagattggag ttgctaccct tcaccatctt 2400

tgcctgctga tttcaatcct aaacgagttg agctactcct tatgcctgaa agttgccttc 2460

aaatcttcca accatacaat gtatgtatca gtttcgaagt tattattttt aacatgaatt 2520

tctacttaaa aaaaaaaaaa aaacacgcac ctcacacaca acttgagtca ttgtctttta 2580

atttgcagat gtttgaatca ttgtctgtgt taagcattga agattgccag ttcttaacag 2640

atctaccaag cctacgagaa gtaccacttt tagcatattt gtgtattgat aattgcacca 2700

atttggttaa aattgatggt tcaattggct ttcttgataa gctccaactc ttgagtgcta 2760

aacggtgtag caagctaaaa attctagcac cctgcgtcat gttgccatct cttgaaattt 2820

tggaccttcg ggggtgcaca tgtcttgata gcttcccgga agtattggga aagatggaga 2880

acataaaaga aatatattta gacgagacag ccatagagac actgccatgt tcaattggaa 2940

attttgttgg gcttcaactt ttgtccctga ggaaatgcgg aaggcttcat cagctaccag 3000

gtagtatatg tatattgccg aaagttaaag tgattttcgg ttttgggcat gtggtatatc 3060

gattttggga agagaaccaa tatgaacaag agttgagctt agaagtgtct ccaaggtcca 3120

tggttgttgt tgatggtgac ctggatttta catatattga catgtattat ccacacataa 3180

gtccaaataa tgtcatccaa gtatgcagtc ctaatctgct cttgcatcat gatttcattt 3240

tgttgttcaa aaagcttgca agcaaggatg ggagcagatg caggaaatcg tcaatgcatt 3300

tctcgtttcg aaacaaattc cccaagattg cggtatgttg ttctgtattg cctagtttga 3360

aaattaccat gatattgatt ttgaagttgg gcgtactcat caacggcact aagatattta 3420

gttcatcatg taactactta tttacacaaa catggaaccc aaaactttgg tgtgatctag 3480

aaagcaaagc agaggggatg ttttcagagc aagaatggaa tgaagctgag attttgtttg 3540

agttgggata ccccacacca tgtgctggat taacaatgtc gctccacaac tttgctgagg 3600

gacgtctaaa ttggacccta ttcggtgtct acgaggaggg aaataataag gaggatatta 3660

aatttaaaga tcccatgtca accttttcat tctgtaacat gctcatggaa cctccctctt 3720

cattacctag ttgtttgtac tatgttgtta aatga 3755

<210> 6

<211> 3756

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 6

atggcacaca gaacagcacc atcttggtct accttcacac ttaaatggat ttatgatgtc 60

ttcctcagtt ttagaggtga agacactcgt caaaaattca ctggcaatct ctacaattct 120

ctgtgtgaaa agggagttca tactttcatt gatgatgaag ggcttagaag aggggaagaa 180

attacaccag ctcttctcaa tgccattcaa aattcaagga ttgccattgt tgttttctct 240

aagaactatg catcctcaac tttttgtttg gatgaacttg tcaagatcct tgagtgcttg 300

aaggaagaaa aaggtcgatc agtttttcca atattttatg atgtggatcc atcacatgtt 360

cggcatcaga aagggactta ttcagaagca ttggcaaaac atgaagaaag gttcccagat 420

gacagtgaca aagtgcaaaa atggaggaag gctttatatg aagcagccaa tctatcaggc 480

tggcatttcc aacatgggta ttctatactt cctttttatt gtatgtgtta taaactgatc 540

tctttttaca tttgcctaat aattttcata ttaattactc acaaagaaag aaagcatagt 600

aaatcacatt gatctatctt gaacggtgaa atttaagaaa tggagacaat aaatttatga 660

gattaattct gattgaaatg agtaaactaa acacaaattt gaagctttag tttcaattca 720

catgttttat acaatgggca gggagctaga atataagtcc atccgaaaat ttgttaaaga 780

ggtctataaa aggattagtt gcattccttt acacattgct gataatccaa ttgggctaga 840

gcatgcagtg ctagaagtga aatctctcct tggacatggt tctgatgtca acattatagg 900

aatttatggt attggtggta tcggtaaaac cacaatttct cgtgccgtgt ataacttgat 960

ttgtagtcaa tttgaaggca catgttttct ccctgacatt agagaaaagg caatcaataa 1020

gcaaggtctt gtccaactcc aagaaatgtt actttctgaa gtactcaaga agaaacatat 1080

caaagtgggt gatgttaaca gaggaattcc aataataaaa aggaggcttg aaaaaaagaa 1140

ggttcttctg gttttagatg atgttgacaa attagagcag ttaaaggttc ttgcaggaga 1200

aagtcgttgg tttggcaatg gaagtataat cattatcacc acaagagaca aacacttgct 1260

agcgactcat ggggtggtaa aaatatatga tgttaaacca ttaaatgttg caaaggctct 1320

tgaattgttt aactggtgtg cctttaaaaa tcataaagct gatccacttt atgtgaatat 1380

tgctaaccgt gcagtttctt atgcgtgtgg cattccattg gctctggaag tgataggttc 1440

tcatttattt ggaaaaagtt tgaatgaatg taattctgta ttggagggcg agccctggtg 1500

cagcggtaaa gttgtgcctt ggtgacttgt tggtcatggg ttcgaatccg gaaacagcct 1560

ctttgcatat gcaagggtaa ggctgcgtac aatatccctc cctcatacct tcgcatagcg 1620

aagagcctct aggcaatggg gtacgaatgt aattctgcat tggataaata tgaaagaatt 1680

cctcatgaaa agatccatga aatacttaaa gtaagctatg atggtttgga agaaaatgag 1740

aagcaaattt tccttgacat tgcttgtttc ttcaatactt gtggtgtggg ctacgtcaca 1800

tcagtgctac gtgctcatgg ttttcatgta aaagatggtt tgagagtgtt ggttgacaga 1860

tctctcttaa agattgatgc ttctggttgt gtgagaatgc atgatctaat tcgagacaca 1920

ggcagagaaa ttgtaaggca agaatcaaca gttgagcctg gcagacgtag taggttatgg 1980

tttgaagagg acattgttca tgttttggaa gaaaatacgg tatgttagaa attacgaaca 2040

tctctatgct atttctttgc ttttcattcc tttattaaaa taacaatttt actgaataca 2100

tgataaattt tgggattctt tcccctgtta tctatttaat ttttatatga tgatgagatt 2160

gctaatgtgc acatttttgt ggctaaattg tgctttgggc atggaaggga actgataaaa 2220

tagaattcat aaagcttgaa gggtacaaca acatacaagt gcaatggaat ggaaaaacct 2280

tgaaggagat gaagaacctg aggattttga ttattgaaaa tacaaccttt tctacaggcc 2340

ccgagcatct gccaaatagt ttgagagtgc tagattggag ttgctaccct tcaccatctt 2400

tgcctgctga tttcaatcct aaacgagttg agctactcct tatgcctgaa agttgccttc 2460

aaatcttcca accatacaat gtatgtatca gtttcgaagt tattattttt aacatgaatt 2520

tctactttaa aaaaaaaaaa aaaacacgca cctcacacac aacttgagtc attgtctttt 2580

aatttgcaga tgtttgaatc attgtctgtg ttaagcattg aagattgcca gttcttaaca 2640

gatctaccaa gcctaagaga agtaccactt ttagcatatt tgtgtattga taattgcacc 2700

aatttggtta aaattgaagg ttcaattggc tttcttgata agctccaact cttgagtgct 2760

aaacggtgta gcaagctaaa aattctagca ccctgcgtca tgttgccatc tcttgaaatt 2820

ttggaccttc gggggtgcac atgtcttgat agcttcccgg aagtattggg aaagatggag 2880

aacataaaag aaatatattt agacgagaca gccatagaga cactgccatg ttcaattgga 2940

aattttgttg ggcttcaact tttgtccctg aggaaatgcg gaaggcttca tcagctacca 3000

ggtagtatat gtatattgcc gaaagttaaa gtgattttcg gttttgggca tgtggtatat 3060

cgattttggg aagagaacca atatgaacaa gagttgagct tagaagtgtc tccaaggtcc 3120

atggttgttg ttgatggtga cctggatttt acatatattg acatgtatta tccacacata 3180

agtccaaata atgtcatcca agtatgcagt cctaatctgc tcttgcatca tgatttcatt 3240

ttgttgttca aaaagcttgc aagcaaggat gggagcagag gcaggaaatc gtcaatgcat 3300

ttctcgtttc gaaacaaatt ccccaagatt gcggtatgtt gttctgtatt gcctagtttg 3360

aaaattacca tgatattgat tttgaagttg ggcgtactca tcaacggcac taagatattt 3420

agttcatcat gtagctactt atttacacaa acatggaacc caaaactttg gtgtgatcta 3480

gaaagcaaag cagaggggat gttttcagag caagaatgga atgaagctga gattttgttt 3540

gagttgggat accccacacc atgtgctgga ttaacaatgt cgctccacaa ctttgctgag 3600

ggacgtctaa attggaccct atttggtgtc tacgaggagg gaaataataa ggaggatatt 3660

aaatttaaag atcccatgtc aaccttttca ttctgtaaca tgctcatgga acctccctct 3720

tcattaccta gttgtttgta ctatgttgtt aaatga 3756

<210> 7

<211> 3756

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 7

atggcacaca gaacagcacc atcttggtct accttcacac ttaaatggat ttatgatgtc 60

ttcctcagtt ttagaggtga agacactcgt caaaaattca ctggcaatct ctacaattct 120

ctgtgtgaaa agggagttca tactttcatt gatgatgaag ggcttagaag aggggaagaa 180

attacaccag ctcttctcaa tgccattcaa aattcaagga ttgccattgt tgttttctct 240

aagaactatg catcctcaac tttttgtttg gatgaacttg tcaagatcct tgagtgcttg 300

aaggaagaaa aaggtcgatc agtttttcca atattttatg atgtggatcc atcacatgtt 360

cggcatcaga aagggactta ttcagaagca ttggcaaaac atgaagaaag gttcccagat 420

gacagtgaca aagtgcaaaa atggaggaag gctttatatg aagcagccaa tctatcaggc 480

tggcatttcc aacatgggta ttctatactt cctttttatt gtatgtgtta taaactgatc 540

tctttttaca tttgcctaat aattttcata ttaattactc acaaagaaag aaagcatagt 600

aaatcacatt gatctatctt gaacggtgaa atttaagaaa tggagacaat aaatttatga 660

gattaattct gattgaaatg agtaaactaa acacaaattt gaagctttag tttcaattca 720

catgttttat acaatgggca gggagctaga atataagtcc atccgaaaaa ttgttaaaga 780

ggtctataaa aggattagtt gcattccttt acacattgct gataatccaa ttgggctaga 840

gcatgcagtg ctagaagtga aatctctcct tggacatggt tctgatgtca acattatagg 900

aatttatggt attggtggta tcggtaaaac cacaatttct cgtgccgtgt ataacttgat 960

ttgtagtcaa tttgaaggca catgttttct ccctgacatt agagaaaagg caatcaataa 1020

gcaaggtctt gtccaactcc aagaaatgtt actttctgaa gtactcaaga agaaacatat 1080

caaagtgggt gatgttaaca gaggaattcc aataataaaa aggaggcttg aaaaaaagaa 1140

ggttcttctg gttttagatg atgttgacaa attagagcag ttaaaggttc ttgcaggaga 1200

aagtcgttgg tttggcaatg gaagtataat cattatcacc acaagagaca aacacttgct 1260

agcgactcat ggggtggtaa aaatatatga tgttaaacca ttaaatgttg caaaggctct 1320

tgaattgttt aactggtgtg cctttaaaaa tcataaagct gatccacttt atgtgaatat 1380

tgctaaccgt gcagtttctt atgcgtgtgg cattccattg gctctggaag tgataggttc 1440

tcatttattt ggaaaaagtt tgaatgaatg taattatgta ttggagggcg agccctggtg 1500

cagcggtaaa gttgtgcctt ggtgacttgt tggtcatggg ttcgaatccg gaaacagcct 1560

ctttgcatat gcaagggtaa ggctgcgtac aatatccctc ccccatacct tcgcatagcg 1620

aagagcctct aggcaatggg gtgcgaatgt aattctgcat tggataaata tgaaagaatt 1680

cctcatgaaa agatccatga aatacttaaa gtaagctatg atggtttgga agaaaatgag 1740

aagcaaattt tccttgacat tgcttgtttc ttcaatactt gtggtgtggg ctacgtcaca 1800

tcagtgctac gtgctcatgg ttttcatgta aaagatggtt tgagagtgtt ggttgacaga 1860

tctctcttaa agattgatgc ttctggttgt gtgagaatgc atgatctaat tcgagacaca 1920

ggcagagaaa ttgtaaggca agaatcaaca gttgagcctg gcagacgtag taggttatgg 1980

tttgaagagg acattgttca tgttttggaa gaaaatacgg tatgttagaa attacgaaca 2040

tctctatgct atttctttgc ttttcattcc tttattaaaa taacaatttt actgaataca 2100

tgataaattt tgggattctt tcccctgtta tctatttaat ttttatatga tgatgagatt 2160

gctaatgtgc acatttttgt ggctaaattg tgctttgggc atggaaggga actgataaaa 2220

tagaattcat aaagcttgaa gggtacaaca acatacaagt gcaatggaat ggaaaaacct 2280

tgaaggagat gaagaacctg aggattttga ttattgaaaa tacaaccttt tctacaggcc 2340

ccgagcatct gccaaatagt ttgagagtgc tagattggag ttgctaccct tcaccatctt 2400

tgcctgctga tttcaatcct aaacgagttg agctactcct tatgcctgaa agttgccttc 2460

aaatcttcca accatacaat gtatgtatca gtttcgaagt tattattttt aacatgaatt 2520

tctactttaa aaaaaaaaaa aaaacacgca cctcacacac aacttgagtc attgtctttt 2580

aatttgcaga tgtttgaatc attgtctgtg ttaagcattg aagattgcca gttcttaaca 2640

gatctaccaa gcctaagaga agtaccactt ttagcatatt tgtgtattga taattgcacc 2700

aatttggtta aaattgaagg ttcaattggc tttcttgata agctccaact cttgagtgct 2760

aaacggtgta gcaagctaaa aattctagca ccctgcgtca tgttgccatc tcttgaaatt 2820

ttggaccttc gggggtgcac atgtcttgat agcttcccgg aagtattggg aaagatggag 2880

aacataaaag aaatatattt agacgagaca gccatagaga cactgccatg ttcaattgga 2940

aattttgttg ggcttcaact tttgtccctg aggaaatgcg gaaggcttca tcagctacca 3000

ggtagtatat gtatattgcc gaaagttaaa gtgattttcg gttttgggca tgtggtatat 3060

cgattttggg aagagaacca atatgaacaa gagttgagct tagaagtgtc tccaaggtcc 3120

atggttgttg ttgatggtga cctggatttt acatatattg acatgtatta tccacacata 3180

agtccaaata atgtcatcca agtatgcagt cctaatctgc tcttgcatca tgatttcatt 3240

ttgttgttca aaaagcttgc aagcaaggat gggagcagat gcaggaaatc gtcaatgcat 3300

ttctcgtttc gaaacaaatt ccccaagatt gcggtatgtt gttctgtatt gcctagtttt 3360

aaaattacca tgatattgat tttgaagttg ggcgtactca tcaacggcac taagatattt 3420

agttcatcat gtagctactt atttacacaa acatggaacc caaaactttg gtgtgatcta 3480

gaaagcaaag cagaggggat gttttcagag caagaatgga atgaagctga gattttgttt 3540

gagttgcgat accccacacc atgtgctgga ttaacaatgt cgctccacaa ctttgctgag 3600

ggacgtctaa attggaccct atttggtgtc tacgaggagg gaaataataa ggaggatatt 3660

aaatttaaag atcccatgtc aaccttttca ttctgtaaca tgctcatgga acctccctct 3720

tcattaccta gttgtttgta ctatgttgtt aaatga 3756

<210> 8

<211> 3754

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 8

atggcacaca gaacagcacc atcttggtct accttcacac ttaaatggat ttatgatgtc 60

ttcctcagtt ttagaggtga agacactcgt caaaaattca ctggcaatct ctacaattct 120

ctgtgtgaaa agggagttca tactttcatt gatgatgaag ggcttagaag aggggaagaa 180

attacaccag ctcttctcaa tgccattcaa aattcaagga ttgccattgt tgttttctct 240

aagaactatg catcctcaac tttttgtttg gataaacttg tcaagatcct tgagtgcttg 300

aaggaagaaa aaggtcgatc agtttttcca atattttatg atgtggatcc atcacatgtt 360

cggcatcaga aagggactta ttcagaagca ttggcaaaac atgaagaaag gttcccagat 420

gacagtgaca aagtgcaaaa atggaggaag gctttatatg aagcagccaa tctatcaggc 480

tggcatttcc aacatgggta ttctatactt cctttttatt gtatgtgtta taaactgatc 540

tctttttaca tttgcctaat aattttcata ttaattactc acaaagaaag aaagcatagt 600

aaatcacatt gatctatctt gaacggtgaa atttaagaaa tggagacaat aaatttatga 660

gattaattct gattgaaatg agtaaactaa acacaaattt gaagctttag tttcaattca 720

catgttttat acaatgggca gggagctaga atataagtcc atccgaaaaa ttgttaaaga 780

ggtctataaa aggattagtt gcattccttt acacattgct gataatccaa ttgggctaga 840

gcatgcagtg ctagaagtga aatctctcct tggacatggt tctgatgtca acattatagg 900

aatttatggt attggtggta tcggtaaaac cacaatttct cgtgccgtgt ataacttgat 960

ttgtagtcaa tttgaaggca catgttttct ccttgacatt agagaaaagg caatcaataa 1020

gcaaggtctt gtccaactcc aagaaatgtt actttctgaa gtactcaaga agaaacatat 1080

caaagtgggt gatgttaaca gaggaattcc aataataaaa aggaggcttg aaaaaaagaa 1140

ggttcttctg gttttagatg atgttgacaa attagagcag ttaaaggttc ttgcaggaga 1200

aagtcgttgg tttggcaatg gaagtataat cattatcacc acaagagaca aacacttgct 1260

agcgactcat ggggtggtaa aatatatgat gttaaaccat taaatgttgc aaaggctctt 1320

gaattgttta actggtgtgc ctttaaaaat cataaagctg atccacttta tgtgaatatt 1380

gctaaccgtg cagtttctta tgcgtgtggc attccattgg ctctggaagt gataggttct 1440

catttatttg gaaaaagttt gaatgaatgt aattctgcat tggagggcga gccctggtgc 1500

agcggtaaag ttgtgccttg gtgacttgtt ggtcatgggt tcgaatccgg aaacagcctc 1560

tttgcatatg caagggtaag actgcgtaca atatccctcc ctcatacctt cgcatagcga 1620

agagcctctg ggcaatgggg tacgaatgta attctgcatt ggataaatat gaaagaattc 1680

ctcatgaaaa gatccatgaa atacttaaag taagctatga tggtttggaa gaaaatgaga 1740

agcaaatttt ccttgacatt gcttgtttct tcaatacttg tggtgtgggc tacgtcacat 1800

cagtgctacg tgctcatggt tttcatgtaa aagatggttt gagagtgttg gttgacagat 1860

ctctcttaaa gattgatgct tctggttgtg tgagaatgca tgatctaatt cgagacacag 1920

gcagagaaat tgtaaggcaa gaatcaacag ttgagcctgg cagacgtagt aggttatggt 1980

ttgaagagga cattgttcat gttttggaag aaaatacggt atgttagaaa ttacgaacat 2040

ctctatgcta tttctttgct tttcattcct ttattaaaat aacaatttta ctgaatacat 2100

gataattttt gggattcttt cccctgttat ctatttaatt tttatatgat gatgagattg 2160

ctaatgtgca catttttgtg gctaaattgt gctttgggca tggaagggaa ctgataaaat 2220

agaattcata aagcttgaag ggtacaacaa catacaagtg caatggaatg gaaaagcctt 2280

gaaggagatg aagaacctga ggattttgat tattgaaaat acaacctttt ctacaggccc 2340

cgagcatctg ccaaatagtt tgagagtgct agattggagt tgctaccctt caccatcttt 2400

gcctgctgat ttcaatccta aacgagttga gctactcctt atgcctgaaa gttgccttca 2460

aatcttccaa ccatacaatg tatgtatcag tttcgaagtt attattttta acatgaattt 2520

ctactttaaa aaaaaaaaaa aacacgcacc tcacacacaa cttgagtcat tgtcttttaa 2580

tttgcagatg tttgaatcat tgtctgtgtt aagcattgaa gattgccagt tcttaacaga 2640

tctaccaagc ctacgagaag taccactttt agcatatttg tgtattgata attgcaccaa 2700

tttggttaaa attgatggtt caattggctt tcttgataag ctccaactct tgagtgctaa 2760

acggtgtagc aagctaaaaa ttctagcacc ctgcgtcatg ttgccatctc ttgaaatttt 2820

ggaccttcgg gggtgcacat gtcttgatag cttcccggaa gtattgggaa agatggagaa 2880

cataaaagaa atatatttag acgagacagc catagagaca ctgccatgtt caattggaaa 2940

ttttgttggg cttcaacttt tgtccctgag gaaatgcgga aggcttcatc agctaccagg 3000

tagtatatgt atattgccga aagttaaagt gattttcggt tttgggcatg tggtatatcg 3060

attttgggaa gagaaccaat atgaacaaga gttgagctta gaagtgtctc caaggtccat 3120

ggttgttgtt gatggtgacc tggattttac atatattgac atgtattatc cacacataag 3180

tccaaataat gtcatccaag tatgcagtcc taatctgctc ttgcatcatg atttcatttt 3240

gttgttcaaa aagcttgcaa gcaaggatgg gagcagatgc aggaaatcgt caatgcattt 3300

ctcgtttcga aacaaattcc ccaagattgc ggtatgttgt tctgtattgc ctagtttgaa 3360

aattaccatg atattgattt tgaagttggg cgtactcatc aacggcacta agatatttag 3420

ttcatcatgt aactacttat ttacacaaac atggaaccca aaactttggt gtgatctaga 3480

aagcaaagca gaggggatgt tttcagagca agaatggaat gaagctgaga ttttgtttga 3540

gttgggatac cccacaccat gtgctggatt aacaatgtcg ctccacaact ttgctgaggg 3600

acgtctaaat tggaccctat ttggtgtcta cgaggaggga aataataagg aggatattaa 3660

atttaaagat cccatgtcaa ccttttcatt ctgtaacatg ctcatggaac ctccctcttc 3720

attacctagt tgtttgtact atgttgttaa atga 3754

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaaagtcgtt ggtttggcaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccatgagcac gtagcactga 20

Claims

1.一种控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID NO.2或如SEQ ID NO.2经过修饰后的核苷酸序列所示。

2.根据权利要求1所述的控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因，其特征在于：所述修饰包括转座子的插入、碱基的缺失或增加或CRISPR-Cas9修饰。

3.根据权利要求2所述的控制大豆-根瘤菌匹配性的R基因，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。

4.用于鉴定权利要求1-3任一项所述的R基因的功能标记引物对GmSINE1-F/R，其特征在于：所述GmSINE1-F序列如SEQ ID NO.9所示，GmSINE1-R序列如SEQ ID NO.10所示。

5.权利要求1-3任一项所述的R基因编码的蛋白质。

6.根据权利要求5所述的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

7.权利要求1-3任一项所述的R基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

8.权利要求1-3任一项所述的R基因或其编码的蛋白质在改良大豆及大豆-根瘤菌组合，减弱和限制土著根瘤菌在大豆上的结瘤，增强大豆与根瘤菌菌剂匹配性、增强共生固氮能力中的应用。

9.权利要求1-3任一项所述的R基因和其启动子在改良豆科作物共生固氮中的应用。

10.根据权利要9所述的应用，其特征在于，步骤为：构建包含有序列如SEQ ID NO.2所示的R基因和序列如SEQ ID NO.1所示的启动子的过表达载体或R基因的RNAi载体，通过农杆菌介导转化，然后筛选转基因阳性植株进行培养，接种根瘤菌菌剂，继续培养，完成增强大豆共生固氮能力的应用。