CN112574299A - 新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途 - Google Patents

新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途。具体来说，本公开涉及一种抗SARS‑CoV‑2抗体或其抗原结合片段，以及其在疾病诊断、制备COVID‑19疫苗、制备预防、治疗COVID‑19的药物中的用途。本公开的抗SARS‑CoV‑2抗体或其抗原结合片段能够结合新型冠状病毒的RBD结构域，阻断病毒入侵细胞，对于新型冠状病毒的预防、治疗或检测具有重要的临床意义。

Description

新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途
技术领域
本公开属于生物医药领域，涉及一种新型冠状病毒特异性抗原肽结合的人抗体及其用途。具体来说，本公开涉及一种单克隆抗体，所述抗体特异性结合SARS-CoV-2病毒的RBD结构域，该结构域位于SARS-CoV-2病毒S蛋白，及其前述抗原肽在制备COVID-19疫苗、制备预防、治疗COVID-19的药物中的用途。
背景技术
新冠肺炎疫情自爆发以来，已波及210多个国家和地区，影响70多亿人口，夺走了30余万人的宝贵生命。目前，国内疫情已经得到较好的控制，但是新型冠状病毒依旧在全球肆虐。针对新冠肺炎开发有效的诊断、预防或治疗方法，是当前亟需解决的问题。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于乙型冠状病毒属，线性单链RNA(ssRNA)病毒。其基因组全长约29903个核苷酸，共包含10个基因。自2020年1月10日，第一个SARS-CoV-2基因组序列数据被公布，此后陆续有多个从患者身上分离的新型冠状病毒的基因组序列发布。2020年1月22日，基因组科学数据中心正式发布2019新型冠状病毒资源库。经数据分析，2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与2003年爆发的SARS病毒基因组序列相似度为80％，与2017年2月从国内的蝙蝠中采集到的Bat SARS-likecoronavirus isolate bat-SL-CoVZC45基因组序列相似性最高，相似度为88％。截止到2020年1月30日，全球已有6家机构在“全球共享流感病毒数据库GISAID”上发布了13例新型冠状基因组序列。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种包膜的正链RNA病毒，含有30kb的基因组和四种结构蛋白，即刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。S蛋白调节病毒对目标宿主细胞上受体的附着。E蛋白质的功能是组装病毒并充当离子通道；M蛋白与E蛋白一起在病毒组装中发挥作用，并参与新病毒颗粒的生物合成；N蛋白与病毒RNA形成核糖核蛋白复合物。新型冠状病毒的表面刺状糖蛋白(S蛋白)负责通过与宿主细胞表面受体(ACE2)的相互作用附着到宿主细胞上。S蛋白以同型三聚体的形式存在，每个单体含有1200多个氨基酸。在SARS-CoV-2的S蛋白中，一个含有306-575残基的小结构域被鉴定为受体结合域(RBD)，其中被称为受体结合基序(RBM)的439-508残基直接介导了与ACE2的相互作用。冠状病毒进入细胞依赖于病毒突刺蛋白与细胞受体的结合以及宿主细胞蛋白酶对S蛋白的启动。阐明哪些细胞因子被2019-nCoV利用可能为病毒的传播和治疗靶点的发现提供新的思路。SARS-CoV-2 Spike蛋白由S1结构域和S2结构域组成。S1包含一个受体结合域(RBD)，可以特异性地结合靶细胞上的受体—血管紧张素转换酶2(ACE2)，是其感染过程中最关键的步骤。因此普遍认为SARS-CoV-2 Spike Protein(RBD)对病毒的诊断具有潜在的价值。重组RBD蛋白疫苗是重要的新冠疫苗选择之一。
噬菌体展示技术最初是由英国医学研究理事会(Medical Research Council)于1990年开发，是通过制备人源抗体文库(library)，并以抗体片段(Fab，ScFv)的形式表达在噬菌体表面上，从而筛选特异性抗原的抗体克隆技术。已经提出了可以从单pot抗体文库系统中筛选出几乎所有与抗原发生特异性反应的重组人单克隆抗体可能性，因此，当使用噬菌体展示抗体技术时，能获得可应用于体内诊断或治疗的各种抗体片段(Fab或ScFv)。本发明中以COVID-19患者PBMC构建噬菌体人源抗体库，通过与刺突蛋白的RBD结构域特异性结合，从而筛选特异性抗原的抗体克隆技术。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术存在的问题，例如：针对新型冠状病毒，需要有效的诊断和治疗手段的问题。为此，本公开提供了一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段，能够特异性结合SARS-CoV-2病毒的RBD结构域。RBD结构域是SARS-CoV-2病毒入侵细胞的关键因素之一，通过特异性结合RBD可阻断新型冠状病毒对细胞的入侵，实现对新型冠状病毒的治疗、预防或诊断。
用于解决问题的方案
(1)一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段，所述抗体特异性地结合所述SARS-CoV-2表位，其中，所述SARS-CoV-2表位包含如SEQ ID NO：1所示的序列。
(2)根据(1)所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，其中，编码所述重链可变区的序列包含如SEQ ID NO：39-41任一项所示的序列。
(3)根据(1)-(2)任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，其中，编码所述轻链可变区的序列包含如下所示序列中的一种或多种：
(a1)如SEQ ID NO：42-44任一项所示的序列；
(a2)如SEQ ID NO：45-47任一项所示的序列；
(a3)如SEQ ID NO：48-50任一项所示的序列；
(a4)如SEQ ID NO：51-53任一项所示的序列；
(a5)如SEQ ID NO：54-56任一项所示的序列；
(a6)如SEQ ID NO：57-59任一项所示的序列。
(4)根据(1)-(3)任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含连接子，其中，编码所述连接子的序列包含如SEQ ID NO：60所示的序列。
(5)根据(1)所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含VH互补决定区(CDR)1、VH互补决定区(CDR)2和VH互补决定区(CDR)3，以及所述VL包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，
所述VH由如下氨基酸编码：VHCDR1包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，VHCDR2包含如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，和VHCDR3包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；并且
所述VL由如下氨基酸编码：VLCDR1包含如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45、SEQ IDNO：48、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：57任一项所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55或SEQ IDNO：58任一项所示的氨基酸序列，和VLCDR3包含如SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：59任一项所示的氨基酸序列。
(6)根据(5)所述的抗体或其抗原结合片段，其中，编码所述抗体或其抗原结合片段包含如下所示序列中的一种或多种：
(b1)VH包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；
(b2)VH包含如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；
(b3)VH包含如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；
(b4)VH包含如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；
(b5)VH包含如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；
(b6)VH包含如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列；
(b7)如SEQ ID NO：3、5、7、9、11或13所示的氨基酸序列。
(7)一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自(a)-(d)中的任一项：
(a)包含如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：36或SEQ ID NO：38任一序列或其任意组合所示的核苷酸序列；
(b)包含如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：36或SEQ ID NO：38任一序列或其任意组合所示的核苷酸序列的反向互补序列的核苷酸序列；
(c)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(a)-(b)中的任一项所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(d)与(a)-(c)中的任一项所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
(8)根据(7)所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自(e)-(h)中的任一项：
(e)包含如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO：32和SEQID NO：34所示的核苷酸序列，或包含如SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列；
(f)包含如(e)所示的核苷酸序列的反向互补序列的核苷酸序列；
(g)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(e)-(f)中的任一项所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(h)与(e)-(g)中的任一项所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
(9)根据(8)所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自(i)-(l)中的任一项：
(i)包含如SEQ ID NO：4、6、8、10、12或14任一序列所示的核苷酸序列；
(j)包含如SEQ ID NO：4、6、8、10、12或14任一序列所示的序列的反向互补序列的核苷酸序列；
(k)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)-(j)中的任一项所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(l)与(i)-(k)中的任一项所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
(10)一种载体，其中，所述载体包含根据(7)-(9)任一项所述的多核苷酸。
(11)一种分离的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含如(10)所述的载体。
(12)一种制备稳定表达目标蛋白的宿主细胞的方法，其中，所述方法包含(10)所述的载体，转化初始宿主细胞的步骤；可选的，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
(13)一种制备目标蛋白的方法，所述方法包含利用(11)所述的宿主细胞、或通过(12)所述的方法，制备所述目标蛋白。
(14)一种抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段为(13)所述的方法制备。
(15)一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含根据(1)-(6)任一项或(14)所述的抗体或其抗原结合片段。
(16)(15)所述的试剂盒在制备用于检测COVID-19的试剂盒中的应用。
(17)一种药物组合物或疫苗，其中，所述药物组合物或疫苗中含有根据(1)-(6)任一项或(14)所述的抗体或其抗原结合片段。
(18)(1)-(6)任一项或(14)所述的抗体或其抗原结合片段，或(17)所述的药物组合物或疫苗在制备用于治疗或预防COVID-19的药物的应用。
(19)一种治疗或预防COVID-19的方法，其中，将(1)-(6)任一项或(14)所述的抗体或其抗原结合片段，或(17)所述的药物组合物或疫苗给予动物。
发明的效果
在一个实施方案中，本公开提供了能够特异性结合新型冠状病毒的人源抗体，该抗体通过结合新型冠状病毒的RBD结构域，能够阻断新型冠状病毒向细胞内的入侵，实现对新型冠状病毒的预防或治疗。另一方面，通过与新型冠状病毒的特异性结合，还能够实现对病毒的检测，用于新冠肺炎患者的临床诊断。
在一个实施方案中，本公开提供了编码能够特异性结合新型冠状病毒的人源抗体的多核苷酸、包含多核苷酸的载体、宿主细胞等，能够实现单克隆抗体的表达、制备。
在一个实施方案中，本公开提供了用于制备能够特异性结合新型冠状病毒的人源抗体的方法。
附图说明
附图标记说明
图1示出了构建VL和VH-VL文库时PCR琼脂糖凝胶电泳图，文库包括新冠病人PBMC和正常人PBMC为对照组。
图2示出了噬菌体展示文库测序的质量报告图，包括新冠病人PBMC和正常人PBMC构建的文库。
图3示出了重组质粒RBD-PATX2琼脂糖凝胶电泳验证结果，以及纯化后的RBDSDS-PAGE电泳验证纯度，纯度大于90％。
图4示出了抗体不同稀释浓度下的ELISA结果。
图5A-5H示出了抗体中和实验结果，图5A示出了筛选到的抗体序列对SARS-CoV-2假病毒的抑制率；图5B-5H示出了抗体RBD-R3P1-A12、RBD-R3P2-A2、RBD-R3P2-B5、RBD-R3P1-B6、RBD-R3P1-E4和R3P2-G1对SARS-CoV-2真病毒(图5B-5H中：SARS-CoV2-NP或SARS-CoV-2-NP)的抑制率检测结果。
具体实施方式
定义
在本公开的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
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在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
如本公开所使用的，术语“SARS-CoV-2”，也被称为“2019-nCoV”，其含义为2019新型冠状病毒。
如本公开所使用的，术语“COVID-19”的含义为新型冠状病毒肺炎(Corona VirusDisease 2019)，简称“新冠肺炎”，是指2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染导致的肺炎。
本公开中的“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
本公开中的术语“噬菌体展示技术”，是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
本公开中的术语“抗体”，指免疫球蛋白或其片段或它们的衍生物，并且包括其包含的抗原结合位点的任何多肽，而不管其是否是在体外或体内产生。该术语包括，但不限于，多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的抗体。术语“抗体”还包括抗体片段例如Fab、F(ab’)2、FV、scFv、Fd、dAb和其它保留抗原结合功能的抗体片段。通常情况下，这样的片段将包括抗原结合片段。
本公开中的术语“单链抗体”(scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过有限个氨基酸的短肽(也被称为连接子，linker)连接而成的抗体。
本公开中的术语“外周血单个核细胞”(PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
本公开中的术语“RBD”，是指冠状病毒S蛋白受体结合域(receptor bindingdomain，RBD)RBD在病毒与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-convertingenzyme 2，ACE2)结合、进入宿主细胞过程中发挥重要作用。RBD对于新型冠状病毒具有良好的准确性和特异性，能够用于SARS-CoV-2的检测；与此同时，RBD在SARS-CoV-2入侵细胞的过程中发挥作用，识别并特异性结合RBD能够用于SARS-CoV-2所导致的疾病的治疗。
本公开中的术语“IMGT编号方案”，是Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入了新的标准化编号系统，包括来自抗体轻链和重链的可变结构域以及来自不同物种的T细胞受体链。所述IMGT编号方法基于种系V序列(germ-line V)比对连续计数残基。
在本公开所描述的技术方案中，除非特别说明，否则本公开中针对抗体所采用的抗体编号方案均为IMGT编号方案。
在一些技术方案中，本公开涉及用于限定两个多核苷酸互补程度的杂交条件严格性。可选的，前述多核苷酸可以选自DNA。本公开使用的“严格性”指杂交期间的温度和离子强度条件以及是否存在某些有机溶剂。严格性越高，靶核苷酸序列与经标记的多核苷酸序列之间的互补程度越高。“严格条件”指仅具有高频率互补碱基的核苷酸序列将杂交的温度和离子条件。本文使用的术语“在高严格性或非常高的严格性条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可见于Current Protocols in MolecμLarBiology，John Wiley和Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。本公开提及的具体杂交条件如下：1)高严格性杂交条件：在约45℃的6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，然后于65℃下用0.2XSSC、0.1％SDS洗涤一次或更多次；2)非常高严格性杂交条件：65℃的0.5M磷酸钠，7％SDS，然后于65℃下用0.2X SSC、1％SDS洗涤一次或更多次。
抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段
SARS-CoV-2 Spike蛋白由S1结构域和S2结构域组成，是新型冠状病毒感染并入侵细胞的关键之一。S1包含一个受体结合域(RBD)，可以特异性地结合靶细胞上的受体-血管紧张素转换酶2(ACE2)，是其感染过程中最关键的步骤。因此，普遍认为SARS-CoV-2SpikeProtein(RBD)对病毒的诊断具有潜在的价值。重组RBD蛋白疫苗是重要的新冠疫苗选择之一。
在一些实施方案中，RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，RBD的N端包含“MPLLLLLPLLWAGALA”的信号肽序列，可以有效提高RBD蛋白的表达。而RBD蛋白表达后经过翻译后的修饰，信号肽会被切割，不影响抗SARS-CoV-2抗体的筛选。RBD的基因序列如SEQID NO：2所示。人工合成RBD的基因序列，将RBD基因重组到表达载体PATX2中，得到RBD-PATX2表达载体，克隆位点为克隆位点EcoR1/Not1。
在一些实施方案中，将RBD-PATX2表达载体转染到HEK293F细胞系中培养，收集上清液进行镍柱纯化得到RBD蛋白。
在一些实施方案中，利用噬菌体展示技术筛选与RBD蛋白具有高亲和力的抗体或抗原结合片段。示例性的，与RBD蛋白具有高亲和力的抗体或抗原结合片段包括多克隆、单克隆、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的抗体，或者如Fab、F(ab’)2、FV、scFv、Fd、dAb和其它保留抗原结合功能的抗体片段。
具体的，本公开将COVID-19患者的PBMC取出，构建成包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的噬菌体展示文库，通过与RBD蛋白进行生物淘选，进而筛选到了能够特异性结合新型冠状病毒的人源抗体。
本公开中采用的分子生物学方法，均可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
实施例中采用的所有试剂，除非另有强调，否则均可以通过商业途径购买获得。
实施例1人源ScFv噬菌体展示文库的构建方法
表1 本实施例中使用的主要试剂
Figure BDA0002798169620000061
Figure BDA0002798169620000071
1.文库构建
1.1组装重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)
表2 PCR反应条件和步骤
Figure BDA0002798169620000072
其中，变性，退火，延伸(1)这三个步骤，重复30次。
引物序列：
Forward(F):
5′L-VH 1：ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG(SEQ ID NO：61)
5′L-VH 3：AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG(SEQ ID NO：62)
5′L-VH 4/6：CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG(SEQ ID NO：63)
5′L-VH 5/7：CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG(SEQ ID NO：64)
5′L Vκ1/2：ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG(SEQ ID NO：65)
5′L Vκ3：CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG(SEQ ID NO：66)
5′L Vκ4/5：ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG(SEQ ID NO：67)
5′L Vλ1：GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG(SEQ ID NO：68)
5′L Vλ2：GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG(SEQ ID NO：69)
5′L Vλ3：GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG(SEQ ID NO：70)
5′L Vλ4/5：GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG(SEQ ID NO：71)
5′L Vλ6：GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG(SEQ ID NO：72)
5′L Vλ7：GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG(SEQ ID NO：73)
5′L Vλ8/9/10：GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG(SEQ ID NO：74)
Reverse(R):
3′Cκ：TGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT(SEQ ID NO：75)
3′Cλ：CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG(SEQ ID NO：76)
PCR后琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。
1.2构建轻链可变区噬菌体展示文库
1.2.1准备pATA-scFv-2载体为文库克隆
1.2.2消化载体和PCR产物
表3 消化载体和PCR产物的反应体系
pATA-scFv-2载体 重链/轻链可变区PCR产物
载体或PCR产物 25μg 10μg
Fast Digest NheI 5μl 2μl
Fast Digest NotI 5μl 2μl
10×Fast Digest Buffer 25μl 10μl
ddH<sub>2</sub>O 添加至反应体系共250μL 添加至反应体系共100μL
1.2.3连接
表4 连接反应体系
T4 DNA Ligase(Thermo) 8μl
10×T4 DNA Ligase buffer 15μl
Vector(NheI/NotI) 1.5μg
VL fragment(NheI/NotI) 0.5μg
H<sub>2</sub>O 添加至反应体系共150μl
16℃孵育15h，65℃加热灭活10min。
1.2.4电转
1)TG1感受态细胞的制备。
2)37℃预温2ml SOC培养基(Sigma，S1797)。将电穿孔试管(0.2厘米的间隙)放在冰上(每个转换反应一个试管)。
3)从-80℃冰箱中取出电活性细胞，放在湿冰上，直到它们完全融化(5-10分钟)。细胞解冻后，轻轻拍打使其混合。
4)仔细移液管50μL DNA混合物倒入冷电穿孔试管不引入泡沫。快速地用你的手腕向下轻挥小口杯，将细胞沉淀到井底。
5)电穿孔600Ω，10μF和2.5kV。在脉冲后10秒内，立即在每个试管中加入2mL预加热SOC培养基。在37摄氏度下，220转/分钟，搅拌1小时。
6)收集所有的电转化介质。连续稀释10μL产物在100μL SOC中、并且在含有Amp/葡萄糖的LB培养基中传播。在37℃下放置过夜。通过菌落数量的计数，乘以培养体积，再除以电镀体积来计算转化子的总数。
1.3构建VL-VH噬菌体展示文库
1.3.1消化载体和PCR产物
表5 消化反应体系
Figure BDA0002798169620000091
1.3.2连接
表6 连接反应体系
T4 DNA Ligase(Thermo) 8μl
10×T4 DNA Ligase buffer 15μl
VL-vector(sfiI/XhoI) 1.5μg
VH(sfiI/XhoI) 0.45μg
H<sub>2</sub>O 添加至反应体系共150μl
16℃孵育15h，65℃加热灭活10min。
1.3.3电转
步骤同1.2.4
1.3.4文库评估
1)菌落PCR
以构建好的文库为模板，进行PCR
表7 PCR反应条件
Figure BDA0002798169620000092
其中，变性，退火，延伸(1)这三个步骤，重复30次。
Template:此处为构建好的抗体库
引物序列：
Forward(F):TGCTCGGGGATCCGAATTCT(SEQ ID NO：77)
Reverse(R):TCGAGTGCGGCCGCAAGCTT(SEQ ID NO：78)
2)测序
挑选阳性克隆送到武汉擎科生物科技有限公司测序。
测序质控结果如图2所示。
1.4表达RBD蛋白
人工合成RBD基因序列，将RBD基因重组到表达载体质粒PATX2中，得到RBD-PATX2表达载体；克隆位点EcoR1/Not1，RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，基因序列如SEQ IDNO：2所示；
将RBD-PATX2表达载体转染到HEK293F细胞系中培养，收集上清液进行镍柱纯化得到RBD蛋白；纯化后的RBD还需要进行SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)以验证其纯度。
重组质粒RBD-PATX2琼脂糖凝胶电泳验证结果及纯度验证琼脂糖凝胶电泳图如图3所示，纯化后的RBD SDS-PAGE电泳验证纯度，纯度大于90％。
实施例2与新冠病毒RBD特异性结合的单克隆抗体的制备
表8 本实施例中使用的主要试剂
试剂 编号 制造商
96-well plate 42592 Costar
Tween 20 P2287 Sigma
Tris RES3098T-B7 Sigma
Glycine G8200 Solarbio
PEG 181986 Sigma
PBS C10010500BT Life
BSA A104912-100g aladdin
Skim milk 6342932 BD
2.1第一轮
2.1.1生物淘选
(1)包被：用PBS稀释RBD重组蛋白至50μg/ml，取1ml至免疫管中，4℃包被过夜。
(2)洗涤：弃掉免疫管中液体，用5ml 0.05％PBST洗涤免疫管三遍。
(3)封闭：在免疫管中加入5ml 5％脱脂牛奶(PBS溶解)，30度孵育2个小时。
(4)洗涤：弃掉免疫管中液体，用5ml 0.05％PBST洗涤免疫管三遍。
(5)孵育：用1％脱脂牛奶(PBS溶解)稀释噬菌体文库至滴度为1*1012pfu/ml。取1m加入至免疫管中，室温温柔振荡孵育2个小时。
(6)洗涤：弃掉免疫管中液体，用5ml 0.05％PBST洗涤免疫管三遍。
(7)洗脱：用1ml的甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱与RBD结合的噬菌体，再用Tris-HCl中和至pH 7.0。
2.1.2测定稀释噬菌体的滴度
(1)培养大肠杆菌TG1直到OD600＝0.4-0.6。
(2)混合10μL稀释的洗脱后噬菌体和190μL大肠杆菌TG1。
(3)培养混合物在37℃30分钟，然后倒到2×YT-A(Amp 100μg/ml)培养基中。将培养基倒扣培养在37℃处过夜。
2.1.3噬菌体文库扩增
(1)将10μl E.coli TG1加到800μl of 2YT培养液中在37℃混合培养知道OD600＝0.4-0.6.
(2)将培养至对数期的TG1转入10ml 2YT-G(终浓度2％葡萄糖)培养液，在摇床上37℃培养至OD600＝0.4-0.6。
(3)加入洗脱后的产物，37℃孵育30分钟，37℃摇床摇30分钟。
(4)加入30ml 2YT-AG培养液(终浓度0.1％Amp，2％葡萄糖)，37℃摇床培养1小时。(5)加入M13KO7(M13KO7:TG1＝20:1)，37℃孵育30分钟，37℃摇床30分钟。
(6)菌液在5000rpm离心10分钟。用40ml2YT-AK重悬，30℃摇床孵育过夜。
(7)8000rpm离心10分钟，取出上清，用1ml PBS重悬，12000rpm离心5分钟，将上清转移至新的1.5ml离心管。
2.1.4扩增后的噬菌体文库滴度测定
步骤同2.1.2
2.2第二轮到第四轮
2.2.1生物淘选
循环重复步骤2.1三次，每次投入的噬菌体文库均用前一轮扩增后的洗脱噬菌体。
表9 生物淘选的结果
Figure BDA0002798169620000111
2.3多克隆噬菌体ELISA
(1)包被：抗原组：用PBS稀释RBD重组蛋白至4μg/ml，每孔100ul加入到酶标板中，4℃包被过夜。对照组：酶标板中，每孔加入100ul PBS，4℃包被过夜。
(2)洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl，0.05％PBST洗涤三遍。
(3)封闭：酶标板中每孔加入300μl，5％脱脂牛奶(PBS溶解)，30度孵育2个小时。
(4)洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl，0.05％PBST洗涤三遍。
(5)噬菌体孵育：用1％脱脂牛奶(PBS溶解)稀释每轮扩增后的洗脱噬菌体至要求滴度。每孔100μl加入到酶标板中，室温温柔振荡孵育2个小时。
(6)洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl，0.05％PBST洗涤三遍。
(7)二抗孵育：用1％脱脂牛奶(PBS溶解)稀释抗-M13-HRP抗体(1:5000)。每个孔中加100μl，37℃孵育1小时。
(8)洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl，0.05％PBST洗涤三遍。
(9)显色：每孔加100μL TMB，室温孵育，每孔再加100μL 2M HCl终止反应，酶标仪上读取OD450nm-OD630nM的数值。
表10 多克隆噬菌体ELISA的结果
Figure BDA0002798169620000121
2.4单克隆噬菌体ELISA(根据多克隆结果选用第三轮洗脱产物进行多克隆)
(1)洗脱噬菌体侵染：取一部分稀释过后的第三轮洗脱噬菌体，与200ul处于对数期的大肠杆菌TG1混合。混合物在37℃孵育30分钟后倒到2×YT-A(Amp 100μg/ml)固体培养基上。37℃培养过夜。
(2)单克隆phage扩增：从侵染后的平板上挑取196个单克隆，分别接入600ul 2×YT-A(Amp 100μg/ml)液体培养基中，37℃振荡培养2h，加入适量的辅助噬菌体M13KO7，(M13KO7:TG1＝20:1)，37℃孵育30分钟，37℃摇床30分钟。菌液在4000rpm离心10分钟。用600ul 2YT-AK(Amp 100μg/ml，Kan 50μg/ml)重悬，30℃摇床孵育过夜。次日，8000rpm离心菌液10分钟，取出上清备用。
(3)包被：抗原组：用PBS稀释RBD重组蛋白至4μg/ml，每孔100ul加入到酶标板中，4℃包被过夜。对照组：酶标板中，每孔加入100ul PBS，4℃包被过夜。
(4)洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl，0.05％PBST洗涤三遍。
(5)封闭：酶标板中每孔加入300μl，5％脱脂牛奶(PBS溶解)，30度孵育2个小时。
(6)洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl，0.05％PBST洗涤三遍。
(7)噬菌体孵育：每孔100μl单克隆培养物上清加入到酶标板中，室温温柔振荡孵育2个小时。
(8)洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl，0.05％PBST洗涤三遍。
(9)二抗孵育：用1％脱脂牛奶(PBS溶解)稀释抗-M13-HRP抗体(1:5000)。每个孔中加100μl，37℃孵育1小时。
(10)洗涤：弃掉酶标板中液体，每孔用300μl，0.05％PBST洗涤三遍。
(11)显色：每孔加100μL TMB，室温孵育，每孔再加100μL 2M HCl终止反应，酶标仪上读取OD450nm-OD630nM的数值。
表11 单克隆噬菌体ELISA的结果
第一块板(R3P1)96个单克隆ELISA结果
Figure BDA0002798169620000122
Figure BDA0002798169620000132
第二块板(R3P2)96个单克隆ELISA结果
Figure BDA0002798169620000134
我们将抗原组大于3倍对照组的克隆定为阳性克隆，将阳性克隆送去测序。排除掉错误抗体序列和重复抗体序列，最终得到了6条高亲和力的抗体序列。高特异性抗体的序列如下。
Figure BDA0002798169620000141
Figure BDA0002798169620000151
2.5抗体序列的测序
筛选得到的噬菌体阳性克隆，进行全序列测序，得到相应的抗体重链轻链，以及全序列如下：
RBD-R3P1-A12抗体的氨基酸序列为如SEQ ID NO：3所示的序列；
RBD-R3P1-A12抗体的核苷酸序列为如SEQ ID NO：4所示的序列；
RBD-R3P2-A2抗体的氨基酸序列为如SEQ ID NO：5所示的序列；
RBD-R3P2-A2抗体的核苷酸序列为如SEQ ID NO：6所示的序列；
RBD-R3P2-B5抗体的氨基酸序列为如SEQ ID NO：7所示的序列；
RBD-R3P2-B5抗体的核苷酸序列为如SEQ ID NO：8所示的序列；
RBD-R3P1-B6抗体的氨基酸序列为如SEQ ID NO：9所示的序列；
RBD-R3P1-B6抗体的核苷酸序列为如SEQ ID NO：10所示的序列；
RBD-R3P1-E4抗体的氨基酸序列为如SEQ ID NO：11所示的序列；
RBD-R3P1-E4抗体的核苷酸序列为如SEQ ID NO：12所示的序列；
RBD-R3P2-G1抗体的氨基酸序列为如SEQ ID NO：13所示的序列；
RBD-R3P2-G1抗体的核苷酸序列为如SEQ ID NO：14所示的序列；
RBD-R3P1-A12抗体重链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：15所示的序列；
RBD-R3P1-A12抗体重链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：16所示的序列；
RBD-R3P1-A12抗体轻链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：17所示的序列；
RBD-R3P1-A12抗体轻链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：18所示的序列；
RBD-R3P2-A2抗体重链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：19所示的序列；
RBD-R3P2-A2抗体重链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：20所示的序列；
RBD-R3P2-A2抗体轻链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：21所示的序列；
RBD-R3P2-A2抗体轻链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：22所示的序列；
RBD-R3P2-B5抗体重链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：23所示的序列；
RBD-R3P2-B5抗体重链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：24所示的序列；
RBD-R3P2-B5抗体轻链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：25所示的序列；
RBD-R3P2-B5抗体轻链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：26所示的序列；
RBD-R3P1-B6抗体重链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：27所示的序列；
RBD-R3P1-B6抗体重链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：28所示的序列；
RBD-R3P1-B6抗体轻链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：29所示的序列；
RBD-R3P1-B6抗体轻链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：30所示的序列；
RBD-R3P1-E4抗体重链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：31所示的序列；
RBD-R3P1-E4抗体重链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：32所示的序列；
RBD-R3P1-E4抗体轻链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：33所示的序列；
RBD-R3P1-E4抗体轻链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：34所示的序列；
RBD-R3P2-G1抗体重链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：35所示的序列；
RBD-R3P2-G1抗体重链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：36所示的序列；
RBD-R3P2-G1抗体轻链的氨基酸序列为如SEQ ID NO：37所示的序列；
RBD-R3P2-G1抗体轻链的核苷酸序列为如SEQ ID NO：38所示的序列；
RBD-R3P1-A12、RBD-R3P2-A2、RBD-R3P2-B5、RBD-R3P1-B6、RBD-R3P1-E4或RBD-R3P2-G1抗体重链的CDR1的氨基酸序列为如SEQ ID NO：39所示的序列；
RBD-R3P1-A12、RBD-R3P2-A2、RBD-R3P2-B5、RBD-R3P1-B6、RBD-R3P1-E4或RBD-R3P2-G1抗体重链的CDR2的氨基酸序列为如SEQ ID NO：40所示的序列；
RBD-R3P1-A12、RBD-R3P2-A2、RBD-R3P2-B5、RBD-R3P1-B6、RBD-R3P1-E4或RBD-R3P2-G1抗体重链的CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO：41所示的序列；
RBD-R3P1-A12抗体轻链的CDR1的氨基酸序列为如SEQ ID NO：42所示的序列；
RBD-R3P1-A12抗体轻链的CDR2的氨基酸序列为如SEQ ID NO：43所示的序列；
RBD-R3P1-A12抗体轻链的CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO：44所示的序列；
RBD-R3P2-A2抗体轻链的CDR1的氨基酸序列为如SEQ ID NO：45所示的序列；
RBD-R3P2-A2抗体轻链的CDR2的氨基酸序列为如SEQ ID NO：46所示的序列；
RBD-R3P2-A2抗体轻链的CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO：47所示的序列；
RBD-R3P2-B5抗体轻链的CDR1的氨基酸序列为如SEQ ID NO：48所示的序列；
RBD-R3P2-B5抗体轻链的CDR2的氨基酸序列为如SEQ ID NO：49所示的序列；
RBD-R3P2-B5抗体轻链的CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO：50所示的序列；
RBD-R3P1-B6抗体轻链的CDR1的氨基酸序列为如SEQ ID NO：51所示的序列；
RBD-R3P1-B6抗体轻链的CDR2的氨基酸序列为如SEQ ID NO：52所示的序列；
RBD-R3P1-B6抗体轻链的CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO：53所示的序列；
RBD-R3P1-E4抗体轻链的CDR1的氨基酸序列为如SEQ ID NO：54所示的序列；
RBD-R3P1-E4抗体轻链的CDR2的氨基酸序列为如SEQ ID NO：55所示的序列；
RBD-R3P1-E4抗体轻链的CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO：56所示的序列；
RBD-R3P2-G1抗体轻链的CDR1的氨基酸序列为如SEQ ID NO：57所示的序列；
RBD-R3P2-G1抗体轻链的CDR2的氨基酸序列为如SEQ ID NO：58所示的序列；
RBD-R3P2-G1抗体轻链的CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO：59所示的序列；
连接子氨基酸序列为如SEQ ID NO：60所示的序列。
实施例3ELISA检测抗体不同稀释浓度条件下的OD值
酶联免疫吸附反应ELISA实验步骤：
1、将MES粉末(SIGMA，Lot#SLBZ3485)用ddH2O配制成0.1M、pH＝6.0的MES buffer；2、将EDC(C8H17N3，Thermo Scientific，Lot#TB257918)用ddH2O稀释成10mg/ml。
2、将抗体用0.1M的MES buffer稀释成4μg/ml或者按梯度稀释，计算EC50。
3、在微孔板设阴性对照，每孔中加入10μl EDC溶液和50μl多肽溶液；其余孔中加入10μl EDC溶液和50μl MES buffer。轻轻震动混匀。用不干胶条封板后于4℃过夜或室温放置两个小时以上。
4、去掉不干胶条，吸去孔内液体，每孔加300μl ddH2O，静置2分钟，弃去液体，拍干板子。再重复以上步骤2次。
5、用1X PBST配制1％BSA的封闭液(10X PBST：Solarbio，Cat#P1033-500；BSA:Solarbio，Cat#A8020)，每孔加入200μl封闭液，室温封闭1小时。
6、弃去孔内液体，拍干板子。将RBD蛋白用封闭液按1:500稀释，每孔加入100μl稀释血清，室温反应1小时。
7、弃去孔内液体，每孔加300μl 1XPBST，静置2分钟，弃去液体，拍干板子。再重复以上步骤2次。
8、将HRP标记的Goat Anti-Human IgG(Cwbio，Cat#CW0169S)用封闭液按1：5000稀释，每孔100μl，室温反应40分钟。
9、重复操作步骤7，用1XPBST洗板5次。
10、每孔加入TMB-ELISA显色液(Thermo Scientific，Lot#TK2666052)100μl，避光反应5-15分钟。
11、每孔加入2M H2SO4溶液50μl终止反应。
12、将酶标仪设定波长450nm测量各孔OD值，应在终止反应后30分钟内读值。
根据抗体稀释梯度与RBD结合能力，计算出EC50，结果如图4所示。我们自产6个RBD抗体与文献中报道抗体S309、CR3022对比结果，自产抗体与RBD的亲和力优于S309。
实施例4中和实验
4.1实验前准备
4.1.1平衡试剂
将保存在2-8℃的试剂(胰酶，DMEM完全培养基)取出，至室温平衡，30分钟以上
4.1.2操作人员
由经过培训的实验操作人员进行操作，实验操作前，在清洁区内更衣(穿好一次性无菌衣，换好工作鞋，戴好口罩，帽子，一次性医用乳胶手套)方可进入实验区内，进行实验操作。
4.2实验操作
4.2.1将待检测的血清(或血浆)于56℃水浴灭活30min，6000g离心3min，将上清转移至1.5ml离心管中待用。
4.2.2取96孔板，于第2列(细胞对照CC，见表2)加入DMEM完全培养基(1％双抗，25mM HEPES，10％FBS)150μl/孔，于第3～11列(第3列为病毒对照组VV，第4～11列为样品孔)加入DMEM完全培养基100μl/孔，于B4～B11孔中再加入DMEM完全培养基42.5μl/孔。
4.2.3于B4和B5孔加入血浆样品1(7.5μl)……以此类推，于B10和B11孔加入血浆样品4(7.5μl)。
4.2.4将多道移液器调至50μl，对B4～B11孔中液体轻柔的反复吹吸6～8次充分混匀，然后转移50μl液体至对应的C4～C11中吸弃50μl液体，加样顺序和加样方式参照表12。
表12 加样顺序和加样方式
Figure BDA0002798169620000181
4.2.5用DMEM完全培养基将假病毒稀释至2*104TCID50/ml(按提供的稀释倍数稀释)，于第3～11列每孔加50μl，使每孔含假病毒的量为1*103/孔。
4.2.6将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO2)孵育1小时。
4.2.7当孵育时间至半小时，取出培养箱中事先准备好的Huh-7细胞(汇合率达80％～90％)，以T75培养瓶为例，吸弃瓶中的培养基，加入5ml PBS缓冲液清洗细胞，倾去PBS后，加入3ml 0.25％胰酶-EDTA，使其浸没细胞消化1分钟，倾去胰酶，置于细胞培养箱中消化5分钟，轻轻拍打培养瓶侧壁使细胞脱落，加入10ml培养基中和胰酶，吹打几次后转移至离心管中，210g离心5分钟，倾去上清，用10ml DMEM完全培养基重悬细胞，细胞计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至5*105个/ml。
4.2.8孵育至1小时，向96孔板中每孔加100μl细胞，使每孔细胞为5*104个。
4.2.9将96孔板前后左右轻轻晃动，使细胞在孔中分散均匀，将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO2培养20～28小时。
4.2.10 20～28小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150μl上清，然后加入100μl荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min。
4.2.11反应结束后，用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸6～8次，使细胞充分裂解，从每孔中吸出150μl液体，加入对应96孔化学发光检测板中，置于化学发光检测仪中读取发光值。
4.2.12计算中和抑制率：抑制率＝[1-(样品组的发光强度均值-空白对照CC均值)/(阴性组的发光强度VC均值-空白对照CC均值)]*100％。
4.2.13根据中和抑制率结果，利用Reed-Muench法计算IC50。图5示出中和实验结果图。其中，图5A示出了筛选到的抗体序列对SARS-CoV-2假病毒的抑制率；图5B-5H示出了抗体RBD-R3P1-A12(图5B：A12)、RBD-R3P2-A2(图5D、5G：A2)、RBD-R3P2-B5(图5C：B5)、RBD-R3P1-B6(图5E：B6)、RBD-R3P1-E4(图5B、5H：E4)和R3P2-G1(图5F：G1)对SARS-CoV-2真病毒(图5B-5H中：SARS-CoV2-NP或SARS-CoV-2-NP)的抑制率检测结果，其中抗体浓度-1，-2，-3分别代表浓度63ng,250ng,1ug。根据六个RBD抗体SARS-CoV-2假病毒和真病毒中和实验结果，E4结果最明显，对真病毒有明显的抑制作用。
本公开并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，提供所述实施方案例如来说明本公开的各方面。从本文的描述和教导，对所述组合物和方法的各种修改将变得明显。可以在不脱离本公开的真正范围和精神的情况下实践这类变化，并且这类变化旨在落入本公开的范围内。
序列表
<110> 苏州方科生物科技有限公司
苏州系统医学研究所
<120> 新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途
<130> 6A59-2093437I
<141> 2020-11-25
<160> 78
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
20 25 30
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
35 40 45
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
50 55 60
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
65 70 75 80
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
85 90 95
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
100 105 110
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
115 120 125
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
130 135 140
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
145 150 155 160
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
165 170 175
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
180 185 190
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
195 200 205
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
210 215 220
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Ser
225 230 235 240
Gly His His His His His His
245
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<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgcctctgc tgctgctgct ccccctgctg tgggccggag ctctggctag ggtgcagccc 60
accgagagca tcgtgaggtt ccccaatatc acaaatctgt gtcccttcgg cgaggtgttt 120
aacgccacca ggtttgcctc cgtgtacgcc tggaatagga agagaatcag caattgtgtg 180
gccgactaca gcgtgctgta caattccgcc agcttctcca ccttcaagtg ctacggcgtg 240
agccccacca agctgaatga cctgtgtttt accaatgtgt acgccgacag cttcgtgatc 300
aggggcgatg aggtgaggca gatcgccccc ggccagacag gcaagatcgc cgattacaat 360
tacaagctgc ctgatgattt taccggctgt gtgatcgcct ggaatagcaa taacctggat 420
agcaaggtgg gcggcaacta caattacctg tacagactgt ttagaaagtc caacctgaag 480
cccttcgaga gggacatcag caccgagatc taccaggccg gctccacacc ttgtaacggc 540
gtggagggct tcaactgcta ctttcccctg cagagctacg gcttccagcc caccaatggc 600
gtgggctacc agccttacag agtggtggtg ctgagctttg agctgctgca cgcccccgcc 660
accgtgtgtg gacctaagaa gagcaccaat ctggtgaaga ataagtgcgt gaacttcagc 720
ggccaccacc accaccatca c 741
<210> 3
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Leu Ser Glu Lys Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
180 185 190
Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
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<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caggtgcagc tggtgcaatc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggggt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg ggcttgagtg ggtctcactt atttatcccg gtggtagcac atactacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaggaacac gctgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatctttca 300
gaaaaggggg gtatggacgt ctggggccaa gggaccctgg tcaccgtctc gagtggtggt 360
ggcggttctg gtggtggtgg tagcggtggc ggtggtagtg gcggtggcgg tgctagcgaa 420
attgtaatga cacagtctcc aggcaccctg tctttgtctc caggggaaag agccaccctc 480
tcctgcaggg ccagtcagag tgttagcagc agctacttag cctggtacca gcagaaacct 540
ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccagca gggccactgg catcccagac 600
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag actggagcct 660
gaggattttg cagtgtatta ctgtcagcag tatggtagct caccgtggac gttcggccaa 720
gggaccaagg tggagatcaa a 741
<210> 5
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Leu Ser Glu Lys Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Ser Val Leu Pro Leu Phe Pro Gly Glu Ser Gly Ser Leu
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Asp Phe Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Asn
180 185 190
Arg Pro Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val
210 215 220
Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Pro Ile Thr Phe Gly Pro
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Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
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tcctgtgcag cctctggggt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg ggcttgagtg ggtctcactt atttatcccg gtggtagcac atactacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaggaacac gctgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatctttca 300
gaaaaggggg gtatggacgt ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc gagtggtggt 360
ggcggttctg gtggtggtgg tagcggtggc ggtggtagtg gcggtggcgg tgctagcgaa 420
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tcctgcaggg ccagtcagaa tgttggcgac ttcttagcct ggtaccagca taaacctggc 540
caggctccca agctcctcat ctatggtgca accaacaggc ccactggcat ccccgacagg 600
ttcagtggca ccgggtctgg gacagacttc acgctgacca tcagtagaat ggaacctgaa 660
gattttgcag tgtacttctg tcagcaatac gggacctcac cgcctatcac tttcggccct 720
gggaccaaag tggatatcaa a 741
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<213> Artificial Sequence
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ser Asn
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Leu Ser Glu Lys Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu Ile Val Met Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu
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Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Val Ser Arg Phe Phe Ser Trp Tyr Gln
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Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile His Thr Ala Ser Thr
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Arg Ala Thr Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr
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Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Ser Ala Met
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Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gly Ala Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly
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gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaggaacac gctgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatctttca 300
gaaaaggggg gtatggacgt ctggggccaa gggaccctgg tcaccgtctc gagtggtggt 360
ggcggttctg gtggtggtgg tagcggtggc ggtggtagtg gcggtggcgg tgctagcgaa 420
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Arg Phe Gly Pro Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 12
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
caggtgcagc tggtgcaatc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggggt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg ggcttgagtg ggtctcactt atttatcccg gtggtagcac atactacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaggaacac gctgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatctttca 300
gaaaaggggg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc gagtggtggt 360
ggcggttctg gtggtggtgg tagcggtggc ggtggtagtg gcggtggcgg tgctagcgac 420
atcgtgatga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 480
acttgccggg ccagtcaggg cattagcagt tatttagcct ggtatcagca aaaaccaggg 540
aaagccccta agctcctgat ctatgctgca tccactttgc aaagtggggt cccatcaagg 600
ttcagcggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcagcctgaa 660
gattttgcaa cttattactg tcaacaactt aatagttacc cccggtttgg acctgggacc 720
aaggtggaga tcaaa 735
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<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Leu Ser Glu Lys Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Gln Ala Val Leu Thr
130 135 140
Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr
145 150 155 160
Cys Gly Gly Asn His Ile Gly Ser Lys Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Ser Asp Ser Asp Arg
180 185 190
Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asp Thr
195 200 205
Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Arg Ser Asp His Trp Val Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
245
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<211> 741
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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caggtgcagc tggtgcaatc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggggt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaggg ggcttgagtg ggtctcactt atttatcccg gtggtagcac atactacgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaggaacac gctgtatctt 240
caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatctttca 300
gaaaaggggg gtatggacgt ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc gagtggtggt 360
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gctgtgctga ctcagccacc ctcagtgtca gtggccccag gaaagacggc cagaataacc 480
tgtgggggaa accacattgg aagtaagagt gtgaactggt accagcagaa gtcaggccag 540
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Asp Leu Ser Glu Lys Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<213> Artificial Sequence
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caggtgcagc tggtgcaatc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
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<213> Artificial Sequence
<400> 17
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gaaattgtaa tgacacagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Asp Leu Ser Glu Lys Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
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Met Val Thr Val Ser Ser
115
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caggtgcagc tggtgcaatc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
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<213> Artificial Sequence
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Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Val Leu Pro Leu Phe Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Gly Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Gly Asp Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Arg Pro Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Thr Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Pro
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Pro
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Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
gaaatagtga tgacgcagtc tcccagtgtt ctgcctctgt ttccaggaga aagcggctcc 60
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<213> Artificial Sequence
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
caggtgcagc tggtgcaatc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
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<213> Artificial Sequence
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Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Val Ser Arg Phe
20 25 30
Phe Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<213> Artificial Sequence
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<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Leu Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Asp Leu Ser Glu Lys Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
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Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
caggtgcagc tggtgcaatc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
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<213> Artificial Sequence
<400> 29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaattgtgc tgactcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
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<213> Artificial Sequence
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Leu Ile Tyr Pro Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Asp Leu Ser Glu Lys Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
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Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<213> Artificial Sequence
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caggtgcagc tggtgcaatc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
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<213> Artificial Sequence
<400> 33
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Arg
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Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
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<213> Artificial Sequence
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Val Ser Ser Asn
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115
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<211> 354
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
caggtgcagc tggtgcaatc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggggt caccgtcagt agcaactaca tgagctgggt ccgccaggct 120
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gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaggaacac gctgtatctt 240
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<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 37
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn His Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
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35 40 45
Ser Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
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Asn Ser Gly Asp Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
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Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 38
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
caggctgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccagaata 60
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caggcccctg tgctggtcat ctattctgat agcgaccggc cctcagggat acctgcgcga 180
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 39
Gly Val Thr Val Ser Ser Asn Tyr
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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1 5
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Ala Arg Asp Leu Ser Glu Lys Gly Gly Met Asp Val
1 5 10
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<400> 42
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1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 43
Gly Ala Ser
1
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 44
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
1 5
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<213> Artificial Sequence
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1 5
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Gly Ala Thr
1
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<400> 47
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<400> 48
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 49
Thr Ala Ser
1
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 50
Gln His Tyr Gly Ala Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 51
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 52
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 52
Gly Ala Ser
1
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 53
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gly Thr
1 5
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 54
Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 55
Ala Ala Ser
1
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 56
Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Arg
1 5
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<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 57
His Ile Gly Ser Lys Ser
1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 58
Ser Asp Ser
1
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 59
Gln Val Trp Asp Asn Arg Ser Asp His Trp Val
1 5 10
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<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 60
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ala Ser
20
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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acaggtgccc actcccaggt gcag 24
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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aaggtgtcca gtgtgargtg cag 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 63
cccagatggg tcctgtccca ggtgcag 27
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 64
caaggagtct gttccgaggt gcag 24
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<211> 25
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<213> Artificial Sequence
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atgaggstcc cygctcagct gctgg 25
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ctcttcctcc tgctactctg gctcccag 28
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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atttctctgt tgctctggat ctctg 25
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ggtcctgggc ccagtctgtg ctg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 69
ggtcctgggc ccagtctgcc ctg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<211> 23
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ggtccaattc ycaggctgtg gtg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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tgctgtcctt gctgtcctgc t 21
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caccagtgtg gccttgttgg cttg 24
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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tgctcgggga tccgaattct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 78
tcgagtgcgg ccgcaagctt 20

Claims (19)

1.一种抗SARS-CoV-2抗体或其抗原结合片段，所述抗体特异性地结合所述SARS-CoV-2表位，其中，所述SARS-CoV-2表位包含如SEQ ID NO：1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，其中，编码所述重链可变区的序列包含如SEQ ID NO：39-41任一项所示的序列。
3.根据权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，其中，编码所述轻链可变区的序列包含如下所示序列中的一种或多种：
(a1)如SEQ ID NO：42-44任一项所示的序列；
(a2)如SEQ ID NO：45-47任一项所示的序列；
(a3)如SEQ ID NO：48-50任一项所示的序列；
(a4)如SEQ ID NO：51-53任一项所示的序列；
(a5)如SEQ ID NO：54-56任一项所示的序列；
(a6)如SEQ ID NO：57-59任一项所示的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含连接子，其中，编码所述连接子的序列包含如SEQ ID NO：60所示的序列。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述VH包含VH互补决定区(CDR)1、VH互补决定区(CDR)2和VH互补决定区(CDR)3，以及所述VL包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中，
所述VH由如下氨基酸编码：VHCDR1包含如SEQ ID NO：39所示的氨基酸序列，VHCDR2包含如SEQ ID NO：40所示的氨基酸序列，和VHCDR3包含如SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列；并且
所述VL由如下氨基酸编码：VLCDR1包含如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：57任一项所示的氨基酸序列，VLCDR2包含如SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：55或SEQ ID NO：58任一项所示的氨基酸序列，和VLCDR3包含如SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：59任一项所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中，编码所述抗体或其抗原结合片段包含如下所示序列中的一种或多种：
(b1)VH包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；
(b2)VH包含如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列；
(b3)VH包含如SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；
(b4)VH包含如SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列；
(b5)VH包含如SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列；
(b6)VH包含如SEQ ID NO：35所示的氨基酸序列，和VL包含如SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列；
(b7)如SEQ ID NO：3、5、7、9、11或13所示的氨基酸序列。
7.一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自(a)-(d)中的任一项：
(a)包含如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：36或SEQ ID NO：38任一序列或其任意组合所示的核苷酸序列；
(b)包含如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：36或SEQ ID NO：38任一序列或其任意组合所示的核苷酸序列的反向互补序列的核苷酸序列；
(c)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(a)-(b)中的任一项所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(d)与(a)-(c)中的任一项所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自(e)-(h)中的任一项：
(e)包含如SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22所示的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26所示的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列，包含如SEQ ID NO：32和SEQID NO：34所示的核苷酸序列，或包含如SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列；
(f)包含如(e)所示的核苷酸序列的反向互补序列的核苷酸序列；
(g)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(e)-(f)中的任一项所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(h)与(e)-(g)中的任一项所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自(i)-(l)中的任一项：
(i)包含如SEQ ID NO：4、6、8、10、12或14任一序列所示的核苷酸序列；
(j)包含如SEQ ID NO：4、6、8、10、12或14任一序列所示的序列的反向互补序列的核苷酸序列；
(k)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)-(j)中的任一项所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(l)与(i)-(k)中的任一项所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。
10.一种载体，其中，所述载体包含根据权利要求7-9任一项所述的多核苷酸。
11.一种分离的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含如权利要求10所述的载体。
12.一种制备稳定表达目标蛋白的宿主细胞的方法，其中，所述方法包含利用权利要求10所述的载体，转化初始宿主细胞的步骤；可选的，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
13.一种制备目标蛋白的方法，所述方法包含利用权利要求11所述的宿主细胞、或通过权利要求12所述的方法，制备所述目标蛋白。
14.一种抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段为权利要求13所述的方法制备。
15.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含根据权利要求1-6任一项或权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段。
16.权利要求15所述的试剂盒在制备用于检测COVID-19的试剂盒中的应用。
17.一种药物组合物或疫苗，其中，所述药物组合物或疫苗中含有根据权利要求1-6任一项或权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段。
18.权利要求1-6任一项或权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求17所述的药物组合物或疫苗在制备用于治疗或预防COVID-19的药物的应用。
19.一种治疗或预防COVID-19的方法，其中，将权利要求1-6任一项或权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求17所述的药物组合物或疫苗给予动物。
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113880947A (zh) * 2021-07-26 2022-01-04 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 小分子抗体及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物
CN114213531A (zh) * 2021-12-07 2022-03-22 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗新型冠状病毒中和抗体、其抗原结合片段及其应用
CN114230658A (zh) * 2022-01-24 2022-03-25 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 新型冠状病毒特异性t细胞受体和其用途
WO2022110742A1 (zh) * 2020-11-25 2022-06-02 苏州方科生物科技有限公司 新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途
WO2022240887A1 (en) * 2021-05-10 2022-11-17 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods for detecting and staging cellular viral immune responses
EP4147716A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-15 Samatva Research Corporation Anti-virus moiety immobilised in a matrix
US11732030B2 (en) 2020-04-02 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
US11999777B2 (en) 2020-06-03 2024-06-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111592594A (zh) * 2020-03-13 2020-08-28 北京大学 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
CN111690058A (zh) * 2020-03-30 2020-09-22 三优生物医药(上海)有限公司 针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途
CN111793129A (zh) * 2020-07-28 2020-10-20 上海市公共卫生临床中心 一种特异性结合冠状病毒的抗体或其抗原结合片段

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113336846B (zh) * 2020-06-04 2023-11-10 山东宽和正生物医药有限公司 针对新冠病毒SARS-CoV-2的单克隆抗体E11
CN111978395B (zh) * 2020-07-20 2022-06-10 四川大学 抗新型冠状病毒rbd结构域抗原的单克隆抗体
CN111978378B (zh) * 2020-08-10 2022-02-01 武汉大学 SARS-CoV-2抗原多肽及其应用
CN112574299B (zh) * 2020-11-25 2023-03-21 苏州方科生物科技有限公司 新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111592594A (zh) * 2020-03-13 2020-08-28 北京大学 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
CN111690058A (zh) * 2020-03-30 2020-09-22 三优生物医药(上海)有限公司 针对冠状病毒的具有中和活性的抗体及其用途
CN111793129A (zh) * 2020-07-28 2020-10-20 上海市公共卫生临床中心 一种特异性结合冠状病毒的抗体或其抗原结合片段

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11732030B2 (en) 2020-04-02 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
US11999777B2 (en) 2020-06-03 2024-06-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies
WO2022110742A1 (zh) * 2020-11-25 2022-06-02 苏州方科生物科技有限公司 新型冠状病毒特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途
WO2022240887A1 (en) * 2021-05-10 2022-11-17 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods for detecting and staging cellular viral immune responses
CN113880947A (zh) * 2021-07-26 2022-01-04 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 小分子抗体及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物
EP4147716A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-15 Samatva Research Corporation Anti-virus moiety immobilised in a matrix
WO2023037119A1 (en) * 2021-09-10 2023-03-16 Samatva Research Corporation Anti-virus moiety immobilised in a matrix
CN114213531A (zh) * 2021-12-07 2022-03-22 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗新型冠状病毒中和抗体、其抗原结合片段及其应用
CN114213531B (zh) * 2021-12-07 2023-04-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗新型冠状病毒中和抗体、其抗原结合片段及其应用
CN114230658A (zh) * 2022-01-24 2022-03-25 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 新型冠状病毒特异性t细胞受体和其用途
CN114230658B (zh) * 2022-01-24 2024-03-29 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 新型冠状病毒特异性t细胞受体和其用途

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