MX2013009258A - Antagonistas de pcsk9. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos antagonistas contra la proproteína de convertasa-subtilisina/quexina tipo 9a ("PCSK9"), y métodos de uso de estos anticuerpos.

Description

ANTAGONISTAS DE PCSK9 REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES DE PATENTE RELAC IONADAS La presente solicitud proclama el beneficio de prioridad para la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica N úmero 61 /442 , 1 26, presentada el 1 1 de febrero de 201 1 , la cual se incorpora como referencia para todos los propósitos.

CAM PO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a antagonistas de anticuerpos contra PCSK9.

ANTEC EDENT ES DE LA I NVEN C IÓN El receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) previene la ateroesclerosis y la h ipercolesterolemia mediante la eliminación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) en la corriente sangu ínea. El LDL-R se reg ula al nivel posterior a la traducción mediante la pro-proteína de convertasa-subtilisina / quexina tipo 9a ("PCSK9"). Recientemente , se reportó la eliminación genética de PCSK9 en los ratones . Estos ratones mostraron una reducción aproximada del 50 por ciento en los niveles de colesterol en plasma , y mostraron u na mejor sensibilidad a las estatinas para reducir el colesterol en plasma (Rashid S y colaboradores (2005) Proc Nati Acad Sci 1 02: 5374-5379. Los datos genéticos humanos también apoyan el papel de la PCSK9 en la homeostasia de LDL. Recientemente se identificaron dos mutaciones que son presu miblemente mutaciones de "pérdida de función" en la PCSK9. Los individuos con estas mutaciones tienen una reducción de aproximadamente el 40 por ciento en los niveles en plasma de LDL-C, lo cual se traduce a una disminución aproximada del 50 al 90 por ciento en la enfermedad cardíaca coronaria. Tomados juntos, estos estudios indican que un inhibidor de PCSK9 sería benéfico para reducir las concentraciones en plasma de LDL-C y otras condiciones de enfermedad mediadas por PCSK9 y se podría co-administrar, por ejemplo, con un segundo agente útil para reducir el colesterol, para tener mayor eficacia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos que se enlazan a, y antagonizan, la función de la pro-proteína de convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9) (por ejemplo, SEQ ID NO: 43), y los métodos para utilizar estos anticuerpos, por ejemplo, para tratar las condiciones de enfermedad mediadas por PCSK9.

En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos y moléculas de enlace de antígeno que se enlazan a la pro-proteína de convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9). En algunas modalidades, el anticuerpo bloquea la interacción de PCSK9 con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR), e inhibe la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) mediada por la pro-proteína de convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9), en donde el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende un segmento-V de cadena pesada humana, una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de cadena pesada, y una región de estructura 4 (FR4) de cadena pesada; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende un segmento-V de cadena ligera humana, una CDR3 de cadena ligera, y una FR4 de cadena ligera, en donde: i) la región variable CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos ITTEGGFAY (SEQ ID NO: 17); y ii) la región variable CDR3 de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos QQSNYWPLT (SEQ ID NO: 24).

En algunas modalidades, el anticuerpo o la molécula de enlace de antígeno se enlaza a la PCSK9 humana con una constante de disociación en equilibrio (KD) de aproximadamente 500 pM o menos. Por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo o la molécula de enlace de antígeno se enlaza a la PCSK9 humana con una constante de disociación en equilibrio (KD) de aproximadamente 400 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 190 pM, 180 pM, 170 pM, 160 pM, 150 pM, 140 pM, o menos.

En algunas modalidades, el segmento-V de cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento o el 99 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 27, y el segmento-V de cadena ligera tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento o el 99 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 28.

En algunas modalidades, el segmento-V de cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento o el 99 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, y el segmento-V de cadena ligera tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento o el 99 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 28.

En algunas modalidades, la FR4 de cadena pesada es una FR4 de la línea germinal humana. En algunas modalidades, la FR4 de cadena pesada es la SEQ ID NO: 35.

En algunas modalidades, la FR4 de cadena ligera es una FR4 de la línea germinal humana. En algunas modalidades, la FR4 de cadena ligera es la SEQ ID NO: 39.

En algunas modalidades, el segmento-V de cadena pesada y el segmento-V de cadena ligera cada uno comprenden una región determinante de complementariedad 1 (CDR1), y una región determinante de complementariedad 2 (CDR2); en donde: i) la CDR1 del segmento-V de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; ii) la CDR2 del segmento-V de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; iii) la CDR1 del segmento-V de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; y iv) la CDR2 del segmento-V de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23.

En algunas modalidades, i) la CDR1 del segmento-V de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 14; ii) la CDR2 del segmento-V de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 16; iii) la CDR3 de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 17; iv) la CDR1 del segmento-V de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 19; v) la CDR2 del segmento-V de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 22; y vi) la CDR3 de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 24. En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento o el 99 por ciento de identidad de la secuencia de anninoácidos con la región variable de la SEQ ID NO: 40 y la región variable de cadena ligera tiene cuando menos el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento o el 99 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable de la SEQ ID NO: 41.

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 40 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 41.

En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento o el 99 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 9, y la región variable de cadena ligera tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento o el 99 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11.

En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 9, y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11.

En algunas modalidades, el anticuerpo es una IgG. En algunas modalidades, el anticuerpo es una I g G .

En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento FAb'. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo de una sola cadena (scFv). En algunas modalidades, el anticuerpo comprende regiones constantes humanas. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región constante de I g G 1 humana. En algunas modalidades, la región constante de lgG1 humana se muta para tener una afinidad de enlace reducida por un ligando efector, tal como el receptor de Fe (FcR), por ejemplo, Fe gamma R1, sobre una célula o el componente de complemento C1. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,624,821. En algunas modalidades, los residuos de aminoácidos L234 y L235 de la región constante de I g G están sustituidos por Ala234 y Ala235. La numeración de los residuos en la región constante de cadena pesada es aquélla del índice de la Unión Europea (EU) (véase, Kabat y colaboradores (1983) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," U.S. Dept. Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos).

En algunas modalidades, el anticuerpo está enlazado a una proteína portadora, por ejemplo, albúmina.

En algunas modalidades, el anticuerpo está PEGilado.

En un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden un anticuerpo o la molécula de enlace de antígeno como se describe en la presente, y un excipiente fisiológicamente compatible.

En algunas modalidades, la composición comprende además un segundo agente que reduce los niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C) en un individuo.

En algunas modalidades, el segundo agente es una estatina.

Por ejemplo, la estatina se puede seleccionar a partir del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, y simvastatina.

En algunas modalidades, el segundo agente se selecciona a partir del grupo que consiste en fibratos, niacina y análogos de la misma, un inhibidor de la absorción de colesterol, un secuestrante de ácido biliar, un mimético de hormona tiroides, un inhibidor de proteína de transferencia de triglicéridos microsomal, un inhibidor de acll-transferasa de diacil-glicerol (DGAT), un ácido nucleico inhibidor dirigido a la PCSK9, y un ácido nucleico inhibidor dirigido a la apoBIOO.

En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos para reducir el colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C), el colesterol que no es de lipoproteína de alta densidad (no HDL-C), y/o el colesterol total en un individuo que lo necesite, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente efectiva al individuo, de un anticuerpo o de la molécula de enlace de antígeno como se describe en la presente.

En algunas modalidades, el individuo tiene hipo-respuesta o es resistente a la terapia con estatina. En algunas modalidades, el individuo es intolerante a la terapia con estatina. En algunas modalidades, el individuo tiene un nivel de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C) de la línea base de cuando menos aproximadamente 100 miligramos/decilitro, por ejemplo, de cuando menos aproximadamente 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 miligramos/decilitro, o más alto. En algunas modalidades, el individuo tiene hipercolesterolemia familiar. En algunas modalidades, el individuo tiene trigliceridemia. En algunas modalidades, el individuo tiene una mutación del gen de PCSK9 de ganancia de función. En algunas modalidades, el individuo tiene dislipidemia inducida por fármacos.

En algunas modalidades, se reduce el colesterol total con el LDL-C.

En algunas modalidades, los métodos comprenden además administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo agente efectivo para reducir el LDL-C al individuo.

En algunas modalidades, el segundo agente es una estatina. Por ejemplo, la estatina se puede seleccionar a partir del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, y simvastatina.

En algunas modalidades, el segundo agente se selecciona a partir del grupo que consiste en fibratos, niacina y análogos de la misma, inhibidores de la absorción de colesterol, secuestrantes de ácido biliar, miméticos de hormona tiroides, un inhibidor de proteína de transferencia de triglicéridos microsomal, un inhibidor de acil-transferasa de diacil-glicerol (DGAT), un ácido nucleico inhibidor dirigido a la PCSK9, y un ácido nucleico inhibidor dirigido a la apoBIOO.

En algunas modalidades, el anticuerpo o la molécula de enlace de antígeno y el segundo agente se co-administran como una mezcla.

En algunas modalidades, el anticuerpo o la molécula de enlace de antígeno y el segundo agente se co-administran por separado.

En algunas modalidades, el anticuerpo se administra intravenosamente. En algunas modalidades, el anticuerpo se administra subcutáneamente.

DEFINICIONES Un "anticuerpo" se refiere a un polipéptido de la familia de inmunoglobulina, o un polipéptido que comprende fragmentos de una inmunoglobulina que es capaz de enlazarse no covalentemente, reversiblemente, y de una manera específica al antígeno correspondiente. Una unidad estructural de anticuerpo de ejemplo comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50 a 70 kD), conectadas a través de un enlace de disulfuro. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante ?, ?, a, ?, d,3 e, y µ, así como la gran cantidad de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como ya sea o bien ?. Las cadenas pesadas se clasifican como ?, µ, a, d, ó e, las cuales definen a su vez las clases de inmunoglobulina IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectivamente. El término N de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos primordialmente responsables del reconocimiento de antígenos. Los términos "cadena ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH), se refieren a estas regiones de las cadenas ligera y pesada, respectivamente. Como se utiliza en esta solicitud, un "anticuerpo" abarca todas las variaciones de anticuerpos y fragmentos de los mismos que posean específicamente un enlace particular, por ejemplo, para PCSK9. Por consiguiente, dentro del alcance de este concepto están los anticuerpos de longitud completa, los anticuerpos quiméricos, los anticuerpos humanizados, los anticuerpos de una sola cadena (scFv), Fab, Fab', y las versiones multiméricas de estos fragmentos (por ejemplo, F(ab')2) con la misma especificidad de enlace.

"Dominios determinantes de complementariedad" o "regiones determinantes de complementariedad ("CDRs") se refieren de una manera intercambiable a las regiones hipervariables de VL y VH- Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) son el sitio de enlace de proteína objetivo de las cadenas de anticuerpo, que aloja la especificidad para esa proteína objetivo. Hay tres CDRs (CDR1-3, numeradas en secuencia a partir del término N) en cada VL o VH humana, que constituyen de aproximadamente el 15 al 20 por ciento de los dominios variables. Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) son estructuralmente complementarias para el epítopo de la proteína objetivo y, por consiguiente, son directamente responsables de la especificidad de enlace. Los estiramientos restantes de VL o VH, las denominadas como regiones de estructura, exhiben menos variación en la secuencia de aminoácidos (Kuby, Immunology, 4a Edición, Capítulo 4. W. H. Freeman & Co., Nueva York, 2000).

Las posiciones de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) y de las regiones de estructura, se determinan utilizando diferentes definiciones bien conocidas en este campo, por ejemplo, Kabat, Chotia, la base de datos internacional ImMunoGeneTics (IMGT) (en la red mundial en imgt.cines.fr/), y AbM (véase, por ejemplo, Johnson y colaboradores, Ácido nucleicos Res., 29: 205-206 (2001); Chotia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987); Chotia y colaboradores, Nature, 342: 877-883 (1989); Chotia y colaboradores, J. Mol. Biol., 227: 799-817 (1992); Al-Lazikani y colaboradores, J. Mol. Biol., 273: 927-748 (1997)). Las definiciones de los sitios de combinación de antígenos también se describen en los siguientes: Ruiz y colaboradores, Ácido nucleicos Res., 28: 219-221 (2000); y Lefranc, M. P., Ácido nucleicos Res., 29: 207-209 (2001); MacCallum y colaboradores, J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996); y Martin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 86: 9268-9272 (1989); Martin y colaboradores, Methods Enzymol., 203: 121-153 (1991); y Rees y colaboradores, en Sternberg M.J.E. (Editor), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996).

El término "determinante de especificidad de enlace" o "BSD", se refiere de una manera intercambiable a la secuencia de aminoácidos mínima contigua o no contigua dentro de una región determinante de complementariedad, necesaria para determinar la especificidad de enlace de un anticuerpo. Un determinante de especificidad de enlace (BSD) mínima puede estar dentro de una o más secuencias CDR. En algunas modalidades, los determinantes de especificidad de enlace mínima residen dentro de (es decir, son determinados exclusivamente por) una porción o la longitud completa de las secuencias CDR3 de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

Una "cadena ligera de anticuerpo" o una "cadena pesada de anticuerpo", como se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido que comprende la VL o la VH, respectivamente. La VL endógena es codificada por los segmentos V del gen (variables) y J (de unión), y la VH endógena, por V, D (diversidad), y J. Cada una de VL o VH incluye las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) así como las regiones de estructura. En esta solicitud, las cadenas ligeras de anticuerpos y/o las cadenas pesadas de anticuerpos, de cuando en cuando, pueden ser colectivamente referidas como "cadenas de anticuerpos". Estos términos abarcan las cadenas de anticuerpos que contengan mutaciones que no alteren la estructura básica de VL o VH, como lo reconocerá fácilmente un experto en la materia.

Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por la digestión con diferentes peptidasas. Por consiguiente, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo debajo de los enlaces de disulfuro, en la región de articulación, para producir el F(ab)'2l un dímero de Fab' que por sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace de disulfuro. El F(ab)'2 se puede reducirse bajo condiciones suaves para romper el enlace de disulfuro en la región de articulación, convirtiendo de esta manera el dímero de F(ab)'2 en un monómero de Fab'. El monómero de Fab' es esencialmente Fab con una parte de la región de articulación. Paul, Fundamental Immunology 3a Edición (1993). Aunque diversos fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto , un experto apreciará q ue estos fragm entos se pueden sintetiza r de novo ya sea químicamente, o bien empleando la metodolog ía de ADN recombinante. Por consiguiente, el término "anticuerpo", como se utiliza en la presente, también incluye fragmentos de anticuerpos ya sea producidos mediante la modificación de los anticuerpos enteros, o bien aquéllos sintetizados de novo empleando las metodolog ías de ADN recombinante (por ejemplo, el Fv de una sola cadena) , o aquéllos identificados utilizando bibliotecas de exhibición de fagos (véase, por ejemplo, McCafferty y colaboradores, Nature 348 : 552-554 ( 1 990)) .

Para la preparación de anticuerpos monoclonales o policlonales, se puede emplear cualquier técnica conocida en la materia (véase, por ejemplo, Kohler y Milstein , Nature 256: 495-497 ( 1 975); Kozbor y colaboradores, Immunology Today 4:72 ( 1 983) ; Colé y colaboradores, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, páginas 77-96. Alan R. Liss, I nc. 1 985) . Las técnicas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (Patente de los Estados U nidos de Norteamérica Número 4,946,778) se puede adaptar para prod ucir anticuerpos para los polipéptidos de esta invención . También , se pueden utilizar ratones transgénicos, u otros organismos, tales como otros mam íferos, para expresar los anticuerpos human izados. De una manera alternativa , se puede emplear la tecnolog ía de exhibición de fagos pa ra identificar los anticuerpos y los fragmentos Fab heteroméricos q ue se enlacen específicamente con antígenos seleccionados (véase , por ejemplo, McCafferty y colaboradores, supra; Marks y colaboradores, Biotechnology, 10: 779-783, (1992)).

Los métodos para la humanización o la primatización de anticuerpos no humanos son bien conocidos en la materia. En términos generales, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos con referidos con frecuencia como residuos de importación, los cuales típicamente se toman a partir de un dominio variable de importación. La humanización se puede llevar a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (véase, por ejemplo, Jones y colaboradores, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen y colaboradores, Science 239:1534-1536 (1988), y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2. 593-596 (1992)), mediante la introducción de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de roedor, o de las secuencias de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de roedor, para sustituir las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De conformidad con lo anterior, estos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,816,567), en donde se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente a partir de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en donde algunos residuos de la región determinante de complementariedad ("CDR") y posiblemente algunos residuos de la región de estructura ("FR") son sustituidos por residuos a partir de los sitios análogos de los anticuerpos de roedor.

Los anticuerpos o moléculas de enlace de antígeno de la invención incluyen además una o más cadenas de inmunoglobulina que se conjugan químicamente con, o se expresan como, proteínas de fusión con otras proteínas. También incluyen al anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesada/ligera diferentes y dos sitios de enlace diferentes. Otros fragmentos o porciones de anticuerpos de enlace de antígeno de la invención incluyen al scFv bivalente (díacuerpo), los anticuerpos scFv biespecíficos en donde la molécula de anticuerpo reconoce dos epítopos diferentes, dominios de enlace individuales (dAbs), y minicuerpos.

Los diversos anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno descritos en la presente se pueden producir mediante la modificación enzimática o química de los anticuerpos intactos, o se pueden sintetizar de novo empleando metodologías de ADN recombinante (por ejemplo, Fv de una sola cadena), o se pueden identificar utilizando bibliotecas de exhibición de fagos (véase, por ejemplo, McCafferty y colaboradores, Nature 348: 552-554, 1990). Por ejemplo, los minicuerpos se pueden generar empleando los métodos descritos en este campo, por ejemplo, Vaughan y Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4: 417-30 2001. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de métodos, incluyendo fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab'. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny y colaboradores, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). Los anticuerpos de una sola cadena se pueden identificar utilizando bibliotecas de exhibición de fagos o bibliotecas de exhibición de ribosoma, o bibliotecas de genes mezclados. Estas bibliotecas se pueden construir a partir de fuentes sintéticas, semi-sintéticas, o nativas e inmunocompetentes.

Un "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en donde: (a) la región constante, o una porción de la misma, es alterada, reemplazada o intercambiada, de tal manera que el sitio de enlace de antígeno (región variable) se enlaza a una región constante de una clase, función efectora, y/o especia diferente o alterada, o a una molécula enteramente diferente que confiere nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una porción de la misma, es alterada, reemplazada o intercambiada, con una región variable que tiene una especificidad de antígeno diferente o alterada. Por ejemplo, como se muestra en los Ejemplos más adelante, un anticuerpo anti-PCSK9 de ratón se puede modificar mediante el reemplazo de su región constante con la región constante a partir de una inmunoglobulina humana. Debido al reemplazo con una región constante humana, el anticuerpo quimérico puede retener su especificidad para reconocer la PCSK9 humana, mientras que tiene una antigenicidad reducida en el ser humano comparándose con el anticuerpo de ratón original.

El término "molécula de enlace de anticuerpo" o "ligando que no es anticuerpo" se refiere a miméticos de anticuerpos que utilizan andamiajes de proteína que no es inmunoglobulina, incluyendo adnectinas, avímeros, moléculas de enlace de polipéptido de una sola cadena, y peptidomiméticos de enlace tipo anticuerpos.

El término "región variable" o "región-V" se refiere, de una manera intercambiable, a una cadena pesada o ligera que comprende FR1 -CDR1 -FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Véase la Figura 1. Una región variable endógena es codificada por los genes V-D-J de cadena pesada o por los genes V-J de cadena ligera de inmunoglobulina. Una región-V puede ser de presentación natural, recombinante, o sintética.

Como se utiliza en la presente, el término "segmento variable" o "segmento-V" se refiere, de una manera intercambiable, a una subsecuencia de la región variable que incluye FR1 -CDR1 -FR2-CDR2-FR3. Véase la Figura 1. Un segmento-V endógeno es codificado por un gen-V de inmunoglobulina. Un segmento-V puede ser de presentación natural, recombinante, o sintético.

Como se utiliza en la presente, el término "segmento-J" se refiere a una subsecuencia de la región variable codificada que comprende una porción C-terminal de una CDR3 y la FR4. Un segmento-J endógeno es codificado por un gen-J de inmunoglobulina. Véase la Figura 1. Un segmento-J puede ser de presentación natural, recombinante, o sintético.

Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que retiene la reactividad de un anticuerpo no humano, mientras que es menos inmunogénico en los seres humanos. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la conservación de las regiones CDR no humanas, y el reemplazo de las partes restantes del anticuerpo con sus contrapartes humanas. Véase, por ejemplo, Morrison y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81: 6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1988); Verhoeyen y colaboradores, Science, 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3): 169-217 (1994).

El término "secuencia de la línea germinal humana correspondiente" se refiere a la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia o subsecuencia de aminoácidos de la región variable humana que comparte la más alta identidad de secuencia de aminoácidos determinada, con una secuencia o subsecuencia de aminoácidos de la región variable de referencia, en comparación con todas las otras secuencias de aminoácidos de región variable conocidas codificadas por las secuencias de región variable de inmunoglobulina de la línea germinal humana. La secuencia de la línea germinal humana correspondiente también puede referirse a la secuencia o subsecuencia de aminoácidos de la región variable humana con la más alta identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia o subsecuencia de aminoácidos de la región variable de referencia, en comparación con todas las demás secuencias de aminoácidos de la región variable. La secuencia de la línea germinal humana correspondiente puede ser de las regiones de estructura solamente, de las regiones determinantes de complementariedad solamente, de las regiones de estructura y determinantes de complementariedad, un segmento variable (como se define anteriormente), u otras combinaciones de secuencias o subsecuencias que comprendan una región variable. La identidad de secuencia se puede determinar empleando los métodos descritos en la presente, por ejemplo, mediante la alineación de dos secuencias utilizando BLAST, ALIGN, u otro algoritmo de alineación conocido en la materia. La secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de la línea germinal humana correspondiente puede tener una identidad de secuencia de cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, o el 99 por ciento con la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de la región variable de referencia. Las secuencias de la línea germinal humana correspondientes se pueden determinar, por ejemplo, a través de la base de datos internacional ImMunoGeneTics que se encuentra públicamente disponible (IMGT) (en la red mundial, en imgt.cines.fr/), y en V-base (en la red mundial, en vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk).

La frase "se enlazan específicamente (o selectivamente)", cuando se utiliza en el contexto de describir la interacción entre un antígeno, por ejemplo, una proteína, con un anticuerpo o con un agente de enlace derivado de un anticuerpo, se refiere a una reacción de enlace que es determinante de la presencia del antígeno en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos, por ejemplo, en una muestra biológica, por ejemplo, en una muestra de sangre, suero, plasma, o tejido. Por consiguiente, bajo las condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos o los agentes de enlace con una especificidad de enlace particular se enlazan a un antigeno particular cuando menos dos vece el fondo, y no se enlazan sustancialmente en una cantidad significativa a otros antígenos presentes en la muestra. El enlace específico a un anticuerpo o a un agente de enlace bajo estas condiciones puede requerir que el anticuerpo o el agente se haya seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Como sea deseado o apropiado, esta selección se puede lograr sustrayendo los anticuerpos que reaccionen cruzadamente, por ejemplo, con las moléculas de PCSK9 a partir de otras especies (por ejemplo, de ratón), o con otros subtipos de PCSK. Se pueden emplear una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmuno-reactivos con una proteína particular. Por ejemplo, se utilizan rutinariamente inmunoensayos ELISA en fase sólida para seleccionar los anticuerpos específicamente inmuno-reactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998), para una descripción de los formatos y condiciones de los inmunoensayos que se pueden emplear para determinar la inmuno-reactividad específica). Típicamente, una reacción de enlace específica o selectiva producirá una señal cuando menos dos veces sobre la señal del fondo, y más típicamente cuando menos de 10 a 100 veces sobre el fondo.

El término "constante de disociación en equilibrio (KD, M)" se refiere a la constante del índice de disociación (kd, tiempo"1) dividida entre la constante del índice de asociación (ka, tiempo"1, M'1). Las constantes de disociación en equilibrio se pueden medir empleando cualquier método conocido en este campo. Los anticuerpos de la presente invención tendrán, en términos generales, una constante de disociación en equilibrio de menos de aproximadamente 10"7 ó 10"8 M.

Como se utiliza en la presente, el término "región de enlace de antígeno" se refiere a un dominio de la molécula de enlace de PCSK9 de esta invención que es responsable del enlace específico entre la molécula y PCSK9. Una región de enlace de antígeno incluye cuando menos una región variable de cadena pesada de un anticuerpo y cuando menos una región variable de cadena ligera de un anticuerpo. Existe cuando menos una de estas regiones de enlace de antígeno presente en cada molécula de enlace de PCSK9 de esta invención, y cada una de las regiones de enlace de antígeno puede ser idéntica o diferente de las otras. En algunas modalidades, cuando menos una de las regiones de enlace de antígeno de una molécula de enlace de PCSK9 de esta invención, actúa como un antagonista de PCSK9.

El término "antagonista", como se utiliza en la presente, se refiere a un agente que es capaz de enlazarse e inhibir específicamente la actividad de la molécula objetivo. Por ejemplo, un antagonista de PCSK9 se enlaza específicamente a PCSK9 e inhibe total o parcialmente la degradación del LDL-R mediada por PCSK9. Como se utiliza en la presente, la inhibición de la degradación del LDL-R mediada por PCSK9 interfiere con el enlace de PCSK9 al LDL-R. En algunos casos, un antagonista de PCSK9 se puede identificar por su capacidad para enlazarse a PCSK9 e inhibir el enlace de PCS 9 al LDL-R. La inhibición se presenta cuando la degradación del LDL-R mediada por PCSK9, cuando se expone a un antagonista de la invención, es cuando menos aproximadamente el 10 por ciento menor, por ejemplo, cuando menos aproximadamente el 25 por ciento, el 50 por ciento, el 75 por ciento menor, o es totalmente inhibida, en comparación con la degradación mediada por PCSK9 en la presencia de un control o en ausencia del antagonista. Un control puede no exponerse a ningún anticuerpo o molécula de enlace de antígeno, o se puede exponer a un anticuerpo o molécula de enlace de antígeno que se enlace específicamente a otro antígeno, o a un anticuerpo anti-PCSK9 o molécula de enlace de antígeno que se sepa que no funciona como un antagonista. Un "antagonista de anticuerpo" se refiere a la situación en donde el antagonista es un anticuerpo inhibidor.

El término "PCSK9" o "pro-proteína de convertasa-subtilisina / quexina tipo 9a" se refiere de una manera intercambiable a una pro-proteína de convertasa humana que se presenta naturalmente perteneciente a la sub-familia de proteinasa K de la familia de subtilasa secretora. La PCSK9 se sintetiza como un zimógeno soluble que experimenta un procesamiento intramolecular auto-catalítico en el retículo endoplásmico, y se piensa que funciona como una pro-proteína de convertasa. La PCSK9 tiene una función en la homeostasia del colesterol y puede tener una función en la diferenciación de las neuronas corticales. Las mutaciones en este gen de PCSK9 se han asociado con una forma de hipercolesterolemia familiar dominante autosomal. Véase, por ejemplo, Burnett y Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1): 11-26. El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de PCSK9 son conocidos, y se han publicado en GenBank Números de Acceso NM_174936.2 y NP_777596.2, respectivamente. Como se utiliza en la presente, un polipéptido de PCSK9 se enlaza funcionalmente al LDL-R y promueve la degradación del LDL-R. Estructuralmente, una secuencia de aminoácidos de PCSK9 tiene cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento ó el 100 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de GenBank Número de Acceso NP_777596.2. Estructuralmente, una secuencia de ácido nucleico de PCSK9 tiene cuando menos aproximadamente el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento ó el 100 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de GenBank Número de Acceso NM_174936.2.

La frase "mutación de ganancia de función de PCSK9" se refiere a las mutaciones naturales que se presentan en los genes de PCSK9 que están asociados con y/o son causantes del fenotipo de hipercolesterolemia familiar, ateroesclerosis acelerada y enfermedad cardíaca coronaria prematura, por ejemplo, debido a una mejor degradación del LDL-R y a una reducción de los niveles de LDL-R. La frecuencia del alelo de las mutaciones de ganancia de función de PCSK9 es rara. Véase, Burnett y Hooper, Clin Biochem Rev. (2008) 29(1): 11-26. Las mutaciones de ganancia de función de PCSK9 de ejemplo incluyen D129N, D374H, N425S y R496W. Véase, Fasano y colaboradores, Atherosclerosis (2009) 203(1): 166-71. Las mutaciones de ganancia de función de PCSK9 se revisan, por ejemplo, en Burnett y Hooper, supra, Fasano y colaboradores, supra; Abifadel y colaboradores, J Med Genet (2008) 45(12): 780-6; Abifadel y colaboradores, Hum Mutat (2009) 30(4): 520-9; y Li y colaboradores, Recent Pat DNA Gene Seq (2009) Noviembre 1 (PMID 19601924).

"Actividad" de un polipéptido de la invención se refiere a las funciones estructurales, reguladoras, o bioquímicas de un polipéptido en su célula o tejido nativo. Los ejemplos de la actividad de un polipéptido incluyen tanto las actividades directas como las actividades indirectas. Las actividades directas de PCSK9 de ejemplo son el resultado de la interacción directa con el polipéptido, incluyendo el enlace al LDL-R y la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) mediada por PCSK9. Las actividades indirectas de ejemplo en el contexto de PCSK9 se observan como un cambio en el fenotipo o en la respuesta en una célula, tejido, órgano, o sujeto, a una actividad dirigida por el polipéptido, por ejemplo, la reducción del aumento de LDL-R en el hígado, la reducción del HDL-C en plasma, la disminución del colesterol en plasma, o mejoras en la sensibilidad a las estatinas.

El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o a una proteína, denota que el ácido nucleico o la proteína están esencialmente libres de otros componentes celulares con los que están asociados en el estado natural. Están de preferencia en un estado homogéneo. Puede estar en una solución ya sea seca o bien acuosa. La pureza y la homogeneidad típicamente se determinan empleando técnicas de química analítica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía de líquidos de alto rendimiento. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está sustancialmente purificada. En particular, se separa un gen aislado de los marcos de lectura abierta que flanquean al gen y codifican una proteína diferente del gen de interés. El término "purificada" denota que un ácido nucleico o una proteína da lugar esencialmente a una banda en un gel electroforético. En particular, significa que el ácido nucleico o la proteína es cuando menos el 85 por ciento pura, más preferiblemente cuando menos el 95 por ciento pura, y de una manera muy preferible cuando menos el 99 por ciento pura.

El término "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN), y los polímeros de los mismos en una forma ya sea de una sola cadena o bien de doble cadena. A menos que se limite de una manera específica, el término abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de natural nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares a las del ácido nucleico de referencia, y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos que se presentan naturalmente. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente las variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), los alelos, ortólogos, SNPs, y las secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. De una manera específica, las sustituciones de codones degenerados se pueden lograr mediante la generación de secuencias en donde la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos), está sustituida con residuos de bases mixtas y/o de desoxi-inosina (Batzer y colaboradores, Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka y colaboradores, J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); y Rossolini y colaboradores, Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).

Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína", se utilizan indistintamente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en donde uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido que se presenta naturalmente correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos que se presentan naturalmente y a los polímeros de aminoácidos que no se presentan naturalmente.

El término "aminoácido" se refiere a los aminoácidos que se presentan naturalmente y sintéticos, así como a los análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que se presentan naturalmente. Los aminoácidos que se presentan naturalmente son aquéllos codificados por el código genético, así como los aminoácidos que son modificados posteriormente, por ejemplo, hidroxi-prolina, ?-carboxi-glutamato, y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos se refieren a los compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se presenta naturalmente, es decir, un carbono-a que se enlaza a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina-metil-sulfonio. Estos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina), o estructuras base de péptidos modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se presenta naturalmente. Los miméticos de aminoácidos se refieren a los compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una manera similar a un aminoácido que se presenta naturalmente.

"Variantes conservadoramente modificadas" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes conservadoramente modificadas se refieren a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en donde el acido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, hasta las secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por consiguiente, en cada posición en donde una alanina sea especificada por un codón, el codón puede ser alterado hasta cualquiera de los codones correspondientes descritos, sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", las cuales son una especie de variaciones conservadoramente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico de la presente que codifica un polipéptido, también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón de un ácido nucleico (excepto AUG, el cual es ordinariamente el único codón para metionina, y TGG, el cual es ordinariamente el único codón para triptófano) puede ser modificado para proporcionar una molécula funcionalmente idéntica. De conformidad con lo anterior, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifique un polipéptido es implícita en cada secuencia descrita.

Con respecto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, supresiones, o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido, o proteína, que alteren, agreguen, o supriman un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada, es una "variante conservadoramente modificada", en donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. En la materia se conocen bien las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Estas variantes conservadoramente modificadas son en adición a, y no excluyen, las variantes polimórficas, los homólogos inter-especies, y los alelos de la invención.

Los siguientes ocho grupos contienen cada uno los aminoácidos que son sustituciones conservadoras unos por otros: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y), Triptófano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); y 8) Cisteína (C), Metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).

El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina mediante la comparación de dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia del polinucleotido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos), comparándose con la secuencia de referencia (por ejemplo, un polipéptido de la invención), la cual no comprende adiciones o supresiones, para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las que se presenta la base de ácido nucleico idéntica o el residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias, para proporcionar el número de posiciones emparejadas, se divide el número de posiciones emparejadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y se multiplica el resultado por 100, para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos "idéntica" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas secuencias. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si las dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o de nucleótidos que son iguales (es decir, una identidad de secuencia del 70 por ciento, 75 por ciento, 80 por ciento, 85 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento o 99 por ciento sobre una región especificada, o, cuando no se especifique, sobre toda la secuencia de una secuencia de referencia), cuando se compara o se alinea para una máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o sobre una región designada medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o mediante alineación manual e inspección visual. La invención proporciona polipéptidos o polinucleótidos que son sustancialmente idénticos a los polipéptidos o polinucleótidos, respectivamente, ejemplificados en la presente (por ejemplo, las regiones variables ejemplificadas en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, y 40-41; los segmentos variables ejemplificados en cualquiera de las SEQ ID NOs: 25-29; las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) ejemplificadas en cualquiera de las SEQ ID NOs: 13-24; las regiones de la estructura (FRs) ejemplificadas en cualquiera de las SEQ ID NOs: 30-39; y las secuencias de ácidos nucleicos ejemplificadas en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, y 46-49). Opcionalmente, la identidad existe sobre una región que es de cuando menos aproximadamente 15, 25 ó 50 nucleótidos de longitud, o más preferiblemente sobre una región que es de 100 a 500 ó 1,000 o más nucleótidos de longitud, o sobre la longitud completa de la secuencia de referencia. Con respecto a las secuencias de aminoácidos, puede existir Identidad o una identidad sustancial sobre una región que es de cuando menos 5, 10, 15 ó 20 aminoácidos de longitud, opcionalmente de cuando menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 50, 75 ó 100 aminoácidos de longitud, opcionalmente de cuando menos aproximadamente 150, 200 ó 250 aminoácidos de longitud, o sobre la longitud completa de la secuencia de referencia. Con respecto a las secuencias de aminoácidos más cortas, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de 20 ó menos aminoácidos, existe una identidad sustancial cuando uno o dos residuos de aminoácidos son conservadoramente sustituidos, de acuerdo con las sustituciones conservadoras definidas en la presente.

Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen en una computadora las secuencias de prueba y de referencia, se designan las coordenadas de las subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Se pueden utilizar los parámetros del programa por omisión, o se pueden designar parámetros alternativos. Entonces el algoritmo de comparación de secuencias calcula los porcentajes de identidad de secuencias para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente, incluye la referencia a un segmento de cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas a partir del grupo que consiste en 20 a 600, usualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más usualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en donde una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alinean óptimamente las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la materia. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede conducir, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443, mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85:2444, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Current Protocols ¡n Molecular Blology (suplemento de 1995)).

Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul y colaboradores (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, y Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo involucra primero identificar los pares de secuencias de alto puntaje (HSPs) mediante la identificación de palabras cortas de una longitud W en la secuencia pedida, ya sea que se emparejen o satisfagan algún puntaje umbral T de valor positivo cuando sean alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de una base de datos. T es referido como el umbral de puntaje de palabra vecina (Altschul y colaboradores, supra). Estos impactos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas con el fin de encontrar pares de secuencias de alto puntaje (HSPs) más largos que las contengan. Los impactos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se pueda incrementar el puntaje de alineación acumulativo. Los puntajes acumulativos se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntaje de recompensa para un par de residuos emparejados; siempre > O), y N (puntaje de multa para residuos mal emparejados; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntaje para calcular el puntaje acumulativo. La extensión de los impactos de palabras en cada dirección se detiene cuando: el puntaje de alineación acumulativo cae fuera por la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; el puntaje acumulativo llega hasta cero o menos, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntaje negativo; o se llega al final de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T, y X del algoritmo BLAST, determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) utiliza por omisión una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza por omisión una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntaje BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: 10915) utiliza alineaciones (B) de 50, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4, y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 5873-5787). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por la cual se presentaría por azar un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña, en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia, es menor de aproximadamente 0.2, más preferiblemente menor de aproximadamente 0.01, y de una manera muy preferible menor de aproximadamente 0.001.

Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos son sustancialmente idénticas, es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo cruzadamente con los anticuerpos reproducidos contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más adelante. Por consiguiente, un polipéptido es típicamente sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, en donde los dos péptidos difieren solamente por las sustituciones conservadoras. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos se hibridan una con la otra bajo condiciones restringentes, como se describe más adelante. Todavía otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas, es que se pueden utilizar los mismos cebadores para amplificar la secuencia.

El término "enlazar", cuando se utiliza en el contexto de describir la manera en que se conectan las regiones de enlace de antígeno dentro de una molécula de enlace de PCSK9 de esta invención, abarca todos los significados posibles para unir físicamente las regiones. La multitud de regiones de enlace de antígeno con frecuencia se unen mediante enlaces químicos, tales como un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico o un enlace de disulfuro) o un enlace no covalente, el cual puede ser ya sea un enlace directo (es decir, sin un enlazador entre dos regiones de enlace de antígeno) o bien un enlace indirecto (es decir, con la ayuda de cuando menos una molécula enlazadora entre dos o más regiones de enlace de antígeno).

Los términos "sujeto", "paciente", e "individuo" se refieren de una manera intercambiable a un mamífero, por ejemplo, a un ser humano o a un mamífero primate no humano. El mamífero también puede ser un mamífero de laboratorio, por ejemplo, ratón, rata, conejo, hámster. En algunas modalidades, el mamífero puede ser un mamífero agrícola (por ejemplo, equino, ovino, bovino, porcino, camélido) o un mamífero doméstico (por ejemplo, canino, felino).

Los términos "cantidad terapéuticamente aceptable" o "dosis terapéuticamente efectiva" se refieren de una manera intercambiable a una cantidad suficiente para efectuar el resultado deseado (es decir, una reducción en el colesterol no de lipoproteína de alta densidad (no HDL-C) en plasma, hipercolesterolemia, ateroesclerosis, enfermedad cardíaca coronaria). En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente aceptable no induce ni provoca efectos secundarios indeseables. Una cantidad terapéuticamente aceptable se puede determinar administrando primero una dosis baja, y luego aumentando crecientemente esa dosis hasta lograr el efecto deseado. Una "dosificación profilácticamente efectiva" y una "dosificación terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo antagonizante de PCSK9 de la invención puede prevenir el establecimiento de, o puede dar como resultado una disminución en la gravedad de, respectivamente, los síntomas de la enfermedad asociados con la presencia de PCSK9 (por ejemplo, hipercolesterolemia). Estos términos también pueden promover o aumentar, respectivamente, la frecuencia y duración de los períodos libres de los síntomas de la enfermedad. Una "dosificación profilácticamente efectiva" y una "dosificación terapéuticamente efectiva" también puede prevenir o mitigar, respectivamente, el deterioro o la discapacidad debida a los trastornos y enfermedades resultantes de la actividad de PCSK9.

El término "co-administrar" se refiere a la presencia simultánea de dos agentes activos en la sangre de un individuo. Los agentes activos que se co-administran se pueden suministrar de una manera concurrente o en secuencia.

El término "estatina" se refiere a una clase de agentes farmacológicos que son inhibidores competitivos de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril-coenzima A (HMG-CoA)-reductasa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada (SEQ ID NO: 1) y de la cadena ligera (SEQ ID NO: 3) del anticuerpo monoclonal de ratón progenitor MAB1. Las secuencias de las CDR1, CDR2 y CDR3 están subrayadas y en negrillas.

La Figura 2 ilustra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada (SEQ ID NO: 5) y de la cadena ligera (SEQ ID NO: 7) del anticuerpo humano-diseñado (HumaneeredMR) MAB2. Las secuencias de las CDR1, CDR2 y CDR3 están subrayadas y en negrillas.

La Figura 3 ilustra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada (SEQ ID NO: 9) y de la cadena ligera (SEQ ID NO: 11) del anticuerpo humano-diseñado (HumaneeredMR) MAB3. Las secuencias de las CDR1, CDR2 y CDR3 están subrayadas y en negrillas.

Las Figuras 4A y 4B ilustran el ensayo ELISA que prueba el enlace de (A) MAB2 y (b) MAB3 en comparación con MAB1 a varios antígenos humanos y de ratón diferentes.

Las Figuras 5A, 5B y 5C ilustran el enlace de MAB2 y MAB3 a: (A) Pcsk9 humana, y (B) Pcsk9 de cinomolgo. (C) Los datos se ajustaron al modelo descrito en Piehler y colaboradores (1997) J Immunol Methods 201: 189-206, y los valores Kd se calcularon a partir del ajuste. Las gráficas son representativas de cuando menos 2 experimentos independientes.

La Figura 6 ilustra que el anticuerpo monoclonal de ratón progenitor, MAB1, probablemente se enlaza a un epítopo dentro de los residuos de aminoácidos 159-182 (ERITPPRYRADEYQPPDGGS LVE; SEQ ID NO: 42) basándose en la espectrometría de masas de intercambio de deuterio. Los experimentos automatizados de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio se llevaron a cabo con un establecimiento similar y en una forma similar a como se describe en Chalmers y colaboradores, Anal Chem 2006, 78, 1005-1014. Dicho de una manera breve, se utilizó un manipulador de líquidos LEAP Technologies Pal HTS (LEAP Technologies, Carrboro, NC) para todas las operaciones de manipulación de líquidos. El manipulador de líquidos fue controlado mediante órdenes de automatización escritas en LEAP Shell, y se alojó en un recinto refrigerado mantenido a 2°C. Se montaron una válvula de inyección de 6 compuertas y una estación de lavado sobre el riel del manipulador de líquidos, y facilitaron la inyección de muestras en el sistema cromatográfico y el lavado de la jeringa. Para la digestión en línea, se colocó una columna enzimática (pepsina inmovilizada ABI) en línea entre la válvula de inyección y la columna de atrape. El sistema cromatográfico, consistente en dos válvulas adicionales (15 kPSI Valco, Houston, TX), un cartucho de trampa en fase invertida EXP Halo C18 de 4 microlitros (Optimize Technologies Inc., Oregon City, OR), y una columna analítica (diámetro interno de 300 mieras, Halo C18 de 2.7 mieras, Michrom Bioresources Inc.), se alojó en un recinto enfriado separado que se montó enfrente de la fuente del espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap (ThermoElectron Corp.). La temperatura del recinto que alojaba al sistema cromatográfico se mantuvo a 0°C mediante enfriadores de peltre montados en la parte superior del recinto. Para los análisis de PCSK9, se cargaron cuatro placas de 96 pozos que contenían la muestra, diluyente, reductor, y apagador, en el manipulador de líquidos, antes del inicio de cada secue3ncia experimental. Antes de cada inyección, se mezclaron 25 microlitros de solución de proteína (aproximadamente 2 miligramos/mililitro) ya sea con 25 microlitros de regulador de trietilamina 50 mM (pH de 7.4) o bien con 25 microlitros regulador de trietilamina 50 mM (pH de 7.4) que contenían aproximadamente 21 microgramos de 13C10-FAB, y se dejaron mezclarse durante 30 minutos. Para iniciar la reacción de intercambio, se agregaron 150 microlitros de regulador de D20 (D20, NaCI 150 mM) o de regulador de H20 (NaCI 150 mM), y se dejaron intercambiarse durante 1 minuto. Entonces se agregaron 200 microlitros de regulador de reducción-oxidación (TCEP 1M, Urea 8M, pH de 4.0), y la mezcla se dejó reaccionar durante aproximadamente 1 minuto. La mezcla entonces se apagó con 300 microlitros de regulador de apagado (ácido trifluoro-acético (TFA) al 5 por ciento) para reducir la mezcla hasta un pH de 2.5. Entonces se inyectaron 500 microlitros de muestra y se digirieron en línea, y los péptidos resultantes se atraparon y se analizaron mediante LC-MS, como se describe a continuación. El sistema de cromatografía utilizó dos bombas de HPLC separadas para llevar a cabo la digestión en línea, atrapar los péptidos digeridos sobre una columna de trampa C18, y eluir los péptidos atrapados a través de una columna analítica. Una bomba de "carga", operada a una velocidad de flujo de 125 microlitros/minuto (ácido trifluoro-acético (TFA) a. 0.05 por ciento), transfirió las muestras desde el ciclo de muestras de la válvula de inyección PAL (500 microlitros), a través de una columna de pepsina, y hasta el cartucho de trampa en fase invertida. Después de un paso de carga de 6 minutos, la primera válvula a 15 kPSI se conmutó para que fluyera el fluido desde una bomba en "gradiente" a través de la trampa durante un período de desalificación de 3 minutos (25 microlitros/minuto). Después del paso de desalificación, la segunda válvula de 15 kPSI se conmutó con el objeto de facilitar la elución de los péptidos desde la trampa y hacia dentro de la columna analítica y la fuente de iones del espectrómetro de masas. La bomba en gradiente (Waters Nano Acquity) suministró un gradiente del 0 al 40 por ciento de la fase móvil B, a 5 microlitros/minuto, y entonces suministró un segundo gradiente desde el 40 hasta el 75 por ciento de la fase móvil B. El tiempo total para el gradiente fue de 75 minutos. Las composiciones reguladoras de la bomba en gradiente fueron: A: 99.75:0.25 por ciento por volumen/volumen (H20 : ácido fórmico), y B: 99.75:0.25 por ciento por volumen/volumen (acetonitrilo : ácido fórmico).

Para la espectrometría de masas, se llevó a cabo la LC-ESI-MS en un LTQ-Orbitrap (ThermoElectron, San José, CA). Se llevaron a cabo experimentos de MS/MS dependientes de los datos para recolectar los espectros de masas en fila para el propósito de identificar las secuencias de los péptidos generados mediante proteólisis. Para estas adquisiciones, las MS/MS se adquirieron en el LTQ, y las exploraciones de MS se adquirieron en el Orbitrap. Las adquisiciones llevadas a cabo para el propósito de determinar el nivel de deuteracion se adquirieron a una resolución de 60,000 en el Orbitrap (sobre m/z de 400 a 2,000). Los parámetros del instrumento utilizados para todos los experimentos incluyeron un voltaje de aspersión de 3.5 kV, un tiempo de inyección máximo de 1,000 milisegundos, un LTQ AGC objetivo para la MS de 50,000 iones, y un FTMS AGC objetivo para la MS de 1,000,000 iones. Los archivos .RAW del Orbitrap se convirtieron en archivos .mzXML utilizando un programa de la empresa (RawXtract). Subsiguientemente, los archivos .mzXML se convirtieron en archivos .mzBIN, y las adquisiciones de MS en fila se buscaron utilizando SEQUEST (ThermoElectron). Utilizando las identificaciones de las secuencias de péptidos, se utilizó un programa escrito en la empresa (Deutoronomy) para extraer automáticamente los cromatogramas para cada secuencia identificada y para generar los espectros promedio. Luego los espectros promedio se suavizaron y se pusieron en el centroide para determinar el nivel de absorción de deuterio.

Después del procesamiento automatizado inicial, se validó manualmente la calidad y el centroide de cada espectro promedio, o se corrigió utilizando un visor de datos interactivo integrado en el Deutoronomy. Se encontró que los anticuerpos humano-diseñados (HumaneeredMR) MAB2 y MAB3 compiten por el mismo epítopo que el MAB1 utilizando un ensayo de competición de epítopos bajado en la interferometría de las bio-capas.

La Figura 7 ilustra que MAB2 y MAB3 pueden bloquear la interacción de PCSK9 y LDL-R, como se determina en un ensayo bioquímico de transferencia de energía de resonancia con fluorescencia resuelta en el tiempo (TR-FRET). El enlace de los anticuerpos antagonistas de Pcsk9 a la Pcsk9 puede alterar la capacidad de Pcsk9 para formar un complejo con LDLr, protegiendo, por consiguiente, al LDLr de la sub-regulación/degradación, y mejorando la absorción de LDL. Para probar esto, la PCSK9 humana marcada con un fluoróforo (hPCSK9-AF) se incubó con MAB2 ó MAB3 en regulador de ensayo (HEPES 20 mM, pH de 7.2, NaCI 150 mM, CaCI21 mM, Tween 20 al 0.1 por ciento por volumen/volumen, y albúmina de suero bovino (BSA) al 0.1 por ciento en peso/volumen) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Esto fue seguido por la adición del LDL-R marcado con europio (hLDL-R-Eu), y una incubación adicional a temperatura ambiente durante 90 minutos, de tal manera que las concentraciones finales fueron de hPcsk9-AF 8 nM y hLDL-R-Eu 1 nM. La señal de TR-FRET (330 nanómetros de excitación y 665 nanómetros de emisión) se midió con un lector de placas (EnVision 2100, Perkin Elmer), y se calculó el porcentaje de inhibición en la presencia de los anticuerpos de Pcsk9. Los valores IC50 se calcularon graficando los valores del porcentaje de inhibición en Prism (GraphPad). Cada punto de datos representa el promedio ± SD (n = 4 réplicas por punto). Los datos son representativos de cuando menos dos experimentos independientes. Los anticuerpos humano-diseñados (HumaneeredMR) AB2 y MAB3 fueron capaces de alterar el complejo con valores IC50 de 20 nM y 28 nM, respectivamente, los cuales son comparables con la IC50 de 77 nM encontrada para el anticuerpo progenitor MAB1 (no se muestran los datos).

La Figura 8 ilustra que los anticuerpos humano-diseñados (HumaneeredMR) MAB2 y MAB3 son equivalentes al anticuerpo de ratón MAB1 en que conducen a un aumento en los niveles de LDL-R y a la absorción de LDL por parte de las células HepG2. Para la medición del LDL-R, las células se incubaron con anticuerpos de enlace de PCSK9 y se marcaron con anticuerpos anti-LDL-R. Para la absorción de LDL, las células se incubaron con anticuerpos de enlace de PCSK9, PCSK9, y Dil-LDL. Los anticuerpos de LDL-R y la fluorescencia de Dil-LDL se midieron mediante citometría de flujo. Se muestra el promedio + SEM para las mediciones replicadas para las gráficas de MAB2 y MAB3. Los resultados son representativos de 2 experimentos independientes.

Para los ensayos de absorción de LDL, los anticuerpos de enlace de PCSK9 se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en DMEM conteniendo suero bovino fetal deficiente en lipoproteína al 10 por ciento (Intracel), y PCSK9 humana 200 nM (Hampton y colaboradores, PNAS (2007)104: 14604-14609), y se agregaron las soluciones del anticuerpo/PCSK9/medio a las células a las placas de 96 pozos, y se incubaron durante la noche. Al día siguiente, se agregó la LDL marcada con perclorato de 1,1'-dioctadeci 1-3,3,3', 3'-tetrametil-indo-carbocia nina (Dil-LDL,Biomedical Technologies), durante 2 horas adicionales. Entonces se aspiró el medio, las células se lavaron tres veces con suero regulado con fosfato, y las células se disociaron con tripsina-EDTA al 0.25 por ciento. Las células se transfirieron entonces al regulador FACS (PBS conteniendo suero bovino fetal al 5 por ciento, EDTA 2 mM, y azida de sodio al 0.2 por ciento), se centrifugaron a 1000 x g durante 10 minutos, se aspiraron, y se fijaron en paraformaldehído al 1 por ciento. La absorción de LDL se midió mediante fluorescencia Dil celular (excitación a 488 nanometros y emisión a 575 nanometros) utilizando citometría de flujo (Becton Dickinson LSR II). Para los ensayos de LDL-R superficial, las células se incubaron con el medio sin suero conteniendo anticuerpos, se lavaron con suero regulado con fosfato, y se cosecharon en Versine (Biowhittaker, 17-771E), y regulador FACS. Las células se transfirieron a nuevas placas, se centrifugaron a 1200 revoluciones por minuto durante 5 minutos, y se bloquearon con IgG de conejo normal (MP Biomedicals). Las células se marcaron con anticuerpos marcados con IgG de conejo anti-hLDL-R-Alexa 647 (5 microgramos/mililitro) en regulador FACS, se centrifugaron, se lavaron, y se fijaron en paraformaldehído al 1 por ciento. El LDL-R superficial se midió mediante citometría de flujo (excitación a 488 nanómetros y emisión a 633 nanómetros). Las EC50s se calcularon utilizando Prism (GraphPad).

La Figura 9 proporciona un esquema del diseño del estudio para el modelo de ratón de infusión de PCSK9 humana, para determinar el efecto de disminución del colesterol de los presentes anticuerpos. MAB2 y MAB3 son anticuerpos anti-PCSK9 humano-diseñados (HumaneeredMR) que se enlazan con una alta afinidad a hPCSK9 sin enlace alguno detectable a la PCSK9 de murino. Para probar si los anticuerpos podrían tanto inhibir la elevación del colesterol no de lipoproteína de alta densidad (no HDL) mediada por la hPCSK9 como prevenir la degradación del LDL-R hepático mediada por la PCSK9, los anticuerpos se inyectaron cada uno en ratones 3 horas antes de la implantación de la mini-bomba osmótica que contenía la hPCSK9 (para la infusión continua). La cosecha de plasma y de tejido hepático se llevó a cabo 24 horas después de la inyección de la hPCSK9.

La Figura 10 muestra que el tratamiento con los anticuerpos de MAB2 y MAB3 dio como resultado la acumulación de la PCSK9 humana ("hPCSK9") en el modelo de infusión de ratón. Se cuantificaron los niveles en plasma tanto de IgG como de hPCSK9 mediante el ensayo Meso Scale Discovery (MSD). Para el ensayo de IgG MSD, se utilizaron placas MSD Standard 96 (L11XA-3). Dicho de una manera breve, las placas se recubrieron con 25 a 28 microlitros de antígeno de captura, PCSK9-His, 1 microgramo/mililitro en suero regulado con fosfato (PBS) (de 25 a 28 nanogramos/pozo) durante la noche a 4°C. La solución de recubrimiento se volcó, y las placas se bloquearon con 150 microlitros/pozo del Bloqueador A de MSD al 5 por ciento (R93AA-2) agitando durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa con suero regulado con fosfato (PBS) + Tween-20 al 0.05 por ciento, 300 microlitros x 3 veces, 25 microlitros de diluciones del calibrador de IgG (10 diluciones en serie con el bloqueador A de MSD desde 10,000 hasta 0.0003 nanogramos/mililitro), diluciones de la muestra en plasma desconocidas (10.000X con el bloqueador A de MSD), o se agregaron muestras de control de calidad y se incubaron con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar, se agregaron 25 microlitros/pozo de 1 microgramo/mililitro de anticuerpo de detección (anticuerpo de detección marcado con SULFO-TAG de cabra anti-humano MSD, R32AC-5, diluido con albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento / suero regulado con fosfato (PBS) / Tween-20 al 0.05 por ciento) (anticuerpo de detección marcado con SULFO-TAG de cabra anti-humano MSD, R32AJ-5), y se incubaron con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado y de la adición de 150 microlitros/pozo de regulador de lectura T 1X, la placa se leyó inmediatamente en el MSD SECTOR Imager 6000. Se hizo una gráfica de la curva estándar y se calcularon muestras desconocidas utilizando el software de análisis de datos de MSD.

Se cuantificaron los niveles de IgG en plasma mediante el ensayo Meso Scale Discovery (MSD). El anticuerpo libre se midió utilizando hPCSK9 para la captura. Este ensayo midió el anticuerpo "libre" y posiblemente mide los complejos de 1:1 de Ab:PCSK9. Para el ensayo de IgG MSD, se utilizaron placas MSD Standard 96 (L11XA-3). Dicho de una manera breve, las placas se recubrieron con 25 a 28 microlitros de antígeno de captura, PCSK9-His, 1 microgramo/mililitro en suero regulado con fosfato (25-28 nanogramos/pozo) durante la noche a 4°C. La solución de recubrimiento se removió y las placas se bloquearon con 150 microlitros/pozo del Bloqueador MSD A al 5 por ciento (R93AA-2) con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa con suero regulado con fosfato + Tween-20 al 0.05 por ciento (300 microlitros, 3 veces), se agregaron 25 microlitros de diluciones de calibrador de IgG (10 diluciones en serie con Bloqueador MSD A desde 10,000 hasta 0.0003 nanogramos/mililitro), diluciones desconocidas de muestras de plasma (10.000X con Bloqueador MSD A), o muestras de control de calidad, y se incubaron con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar, se agregaron 25 microlitros/pozo de 1 micro-gramo/mililitro de anticuerpo de detección (anticuerpo de detección marcado con SULFO-TAG de cabra anti-ratón SD, R32AC-5, diluido con albúmina de suero bovino al 1 por ciento / suero regulado con fosfato / Tween 20 al 0.05 por ciento), y se incubaron con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado y de la adición de 150 microlitros/pozo de regulador de lectura T 1X, la placa se leyó inmediatamente en un MSD SECTOR Imager 6000. Una gráfica de la curva estándar y las muestras desconocidas, se calcularon utilizando el software de análisis de datos MSD.

El ensayo de hPCSK9 MSD es similar al ensayo de IgG, pero con las siguientes excepciones. Las placas se recubrieron con 25 a 28 microlitros de anticuerpo de captura (7D16.C3: 2.95 miligramos/ mililitro) a 1 microgramo/mililitro. Después del bloqueo de las placas, se incubaron 25 microlitros de diluciones calibradoras de hPCSK9 (10 puntos desde 10,000 hasta 0.0003 nanogramos/mililitro), y diluciones de muestras en plasma (10.000X con Bloqueador MSD A) con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por una incubación con el anticuerpo de detección primario (anticuerpo policlonal de conejo anti-PCSK9, Ab4, Conejo ID #RB11835 de la empresa). Se agregó un paso de incubación adicional con el anticuerpo de detección secundario (anticuerpo de detección marcado con SU LFO-TAG de cabra anti-conejo MSD, R32AB-5), antes de la lectura con el MSD SECTOR Imager 6000.

La Figura 11 ilustra que los anticuerpos MAB2 y MAB3 conducen a la reducción en plasma del colesterol no HDL en el modelo de infusión de hPCSK9 de ratón. La inyección previa del anticuerpo de MAB2 dio como resultado una protección del 52 por ciento de la elevación en el colesterol no HDL mediada por hPCSK9. La inyección previa del MAB3 dio como resultado una protección equivalente de la elevación en el colesterol no HDL mediada por hPCSK9. Los ratones C57BL/6 se trataron con vehículo solo, con PCSK9 sola, o con PCSK9 + 20 miligramos/kilogramo de MAB2, o PCSK9 + 20 miligramos/kilogramo de MAB3. Los valores individuales se muestran con el valor promedio marcado como una barra horizontal. Con el fin de cuantificar el nivel total de colesterol en plasma, se utilizó un analizador clínico Olympus (Olympus America Inc.: Olympus AU400). Las muestras de plasma se diluyeron a 1:3 en ddH20, y se cuantificaron 40 microlitros de las muestras de plasma diluidas para determinar el nivel total de colesterol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Con el objeto de cuantificar HDL y no HDL en plasma, se obtuvieron las fracciones de colesterol utilizando el Spife 3000 de Helena Laboratories. Todos los procedimientos, incluyendo la preparación de muestras, la preparación del gel, la aplicación de muestras, la electroforesis en gel, el teñido, el lavado, y el secado, se hicieron siguiendo las instrucciones proporcionadas en el manual del operador. Luego el gel se exploró en el Quick Sean 2000 utilizando la Ranura 5, y se calculó el porcentaje relativo de las fracciones de colesterol de lipoproteína utilizando el densitómetro Helena. Finalmente, se calcularon los valores absolutos de HDL y no HDL mediante la multiplicación del porcentaje de cada fracción y los niveles totales de colesterol.

La Figura 12 ilustra los perfiles farmacocinéticos (PK) en rata para los anticuerpos MAB2 y MAB3 (lgG1 humana silenciosa) en comparación con un perfil farmacocinético (PK) de lgG1 "típico". No hubo evidencia de la disposición mediada por el objetivo (TMD), indicando que no hubo evidencia alguna de la disposición mediada por el objetivo (TMD), indicando que los anticuerpos no reaccionan cruzadamente con la PCSK9 de roedor). Para cada anticuerpo de prueba, 3 ratas Lewis machos se inyectaron a 10 miligramos/ kilogramo. En los tiempos = 0, 1, 6, 24 horas, 2, 4, 8 y 16 días, se muestrearon 250 microlitros de sangre, y el plasma aclarado se diluyó y se evaluó en un ELISA de captura (IgG de cabra antihumano) para medir el anticuerpo humano total recuperado. También se generó una curva estándar para cada anticuerpo de prueba. La cantidad de la IgG recuperada se gráfico contra la recuperación esperada de una IgG humana típica en una rata.

DESCRIPCIÓN DETALLADA I. Introducción Los anticuerpos y moléculas de enlace de antígeno de la presente invención específicamente se enlazan a la pro-proteína de convertasa-subtilisina/quexina tipo 9a ("PCSK9"). Los presentes anticuerpos anti-PCSK9 y moléculas de enlace de antígeno se enlazan al dominio catalítico de PCSK9 y alteran el complejo de PCSK9/receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R), impidiendo de esta manera la sub-regulación de LDL-R mediada por PCSK9 y la actualización de LDL. En particular, los anticuerpos anti-PCSK9 y las moléculas de enlace de antígeno se enlazan a un epítopo dentro de los residuos 159-182 de PCSK9, por ejemplo, un epítopo dentro de la secuencia de aminoácidos ERITPPRYRADEYQ PPDGGSLVE (SEQ ID NO: 42), localizada en el dominio catalítico de PCSK9. Los anticuerpos anti-PCSK9 y las moléculas de enlace de antígeno de la invención son antagonistas de PCSK9 porque previenen, reducen y/o inhiben la interacción de PCSK9 con el receptor de lípido de baja densidad (LDLR), y previenen, reducen y/o inhiben la degradación del LDL-R mediada por PCSK9, facilitando de esta manera el aumento de absorción de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C). Los anticuerpos anti-PCSK9 y las moléculas de enlace de antígeno encuentran uso en el tratamiento de sujetos que padezcan, por ejemplo, de dislipidemia, hipercolesterolemia, trigliceridemia y otras condiciones de enfermedad mediadas por PCSK9.

II. Anticuerpos anti-PCSK9 mejorados en general Se pueden producir fragmentos de anticuerpos anti-PCSK9 por cualquier medio conocido en la materia, incluyendo, pero no limitándose a, expresión recombinante, síntesis química, y digestión enzimática de los tetrámeros de anticuerpos, mientras que los anticuerpos monoclonales de longitud completa se pueden obtener mediante, por ejemplo, producción recombinante o hibridoma. La expresión recombinante puede ser a partir de cualesquiera células huésped apropiadas conocidas en la materia, por ejemplo, células huésped de mamífero, células huésped bacterianas, células huésped de levadura, células huésped de insectos, etc. Cuando están presentes, las regiones constantes de los anticuerpos anti-PCSK9 pueden ser de cualquier tipo o subtipo, como sea apropiado, y se pueden seleccionar a partir de las especies de sujetos que se vayan a tratar mediante los presentes métodos (por ejemplo, humanas, de primates o de otros mamíferos no humanos, por ejemplo, de mamíferos agrícolas (por ejemplo, equino, ovino, bovino, porcino, camélido), de mamíferos domésticos (por ejemplo, canino, felino), o de roedores (por ejemplo, rata, ratón, hámster, conejo). En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 son humanizados o HumaneeredMR (humano-diseñados). En algunas modalidades, el isotipo de la región constante es IgG, por ejemplo, lgG1. En algunas modalidades, la región constante de IgG 1 humana se muta para tener una afinidad de enlace reducida por un ligando efector, tal como el receptor de Fe (FcR), por ejemplo, Fe gamma R1 , sobre una célula o el componente de complemento C1. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,624,821. Los anticuerpos que contienen estas mutaciones median una reducción de, o ninguna citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En algunas modalidades, los residuos de aminoácidos L234 y L235 de la región constante de lgG1 están sustituidos por Ala234 y Ala235. La numeración de los residuos en la región constante de cadena pesada es aquélla del índice de la Unión Europea (EU) (véase, Kabat y colaboradores (1983) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," U.S. Dept. Health and Human Services (Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos)). Véase también, por ejemplo, Woodle y colaboradores, Transplantation (1 999) 68(5): 608-616; Xu y colaboradores, Cell Immunol (2000) 200(1 ): 16-26; y Hezareh y colaboradores, J Virol 75(24): 1 2161 -8.

Los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno de la invención también incluyen unidades de enlace de antígeno de un solo domin io, las cuales tienen u n andamiaje de camélido. Los animales de la familia de camélidos incluyen camellos, llamas, y alpacas. Los camélidos prod ucen anticuerpos funcionales desprovistos de cadenas ligeras. El domin io variable de cadena pesada (VH) se pliega de una manera autónoma y funciona independ ientemente como una un idad de enlace de antígeno. Su superficie de enlace involucra solamente tres regiones determinantes de complementariedad , comparándose con las seis reg iones determinantes de complementariedad de las moléculas de enlace de antígeno clásicas (Fabs) o de los fragmentos va riables de u na sola cadena (scFvs) . Los anticuerpos de camélido son capaces de obtener afinidades de enlace comparables a aq uéllas de los anticuerpos convencionales. Las molécu las anti-PCSK9 basadas en el andamiaje de camélido, con especificidades de enlace de los anticuerpos anti-PCSK9 ejemplificados en la presente, se pueden producir empleando los métodos bien conocidos en la materia , por ejemplo, Dumou lin y colaboradores, Natu re Struct. Biol . 1 1 : 500-51 5, 2002 ; G hahroudi y colaboradores, FEBS Letters 414: 521 -526, 1 997; y Bond y colaboradores, J Mol Biol . 332 :643-55, 2003.

Los anticuerpos a nti-PCSK9 mejorados de la invención son anticuerpos humanos diseñados con secuencias de la región-V que tienen una identidad sustancial de secuencia de aminoácidos con las secuencias de la línea germinal humana de la región-V, mientras que conservan la especificidad y afinidad de un anticuerpo de referencia. Véanse la Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2005/0255552 y la Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2006/0134098, ambas de las cuales se incorporan a la presente como referencia. El proceso de mejora identifica la información de secuencia mínima requerida para determinar la especificidad de enlace de antígeno a partir de la región variable de un anticuerpo de referencia, y transfiere esa información a una biblioteca de secuencias genéticas de la región-V parcial humana para generar una biblioteca enfocada a los epítopos de regiones-V de anticuerpos humanos. Se puede utilizar un sistema de secreción basado en microbios para expresar los miembros de la biblioteca como fragmentos de anticuerpo Fab, y se rastrea la biblioteca para determinar los Fabs de enlace de antígeno, por ejemplo, utilizando un ensayo de enlace de levantamiento de colonias. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2007/0020685. Adicionalmente se pueden caracterizar los clones positivos para identificar aquéllos con la afinidad más alta. Los Fabs humanos diseñados resultantes retienen la especificidad de enlace del progenitor, el anticuerpo anti-PCSK9 de referencia, típicamente tienen una afinidad por el antígeno equivalente o más alta en comparación con el anticuerpo progenitor, y tienen regiones-V con un alto grado de identidad de secuencia comparándose con las regiones-V del anticuerpo de la línea germinal humana.

El determinante de especificidad de enlace (BSD) mínimo requerido para generar la biblioteca enfocada a los epítopos, está típicamente representado por una secuencia dentro de la CDR3 de cadena pesada ("CDRH3"), y una secuencia dentro de la cadena ligera de la CDR3 ("CDRL3"). El determinante de especificidad de enlace (BSD) puede comprender una porción o la longitud entera de una CDR3. El determinante de especificidad de enlace (BSD) puede estar comprendido de residuos de aminoácidos contiguos o no contiguos. En algunos casos, la biblioteca enfocada a los epítopos se construye a partir de secuencias del segmento-V humanas enlazadas a la región CDR3-FR4 única a partir del anticuerpo de referencia que contiene el determinante de especificidad de enlace (BSD) y las secuencias del segmento-J de la línea germinal humana (véanse, la Figura 1 y la Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2005/0255552). De una manera alternativa, las bibliotecas del segmento-V humano se pueden generar mediante el reemplazo del cásete secuencial, en donde solamente una parte del segmento-V del anticuerpo de referencia es inicialmente reemplazada por una biblioteca de secuencias humanas. Los "casetes" humanos identificados, que soportan el enlace en el contexto de las secuencias de aminoácidos residuales del anticuerpo de referencia, se recombinan entonces en un segundo rastreo de la biblioteca, para generar segmentos-V completamente humanos (véase la Publicación de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 2006/0134098).

En cada caso, se utilizan los segmentos de la CDR3 de cadena pesada y ligera emparejados, los segmentos CDR3-FR4, o los segmentos-J, que contienen los determinantes de especificidad a partir del anticuerpo de referencia, para limitar la especificidad de enlace, de tal manera que los enlazadores de antígeno obtenidos a partir de la biblioteca retienen la especificidad del epítopo del anticuerpo de referencia. Se pueden introducir cambios de maduración adicionales en las regiones CDR3 de cada cadena para la construcción de la biblioteca, con el objeto de identificar los anticuerpos con una cinética de enlace óptima. Los anticuerpos humanos diseñados resultantes tienen secuencias del segmento-V derivadas a partir de las bibliotecas de la línea germinal humana, retienen la secuencia corta del determinante de especificidad de enlace (BSD) a partir de las regiones CDR3, y tienen regiones de estructura 4 (FR4) de la línea germinal humana.

De conformidad con lo anterior, en algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 contienen un determinante de especificidad de enlace (BSD) mínimo dentro de la CDR3 de las cadenas pesadas y ligeras derivadas a partir del anticuerpo monocional originador o de referencia. Las secuencias restantes de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera (CDR y FR), por ejemplo, el segmento-V y el segmento-J, son a partir de las secuencias de aminoácidos de la línea germinal humana y de afinidad madurada correspondientes. Los segmentos-V se pueden seleccionar a partir de una biblioteca de segmento-V humano. Se puede llevar a cabo un refinamiento adicional de la secuencia mediante maduración de afinidad.

En otra modalidad, las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos anti-PCSK9 contienen un segmento-V humano a partir de la secuencia de la línea germinal humana correspondiente (FR1-CDR 1 -FR2-CDR2-FR3), por ejemplo, seleccionado a partir de una biblioteca del segmento-V humano, y un segmento de la secuencia de CDR3-FR4 a partir del anticuerpo monoclonal originador. El segmento de la secuencia de CDR3-FR4 se puede retinar adicionalmente, mediante el reemplazo de los segmentos de la secuencia con la secuencia de la línea germinal humana correspondiente y/o mediante maduración de afinidad. Por ejemplo, la secuencia de FR4 y/o CDR3 que rodea al determinante de especificidad de enlace (BSD), puede ser reemplazada con la secuencia de la línea germinal humana correspondiente, mientras que se conserva el determinante de especificidad de enlace (BSD) a partir de la CDR3 del anticuerpo monoclonal originador.

En algunas modalidades, la secuencia de la línea germinal humana correspondiente para el segmento-V de cadena pesada es VH22-05. En algunas modalidades, la secuencia de la línea germinal humana correspondiente para el segmento-J de cadena pesada es JH1, JH4, o JH5. Los genes de la región variable son referenciados de acuerdo con la nomenclatura convencional para los genes de la región variable de inmunoglobulina. La información actual de los genes de inmunoglobulina está disponible a través de la red mundial, por ejemplo, en las bases de datos ImMunoGeneTics (IMGT), V-base, y PubMed. Véase también, Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001; 18(2): 100-16; Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001; 18(3): 161-74; Exp Clin Immunogenet. 2001; 18(4): 242-54; y Giudicelli y colaboradores, Nucleic Acids Res., 1 de Enero de 2005; 33 (Publicación de la base de datos): D256-61.

En algunas modalidades, la secuencia de la línea germinal humana correspondiente para el segmento-V de cadena ligera es VK1 02 ó VK1 012. En algunas modalidades, la secuencia de la línea germinal humana correspondiente para el segmento-J de cadena ligera es JK2.

En algunas modalidades, el segmento-V de cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento ó el 100 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos Q(I/V)TLKESGPVLVKPT(E/Q)TLTLTCTVS GFSLSTSG(M/V)GVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDNKYYNPSLKSRLT ISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR (SEQ ID NO: 27). En algunas modalidades, el segmento-V de cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o el 100 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos QITLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEW LADIWWDDNKYYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYC AR (SEQ ID NO: 25). En algunas modalidades, el segmento-V de cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o el 100 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTV SGFSLSTSGVGVGWIRQSPGKALEWLADIWWDDN KYYNPSLKSRLTIS KDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAR (SEQ ID NO: 26).

En algunas modalidades, el segmento-V de cadena ligera tiene cuando menos el 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 85 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 93 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento ó 100 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRA (G/S)Q(R/S)I(N/S)(H/N)NLHWYQQKPDESPRLLI FASRLISGVPSRFS GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 29). En algunas modalidades, el segmento-V de cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, 86 por ciento, 87 por ciento, 88 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 91 por ciento, 92 por ciento, 93 por ciento, 94 por ciento, 85 por ciento, 89 por ciento, 90 por ciento, 93 por ciento, 95 por ciento, 96 por ciento, 97 por ciento, 98 por ciento, 99 por ciento ó 100 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAGQRISHNLHW YQQKPDESPRLLINFASRLISGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT YYC (SEQ ID NO: 28).

En algunas modalidades: i) la CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos ITTEGGFAY (SEQ ID NO: 17); y ¡i) la región variable CDR3 de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos QQSNYWPLT (SEQ ID NO: 24).

En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención comprenden una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1, la cual comprende una secuencia de aminoácidos TSG(M/V)GVG (SEQ ID NO: 15); una CDR2, la cual comprende una secuencia de aminoácidos DIWWDDNKYYNPSLKS (SEQ ID NO: 16); y una CDR3, la cual comprende una secuencia de aminoácidos ITTEGGFAY (SEQ ID NO: 17).

En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención comprenden una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1, la cual comprende una secuencia de aminoácidos RA(G/S)Q(R/S)I(N/S)-(H/N)NLH (SEQ ID NO: 20); una CDR2, la cual comprende una secuencia de aminoácidos FASR(L/S)ES (SEQ ID NO: 23); y una CDR3, la cual comprende una secuencia de aminoácidos QQSNYWPLT (SEQ ID NO: 24).

En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada comprende una FR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 32; una FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 33; una FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34; y una FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35. Las secuencias de aminoácidos identificadas pueden tener uno o más aminoácidos sustituidos (por ejemplo, a partir de la maduración de afinidad) o uno o dos aminoácidos conservadoramente sustituidos.

En algunas modalidades, la región variable de cadena ligera comprende una FR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 36; una FR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37; una FR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38; y una FR4 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39. Las secuencias de aminoácidos identificadas pueden tener uno o más aminoácidos sustituidos (por ejemplo, a partir de la maduración de afinidad) o uno o dos aminoácidos conservadoramente sustituidos.

Sobre su longitud completa, las regiones variables de los anticuerpos anti-PCSK9 de la presente invención, en términos generales, tendrán una identidad de secuencia de aminoácidos de la región variable total (por ejemplo, FR1 -CDR1 -FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4) de cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, por ejemplo, de cuando menos aproximadamente el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento con la secuencia de aminoácidos de la región variable de la línea germinal humana correspondiente. Por ejemplo, la cadena pesada de los anticuerpos anti-PCSK9 puede tener cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con la región variable de la línea germinal humana Vh2 2-05. La cadena ligera de los anticuerpos anti-PCSK9 puede tener cuando menos aproximadamente el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con la región variable de la línea germinal humana Vk1 02. En algunas modalidades, solamente se agregan, se suprimen, o se sustituyen los aminoácidos dentro de las regiones de estructura. En algunas modalidades, la comparación de identidad de secuencia excluye la CD3.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 de la invención comprenden una región variable de cadena pesada que tiene cuando menos el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 40, y comprenden una región variable de cadena ligera que tiene cuando menos el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 41 (es decir, secuencias en consenso).

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 de la invención comprenden una región variable de cadena pesada que tiene cuando menos el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 1, y comprenden una región variable de cadena ligera que tiene cuando menos el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 3 (es decir, MAB1 de ratón).

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 de la invención comprenden una región variable de cadena pesada que tiene cuando menos el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 5, y comprenden una región variable de cadena ligera que tiene cuando menos el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 7 (es decir, MAB2).

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 de la invención comprenden una región variable de cadena pesada que tiene cuando menos el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con una región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 9, y comprenden una región variable de cadena ligera que tiene cuando menos el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento, o el 100 por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos con una región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 11 (es decir, MAB3).

Para las secuencias de aminoácidos identificadas, de menos de 20 aminoácidos de longitud, se pueden tolerar una o dos sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, mientras que todavía que conserve la actividad de enlace específico y/o antagonista deseada.

Los anticuerpos anti-PCSK9 de la presente invención, en términos generales, se enlazarán a la PCSK9 con una constante de disociación en equilibrio (KD) de menos de aproximadamente 10"8 M ó 10"9 M, por ejemplo, de menos de aproximadamente 10"10 M ó 10"11M, en algunas modalidades de menos de aproximadamente 10"12 M ó 10-13 M.

Los anticuerpos anti-PCSK9 opcionalmente se pueden multimerizar y utilizar de acuerdo con los métodos de esta invención. Los anticuerpos anti-PCSK9 pueden ser un anticuerpo tetramérico de longitud completa (es decir, que tiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas), un anticuerpo de una sola cadena (por ejemplo, un scFv), o una molécula que comprende fragmentos de anticuerpos que forman uno o más sitios de enlace de antígeno y confieren especificidad de enlace de PCSK9, por ejemplo, la cual comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera (por ejemplo, Fab' u otros fragmentos similares).

La invención proporciona además polinucleótidos que codifican los anticuerpos descritos en la presente, por ejemplo, los polinucleótidos que codifican regiones variables de cadena pesada o ligera o segmentos que comprenden las regiones determinantes de complementariedad, como se describen en la presente. En algunas modalidades, la secuencia de polinucleótidos se optimiza para la expresión, por ejemplo, se optimiza para la expresión en mamífero, o se optimiza para la expresión en un tipo de célula particular. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o el 100 por ciento de identidad de secuencia del ácido nucleico con un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 46, y SEQ ID NO: 48. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la cadena ligera tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o el 100 por ciento de identidad de secuencia del ácido nucleico con un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 47, y SEQ ID NO: 49.

En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o el 100 por ciento de identidad de secuencia del ácido nucleico con un polinucleótido de la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la cadena ligera tiene cuando menos el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o el 100 por ciento de identidad de secuencia del ácido nucleico con un polinucleótido de la SEQ ID NO: 4 (es decir, AB1).

En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o el 100 por ciento de identidad de secuencia del ácido nucleico con un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 46. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la cadena ligera tiene cuando menos el 85 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o el 100 por ciento de identidad de secuencia del ácido nucleico con un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 47 (es decir, MAB2).

En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o el 100 por ciento de identidad de secuencia del ácido nucleico con un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 48. En algunas modalidades, el polinucleótido que codifica la cadena ligera tiene cuando menos el 85 por ciento, el 86 por ciento, el 87 por ciento, el 88 por ciento, el 89 por ciento, el 90 por ciento, el 91 por ciento, el 92 por ciento, el 93 por ciento, el 94 por ciento, el 95 por ciento, el 96 por ciento, el 97 por ciento, el 98 por ciento, el 99 por ciento o el 100 por ciento de identidad de secuencia del ácido nucleico con un polinucleótido seleccionado a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 49 (es decir, MAB3). III. Ensayos para identificar los anticuerpos anti-PCSK9 Los anticuerpos antagonistas se pueden identificar mediante la generación de anticuerpos anti-PCSK9, y entonces se prueba cada anticuerpo para determinar su capacidad para reducir o inhibir los eventos mediados por PCSK9, por ejemplo, el enlace al LDLR, promoviendo la degradación del LDLR. Los ensayos se pueden llevar a cabo in vitro o in vivo. Los anticuerpos de ejemplo se enlazan a PCSK9, impiden que la PCSK9 forme un complejo con el LDLR, y reducen o inhiben la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) mediada por la pro-proteína de convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9).

El enlace de los anticuerpos o moléculas de enlace de antígeno con la PCSK9 se puede determinar utilizando cualquier método conocido en la materia, incluyendo, sin limitación, ELISA, Biacore y Western Blot.

La degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) mediada por la PCSK9 también se puede medir utilizando cualquier método conocido en la materia. En una modalidad, la capacidad del anticuerpo anti-PCSK9 o de la molécula de enlace de antígeno para inhibir la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) se determina utilizando un modelo de infusión de ratón. Los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno se infunden intravenosamente (por ejemplo, 3 microgramos/hora) en un ratón, y se determinan los niveles del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) en preparaciones de membrana de hígado en comparación con los niveles del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) en preparaciones de membrana de hígado a partir de un ratón que haya recibido infusiones intravenosas de un anticuerpo de control (por ejemplo, que se enlace a un antígeno no relacionado). Los ratones que hayan recibido los anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 tendrán niveles detectablemente más altos del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R), por ejemplo, cuando menos el 10 por ciento, el 20 por ciento, el 50 por ciento, el 80 por ciento, o el 100 por ciento más altos, en comparación con los ratones que hayan recibido el anticuerpo de control.

Los anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 también se pueden probar para determinar su eficacia terapéutica para reducir los niveles en plasma de LCL-C, no HDL-C y/o colesterol total. Los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno se infunden intravenosamente (por ejemplo, 3 microgramos/hora) en un mamífero (por ejemplo, en un ratón, rata, primate no humano, ser humano), y se determinan los niveles en plasma de LCL-C, no HDL-C y/o colesterol total en comparación con los niveles en plasma de LCL-C, no HDL-C y/o colesterol total a partir del mismo mamífero antes del tratamiento o a partir de un mamífero que haya recibido infusiones intravenosas de un anticuerpo de control (por ejemplo, que se enlace a un antígeno no relacionado). El mamífero que haya recibido los anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 tendrá niveles detectablemente más bajos en plasma de LCL-C, no HDL-C y/o colesterol total, por ejemplo, cuando menos el 10 por ciento, el 20 por ciento, el 50 por ciento, el 80 por ciento, o el 100 por ciento más bajos, en comparación con el mamífero antes del tratamiento o con el mamífero que haya recibido el anticuerpo de control.

IV. Com posiciones que comprenden anticuerpos anti-PCSK9 La invención proporciona composiciones fa rmacéuticas que comprenden los presentes anticuerpos anti-PCSK9 o moléculas de enlace de antígeno formulados junto con un veh ículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones ad icionalmente pueden contener otros agentes terapéuticos q ue sean adecuados para el tratamiento o la prevención de un trastorno dado. Los vehículos farmacéuticamente aceptables mejoran o estabilizan la composición, o facilitan la preparación de la composición . Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen solventes, medios de dispersión , recubrimientos, agentes antibacterianos y antifú ngicos, agentes isotónicos y retardantes de absorción , y similares , q ue sean fisiológicamente compatibles.

U na composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar mediante u na variedad de métodos conocidos en la técnica . La vía y/o el modo de admin istración varían dependiendo de los resu ltados deseados. Se prefiere que la administración sea intravenosa , intramuscular, intraperitoneal , o subcutánea , o que se administre próxima al sitio del objetivo. El veh ículo farmacéutica-mente aceptable debe ser adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral , intranasal , por in halación , espinal, o epidérmica (por ejemplo, mediante i nyección o infusión) . Dependiendo de la vía de admin istración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, la molécula biespecífica y mu ltiespecífica , se puede recubrir en un material para proteger al compuesto de la acción de los ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.

Los anticuerpos, solos o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden hacer en formulaciones de aerosol (es decir, se pueden "nebulizar") para administrarse por medio de inhalación. Las formulaciones de aerosol se pueden poner en propelentes aceptables presurizados, tales como dicloro-difluoro-metano, propano, nitrógeno, y similares.

En algunas modalidades, la composición es estéril y fluida. Se puede mantener una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión, y mediante el uso de tensoactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, poli-alcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio, en la composición. Se puede provocar la absorción de largo plazo de las composiciones inyectables mediante la inclusión en la composición de un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden preparar de acuerdo con los métodos bien conocidos y rutinariamente practicados en este campo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son determinados en parte por la composición particular que se esté administrando, así como por el método particular empleado para administrar la composición. De conformidad con lo anterior, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención. Los métodos aplicables para formular los anticuerpos y determinar la dosificación y programación apropiadas, se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edición, University of the Sciences in Philadelphia, Editores, Lippincott Williams & Wilkins (2005); y en Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, Londres: Pharmaceutical Press., y en Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31a Edición., 1996, Amer Pharmaceutical Assn, y Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, Editor, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978, cada uno de los cuales se incorpora a la presente como referencia. Las composiciones farmacéuticas de preferencia se elaboran bajo condiciones GMP. Típicamente, se emplea una dosis terapéuticamente efectiva o una dosis eficaz el anticuerpo anti-PCSK9 en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los anticuerpos anti-PCSK9 se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables mediante los métodos convencionales conocidos por los expertos en este campo. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). En la determinación de una dosis terapéuticamente o profilácticamente efectiva, se puede administrar una dosis baja, y entonces se aumenta crecientemente hasta que se logre una respuesta deseada con efectos secundarios indeseados mínimos o nulos. Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a través del tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente, como sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es en especial conveniente formular las composiciones parenterales en una forma unitaria de dosificación para mayor facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación, como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se vayan a tratar; cada unidad contiene una cantidad previamente determinada del compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración particular, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado depende de una variedad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o del éster, la sal o la amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular, que se estén empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, los compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que se esté tratando, y factores similares.

En algunas modalidades, las composiciones farmacológicas comprenden una mezcla del anticuerpo anti-PCSK9 o de la molécula de enlace de antígeno, y un segundo agente farmacológico. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender un anticuerpo anti-PCSK9 o molécula de enlace de antígeno de la invención y un agente que se sepa que es benéfico para reducir el colesterol, incluyendo LDL-C, no HDL-C y colesterol total y/o para elevar el HDL-C.

Los segundos agentes de ejemplo para incluirse en las mezclas con el presente anticuerpo antagonista anti-PCSK9 o molécula de enlace de antígeno incluyen, sin limitación, un inhibidor de HMG-CoA-reductasa (es decir, una estatina), fibratos (por ejemplo, clofibrato, gemfibrozil, fenofibrato, ciprofíbrato, bezafibrato), niacina y análogos de la misma, inhibidores de la absorción de colesterol, secuestrantes de ácido biliar (por ejemplo, colestiramina, colestípol, colesvelam), un inhibidor del transporte de ácido biliar ¡leal (IBAT), un mimético de hormona tiroides (por ejemplo, el compuesto KB2115), un inhibidor de proteína de transferencia de triglicéridos microsomal, un agonista doble alfa y gamma del receptor activado por el proliferador de peroxisoma (PPAR), un inhibidor de acil-transferasa de acil-CoA:diacil-glicerol (DGAT), un inhibidor de acil-transferasa de acil-CoA:colesterol (ACAT), un inhibidor de Niemann Pick 1 t¡po-C1 (NPC1-L1) (por ejemplo, ezetimiba), un agonista de las proteínas de Cásete de Enlace de ATP (ABC) G5 ó G8, un inhibidor de la proteina de transferencia de colesterol-éster (CETP), un ácido nucleico inhibidor dirigido a la PCSK9, y un ácido nucleico inhibidor dirigido a la apoBIOO. Los agentes que disminuyen los lípidos son conocidos en la materia, y se describen, por ejemplo, en Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11a Edición, Brunton, Lazo y Parker, Editores, McGraw-Hill (2006); 2009 Physicians' Desk Reference (PDR), por ejemplo, en la 63a (2008) Editores, Thomson PDR.

Los agentes que disminuyen los lípidos adicionales útiles en las presentes composiciones se describen y/o se revisan, por ejemplo, en Chang y colaboradores, Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4): 562-70; Sudhop y colaboradores, Drugs (2002) 62(16): 2333-47; Bays y Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11): 1901-38; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar (134): 45-50; Tomoda y Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3): 375-89; Tenenbaum y colaboradores, Adv Cardiol (2008) 45: 127-53; Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2): S241-S248; Lee y colaboradores, J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11): 1785-8; Oh y colaboradores, Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7; Birch y colaboradores, J Med Chem (2009) 52(6): 1558-68; y Baxter y Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8: 308-320.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno de la invención se proporcionan como una mezcla con una estatina. Las estatinas de ejemplo incluyen, sin limitación, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, y simvastatina.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno de la invención se proporcionan como una mezcla con un agente farmacológico que induce hipercolesterolemia o trigliceridemia. Por ejemplo, el segundo agente farmacológico puede ser un inhibidor de proteasa, por ejemplo, Saquinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir, Atazanavir, Fosamprenavir, Tipranavir, Darunavir, abacavir-lamivudina-zidovudina (Trizivir). En algunas modalidades, el segundo agente farmacológico es Tacrolimus.

V. Métodos para utilizar los anticuerpos anti-PCSK9 A. Condiciones sujetas al tratamiento con anticuerpos anti-PCSK9 Los anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 y las moléculas de enlace de antígeno de la invención encuentran uso en el tratamiento de cualquier condición de enfermedad mediada por la actividad o la sobre-actividad de PCSK9.

Por ejemplo, los individuos que tienen o que están en riesgo de desarrollar dislipidemia o hipercolesterolemia por cualquier número de razones o etiologías, pueden beneficiarse de la administración de los presentes anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 y moléculas de enlace de antígeno. Por ejemplo, el individuo puede tener hipercolesterolemia homocigótica o heterocigótica familiar o genéticamente transmitida en donde esté presente un receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) funcional. Las mutaciones genéticas asociadas con y/o causantes de hipercolesterolemia familiar o genéticamente heredada se resumen, por ejemplo, en Burnett y Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1): 11-26. El individuo también puede tener otras condiciones de enfermedad o puede dedicarse a comportamientos que contribuyan a, o que aumenten, el riesgo de desarrollar dislipidemia o hipercolesterolemia. Por ejemplo, el individuo puede ser obeso, o puede padecer diabetes o síndrome metabólico. El individuo puede ser un fumador, puede llevar un estilo de vida sedentaria, o puede tener una dieta alta en colesterol.

La dirección a la PCSK9 es útil para la reducción, reversión, inhibición, o prevención de dislipidemia, hipercolesterolemia y trigliceridemia post-prandial. Véase, por ejemplo, Le May y colaboradores, Arterioscler Thromb Vasc Biol (2009) 29(5): 684-90; Seidah, Expert Opin Ther Targets (2009) 13(1): 19-28; y Poirier y colaboradores, J Biol Chem (2009) PMID 19635789. De conformidad con lo anterior, la administración de los presentes anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 y moléculas de enlace de antígeno encuentra uso en la reducción, reversión, inhibición, y prevención de dislipidemia, hipercolesterolemia, y trigliceridemia post-prandial en un individuo que lo necesite.

Los presentes anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 y moléculas de enlace de antígeno encuentran uso en la reducción o disminución de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C) en un individuo que lo necesite. El individuo puede tener niveles persistentemente elevados de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C). En algunas modalidades, el individuo tiene niveles en plasma de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C) consistentemente arriba de 80 miligramos/decilitro, por ejemplo arriba de 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 miligramos/decilitro, o más altos. Los presentes anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 y moléculas de enlace de antígeno también encuentran uso en la reducción o disminución del colesterol que no es de lipoproteína de alta densidad (no HDL-C) o del colesterol total en un individuo que lo necesite.

El individuo puede ya estar tomando otro agente farmacológico para reducir el colesterol, y puede ser resistente o intolerante a este agente. Por ejemplo, el individuo puede ya estar bajo un régimen terapéutico con una estatina, el cual puede haber probado ser ineficaz en este individuo para reducir el colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C), el colesterol que no es de lipoproteína de alta densidad (no HDL-C), o el colesterol total hasta niveles aceptables. El individuo también puede ser intolerante a la administración de una estatina. La administración combinada de los presentes anticuerpos antagonistas anti-PCSK9 y moléculas de enlace de antígeno con un segundo agente útil para reducir el colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C) o el colesterol que no es de lipoproteína de alta densidad (no HDL-C) y/o para elevar el colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL-C) mejorará la eficacia y tolerancia del segundo agente, por ejemplo, al permitir que se administren dosis más bajas del segundo agente.

En algunas modalidades, el individuo tiene una mutación de ganancia de función en el gen de PCSK9, por ejemplo, que da como resultado un incremento aberrante en la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R).

En algunas modalidades, el individuo está recibiendo un agente farmacológico que induce dislipidemia o hipercolesterolemia, es decir, el individuo tiene dislipidemia o hipercolesterolemia inducida por fármacos. Por ejemplo, el individuo puede estar recibiendo un régimen terapéutico de inhibidores de proteasa, por ejemplo, para el tratamiento de una infección por VIH. Otro agente farmacológico que se sabe que provoca niveles elevados de triglicéridos en plasma es el Tacrolimus, un fármaco inmunosupresor administrado a los pacientes con trasplante. Se ha demostrado que la ciclosporina aumenta la lipoproteína de baja densidad (LDL) de una manera significativa. Véase, por ejemplo, Ballantyne y colaboradores (1996) 78(5): 532-5. Los anti-psicóticos de segunda generación (por ejemplo, arípiprazol, clozapina, olanzapina, quetiapina, risperidona, y ziprasidona) también se han asociado con la dislipidemia. Véase, por ejemplo, Henderson, J Clin Psychiatry (2008) 69(2): e04 y Brooks y colaboradores, Curr Psychiatry Rep (2009) 11(1): 33-40.

B. Administración de los anticuerpos anti-PCSK9 Un médico o veterinario puede empezar con dosis de los anticuerpos de la invención empleados en la composición farmacéutica en niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado, y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado. En general, la dosis efectiva de las composiciones de la presente invención varía dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo la enfermedad o condición específica que se vaya a tratar, el medio de administración, el sitio objetivo, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano o un animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosificaciones del tratamiento se necesitan titular para optimizar la seguridad y la eficacia. Para su administración con un anticuerpo, la dosificación está en el intervalo de aproximadamente 0.0001 a 100 miligramos/ kilogramo, y más usualmente de 0.01 a 5 miligramos/kilogramo, del peso corporal del huésped. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser de 1 miligramo/kilogramo de peso corporal ó de 10 miligramos/ kilogramo de peso corporal, o pueden estar dentro del intervalo de 1 a 10 miligramos/kilogramo. La dosificación puede ser diaria, semanal, quincenal, mensual, o con más o menos frecuencia, como sea necesario o deseado. Un régimen de tratamiento de ejemplo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, o una vez al mes, o una vez cada 3 a 6 meses.

En algunas modalidades, se administra un polinucleótido que codifica un anticuerpo anti-PCSK9 o una molécula de enlace de antígeno de la invención. En las modalidades en donde el agente es un ácido nucleico, las dosificaciones típicas pueden estar en el intervalo de aproximadamente 0.1 miligramos/kilogramo de peso corporal hasta e incluyendo aproximadamente 100 miligramos/ kilogramo de peso corporal, por ejemplo, entre aproximadamente 1 miligramo/kilogramo de peso corporal y aproximadamente 50 miligramos/kilogramo de peso corporal. En algunas modalidades, son de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ó 50 miligramos/kilogramo de peso corporal.

El anticuerpo se puede administrar en dosis individuales o divididas. El anticuerpo usualmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosificaciones individuales pueden ser semanalmente, quincenalmente, mensualmente, o anualmente, como sea necesario o deseado. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indique mediante la medición de niveles en sangre del anticuerpo anti-PCSK9 en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para alcanzar una concentración del anticuerpo en plasma de 1 a 1000 microgramos/ mililitro, y en algunos métodos, de 25 a 300 microgramos/mililitro. De una manera alternativa, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso, se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran una vida media más larga que aquélla de los anticuerpos quiméricos y de los anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En las aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento durante el resto de su vida. En las aplicaciones terapéuticas, algunas veces se requiere una dosificación relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduzca o se termine el progreso de la enfermedad, y de preferencia hasta que el paciente muestre una mitigación parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-PCSK9 o el agente de enlace de antígeno se administra cuando los niveles en plasma de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C) en el paciente se elevan por arriba de un nivel umbral previamente determinado, por ejemplo, hasta cuando menos aproximadamente 80 miligramos/decilitro, por ejemplo, hasta cuando menos aproximadamente 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 miligramos/decilitro, o más altos.

C. Co-administración con un segundo agente El antagonista de anticuerpo de PCSK9 se puede utilizar en combinación con agentes que se sepa que son benéficos para reducir el colesterol, incluyendo el colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C), el colesterol que no es de lipoproteína de alta densidad (no HDL-C), y el colesterol total, y/o para elevar el colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL-C).

Los agentes activos se pueden administrar juntos en una mezcla con el anticuerpo antagonista anti-PCSK9, o cada agente se puede administrar por separado. El agente de anticuerpo y el otro agente activo se pueden administrar, pero necesitan administrarse, de una manera concurrente.

Los segundos agentes de ejemplo para utilizarse en co-administración con el presente anticuerpo antagonista anti-PCSK9 o la molécula de enlace de antígeno incluyen, sin limitación, un inhibidor de HMG-CoA-reductasa (es decir, una estatina), fibratos (por ejemplo, clofibrato, gemfibrozil, fenofibrato, ciprofibrato, bezafibrato), niacina y análogos de la misma, inhibidores de la absorción de colesterol, secuestrantes de ácido biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesvelam), un inhibidor del transporte de ácido biliar ¡leal (IBAT), un mimético de hormona tiroides (por ejemplo, el compuesto KB2115), un inhibidor de proteína de transferencia de triglicéridos microsomal, un agonista doble alfa y gamma del receptor activado por el proliferador de peroxisoma (PPAR), un inhibidor de acil-transferasa de acil-CoA:diacil-glicerol (DGAT), un inhibidor de acil-transferasa de acil-CoA:colesterol (ACAT), un inhibidor de Niemann Pick 1 tipo-C1 (NPC1-L1) (por ejemplo, ezetimiba), un agonista de las proteínas de Cásete de Enlace de ATP (ABC) G5 ó G8, un inhibidor de la proteína de transferencia de colesterol-éster (CETP), un ácido nucleico inhibidor dirigido a la PCSK9, y un ácido nucleico inhibidor dirigido a la apoBIOO.

Los agentes reductores de lípidos útiles adicionales se describen y/o se revisan, por ejemplo, en Chang y colaboradores, Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4): 562-70; Sudhop y colaboradores, Drugs (2002) 62(16): 2333-47; Bays y Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11): 1901-38; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar (134): 45-50; Tomoda y Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3): 375-89; Tenenbaum y colaboradores, Adv Cardiol (2008) 45: 127-53; Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2): S241-S248; Lee y colaboradores, J Microbio! Biotechnol (2008) 18(11): 1785-8; Oh y colaboradores, Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7; Birch y colaboradores, J Med Chem (2009) 52(6): 1558-68; y Baxter y Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8: 308-320.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno de la invención se coadministran con una estatina. Las estatinas de ejemplo incluyen, sin limitación, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, y simvastatina.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno de la invención se coadministran con un agente farmacológico que induzca hipercolesterolemia o trigliceridemia. Por ejemplo, el segundo agente farmacológico puede ser un inhibidor de proteasa, por ejemplo, Saquinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir, Atazanavir, Fosamprenavir, Tipranavir, Darunavir, abacavir-lamivudina-zidovudina (Trizivir). En algunas modalidades, el segundo agente farmacológico es Tacrolimus.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno de la invención se coadministran con un ácido nucleico inhibidor (por ejemplo, un siARN, un miARN, una secuencia anti-sentido, una ribozima) que se dirija específicamente a PCSK9 o a apoBIOO.

VI. Kits Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden proporcionar en un kit. En ciertas modalidades, un kit de la presente invención comprende un anticuerpo antagonista anti-PCSK9 o una molécula de enlace de antígeno de la invención, como se describe en la presente. Los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno se pueden proporcionar en dosificaciones uniformes o variables.

En algunas modalidades, los kits comprenden uno o más segundos agentes farmacológicos, como se describen en la presente. El segundo agente farmacológico se puede proporcionar en la misma formulación o en formulaciones separadas de los anticuerpos anti-PCSK9 o de las moléculas de enlace de antígeno. Las dosificaciones de los primeros y los segundos agentes pueden ser independiente-mente uniformes o variables.

En algunas modalidades, los kits comprenden el antagonista de anticuerpo de PCSK9 y uno o más agentes que se sepa que son benéficos para reducir el colesterol, incluyendo el colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C), el colesterol que no es de lipoproteína de alta densidad (no HDL-C), y el colesterol total, y/o para elevar el colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL-C).

Los segundos agentes de ejemplo para incluirse en los kits con el presente anticuerpo antagonista anti-PCSK9 o la molécula de enlace de antígeno incluyen, sin limitación, un inhibidor de HMG-CoA-reductasa (es decir, una estatina), fibratos (por ejemplo, clofibrato, gemfibrozil, fenofibrato, ciprofibrato, bezafibrato), niacina y análogos de la misma, inhibidores de la absorción de colesterol, secuestrantes de ácido biliar (por ejemplo, colestiramina, colestipol, colesvelam), un inhibidor del transporte de ácido biliar ¡leal (IBAT), un mimético de hormona tiroides (por ejemplo, el compuesto KB2115), un inhibidor de proteína de transferencia de triglicéridos microsomal, un agonista doble alfa y gamma del receptor activado por el proliferador de peroxisoma (PPAR), un inhibidor de acil-transferasa de acil-CoA:diacil-glicerol (DGAT), un inhibidor de acil-transferasa de acil-CoA:colesterol (ACAT), un inhibidor de Niemann Pick 1 tipo-C 1 (NPC1-L1) (por ejemplo, ezetimiba), un agonista de las proteínas de Cásete de Enlace de ATP (ABC) G5 ó G8, un inhibidor de la proteína de transferencia de colesterol-éster (CETP), un ácido nucleico inhibidor dirigido a la PCSK9, y un ácido nucleico inhibidor dirigido a la apoB100.

Los agentes reductores de lípidos útiles adicionales en los kits se describen y/o se revisan, por ejemplo, en Chang y colaboradores, Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4): 562-70; Sudhop y colaboradores, Drugs (2002) 62(16): 2333-47; Bays y Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11): 1901-38; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar (134): 45-50; Tomoda y Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3): 375-89; Tenenbaum y colaboradores, Adv Cardiol (2008) 45: 127-53; Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2): S241-S248; Lee y colaboradores, J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11): 1785-8; Oh y colaboradores, Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7; Birch y colaboradores, J Med Chem (2009) 52(6): 1558-68; y Baxter y Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) 8: 308-320.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno de la invención se proporcionan en kits con una estatina. Las estatinas de ejemplo incluyen, sin limitación, atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, y simvastatina.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-PCSK9 o las moléculas de enlace de antígeno de la invención se proporcionan en kits con un agente farmacológico que induzca la hipercolesterolemia o la trigliceridemia. Por ejemplo, el segundo agente farmacológico puede ser un inhibidor de proteasa, por ejemplo, Saquinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir, Atazanavir, Fosamprenavir, Tipranavir, Darunavir, abacavir-lamivudina- zidovudina (Trizívir). En algunas modalidades, el segundo agente farmacológico es Tacrolimus.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.

Ejemplo 1 : Generación e Identificación del Agonista de Pcsk9. NVPLFU720 Compendio Se llevaron a cabo estudios para generar un antagonista de anticuerpo funcional contra Pcsk9. Se identificaron múltiples hibridomas que secretaban un anticuerpo capaz de enlazarse una versión de la proteína marcada con His. Los anticuerpos a partir de hibridomas se evaluaron para determinar su actividad antagonista funcional medida por su capacidad para inhibir la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) mediada por Pcsk9 en células HepG2 lo cual da como resultado un aumento en la capacidad de estas células para absorber el colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C). Se identificó un potente anticuerpo monoclonal de lgG1-kappa de murino anti-PCSK9 humana funcional, y se designó como MAB1.

Métodos Antígeno y otras proteínas Se generó una línea celular de expresión estable que secretaba la proteína PCSK9 humana mediante la transfección de las células HEK293 FreestyleMR (Invitrogen, Carlsbad, Ca). Dicho de una manera breve, las células cultivadas en el medio Freestyle (Invitrogen) más suero fetal de becerro al 10 por ciento en el modo adherente en matraces BioCoat (Becton Dickinson) se transfectaron utilizando el reactivo de transfección de Lipofectamina 2000MR y un plásmido recombinante que proporcionó la secuencia de señal de melitina, el ADNc de Pcsk9 maduro (aminoácidos 31-692), y una marca his6 en el término C de la secuencia (clonada por E. Hampton, GNF, NPL 010051). 48 horas después de la transfección, se inició la selección de los transfectantes positivos mediante la adición de 100 microgramos/mililitro de Zeocina en el medio de cultivo. Cuatro semanas más tarde, emergieron cuatro reservas celulares estables de células productoras de Pcsk9. La reserva 4, que fue la de más alta producción, se adaptó a las condiciones de suspensión sin suero en el medio Freestyle , y subsiguientemente se escaló hacia arriba para la producción a gran escala, utilizando el bio-reactor WaveMR en un volumen de producción a una escala de 10 a 20 litros.

Se llevaron a cabo varias ejecuciones a través del tiempo, proporcionando la proteína recombinante producida a velocidades de entre 12 y 30 miligramos/litro. Los sobrenadantes celulares se cosecharon y se concentraron mediante filtración de flujo atravesado. El concentrado resultante se aplicó a una columna Superflow de Enlace de His NiNTA de 25 mililitros (equilibrada con Tris 50 mM/NaCI 300 mM/CaCI2 1 mM/B-Mercaptoetanol 2 mM, pH de 7.4) a 0.5 mililitros/minuto. Después del lavado de la línea base con Tris 50 mM/NaCI 300 mM/lmidazol 20 mM, pH de 7.4, el material enlazado se eluyó con Tris 50 mM/NaCI 300 mM/lmidazol 250 mM, pH de 7.4. El eluato resultante se dializó contra suero regulado con fosfato (PBS), pH de 7.3, se filtró para esterilizarse, y se dividió en alícuotas. Se analizó una muestra mediante cromatografía analítica por exclusión de tamaños para la determinación de la oligomerización. El cromatograma de HPLC obtenido de la proteína purificada muestra dos picos, contando el mayor por el 85 por ciento. El análisis de HPLC-ESI MS de la proteína de longitud completa revela una masa de 58176.0 Da, la cual está de acuerdo con la masa esperada a partir de aa31-692-His de melitina-hsPcsk9 con todos los residuos de cisteína oxidados. Parte de la muestra adicionalmente se N-glicosila. La proteína contaminante de una masa de aproximadamente 13 kD muy probablemente se parece al prodominio libre de la proteína. Se produjeron los homólogos correspondientes de Pcsk9 a partir de ratón, de rata, y de mono cinomolgo en planteamientos de expresión transitoria a gran escala, utilizando nuevamente las células HEK293 Freestyle cultivadas en una suspensión sin suero en el medio Freestyle. Los plásmidos recombinantes, el ADNc de Pcsk9 de ratón/rata que proporciona una secuencia líder natural y una marca his6 en el término C, y la Pcsk9 de cinomolgo que proporciona una secuencia líder de CD33 y una marca hís6 C-terminal, se transfectaron en las células Freestyle utilizando Polietilenimina como portadora del ADN del plásmido en una proporción de 1:3 (microgramos/mililitro : microgramos/mililitro de AD : PEI). Las ejecuciones de producción se llevaron a cabo en la escala de 10 litros en los bio-reactores Wave ; la purificación y caracterización de la proteína se hicieron de una manera análoga a los protocolos descritos anteriormente para la proteína Pcsk9 humana.

Rastreo de hibridomas que secretan anticuerpos funcionales para PCSK9 Se generaron hibridomas, y diez días después de la fusión, se rastrearon las placas de hibridoma para determinar la presencia de anticuerpos específicos de Pcsk9. Para el rastreo mediante ELISA, las placas Maxisorp de 384 pozos (Nunc #464718) se recubrieron con 50 microlitros de Pcsk9 (diluida hasta 15 nanogramos/pozo en suero regulado con fosfato (PBS)), y se incubaron durante la noche a 4°C. La proteína restante se aspiró, y los pozos se bloquearon con albúmina de suero bovino al 1 por ciento en suero regulado con fosfato (PBS). Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, los pozos se lavaron cuatro veces con suero regulado con fosfato + Tween al 0.05 por ciento (PBST). Se transfirieron 15 microlitros de sobrenadante de hibridoma a las placas ELISA. 15 microlitros de suero de ratón, tomado en el momento de la remoción de los ganglios linfáticos periféricos (PLN), se diluyeron a 1:1000 en suero regulado con fosfato (PBS), y se agregaron como un control positivo. PBST. 50 microlitros del anticuerpo secundario (IgG de cabra anti-ratón - HRP (Jackson Immuno Research #115-035-071), diluida a 1:5000 en suero regulado con fosfato (PBS)), se agregaron a todos los pozos de las placas ELISA. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, las placas se lavaron ocho veces con PBST. Se agregaron 25 microlitros de TMB (KPL #50-76-05), y después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente; las placas se leyeron a una absorbencia de 605 nanómetros. Las células a partir de los pozos positivos se expandieron en placas de 24 pozos en un medio HT (DMEM + FBS al 20 por ciento, Pen/Strep/Glu, 1x NEAA, 1x HT, 0.5x HFCS).

Purificación de anticuerpos El sobrenadante que contenía el MAB1 se purificó utilizando proteína G (Upstate # 16-266 (Billerica, MA)). Antes de cargar el sobrenadante, la resina se equilibró con 10 volúmenes de la columna de suero regulado con fosfato (PBS). En seguida del enlace de la muestra, la columna se lavó con 10 volúmenes de la columna de suero regulado con fosfato (PBS), y entonces el anticuerpo se eluyó con 5 volúmenes de la columna de Glicina 0.1 M, pH de 2.0. Las fracciones de la columna se neutralizaron inmediatamente con 1/10 del volumen de Tris-HCI, pH de 9.0. Se midió la OD2eo de las fracciones, y las fracciones positivas se reservaron y se dializaron durante la noche contra suero regulado con fosfato (PBS), pH de 7.2. Determinación de afinidad mediante titulación de solución en equilibrio Se prepararon diluciones en serie de Pcsk9, y se agregaron anticuerpos a cada concentración de antígeno para alcanzar una concentración constante de anticuerpo de 100 pM. Se distribuyeron 100 microlitros/pozo de cada mezcla de dilución por duplicado a una placa de microtitulación de polipropileno de 96 pozos (Greiner). La placa se selló y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Una placa de microtitulación Standard Bind de 96 pozos (Meso Scale Discovery) se recubrió con 25 microlitros de 1 microgramo/ mililitro de Pcsk9 diluida en suero regulado con fosfato (PBS). Esta placa se selló y se incubó durante la noche a 4°C. Después de la incubación, la placa de microtitulación Standard Bind recubierta con antígeno se lavó tres veces con 200 microlitros por pozo de suero regulado con fosfato (PBS)/Tween-20 al 0.05 por ciento (peso/volumen). Subsiguientemente, la placa se bloqueó con 150 microlitros/pozo de suero regulado con fosfato (PBS)/albúmina de suero bovino (BSA) al 5 por ciento (peso/volumen), y se incubó durante una hora a temperatura ambiente con agitación, se repitieron los pasos de lavado, y se transfirieron 25 microlitros/pozo de la preparación de anticuerpo-antígeno a partir de la placa de microtitulación de polipropileno hacia la placa Standard Bind recubierta con antígeno. La placa Standard Bind se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación. Después de tres pasos de lavado adicionales, se agregaron a cada pozo 25 microlitros de 1 microgramo/mililitro de anticuerpo de detección de cabra anti-ratón marcado con Sulfo-Tag (R32AC-5, Meso Scale Discovery) diluido en regulador de suero regulado con fosfato (PBS)/albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento (peso/volumen)/Tween-20 al 0.05 por ciento (peso/volumen), y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con agitación. Después de lavar la placa tres veces, se transfirieron 150 microlitros de Regulador de Lectura 2X (Read Buffer) (R92TC-1, Meso Scale Discovery) a cada pozo. Se generaron señales de electroquimiluminiscencia, y se detectaron mediante un Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Los datos de electroquimiluminiscencia se exportaron y se procesaron utilizando el software Prism y la siguiente ecuación: Ensayo TR-FRET El ensayo TR-FRET se llevó a cabo en placas superficiales blancas de 384 pozos (Perkin Elmer, 6008280). La hPcsk9-AF (10.7 nM) se incubó con diluciones en serie de proteína hPcsk9 no marcada, y los anticuerpos MAB1, MAB2, o MAB3, durante 30 minutos a temperatura ambiente en 15 microlitros de regulador de ensayo (HEPES 20 mM, pH de 7.2, NaCI 150 mM, CaCI2 1 mM, Tween 20 al 0.1 por ciento por volumen/volumen, y albúmina de suero bovino (BSA) al 0.1 por ciento en peso/volumen). Esto fue seguido por la adición de 5 microlitros de hLDL-R-Eu (4 nM) en regulador de ensayo a la hPcsk9 y el complejo de anticuerpo previamente incubado, y por una incubación a temperatura ambiente durante 90 minutos. Las concentraciones finales de estas proteínas marcadas fueron 8 nM de hPcsk9-AF y 1 nM de hLDL-R-Eu. La señal TR-FRET se midió con el lector de múltiples marcas EnVision 2100 (Perkin Elmer) a 330 nanómetros de excitación y a 665 nanómetros de emisión. Los datos se convirtieron a los valores normalizados utilizando la siguiente fórmula: [(valor de 665 nanómetros x 10,000) / (valor de 615 nanómetros)]. El porcentaje de inhibición se calculó con la siguiente fórmula: 100 - [(valor normalizado de la muestra tratada / valor normalizado promediado de las muestras no tratadas) x 100]. Las curvas de respuesta a la dosis del porcentaje de inhibición se graficaron utilizando Prism versión 5 con la fórmula: Y = Inferior + (Superior - Inferior) / (1 + 10A((LoglC50- X)*HillSlope)) (Software GraphPad Prism).

Ensayo de movimiento del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) Las células HepG2 se tripsinizaron y se sembraron a 6 x 104 células por pozo en 100 microlitros de medio de cultivo en placas de 96 pozos de fondo plano (Corning, 3595), las cuales se recubrieron previamente con colágeno al 1 por ciento por volumen/volumen), entonces se incubaron a 37°C en C02 al 5 por ciento durante 24 horas. En términos generales, las células se trataron con 100 microlitros de medio sin suero que contenía cualquiera de la proteína hPcsk9, y los anticuerpos AB1, MAB2, o MAB3. Después del tratamiento, el medio se desechó, y las células se lavaron con 100 microlitros de suero regulado con fosfato (PBS). Para cosechar las células, se agregaron 100 microlitros de Versina (Biowhittaker, 17-771E), y se incubaron durante una hora a 37°C en C02 al 5 por ciento, seguido por la adición de 100 microlitros de regulador FACS.

Las células se transfirieron a placas de 96 pozos de fondo-V (Corning, 3894), y se centrifugaron a 1200 revoluciones por minuto durante 5 minutos para aglomerar las células. Con el fin de bloquear los sitios de enlace no específico sobre las células, se agregaron 50 microlitros de 100 microgramos/mililitro de IgG de conejo normal (MP Biomedicals, 55944), e IgG de ratón (Sigma, 15381) en regulador FACS a cada pozo, y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las células se centrifugaron a 1200 revoluciones por minuto durante 5 minutos, y el regulador se removió fluctuando la placa. Para marcar las células, se agregaron a cada pozo 10 microlitros de IgG de conejo anti-hLDL-R-Alexa 647 (5 microgramos/ mililitro), y 10 microlitros de anticuerpos marcados con IgG de ratón anti-transferrina-R-ficoeritrina (PE) (2 microgramos/mililitro) (CD71, Becton Dickinson Biosciences, 624048) en regulador FACS, y se incubaron durante 60 minutos en hielo. Las células se centrifugaron a 1200 revoluciones por minuto durante 5 minutos, y el regulador se removió fluctuando la placa. Los anticuerpos no enlazados se removieron mediante el lavado de las células dos veces con 200 microlitros por pozo de regulador FACS. Las células se fijaron en paraformaldehído al 1 por ciento en suero regulado con fosfato (PBS), y las células viables se pasaron en compuerta (5000), y se analizaron utilizando un citómetro de flujo BD LSR II y el software FACSDIVA (Becton Dickinson). El valor medio de la fluorescencia PE se midió a una excitación de 488 nanometros y a una emisión de 575 nanometros. El valor medio de la fluorescencia Alexa 647 se midió a una excitación de 488 nanómetros y a una emisión de 633 nanómetros. Una IgG policlonal de conejo anti-hLDL-R 583 hecha a la medida fue producida por Covance (Denver, PA, EUA) para la detección FACS del hLDL-R superficial en células HepG2. La IgG de conejo anti-hLDL-R 583 exhibió una ventana de aproximadamente 7 veces para la detección del hLDL-R sobre la superficie de las células HepG2, comparándose con la IgG de conejo normal. Para determinar la especificidad de la IgG anti-hLDL-R 583 por el LDL-R sobre la superficie de las células HepG2, se llevó a cabo un experimento utilizando la proteína hLDL-R como un competidor por el enlace de esta IgG. Se observó una disminución dependiente de la dosis en la fluorescencia media promedio para la IgG anti-hLDL-R 583 hacia las células HepG2 con las concentraciones crecientes de proteína hLDL-R. Esto demostró que la IgG antí-hLDL-R 583 reconoce específicamente el LDL-R sobre la superficie de las células HepG2 como se mide mediante FACS. El trabajo futuro utilizó la IgG anti-hLDL-R-583-Alexa 647 directamente marcada para la cuantificación FACS del LDL-R sobre la superficie de las células HepG2.

Absorción de LDL-C Las células HepG2 se tripsinizaron y se sembraron a 6 x 104 células por pozo en 100 microlitros del medio de cultivo en placas de 96 pozos de fondo plano (Corning, 3595, las cuales fueron previamente recubiertas con colágeno al 1 por ciento por volumen/volumen), entonces se incubaron a 37°C en C02 al 5 por ciento durante 24 horas. A menos que se informe de otra manera, las células se trataron con 100 microlitros de medio sin suero que contenía la proteína hPcsk9, o los anticuerpos MAB1, MAB2, o MAB3. Después del tratamiento, cada pozo recibió 20 microlitros de 30 microgramos/mililitro de lipoproteína de baja densidad marcada con 3,3'-dioctadecil-indocarbocianina (Dil-LDL) (Intracell, RP-077-175) en el medio sin suero, y se incubó a 37°C en C02 al 5 por ciento durante 2 horas. El medio se removió mediante la fluctuación de las placas, y las células se lavaron con 100 microlitros de suero regulado con fosfato (PBS sin calcio o magnesio, Invitrogen, 14190-144). El suero regulado con fosfato se removió fluctuando las placas, y se agregaron 100 microlitros de tripsina-EDTA al 0.25 por ciento a cada pozo, y se incubaron durante 5 minutos a 37°C en C02 al 5 por ciento. A cada pozo se le agregaron 100 microlitros de regulador FACS (PBS conteniendo suero bovino fetal (FBS) al 5 por ciento, EDTA 2 mM, y azida de sodio al 0.2 por ciento), y las células se aglomeraron mediante centrifugación a 1200 revoluciones por minuto durante 5 minutos. El medio se desechó mediante la fluctuación de la placa, y las células se fijaron mediante la adición de 50 microlitros de paraformaldehído al 1 por ciento (Electron Microscopy Sciences, 15710) en suero regulado con fosfato por pozo (PBS). Las células viables se pasaron en compuerta y se analizaron utilizando un citómetro de flujo BD LSR II y el software FACSDIVA (Becton Dickinson). El valor promedio de la fluorescencia de Dil-LDL a una excitación de 488 nanómetros y a una emisión de 575 nanómetros, y se analizaron 5000 células. Se generaron gráficas de barras utilizando Microsoft Excel 2002 (Microsoft Corporation). El porcentaje de activación se calculó como sigue: % de Activación = [1 - (X ÷ A)] x 100, en donde X = lectura de fluorescencia del medio a partir del pozo de muestra, y A = lectura de fluorescencia del medio a partir del pozo con solamente el tratamiento de hPcsk9.

Se gráfico el porcentaje de activación contra el tratamiento para determinar las EC50s a partir de las curvas de respuesta a la dosis generadas utilizando la ecuación: Y = Inferior + (Superior-Inferior) / ( +10A((LogEC50-X) HillSlope)), y GraphPad Prism 5 (Software GraphPad).

Resultados Generación de un anticuerpo monoclonal humano anti-PCSK9 Se cosecharon células-B a partir de los ganglios linfáticos primarios de los animales inmunizados con proteína Pcsk9. Se generaron hibridomas utilizando fusión mediada por PEG estándar. La fusión resultante se ensayó mediante un ELISA, y se identificaron y se expandieron los enlazadores positivos para Pcsk9 humana, para generar sobrenadantes. Se identificó un potente anticuerpo monoclonal de Pcsk9 lgG1-kappa de murino anti-humano, y se designó como MAB1.

Rastreo de MAB1 para determinar el enlace específicamente a la Pcsk9 Se examinó la especificidad de MAB1 mediante la evaluación del enlace en un ELISA a una serie de otras proteínas. El enlace de MAB1 a otras seis proteínas se comparó con el enlace a Pcsk9-HIS.

Esto demostró que el enlace a Pcsk9 es específico, y que el anticuerpo no se enlazaba a la marca HIS.

Evaluación de MAB1 para determinar el enlace a la Pcsk9 de mono cinomolgo Se determinó el enlace de MAB1 al homólogo de Pcsk9 de mono cinomolgo. Para este ensayo, los sobrenadantes a partir de las células que expresaban la Pcsk9 marcada con HIS de mono cinomolgo se utilizaron junto con una placa de captura de Ni, evitando la necesidad de purificar el material. La PCSK9 humana se diluyó y también se capturó por medio de su marca HIS. El MAB1 fue capaz de enlazarse tanto a la Pcsk9 humana como de mono cinomolgo.

Cinética de enlace de MAB1 El anticuerpo de ratón MAB1, que reconoce la proteína PCSK9 humana, se analizó para determinar su afinidad de enlace empleando titulación de solución en equilibrio (SET). Se encontró que el MAB1 se enlaza con una alta afinidad a la Pcsk9 humana recombinante con una afinidad sub-nanomolar (Kd =270 pM).

Rastreo de MAB1 para determinar su bloqueo de la interacción de Pcsk9/LDL-R Se utilizó el ensayo TR-FRET para determinar si el anticuerpo MAB1 anti-hPcsk9 podría interrumpir la interacción entre las proteínas marcadas hPcsk9-AF y hLDL-R-Eu. Se evaluó la proteína hPcsk9 no marcada o el péptido EGF-A para demostrar si el ensayo podría detectar la interrupción de la señal TR-FRET generada por la interacción de las proteínas marcadas hLDL-R-Eu y hPcsk9-AF. Las concentraciones crecientes de hPcsk9 no marcada compitieron con hPcsk9-AF por el enlace a hLDL-R-Eu, lo cual dio como resultado una disminución de la señal TR-FRET. El péptido EGF-A interrumpió la interacción entre hLDL-R-Eu y hPcsk9-AF con una IC50 de 2.5 µ?. El MAB1 interrumpió la señal TR-FRET entre hPcsk9-Eu y hLDL-R-AF con una IC50 de 77 nM.

Rastreo de MAB1 para determinar su inhibición de la degradación del LDL-R mediada por Pcsk9 Se ha demostrado que el enlace de Pcsk9 al LDL-R conduce a la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R), y esto se confirmó utilizando células HepG2 y la Pcsk9 humana recombinante. Se determinó la capacidad de MAB1 para enlazarse a Pcsk9 y bloquear este efecto. El MAB1 inhibió este efecto en las células HepG2 tratadas con hPcsk9 exógena, y condujo a un aumento del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) de la superficie celular.

Rastreo de MAB1 para determinar su inhibición de Pcsk9 y restablecer la absorción de LDL La inhibición de la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) mediante la Pcsk9 debe restablecer la capacidad de las células HepG2 para internalizar el colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C). El MAB1 previno la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-R) mediada por la Pcsk9 en las células HepG2 tratadas con la hPcsk9 exogena, y condujo a un aumento en la absorción de Dil-LDL con una EC50 de 194 nM.

Ejemplo 2: Creación de los Anticuerpos Antagonistas de PCSK9: MAB2 y MAB3 Compendio Este ejemplo presenta la generación de los anticuerpos humanos MAB2 y MAB3 mediante el diseño del anticuerpo monoclonal de murino antagonista de PCSK9: MAB1, para tener una mayor homología de secuencia con el anticuerpo de la línea germinal humana. MAB2 y MAB3 conservan la especificidad del epítopo, la afinidad, y la reactividad cruzada de PCSK9 de macaco cinomolgo del anticuerpo de murino progenitor. MAB2 y MAB3 tienen una homología mucho más alta con la secuencia de la línea germinal humana que con el anticuerpo de murino original y, por consiguiente, deben ser mejor tolerados por el sistema inmunológico humano.

El anticuerpo monoclonal de ratón MAB1 se humano-diseñó (HumaneeredMR) para poner su secuencia de proteína más cerca de una secuencia de la línea germinal humana, y disminuir su inmunogenicidad. La tecnología Humaneering R (de humano-diseño) está disponible a través de KaloBios del Sur de San Francisco (en la web mundial, en kalobios.com). La humano-ingeniería (Humaneering R) de anticuerpos genera anticuerpos humanos diseñados con secuencias de la región-V que tienen una alta homología con la secuencia de la línea germinal humana, mientras que todavía se conserva la especificidad y afinidad del anticuerpo progenitor o de referencia (Publicaciones de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 2005/0255552 y 2006/0134098). El proceso identifica primero los determinantes de especificidad de enlace de antígeno mínimos (BSDs) en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un Fab de referencia (típicamente, las secuencias dentro de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de la cadena pesada y de la cadena ligera CDR3). Debido a que estos determinantes de especificidad de enlace (BSDs) de la cadena pesada y ligera se mantienen en todas las bibliotecas construidas durante el proceso de humano-ingeniería (H umaneering R), cada biblioteca se enfoca al epítopo, y los anticuerpos humano-diseñados (HumaneeredMR) retienen la especificidad del epítopo del anticuerpo de ratón original.

En seguida, se generan las bibliotecas de cadena completa (en donde una región variable de cadena ligera o pesada entera es reemplazada con una biblioteca de secuencias humanas) y/o las bibliotecas de cásete (en donde una porción de la región variable de cadena pesada o ligera del Fab de ratón es reemplazada con una biblioteca de secuencias humanas). Se utiliza un sistema de secreción bacteriana para expresar los miembros de la biblioteca como fragmentos de anticuerpos Fab, y se rastrea la biblioteca para buscar los Fabs que se enlacen al antígeno, utilizando un ensayo de enlace de levantamiento de colonias (CLBA). Los clones positivos se caracterizan adicionalmente para identificar aquéllos con la más alta afinidad. Los casetes humanos identificados que soporten el enlace en el contexto de las secuencias de murino residuales, se combinan entonces en un rastreo final de la biblioteca, para generar regiones-V completamente humanas.

Los Fabs Humaneered (humano-diseñados) resultantes tienen secuencias del segmento-V derivadas a partir de las bibliotecas humanas, retienen las secuencias cortas del determinante de especificidad de enlace (BSD) identificadas dentro de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3), y tienen las regiones de Estructura 4 de la línea germinal humana. Estos Fabs se convierten hasta las IgGs completas mediante la clonación de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras en los vectores de expresión de IgG. Los anticuerpos completamente HumaneeredMR (humano-diseñados) generados en este proceso retienen la especificidad de enlace del anticuerpo de murino progenitor, típicamente tienen una afinidad por el antígeno equivalente o más alta que el anticuerpo progenitor, y tienen regiones-V con un alto grado de identidad de secuencia, comparándose con los genes de los anticuerpos de la línea germinal humana al nivel de la proteína.

Métodos Clonación de las regiones-V de murino El ADN de la región-V a partir del MAB1 monoclonal de murino se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) a partir del ARN aislado a partir de la línea celular de hibridoma empleando los métodos convencionales. Los cebadores utilizados con éxito para la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la región variable de cadena pesada a partir del ADNc del hibridoma fueron: VH8 (5'-GTCCCTGCATATGTCYT-3'; SEQ ID NO: 50) (Chardes T y colaboradores 1999), y HC constante (5'-GCGTCTAGAAYCTCCACAC ACAGGRRCCAGTGGATAGAC-3'; SEQ ID NO: 51). Los cebadores utilizados con éxito para la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la región variable de cadena ligera (kappa) a partir del ADNc del hibridoma fueron: V 23 (5'-CTGGAYTYCAGCCTCCAGA-3'; SEQ ID NO: 52) (Chardes T y colaboradores 1999), y LC constante (5'-GCGTCTAGAACTGGATGG TGGGAAGATGG-3'; SEQ ID NO: 53). Las regiones variables de cadena pesada y ligera amplificadas se secuenciaron. Entonces se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los genes-V, y para incorporar los sitios de enzimas de restricción para la clonación dentro de los vectores KaloBios: Vh dentro de KB1292-His (versión modificada de KB1292 que codifica un enlazador flexible C-terminal y la marca 6-His (SEQ ID NO: 45) de la secuencia de aminoácidos AAGASHHHHHH (SEQ ID NO: 54) sobre CH1) en ?/col (5') y Nhe\ (3'); Vk dentro de KB1296 en ?/col (5') y fís WI (3'). Estos vectores de cadena pesada y ligera separados se combinaron entonces en un solo vector de expresión de Fab KaloBios bicistrónico mediante digestión de restricción con 8ssHII y C/al, y ligamiento. Los fragmentos Fab se expresaron en E. coli a partir de este vector. Este Fab se probó para determinar el enlace de PCSK9-antígeno y es referido como el Fab SR101-B1 de referencia.

Purificación del Fab Los fragmentos Fab se expresaron mediante secreción a partir de E. coli utilizando los vectores de expresión KaloBios. Las células se cultivaron en un medio 2xYT hasta una OD6oo de aproximadamente 0.6. La expresión se indujo mediante la adición de IPTG hasta 100 µ?, y agitación durante 4 horas a 33°C. El Fab ensamblado se obtuvo a partir de las fracciones periplásmicas mediante lisis osmótica y purificación mediante cromatografía por afinidad utilizando columnas de Ni-NTA (columnas HisTrap HP; GE Healthcare Catálogo #17-5247-01) de acuerdo con los métodos convencionales. Los Fabs se eluyeron en regulador conteniendo imidazol 500 mM, y se dializaron completamente contra suero regulado con fosfato (PBS), pH de 7.4, sin calcio ni magnesio.

Construcción de bibliotecas Se construyeron bibliotecas uniendo las secuencias de bibliotecas humanas KaloBios, las secuencias de murino progenitoras, y las regiones únicas CDR3-FR4 que contenían el determinante de especificidad de enlace (BSD). El determinante de especificidad de enlace (BSD) contenía las secuencias del segmento-J de la línea germinal humana, y CDR3 a partir del Fab EJS005 de referencia optimizado, y se unieron a las bibliotecas del segmento-V humanas utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) traslapada. Las bibliotecas de cásete humanas KaloBios se basaron en la secuencia de la línea germinal humana más cercana a las Vh y Vk de murino originales en las regiones determinantes de complementariedad (CDR). La Vh del MAB1 de murino original está más cerca de la secuencia de la línea germinal humana Vh2-70, de modo que se utilizó la biblioteca KaloBios que contiene los miembros del subgrupo Vh2 (KB1412), en la elaboración de las bibliotecas de cásete de Vh. De la misma manera, debido a que la Vk del MAB1 está más cerca de la secuencia de la línea germinal humana Vk1 02, se utilizó una mezcla de las dos bibliotecas del segmento-V humanas KaloBios que contienen los miembros del subgrupo Vk1 (KB1419 y KB1420), en la elaboración de las bibliotecas de cásete Vk. Estas bibliotecas de cásete se juntaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) traslapada a la secuencia a partir de la región variable de murino progenitora para completar un segmento-V. Se construyeron dos tipos de casetes mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de puente: Los casetes del extremo frontal que contenían las secuencias humanas en las FR1, CDR1, y la primera parte de la FR2, se amplificaron a partir de la mezcla de la biblioteca de Vh2 (KB1412) o de la mezcla de bibliotecas de Vk1 (KB1419 y KB1420) descritas anteriormente, como una plantilla. Los casetes medios que contenían las secuencias humanas en la última parte de FR2, CDR2, y FR3 se amplificaron utilizando las bibliotecas de la región Vh o Vk humana completa descritas anteriormente, como plantillas. Los casetes de Vh tuvieron secuencias comunes traslapadas en FR2 en las posiciones de aminoácidos 45-49 (numeración de Kabat); los casetes de Vk tuvieron secuencias comunes traslapadas en FR2 en los residuos de aminoácidos 42-47 (numeración de Kabat). De esta manera, las bibliotecas del cásete humano del extremo frontal y medio se construyeron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para los isotipos humanos V-pesado 2 y V-kappa 1. Cada biblioteca del cásete de Vh se clonó en el vector KB1292-His en Nco\ (5') y Kpn\ (3'); cada biblioteca del cásete de Vk se clonó en el vector KB1296-B (versión modificada del vector KaloBios KB1296, el cual tiene un sitio Hind\\\ silencioso agregado en FR4) en Ncol (5') y Hind\\\ (3'). Entonces las bibliotecas de los plásmidos Vh o Vk resultantes se combinaron con la cadena complementaria a partir del Fab JG024 de referencia (por ejemplo, la biblioteca del extremo frontal de Vh se combinó con el vector de Vk de referencia optimizado) mediante digestión con fissHIl y C/al, y el ligamiento subsiguiente para crear las bibliotecas de los vectores bicistrónicos que expresaron los Fabs completos.

ELISA General Se utilizó el antígeno de PCSK9-His6 humano recombinante o de macaco cinomolgo para todos los ensayos ELISA. Típicamente, el antígeno de PCSK9-His6 diluido en suero regulado con fosfato a un pH de 7.4, se enlazó a una placa de microtitulación de 96 pozos a 300 nanogramos/pozo mediante incubación durante la noche a 4°C. La placa se bloqueó con una solución de albúmina de suero bovino (BSA) al 3 por ciento en suero regulado con fosfato (PBS) durante una hora a 37°C, y entonces se enjuagó una vez con PBST. Entonces a cada pozo se le agregó el medio celular inducido que contenía el Fab o el Fab purificado diluido (50 microlitros). Después de una incubación de una hora a 37eC, la placa se enjuagó tres veces con PBST. A cada pozo se le agregó el conjugado de anticadena kappa humana-HRP (Sigma #A7164) diluido a 1:5000 en suero regulado con fosfato (PBS) (50 microlitros), y la placa se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con PBST, entonces se agregaron 100 microlitros de sustrato SureBlue TMB (KPL #52-00-03) a cada pozo, y la placa se incubó durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente. La placa se leyó a 650 nanómetros en un espectro-fotómetro.

Para los ELISAs de especificidad sobre las IgGs humana y de ratón purificadas, una placa de 384 pozos se recubrió con un panel de antígenos humanos o de ratón purificados a 88 nanogramos por pozo, y se incubó durante la noche a 4°C. La placa se bloqueó y se lavó como se describe anteriormente; entonces, a cada pozo se le agregaron 22 microlitros de anticuerpo anti-PCSK9 de ratón o humano purificado diluido a 2 microgramos/mililitro en suero regulado con fosfato (PBS). La placa se incubó durante 1 hora a 37°C, y luego se lavó con PBST. El anticuerpo Fe anti-ratón (Jackson ImmunoResearch Labs #115-035-071) o el anticuerpo anti-kappa humana (Sigma #A7164) conjugado con HRP, se diluyó a 1:5000 en suero regulado con fosfato (PBS) (25 microlitros), y se agregó a cada pozo. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, luego se lavó y se reveló como se describe anteriormente.

Ensayo de enlace de levantamiento de colonias (CLBA) El rastreo de las bibliotecas de fragmentos Fab HumaneeredMR (humano-diseñados) se llevó a cabo esencialmente como se describe en (las Publicaciones de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Números 2005/0255552 y 2006/0134098) utilizando filtros de nitrocelulosa recubiertos con PCSK9-His6 a 1 microgramo/ mililitro. Los Fabs enlazados al filtro recubierto con antígeno se detectaron utilizando un anticuerpo anti-cadena ligera kappa humana conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma #A3813) diluido a 1:5000 en PBST, y las manchas se revelaron con el sustrato quimiluminiscente para fosfatasa alcalina DuoLux (Vector Laboratories #SK-6605).

Generación de PCSK9 recombinante biotinilada y mediciones de afinidad La PCSK9 con marcas C-terminales Avi (para la biotinilación dirigida al sitio) y His6 (PCSK9-Avi-His6) se generó mediante la inserción de un sitio de restricción EcoRI entre el gen que codificaba la PCSK9 y la marca His6 en el plásmido pRS5a/PCSK9¡ expresa los aminoácidos 31-692 de la PCSK9 Uniprot Acceso Q8NBP7 con una marca His6 C-terminal (SEQ ID NO: 45)). Los oligonucleótidos que codificaban la marca Avi (secuencia de aminoácidos: GGGLNDIFEA QKIEWHE; SEQ ID NO: 55), y flanqueados con colgaduras de EcoRI se fosforilaron con la cinasa de polinucleótido T4 (Invitrogen), se templaron, y subsiguientemente se ligaron en pRS5a/PCSK9 utilizando el sitio EcoRI recién insertado. Los clones que contenían la marca Avi se verificaron mediante análisis de secuencias. La expresión de PCSK9-Avi-His6 se llevó a cabo en el Sistema de Expresión 293 Freestyle (Invitrogen), y la proteína recombinante secretada se purificó utilizando la resina de Ni-NTA (QIAGEN). En seguida de la purificación, la proteína PCSK9-Avi-His6 se dializó contra Tris 10 mM, pH de 8.0, NaCI 50 mM. La proteína se biotiniló in vitro con la ligasa de proteína-biotina (Avidez) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Al completarse, la reacción se dializó contra suero regulado con fosfato (PBS), pH de 7.2, y la biotinilación se verificó mediante Western blot, sondeando con estreptavidina conjugada con peroxidasa de radícula roja (HRP).

Se analizó la cinética de enlace de las IgGs y los fragmentos Fab producidos durante el proceso de humano-diseño (HumaneeringMR) utilizando un sistema ForteBio Octet QK, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El antígeno PCSK9-Avi-His6 biotinilado se acopló a estreptavidina los Biosensores de Alto Enlace de Estreptavidina (High Binding Bipsensors) (ForteBio #18-0006). Se monitoreó el enlace de Fab al antígeno en tiempo real utilizando el análisis de interferometría de biocapa y el software proporcionado por el fabricante. Las afinidades se calcularon a partir de las constantes de asociación y de disociación determinadas. Se analizó la cinética de enlace de los candidatos finales seleccionados utilizando un ensayo de Titulación de Solución en Equilibrio (Solution Equilibrium Titration ("SET")). Dicho de una manera breve, se prepararon diluciones en serie de Pcsk9 humana, de mono cinomolgo, de ratón, o de rata, y se agregó el anticuerpo (Ab) anti- Pcsk9 a cada concentración de antígeno para alcanzar una concentración constante de anticuerpo de 100 pM. Se distribuyeron 100 microlitros/pozo de cada mezcla de dilución por duplicado en una placa de microtitulación de polipropileno de 96 pozos (Greiner). La placa se selló y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. Una placa de microtitulación Standard Bind de 96 pozos (Meso Scale Discovery) se recubrió con 25 microlitros de 1 microgramo/mililitro de Pcsk9 diluida en suero regulado con fosfato (PBS). Esta placa se selló y se incubó durante la noche a 4°C. Después de la incubación la placa de microtitulación Standard Bind recubierta con antígeno se lavó tres veces con 200 microlitros por pozo de suero regulado con fosfato (PBS)/Tween-20 al 0.05 por ciento (peso/volumen). Subsiguientemente, la placa se bloqueó con 150 microlitros/pozo de suero regulado con fosfato (PBS)/albúmina de suero bovino (BSA) al 5 por ciento (peso/volumen), y se incubó durante una hora a temperatura ambiente con agitación. Se repitieron los pasos de lavado, y se transfirieron 25 microlitros/pozo de la preparación de anticuerpo-antígeno a partir de la placa de microtitulación de polipropileno hasta la placa Standard Bind recubierta con antígeno. La placa Standard Bind se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación. Después de tres pasos de lavado adicionales, se agregaron a cada pozo 25 microlitros de 1 microgramo/mililitro de anticuerpo de detección de cabra anti-humano marcado con Sulfo-Tag (R32AJ-5, Meso Scale Discovery) diluido en regulador de suero regulado con fosfato (PBS)/albúmina de suero bovino (BSA) al 1 por ciento (peso/volumen)/Tween-20 al 0.05 por ciento (peso/volumen), y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con agitación. Después de lavar la placa tres veces, se transfirieron 150 microlitros de Regulador de Lectura 2X (Read Buffer) (R92TC-1, Meso Scale Discovery) a cada pozo. Se generaron señales de electro-quimiluminiscencia, y se detectaron mediante un Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Los datos se procesaron con la adición a Excel XLfit 4.3.2 (ID Business Solutions), utilizando el modelo de ajuste aplicable para los anticuerpos descritos en Piehler y colaboradores (1997) J Immunol Methods 201: 189-206. Se observó un enlace de alta afinidad entre la PCSK9 humana y de mono cinomolgo, y los anticuerpos MAB2 y MAB3 en solución.

Producción y purificación de anticuerpos Los anticuerpos MAB2 y MAB3 completamente humano-diseñados (HumaneeredMR) (IgG 1 kappa silenciosa) se produjeron mediante la co-transfección de los vectores pJG04 (cadena pesada), y pJG10 (cadena ligera) en células 293 Freestyle utilizando el reactivo de transfección 293fectina (Invitrogen #51-0031) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El anticuerpo se purificó a partir de los sobrenadantes celulares 293 Freestyle utilizando una columna de 5 mililitros de Proteína A HP HiTrap (GE Healthcare #17-0403-03). El anticuerpo se eluyó utilizando el Regulador de Elución de IgG (Pierce #21004), y el regulador se intercambió en suero regulado con fosfato (PBS) mediante diálisis. La cromatografía de afinidad de proteína A se llevó a cabo en un sistema de cromatografía de líquidos AKTAFPLC (GE Healthcare).

Ensayo de competición de epítopos Se ensayó la competición entre el anticuerpo de ratón original MAB1 y sus derivados HumaneeredMR (humano-diseñado) MAB2 y MAB3 por el enlace del epítopo sobre PCSK9 utilizando el sistema ForteBio Octet QK y los Biosensores de Alto Enlace de estreptavidina recubiertos con la PCSK9-Avi-His6 biotinilada. Entonces se enlazaron cuatro anticuerpos diferentes para separar los sensores recubiertos con PCSK9 hasta la saturación: MAB1 de ratón, MAB2 completamente humano, MAB3 completamente humano, o el anticuerpo anti-PCSK-9 humano-diseñado (HumaneeredMR) NVP-LGT209 (que se sabe que tiene un epítopo separado de aquél de MAB1). En seguida, todos los sensores se sumergieron en pozos que contenían el anticuerpo de ratón MAB1, para determinar si el primer anticuerpo podría bloquear el enlace de MAB1.

Resultados Secuencias de aminoácidos de la región-V de murino y de referencia Se secuenciaron los productos de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) a partir de células de hibridoma que expresaban el MAB1, y esta secuencia se verificó en gran parte (95 por ciento o más) al nivel de la proteína utilizando un Espectrómetro de Masas ThermoElectron LTQ-Orbitrap. Entonces se clonaron las regiones variables de cadena pesada y ligera de MAB1 en los vectores KaloBios con el objeto de crear el Fab SR101-B1 de referencia. En adición al Fab (SR101-B1) de referencia, se construyó un Fab de referencia optimizado, el JG024. Varios residuos de aminoácidos de estructura del SR101-B1 se cambiaron hasta la línea germinal humana en el JG024.

Análisis de afinidad de Fb de referencia y de referencia optimizado Los residuos de la línea germinal humana incorporados en el Fab JEJS005 de referencia optimizado en las FR1 y FR3 son aquéllos especificados por los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizados para amplificar el repertorio del segmento-V humano y, por consiguiente, están presentes en todos los miembros de las bibliotecas de la región-V HumaneeredMR (humano-diseñada). El Fab de eferencia optimizado se construyó para evaluar si cualquiera de los cambios a la línea germinal humana altera o no las propiedades de enlace de Fab. Mediante el ELISA de dilución, utilizando los Fabs purificados, se determinó que las afinidades de SR101B-1 y EJS005 por el antígeno de PCSK9 parecen estar dentro del ruido experimental, indicando que se toleran los cambios de aminoácidos en EJS005.

Construcción de la biblioteca y selección de los Fabs completamente HumaneeredMR (humano-diseñados) Se generaron bibliotecas de cásete de extremo frontal y medio de cadena pesada y ligera restringidas al subgrupo para Vh2 o Vk1, y se rastrearon para buscar el CLBA. Para Vh, se identificaron los casetes de extremo frontal que soportaban el enlace al antígeno de PCSK9 mediante el ensayo de enlace de levantamiento de colonias, pero no los casetes medios de Vh. En Vk también, solamente se identificaron los casetes de extremo frontal mediante el levantamiento de colonias. Muchos enlazadores a partir de cada biblioteca de extremo frontal se volvieron a confirmar en un ensayo ELISA sobre los sobrenadantes celulares que contenían el Fab, y además se ordenaron por clasificación utilizando un ELISA de afinidad de concentración normalizada.

Debido a que no se identificaron casetes medios pesados-V que soportaran el enlace de PCSK9, se construyó una biblioteca de Fr-3 utilizando los casetes identificados en el rastreo de extremo frontal unidos a la CDR-2 que se amplificó a partir del Fab de referencia optimizado y una biblioteca de Fr-3 amplificada a partir de las bibliotecas KaloBios Vh2. Por consiguiente, se construyó una biblioteca de cásete humana de Fr-3 en el contexto de los casetes de extremo frontal de enlace de antígeno, se rastreó, y se identificaron los clones de enlace de antígeno.

La parte media de Vk siguió una senda diferente. En la parte media de Vk, se construyeron bibliotecas mutagénicas que se estiraron desde Fr-2 hasta la CDR-2, y las cuales codificaron ya sea el residuo de murino progenitor, o bien el residuo de la línea germinal humana más cercano. Esto se unió a una biblioteca de Vk1 Fr3. La biblioteca resultante tuvo casetes de Fe de enlace de antígeno unidos a una biblioteca mutagénica de Fr-2 y Cdr-2 unida a una biblioteca de Fr-3.

A partir de las bibliotecas descritas anteriormente, se identificaron con éxito los casetes humanos de extremo frontal y medio que soportaban el enlace al antígeno de PCSK9, para las cadenas tanto pesada como ligera, mediante CLBA. Estas bibliotecas se rastrearon en el contexto, de tal manera que los clones positivos para CLBA contendrían los Fabs completamente humano-diseñados (HumaneeredMR). Los clones positivos para CLBA fueron todos confirmados y ordenados por clasificación mediante un ELISA de afinidad normalizada. Los seis Fabs que tenían la más alta afinidad y cuya secuencia mostró la más alta identidad con la línea germinal, se purificaron, y se hicieron mediciones de afinidad más precisas utilizando el sistema ForteBio Octet.

Prueba de la afinidad de los Fabs completamente Humaneered R (humano-diseñados) para el antígeno de PCSK9 utilizando el análisis ForteBio Octet Se comparó luego la cinética de enlace de seis Fabs humanos con la cinética del Fab JG024 de referencia, utilizando el sistema ForteBio Octet (los datos numéricos se resumen en la Tabla 1).

Tabla 1 Afinidad de Fabs completamente humano-diseñados (Humaneered R) para PCSK9 La determinación de la concentración de proteína para estos Fabs fue difícil; como tal, los datos fuera de índice (kd) son mucho más confiables que los datos en el índice (ka), y KD (solamente los datos fuera de índice son independ ientes de la concentración) . Todos salvo uno de los Fabs humano-diseñados (H umaneeredM R) probados parecieron tener datos fuera de índice q ue fueron casi tan buenos (es decir, más lentos) como aquéllos del Fab de referencia. Aunq ue son menos confiables, las mediciones de Ka para los seis Fabs fueron similares o mejores (más rápidas) que el Fab de referencia .

A parti r de esta selección de los Fabs de enlace de antígeno humano-diseñados (Humaneered R) , se seleccionaron las cadenas más humanas con la más alta afinidad para convertirse en los anticuerpos de IgG completos. Por consiguiente, la región variable de MAB2 contiene la cadena pesada a partir del Clon 44 y la cadena ligera a partir del Clon 45. La región variable del MAB3 contiene la cadena pesada del Clon 37 a partir del rastreo de la biblioteca de Vh2 Fr3, y la cadena ligera del Clon 45 a partir de la biblioteca de la cadena ligera completa. Debido a que esta combinación de cadenas pesada y ligera no se identificó a partir del mismo rastreo, se clonaron en un vector de expresión, se expresaron, y se midió su afinidad mediante ForteBio Octet. En seguida de la confirmación de que la afinidad del Fab candidato satisfacía o excedía a la afinidad del Fab de referencia, se clonó en los vectores de IgG completos. Análisis de la cinética de enlace de MAB2 y MAB3 utilizando el sistema de titulación de solución en equilibrio (SET) Utilizando el ensayo SET, se determinaron las afinidades de enlace de los anticuerpos MAB2 y MAB3 a la PCSK9 humana en 260 y 300 pM, respectivamente, como se indica en la Tabla 2. Esto sugiere una interacción de alta afinidad entre los anticuerpos y la PCSK9 en solución.

Tabla 2 Cinética de enlace de MAB2 y MAB3 Análisis de especificidad del antígeno de MAB2 y MAB3 mediante ELISA Con el objeto de probar si se conservaba la especificidad del antígeno del anticuerpo de ratón progenitor MAB1 en las IgGs HumaneeredMR (humano-diseñadas) finales, MAB2 y MAB3, se probó el enlace de los anticuerpos a un panel de antígenos humanos y de ratón (así como a la PCSK9 humana) en un ensayo ELISA. Los resultados de este ensayo (Figuras 4A y 4B) muestran que MAB2 y MAB3 conservan la alta especificidad por la PCSK9, de una manera similar al anticuerpo de murino AB1.

Enlace del anticuerpo a la proteína Pcsk9 humana y de macaco cinomolgo en el ELISA MAB2 y MAB3 se evaluaron para determinar su enlace específico a la Pcsk9 humana y de macaco cinomolgo (ciño). Este ensayo ELISA muestra que, como el anticuerpo de ratón progenitor MAB1, los anticuerpos Humaneered R (humano-diseñados) MAB2 y MAB3 son capaces de enlazarse a la Pcsk9 tanto humana como de cinomolgo de una manera similar (Figuras 5A a 5C).

Ensayo de competición de epítopo basado en la interferometría de bio-capa Con el objeto de probar si se conservaba la especificidad con el epítopo del anticuerpo de murino progenitor AB1 en los anticuerpos Humaneered (humano-diseñados) finales MAB2 y MAB3, se desarrolló un ensayo de competición utilizando el sistema ForteBio Octet. Los anticuerpos HumaneeredMR (humano-diseñados) MAB2 y MAB3 bloquean el enlace del anticuerpo de ratón progenitor MAB1, indicando que los anticuerpos HumaneeredMR (humano-diseñados) conservan la especificidad con el epítopo del anticuerpo de murino original. Se obtuvieron resultados similares cuando se cambió el orden de carga de los anticuerpos, es decir, primero se enlazó el MAB1, seguido por el anticuerpo HumaneeredMR (humanódiseñado).

Secuencia de aminoácidos de los anticuerpos HumaneeredMR (humano-diseñados) MAB2 y MAB3, y porcentaje de identidad con la secuencia de la línea germinal humana Las secuencias de aminoácidos de la región variable de la IgG HumaneeredMR (humano-diseñada) final MAB2 y MAB3 se muestran en las Figuras 2 y 3, respectivamente; las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) están subrayadas y en negrillas. Se incluyen las secuencias de nucleótidos en el listado de secuencias.

Se determinó el porcentaje de identidad con las secuencias de la línea germinal humana para MAB2 y MAB3 mediante la alineación de las secuencias de aminoácidos de Vh y Vk contra una sola secuencia de la línea germinal humana (Vh2 2-05 y Vk1 02, respectivamente; Tabla 3). Los residuos en CDRH3 y CDRL3 se omitieron del cálculo para cada cadena.

Tabla 3 Porcentaje de identidad de MAB2 y MAB3 con las secuencias de la l ínea germ inal humana Se discute información adicional con respecto a la caracterización funcional de los anticuerpos H umaneered R (humano-d iseñados) en las leyendas de las Fig uras 7 a 1 2.

Se entiende que los Ejemplos y modalidades descritos en la presente son para propósitos ilustrativos solamente, y q ue se sugerirán diferentes modificaciones o cambios a la luz de los mismos para las personas expertas en este campo, y se deben incluir dentro del espíritu y alcance de esta solicitud , y dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, y entradas de acceso de secuencias citadas en la presente, se incorporan a la presente como referencia en su totalidad para todos los propósitos .

Claims (44)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se enlaza a la pro-proteína de convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9), en donde el anticuerpo bloquea la interacción de PCSK9 con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR), e inhibe la degradación del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) mediada por la pro-proteína de convertasa-subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9), en donde el anticuerpo comprende: a) una región variable de cadena pesada, la cual comprende un segmento-V de cadena pesada humano, una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de cadena pesada, y una región de estructura 4 (FR4) de cadena pesada; y b) una región variable de cadena ligera, la cual comprende un segmento-V de cadena ligera humano, una región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de cadena ligera, y una región de estructura 4 (FR4) de cadena ligera, en donde: i) la región variable CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos ITTEGGFAY (SEQ ID NO: 17); y ii) la región variable CDR3 de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos QQSNYWPLT (SEQ ID NO: 24).

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se enlaza a la PCSK9 humana con una constante de disociación en equilibrio (KD) de aproximadamente 500 pM o menos.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el segmento-V de cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 27, y en donde el segmento-V de cadena ligera tiene cuando menos el 85 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 28.

4. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el segmento-V de cadena pesada tiene cuando menos el 85 por ciento de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, y en donde el segmento-V de cadena ligera tiene cuando menos el 85 por ciento de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 28.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la F 4 de cadena pesada es una FR4 de la línea germinal humana.

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde la FR4 de cadena pesada es la SEQ ID NO: 35.

7. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la FR4 de cadena ligera es una FR4 de la línea germinal humana.

8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde la FR4 de cadena ligera es la SEQ ID NO: 39.

9. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el segmento-V de cadena pesada y el segmento-V de cadena ligera cada uno comprenden una región determinante de complementariedad 1 (CDR1), y una región determinante de complementariedad 2 (CDR2), en donde: i) la CDR1 del segmento-V de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; ii) la CDR2 del segmento-V de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; iii) la CDR1 del segmento-V de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20; y iv) la CDR2 del segmento-V de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23.

10. El anticuerpo de la reivindicación 9, en donde: i) la CDR1 del segmento-V de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 14; ii) la CDR2 del segmento-V de cadena pesada comprende la SEQ ID NO: 16; iii) la CDR3 de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17; iv) la CDR1 del segmento-V de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 19; v) la CDR2 del segmento-V de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 22; y vi) la CDR3 de cadena ligera comprende la SEQ ID NO: 24.

11. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena pesada tiene cuando menos el 90 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable de la SEQ ID NO: 40, y la región variable de cadena ligera tiene cuando menos el 90 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable de la SEQ ID NO: 41.

12. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena pesada tiene cuando menos el 95 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable de la SEQ ID NO: 40, y la región variable de cadena ligera tiene cuando menos el 95 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable de la SEQ ID NO: 41.

13. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 40, y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 41.

14. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena pesada tiene cuando menos el 90 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 9, y la región variable de cadena ligera tiene cuando menos el 90 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11.

15. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena pesada tiene cuando menos el 95 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 9, y la región variable de cadena ligera tiene cuando menos el 95 por ciento de identidad de la secuencia de aminoácidos con la región variable seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11.

16. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 9, y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 11.

17. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un fragmento FAb'.

18. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es una IgG.

19. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de una sola cadena (scFv).

20. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende regiones constantes humanas.

21. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está enlazado a una proteína portadora.

22. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está PEGilado.

23. Una composición que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, y un excipiente fisiológicamente compatible.

24. La composición de la reivindicación 23, en donde la composición comprende además un segundo agente que reduce los niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL-C) en un individuo.

25. La composición de la reivindicación 24, en donde el segundo agente es una estatina.

26. La composición de la reivindicación 25, en donde la estatina se selecciona a partir del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, y simvastatina.

27. La composición de la reivindicación 24, en donde el segundo agente se selecciona a partir del grupo que consiste en fibratos, niacina y análogos de la misma, inhibidores de la absorción de colesterol, secuestrantes de ácido biliar, miméticos de hormona tiroides, un inhibidor de proteína de transferencia de triglicéridos microsomal (MTP), un inhibidor de acil-transferasa de diacil-glicerol (DGAT), una PCSK9 de dirección al ácido nucleico inhibidor, y una apoB100 de dirección al ácido nucleico inhibidor.

28. Un método para reducir el LDL-C en un individuo que lo necesite, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la reivindicación 1 al individuo, reduciendo de esta manera el LDL-C en el individuo.

29. El método de la reivindicación 28, en donde el individuo es hipo-responsivo o resistente a la terapia con estatina.

30. El método de la reivindicación 28, en donde el individuo es intolerante a la terapia con estatina.

31. El método de la reivindicación 28, en donde el individuo tiene un nivel de LDL-C de la línea base de cuando menos aproximadamente 100 miligramos/decilitro.

32. El método de la reivindicación 28, en donde el individuo tiene hipercolesterolemia familiar.

33. El método de la reivindicación 28, en donde el colesterol total se reduce con el LDL-C.

34. El método de la reivindicación 28, en donde el individuo tiene trigliceridemia.

35. El método de la reivindicación 28, en donde el individuo tiene una mutación del gen de PCSK9 de ganancia de función.

36. El método de la reivindicación 28, en donde el individuo tiene dislipidemia inducida por fármacos.

37. El método de la reivindicación 28, el cual además comprende administrar al individuo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo agente efectivo para reducir el LDL-C.

38. El método de la reivindicación 37, en donde el segundo agente es una estatina.

39. El método de la reivindicación 38, en donde la estatina se selecciona a partir del grupo que consiste en atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, y simvastatina.

40. El método de la reivindicación 37, en donde el segundo agente se selecciona a partir del grupo que consiste en fibratos, niacina y análogos de la misma, inhibidores de la absorción de colesterol, secuestrantes de ácido biliar, miméticos de hormona tiroides, un inhibidor de proteína de transferencia de triglicéridos microsomal (MTP), un inhibidor de acil-transferasa de diacil-glicerol (DGAT), una PCSK9 de dirección al ácido nucleico inhibidor, y una apoB100 de dirección al ácido nucleico inhibidor.

41. El método de la reivindicación 37, en donde el anticuerpo y el segundo agente se co-administran como una mezcla.

42. El método de la reivindicación 37, en donde el anticuerpo y el segundo agente se co-administran por separado.

43. El método de la reivindicación 28, en donde el anticuerpo se administra intravenosamente.

44. El método de la reivindicación 28, en donde el anticuerpo se administra subcutáneamente. RESUM EN La presente invención proporciona anticuerpos antagonistas contra la proproteína de convertasa-subtilisina/quexina tipo 9a ("PCSK9") , y métodos de uso de estos anticuerpos.